CN107586743A - 一株林木根际高效溶磷巨大芽胞杆菌及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株林木根际高效溶磷巨大芽胞杆菌，保藏编号为CCTCC NO.M 2017454，分类命名为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)L205。试验表明，该巨大芽孢杆菌的溶磷量达到203.04mg/L，其液体菌液可以有效溶解难溶性无机磷，增加红黄壤土壤中的有效磷含量，并促进林木苗木的生长。本发明丰富了菌种保藏中心的巨大芽孢杆菌的种群库，为更好的开发利用巨大芽孢杆菌的微生物种群资源提供了方便。同时，巨大芽胞杆菌菌株L205能分泌有机酸，溶解无机磷，提高植物对磷素的吸收利用，特别适用于华南红黄壤区林木生物菌肥和林木促生菌剂的生产，可进一步研制开发微生物复合肥料和菌剂。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一株林木根际高效溶磷巨大芽胞杆菌及应用。
背景技术
根际是土壤-根系-微生物三者紧密结合相互影响的场所，也是土壤微生态***的重要组成部分。Sperber等发现，大部分溶磷微生物出现在植物根际土壤中，根际溶磷菌与根系具有相互促进的作用。中国大部分土壤处于缺磷状态，中国南方土壤中95％以上的磷都是难溶态磷因而无法被植物直接吸收，磷素已成为影响植物生长的主要因子。同时，南方速生丰产林大部分为人工纯林，生物多样性简单，生态***薄弱，大量不合理的化学肥料施用造成生态环境质量下降，水土污染和土壤板结等问题日益严重。
林地土壤中枯枝落叶多、有机物丰富，土壤微生物相对于农业土壤更为丰富，尹瑞龄研究发现，在中国旱地土壤的溶磷微生物中，细菌数量所占比例最大。目前报道的溶磷菌种类主要有：芽孢杆菌(Bacillus)、假单胞杆菌(Pseudomonas)、沙门氏菌(Salmonella)、产碱菌(Alcaligenes)等，其中巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)是发现最早、溶磷磷效果最好且在农业上应用面积最为广泛的菌株。
不同的土壤环境气候特征，不同植物其根际情况也有所差异，故特殊的土壤环境可能会导致非土著菌株定殖能力差、菌种淘汰率高等弊端。广西土壤主要为红黄壤，红黄壤也是我国南方典型的土壤类型。现有关于我国红黄壤地区林木根际溶磷菌的报道并不多。由于其特殊的成土过程，土壤中粘粒、氧化铁和氧化铝较高，有效磷缺乏，制约着该地区林木蓄积量的提高。戴沈燕等从江西鹰潭水稻土中分离得到一株高效溶磷菌Y5，其对磷酸钙的溶磷量为159.1mg/L。目前，国内针对林地红黄壤林木根际溶磷菌的研究还比较少，筛选出的均来源于耕地农作物土壤，在林木生产上的应用效果有限。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一株溶磷效果好、定殖能力强、应用范围广、生产成本低的林木根际高效溶磷巨大芽胞杆菌及应用，该菌株特别适用于华南红黄壤区林木生物菌肥和林木促生菌剂的生产。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一株林木根际高效溶磷巨大芽胞杆菌，保藏编号为CCTCC N0.M 2017454，分类命名为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)L205。
上述林木根际高效溶磷巨大芽胞杆菌在溶解难溶性无机磷中的应用。
难溶性无机磷来自红黄壤土壤。
难溶性无机磷为磷酸钙。
上述应用中，巨大芽胞杆菌的扩繁条件为温度15～35℃，pH 6.0～9.0，溶解氧0.2～2.0mg/L，碳氮质量比2∶1～5∶1。
上述林木根际高效溶磷巨大芽胞杆菌在促进林木苗木生长中的应用。
林木苗木生长于红黄壤土壤。
上述应用中，巨大芽胞杆菌的扩繁条件为温度15～35℃，pH 6.0～9.0，溶解氧0.2～2.0mg/L，碳氮质量比2∶1～5∶1。
上述林木根际高效溶磷巨大芽胞杆菌用于生产林木生物菌肥或林木促生菌剂。
巨大芽孢杆菌L205或混合菌总数不少于0.2*108cfu/mL(g)。
发明人从广西红黄壤区林木根际土壤中分离选育得到一株有效溶磷菌株，通过16SrDNA与GenBank中的序列进行Blast比对鉴定为巨大芽孢杆菌。该林木根际高效溶磷巨大芽胞杆菌，保藏编号为CCTCC N0.M 2017454，分类命名为巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)L205。在菌株应用的研究中，发明人通过纯种扩大培养，液体发酵工艺优化，获得了该菌种扩繁工艺技术。试验表明，该巨大芽孢杆菌的溶磷量达到203.04mg/L，其液体菌液可以有效溶解难溶性无机磷，增加红黄壤土壤中的有效磷含量，并促进林木苗木的生长。本发明溶磷菌株丰富了菌种保藏中心的巨大芽孢杆菌的种群库，为更好的开发利用巨大芽孢杆菌的微生物种群资源提供了方便。同时，巨大芽胞杆菌菌株L205能分泌有机酸，溶解无机磷，提高植物对磷素的吸收利用，特别适用于华南红黄壤区林木生物菌肥和林木促生菌剂的生产，可进一步研制开发微生物复合肥料和菌剂。总之，本发明的林木根际高效溶磷巨大芽胞杆菌溶磷效果好、定殖能力强、应用范围广、生产成本低，具有较大的市场应用潜力。
附图说明
图1是本发明巨大芽孢杆菌L205的***发育树。
图2是本发明巨大芽孢杆菌L205的溶磷结果图，图中：A平板正面图，B平板背面图。
保藏信息说明
巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)L205，保藏编号为CCTCC NO.M 2017454，保藏日期：2017年8月28日，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，邮编430072，保藏单位：中国典型培养物保藏中心。
具体实施方式
以下结合实施例及附图，对本发明作进一步详细说明。
一、巨大芽孢杆菌的菌株来源、选育、基因测序
菌株来源：本发明的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)L205是从广西红黄壤区林木根际土壤中分离选育而得的，保藏信息同上。
巨大芽孢杆菌L205的形态特征为：菌落颜色呈白色，菌体呈杆状，有芽孢。
巨大芽孢杆菌L205的生理生化特征为：革兰氏染色呈阳性，接触酶阳性，氧化酶阳性。
巨大芽孢杆菌L205是通过下列具体分离步骤获得的：
A土壤采集：采广西红黄壤区梧州、宁明、鹿寨、田林等地长势良好的林木根际土壤，采取0～20cm根际非根际土壤和根系样品，装入没有拆封的保鲜袋中，贴上标签，封口，置于冰袋中立刻带回实验室进行溶磷菌株分离。
土壤样品的各项指标测定结果见表1。由表1可知：采集自广西梧州、宁明、鹿寨、田林土样的有机质含量都大于36.75mg/kg，四个土壤样品的有机质含量在36.75-56.51mg/kg之间，有机质含量最低的土样采自鹿寨。采自梧州的土壤总磷含量最高，为1.48g/kg，采自田林的样品土壤速效含量是最高的为16.53mg/kg。各土样的pH值在4.15-5.02之间偏酸性。
表1采自广西四个不同区域的土样分析结果
B菌株分离：将不同地区的桉树根际土壤称取样品5g，置于已灭菌装有45mL0.85％NaCl溶液的150mL三角瓶中，振荡30min，制成悬浮液。用1mL微量加样器从中吸取1mL悬液注入盛有9mL 0.85％无菌NaCl溶液的试管中，充分混匀，再从此试管中吸取1mL，注入另一盛有9mL 0.85％无菌NaCl溶液的试管中，以此类推，制成含量(g)与NaCl溶液(mL)比例依次为10-3、10-4、10-5的3种稀释梯度的土壤悬浮液。吸取50μL涂布，每个梯度重复3个，并作好标记。恒温28℃，培养2～5d，筛选溶磷菌的培养基上具有溶磷圈的菌株根据溶磷圈直径(D)和菌落直径(d)比值的大小即HE值确定溶磷力，将溶磷能力较强的菌株，分别接种到LB平板上进行纯化，然后保存到LB斜面培养基上，4℃的冰箱中以备用。
C溶磷能力测定：将100mL液体PKO培养基装入250mL三角瓶，121℃灭菌20min，冷却后，将1mL各待测菌株菌悬液(108cfu/mL)接种至三角瓶中。每一个菌株设置3个重复，对照不接菌加1ml无菌水代替。将上述三角瓶置于28℃、160r/min摇床培养3d，用pH计测量培养液pH值。并在4℃100 00r/min离心10min，取上清液5mL用钼锑钪比色法，在波长700nm下测定有效磷含量。
D液体培养：从单菌落试管斜面挑取一环巨大芽孢杆菌，接种于液体培养基中，在150-220rpm转速摇床上，32℃培养24小时，活菌数达到6×108cfu/mL左右。
E菌株保存：将上述液体发酵得到巨大芽孢杆菌菌液加入经过高温灭菌的甘油，使得甘油在种子液中的终浓度为20％(V/V)，制成巨大芽孢杆菌甘油冷冻管，存放在-80℃冰箱保存，或存放在-196℃液氮罐中进行超低温保存。
F基因序列测定：将巨大芽孢杆菌试管斜面送上海美吉生物技术公司进行16sRNA基因测序，其16s rRNA基因序列如序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列。其***发育树如图1。
二、溶磷试验
PKO(Pikovskaya’s Medium)培养基：葡萄糖10g，磷酸钙3g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.1g，七水硫酸镁0.1g，氯化钾0.2g，硫酸锰0.004g，硫酸亚铁0.002g，酵母膏0.5g，水1000ml，pH7.2。
将巨大芽孢杆菌CCTCC M 2017454接种于PK0培养基上，30℃培养5d，测定其溶磷圈即透明圈直径(D)/菌落大小(d)的比值为2.67。表明该巨大芽孢杆菌具有良好的溶磷效果。三、溶磷量测定
PKO(Pikovskaya’s Medium)培养基：葡萄糖10g，磷酸钙3g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.1g，七水硫酸镁0.1g，氯化钾0.2g，硫酸锰0.004g，硫酸亚铁0.002g，酵母膏0.5g，水1000ml，pH7.2。
将100mL液体PK0培养基装入250mL三角瓶，121℃灭菌20min，冷却后，将1mL巨大芽孢杆菌CCTCC M 2017454(108cfu/mL)接种至三角瓶中。每一个菌株设置3个重复，对照不接菌加1ml无菌水代替。将上述三角瓶置于28℃、160r/min摇床培养3d，用pH计测量培养液pH值。并在4℃100 00r/min离心10min，取上清液5mL用钼锑钪比色法，在波长700nm下测定有效磷含量。
通过液体摇瓶培养条件下L205溶磷能力，结果表明该菌株溶解无机磷菌的有效磷增量在为203.04mg/L。
四、林木解磷微生物菌液的制备
(1)种子制备
种子培养基：胰蛋白胨10g，酵母浸出粉5g，NaCl 10g，pH值7.0，蒸馏水1000mL。将巨大芽孢杆菌CCTCC M 2017454接种1环于装有100mL上述种子培养基的250mL三角瓶中，在旋转式摇床180rpm转速下，30℃培养24h，即得到适用于接种的种子。
(2)液体发酵培养
发酵培养基：胰蛋白胨10g，酵母浸出粉5g，NaCl 10g，pH值7.0，蒸馏水1000mL。将(1)中获得的巨大芽孢杆菌种子按照发酵培养基体积的5％接种于液体发酵培养基中，在旋转式摇床180rpm转速下，30℃培养48h。
(3)发酵结束后调整发酵液的pH值至5.0-6.0之间，即可获得液体菌剂。
五、林木解磷微生物菌剂的制备
(1)种子制备
种子培养基：胰蛋白胨10g，酵母浸出粉5g，NaCl 10g，pH值7.0，蒸馏水1000mL。将巨大芽孢杆菌CCTCC M 2017454接种1环于装有100mL上述种子培养基的250mL三角瓶中，在旋转式摇床180rpm转速下，30℃培养24h，即得到适用于接种的种子。
(2)液体发酵培养
发酵培养基：胰蛋白胨10g，酵母浸出粉5g，NaCl 10g，pH值7.0，蒸馏水1000mL。将(1)中获得的巨大芽孢杆菌种子按照发酵培养基体积的5％接种于液体发酵培养基中，在旋转式摇床180rpm转速下，30℃培养48h。
(3)发酵结束后，取液体发酵培养基置于高速离心机中离心5分钟，去除上清液，加入1％吐温80，冷冻干燥，即获得林木解磷微生物菌剂。
六、林木解磷微生物菌液在林木杯苗培育上的应用
采用灌根接种法，将步骤四所得菌液用无菌水稀释10倍。取长势相同的的松树、杉木实生苗，浇灌10mL稀释后的菌液，每隔2d浇灌无菌水50mL，每隔10d加施缺磷霍格兰营养液。每个浓度处理25株，以清水为对照，试验温度为15～30℃。接种30d后计算各处理苗木存活数、植株平均苗高、地径。
测定结果表明：加入解磷微生物菌剂的松树杯苗比对照组苗高增益了12.3％，地径增益了10.6％，杉木杯苗比对照组苗高增益了9.5％，地径增益了12.8％。说明本发明的微生物制剂对林木具有比较好的促生长效果。
序列表
<110> 广西壮族自治区林业科学研究院
<120> 一株林木根际高效溶磷巨大芽胞杆菌及应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1398
<212> DNA
<213> 巨大芽孢杆菌 L205(Bacillus megaterium L205)
<400> 1
gcagtcgagc gaactgatta gaagcttgct tctatgacgt tagcggcgga cgggtgagta 60
acacgtgggc aacctgcctg taagactggg ataacttcgg gaaaccgaag ctaataccgg 120
ataggatctt ctccttcatg ggagatgatt gaaagatggt ttcggctatc acttacagat 180
gggcccgcgg tgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcaa cgatgcatag 240
ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga 300
ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg ccgcgtgagt 360
gatgaaggct ttcgggtcgt aaaactctgt tgttagggaa gaacaagtac gagagtaact 420
gcttgtacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg 480
gtaatacgta ggtggcaagc gttatccgga attattgggc gtaaagcgcg cgcaggcggt 540
ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccacggct caaccgtgga gggtcattgg aaactgggga 600
acttgagtgc agaagagaaa agcggaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatgt 660
ggaggaacac cagtggcgaa ggcggctttt tggtctgtaa ctgacgctga ggcgcgaaag 720
cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa 780
gtgttagagg gtttccgccc tttagtgctg cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg 840
agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc 900
atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc ctctgacaac 960
tctagagata gagcgttccc cttcggggga cagagtgaca ggtggtgcat ggttgtcgtc 1020
agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt gatcttagtt 1080
gccagcattt agttgggcac tctaaggtga ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg 1140
atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca cacgtgctac aatggatggt 1200
acaaagggct gcaagaccgc gaggtcaagc caatcccata aaaccattct cagttcggat 1260
tgtaggctgc aactcgccta catgaagctg gaatcgctag taatcgcgga tcagcatgcc 1320
gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccacgag agtttgtaac 1380
acccgaagtc ggtggagt 1444
Claims (10)
1.一株林木根际高效溶磷巨大芽胞杆菌，其特征在于保藏编号为CCTCC NO.M2017454，分类命名为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)L205。
2.权利要求1所述林木根际高效溶磷巨大芽胞杆菌在溶解难溶性无机磷中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述难溶性无机磷来自红黄壤土壤。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述难溶性无机磷为磷酸钙。
5.根据权利要求2至4任一所述的应用，其特征在于：所述巨大芽胞杆菌的扩繁条件为温度15～35℃，pH 6.0～9.0，溶解氧0.2～2.0mg/L，碳氮质量比2∶1～5∶1。
6.权利要求1所述林木根际高效溶磷巨大芽胞杆菌在促进林木苗木生长中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述林木苗木生长于红黄壤土壤。
8.根据权利要求6至7任一所述的应用，其特征在于：所述巨大芽胞杆菌的扩繁条件为温度15～35℃，pH 6.0～9.0，溶解氧0.2～2.0mg/L，碳氮质量比2∶1～5∶1。
9.权利要求1所述林木根际高效溶磷巨大芽胞杆菌用于生产林木生物菌肥或林木促生菌剂。
10.根据权利要求9所述的林木生物菌肥或林木促生菌剂，其特征在于：所述巨大芽孢杆菌L205或混合菌总数不少于0.2*108cfu/mL(g)。
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