CN107586315B - 一种嵌合分子 - Google Patents

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CN107586315B CN201710553014.XA CN201710553014A CN107586315B CN 107586315 B CN107586315 B CN 107586315B CN 201710553014 A CN201710553014 A CN 201710553014A CN 107586315 B CN107586315 B CN 107586315B
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Abstract

本发明公开了一种嵌合分子。该分子由靶向作用于目标蛋白的小分子化合物单元、E3泛素连接酶结合单元和连接单元组成。该化合物可以与BRD蛋白结合，最终使BRD蛋白易被蛋白酶体降解，可以作为BRD蛋白降解的药物，用于治疗癌症或冠状动脉疾病。

Description

一种嵌合分子
技术领域
本发明涉及一种嵌合分子。
背景技术
现代分子生物学从3个基本层次上调控蛋白的表达水平：首先，在DNA水平，通过基因敲除，从而使目标蛋白的DNA失活；其次，在mRNA水平，通过小分子RNA，与目标蛋白的mRNA结合，从而抑制mRNA的翻译及表达；再次，在蛋白水平，通过对翻译后靶蛋白的修饰，例如甲基化、磷酸化、糖基化等，从而调整靶蛋白的量及活性。本专利中涉及的嵌合分子(PROTAC)是基于蛋白水平，调控靶蛋白的表达，用于治疗疾病。
本专利中的BRD/PLK嵌合分子具有异源双功能分子，由双重目标蛋白(BRD/PLK)、E3泛素连接酶识别基团、连接基团构成；耦合目标的目的是为了与在该分子的配体BRD/PLK结合；E3泛素连接酶识别基团的目的是与靶蛋白结合后，导致靶蛋白泛素化，最终使靶蛋白被蛋白酶体降解；连接基团的目的是将DHT与E3泛素连接酶识别基团有机结合起来，增加可溶性，避免被其蛋白酶体降解。
从基因水平的功能基因的敲除，再到mRNA水平小分子RNA的干扰，较多的生化技术已被用来研究蛋白质表达调控；嵌合分子则在不影响DNA及mRNA的表达的情况下，在蛋白水平上直接调控蛋白表达，因此在伦理学上更容易接受。同时，嵌合分子作为一种新的蛋白调控方法，具有其他方法所不具有的优势，有可能成为基因治疗的一种替代方案。嵌合分子靶向降解功能蛋白，有可能研制成药物，成为新的治疗方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了式(Ⅰ)所示的化合物、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐、或其溶剂合物：
X-L-Y (I)
其中，X是靶向作用于目标蛋白的小分子化合物单元，Y是E3泛素连接酶结合单元，L是连接单元；
所述靶向作用于目标蛋白的小分子化合物单元X如式(a1)或式(a2)所示：
Figure BDA0001344947020000011
所述E3泛素酶连接结合单元Y如式(b)所示：
Figure BDA0001344947020000021
其中，Q、W分别独立地选自碳或氮；
a表示1-3的整数；
b表示1-3的整数；
c表示1-3的整数；
R0-R11分别独立地选自氢、卤素、氰基、硝基、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基，其中所述的烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基分别独立地任选进一步被一个或多个选自氘原子、卤素、氰基、硝基、氧代基、烷基、卤代烷基、羟烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基的取代基所取代；
波浪线
Figure BDA0001344947020000026
表示R或S立体异构的化学键，或者消旋体；
所述靶向作用于目标蛋白的小分子化合物单元X和E3泛素连接酶结合单元Y上的一个原子分别被连接基团L的一端所取代。
进一步地，所述药物单元X如式(A)或式(A’)所示：
Figure BDA0001344947020000022
所述E3泛素酶连接结合单元Y如式(B)所示：
Figure BDA0001344947020000023
其中，R1-R6分别独立地选自C1-C10的烷基或C3-C10的环烷基；
R7表示氢或C1-C6的烷基。
进一步地，所述连接单元L为
Figure BDA0001344947020000024
Figure BDA0001344947020000025
其中，m表示0～20的整数，n表示1～20的整数，s表示1～20的整数。
进一步地，m表示0～10的整数，n表示1～10的整数，s表示1～20的整数。
进一步地，m表示0～7的整数，n表示1～4的整数，s表示1～4的整数。
进一步地，R1为C3-C10的环烷基，和/或，R2为C1-C6的烷基，和/或，R3为C1-C6的烷基，和/或，R4为C1-C6的烷基。
进一步地，R1为环戊基，和/或，R2为乙基，和/或，R3为甲基，和/或，R4为甲基或环戊基。
进一步地，所述药物单元X如式(A1)、式(A2)或式(A’1)所示：
Figure BDA0001344947020000031
进一步地，所述连接单元L的羰基端与E3泛素酶连接结合单元Y相连，烷基端与单元X相连。
进一步地，所述连接单元L的烷基端与单元X上的烷基碳原子或氨基氮原子相连，和/或，所述连接单元L的羰基端与E3泛素酶连接结合单元Y上的氨基氮原子相连。
进一步地，所述化合物的结构如式(Ⅰ)、式(Ⅱ)或式(Ⅲ)所示：
Figure BDA0001344947020000032
Figure BDA0001344947020000041
L如前述定义。
进一步地，所述化合物为如下化合物之一：
Figure BDA0001344947020000042
本发明还提供了前述化合物、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐、或其溶剂合物在制备BRD4抑制剂类药物上的用途。
进一步地，所述药物是治疗癌症或冠状动脉疾病的药物。
进一步地，所述癌症是***癌或乳腺癌。
本发明提供了一种药物组合物，：它是以前述化合物或其立体异构体、或其药学上可接受的盐、或其溶剂合物为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。
本发明中，术语“立体异构体”包括立体中心(例如带有4个不同取代基的碳)、轴不对称例如有关键、平面不对称及其混合物的存在。
本发明中，所述C1～C4的烷基是指C1、C2、C3、C4的烷基，即具有1～4个碳原子的直链或支链的烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基等等。
本发明中，所述C1～C4的烷基是指C1、C2、C3、C4的烷基，即具有1～4个碳原子的直链或支链的烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基等等。
本发明中，所述C1～C6的烷基是指C1、C2、C3、C4、C5、C6的烷基，即具有1～6个碳原子的直链或支链的烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、戊基、己基等等。
本发明中，所述C1～C10的烷基是指C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10的烷基，即具有1～10个碳原子的直链或支链的烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等等。
本发明中，所述C3～C10的环烷基是指C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10的环烷基，即具有3～10个碳原子的环状烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基、己基、庚基、辛基、环壬基、环癸基、甲基取代的环丙基、乙基取代的环丁基等等。
本发明制备的化合物可以与BRD蛋白结合，最终使BRD蛋白易被蛋白酶体降解，可以作为BRD蛋白降解的药物，用于治疗癌症或冠状动脉疾病。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
附图说明
图1化合物对BRD4蛋白的降解
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
乙基-2–(2-(2-(2-(甲基磺酰基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙酸，(2S,4R)-1-((S)-2-氨基-3,3-二甲基丁酰)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-甲酰胺盐酸盐由睿智化学(成都)有限公司提供；
其他常用试剂N,N-二异丙基乙胺,碘化钾,二甲基亚DMSO,乙酸乙酯,无水硫酸钠,氢氧化钠,甲醇,甲苯,N,N-二甲基甲酰胺,2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯,N,N-二异丙基乙胺均由成都金山化学试剂有限公司提供.
实施例1.化合物1的制备
(1)(R)-乙基-2-(2-(2-(2-(4-(4-(8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢喋啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酰氨基)哌啶-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙酸的合成
向50mL的反应瓶中加入(R)-4-(8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢喋啶-2-基)氨基)-3-甲氧基-N-(哌啶-4-基)苯甲酰胺盐酸盐(200mg,0.368mmol),乙基-2–(2-(2-(2-(甲基磺酰基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙酸(231mg,0.735mmol),N,N-二异丙基乙胺(143mg,1.1mmol),碘化钾(30mg)和10mLDMSO中,60℃下加热搅拌过夜,加30mL水,乙酸乙酯萃取,无水硫酸钠干燥,浓缩,柱层析,得146mg化合物,黄色固体,收率54.7％,质谱726(M+H+).
(2).(R)-2-(2-(2-(2-(4-(4-(8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢喋啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酰氨基)哌啶-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙酸的合成
Figure BDA0001344947020000061
向50mL的反应瓶中加入(R)-乙基-2-(2-(2-(2-(4-(4-(8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢喋啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酰氨基)哌啶-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙酸(50mg,0.069mmol),氢氧化钠(11mg,0.275mmol),5mL水和5mL甲醇中,60℃下加热搅拌2小时,浓缩,加入甲苯10mL,浓缩,反复三次,直接用于下一步反应.
(3)(2S,4R)-1-((S)-2-(叔丁基)-14-(4-(4-(((R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢喋啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酰氨基)哌啶-1-基)-4-氧代-6,9,12-三氧-3-氮十四烷基-1-酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-甲酰胺(1)的合成
Figure BDA0001344947020000062
向上述反应得到的(R)-2-(2-(2-(2-(4-(4-(8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢喋啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酰氨基)哌啶-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙酸加入N,N-二甲基甲酰胺(2mL)，2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(27mg,0.07mmol)，N,N-二异丙基乙胺(12.9mg,0.1mmol)室温搅拌10分钟后，加入(2S,4R)-1-((S)-2-氨基-3,3-二甲基丁酰)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-甲酰胺盐酸盐(33.7mg,0.07mmol)室温搅拌5个小时。反应完毕后，将反应液倒入10mL水中，用30mL(10mL×3)乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，prep-TLC纯化后得25mg化合物1，收率32％。质谱:1125(M+H+)。
1H-HNMR(400MHz,d-DMSO):8.99(s,1H),8.56(s,1H),7.75-7.54(m,6H),7.44-7.39(m,1H),4.71-4.41(m,3H),4.34-4.08(m,3H),3.98(s,3H),3.86-3.71(m,2H),3.65-3.20(m,14H),3.36(s,1H),3.29(s,3H),3.15-2.81(m,2H),2.60(s,3H),2.44-1.41(m,18H),1.40-1.30(m,3H),1.19(s,9H),0.97-0.75(m,3H).
化合物2,3,4,5,6,7,8,9用与化合物1同样的操作，用与之相对应的试剂合成。实施例2.(2S,4R)-1-((S)-2-(叔丁基)-14-(4-(4-(((R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢喋啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酰氨基)哌啶-1-基)-4-氧代-6,9,12-三氧-3-氮十四烷基-1-酰基)-4-羟基-N-((R)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-甲酰胺,质谱：1125(M+H+)。
1H NMR(400MHz,d-DMSO):9.10(s,1H),8.62(s,1H),7.85-7.61(m,6H),7.54-7.42(m,1H),4.75-4.48(m,3H),4.37-4.12(m,3H),4.03(s,3H),3.91-3.81(m,2H),3.75-3.30(m,14H),3.41(s,1H),3.30(s,3H),3.22-2.91(m,2H),2.61(s,3H),2.54-1.40(m,18H),1.43-1.31(m,3H),1.25(s,9H),0.95-0.81(m,3H).
Figure BDA0001344947020000071
实施例3(2S,4R)-1-((S)-2-(叔丁基)-14-(4-(4-(((R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢喋啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酰氨基)哌啶-1-基)-4-氧代-6,9,12-三氧-3-氮十四烷基-1-酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)吡咯烷-2-甲酰胺,质谱：1110(M+H+)。
1H NMR(400MHz,d-DMSO):9.07(s,1H),8.65(s,1H),7.81-7.56(m,6H),7.58-7.45(m,1H),4.81-4.53(m,4H),4.35-4.14(m,3H),4.01(s,3H),3.95-3.83(m,2H),3.71-3.35(m,14H),3.45(s,1H),3.35(s,3H),3.25-2.90(m,2H),2.63(s,3H),2.51-1.46(m,18H),1.21(s,9H),0.90-0.80(m,3H).
Figure BDA0001344947020000072
实施例4.(2S,4R)-1-((S)-2-(2-(2-(2-(4-(4-(((R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5,6,7,8-四羟基蝶啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酰胺基)哌啶-1-基)乙氧基)乙氧基)乙酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-yl)苯基)乙基)吡咯-2-甲酰胺,质谱:1081(M+H+)。
1H NMR(400MHz,d-DMSO):9.13(s,1H),8.61(s,1H),7.70-7.44(m,6H),7.40-7.35(m,1H),4.65-4.40(m,3H),4.37-4.03(m,3H),3.95(s,3H),3.86-3.75(m,2H),3.63-3.25(m,10H),3.34(s,1H),3.24(s,3H),3.19-2.83(m,2H),2.65(s,3H),2.48-1.4(m,18H),1.38-1.30(m,3H),1.20(s,9H),0.97-0.75(m,3H).
Figure BDA0001344947020000081
实施例5.(2S,4R)-1-((S)-2-(2-(2-(2-(4-(4-(((R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5,6,7,8-四羟基蝶啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酰胺基)哌啶-1-基)乙氧基)乙氧基)乙酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((R)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯-2-甲酰胺,质谱:1081(M+H+)。
1H NMR(400MHz,d-DMSO):9.21(s,1H),8.59(s,1H),7.70-7.42(m,6H),7.37-7.35(m,1H),4.66-4.41(m,3H),4.35-4.0(m,3H),3.88(s,3H),3.85-3.70(m,2H),3.67-3.33(m,10H),3.31(s,1H),3.21(s,3H),3.22-2.76(m,2H),2.68(s,3H),2.45-1.43(m,18H),1.39-1.31(m,3H),1.25(s,9H),0.95-0.84(m,3H).
Figure BDA0001344947020000082
实施例6.(2S,4R)-1-((S)-2-(2-(2-(2-(4-(4-(((R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5,6,7,8-四羟基蝶啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酰胺基)哌啶-1-基)乙氧基)乙氧基)乙酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)吡咯-2-甲酰胺,质谱:1067(M+H+)。
1H NMR(400MHz,d-DMSO):9.10(s,1H),8.58(s,1H),7.83-7.66(m,6H),7.47-7.43(m,1H),4.75-4.45(m,4H),4.36-4.18(m,3H),4.03(s,3H),3.89-3.70(m,2H),3.69-3.25(m,10H),3.39(s,1H),3.33(s,3H),3.18-2.85(m,2H),2.65(s,3H),2.47-1.40(m,18H),1.09(s,9H),0.94-0.71(m,3H).
Figure BDA0001344947020000083
实施例7.(2S,4R)-1-((S)-2-(2-(2-(2-(4-(4-(((R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5,6,7,8-四羟基蝶啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酰胺基)哌啶-1-基)乙氧基)乙酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-yl)苯基)乙基)吡咯-2-甲酰胺,质谱:1037(M+H+)。
1H NMR(400MHz,d-DMSO):9.08(s,1H),8.66(s,1H),7.85-7.51(m,6H),7.48-7.34(m,1H),4.78-4.51(m,3H),4.44-4.13(m,3H),3.91(s,3H),3.81-3.64(m,2H),3.60-3.11(m,6H),3.31(s,1H),3.23(s,3H),3.11-2.80(m,2H),2.71(s,3H),2.47-1.49(m,18H),1.37-1.31(m,3H),1.11(s,9H),0.91-0.78(m,3H).
Figure BDA0001344947020000091
实施例8.(2S,4R)-1-((S)-2-(2-(2-(2-(4-(4-(((R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5,6,7,8-四羟基蝶啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酰胺基)哌啶-1-基)乙氧基)乙酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((R)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-yl)苯基)乙基)吡咯-2-甲酰胺,质谱:1037(M+H+)。
1H NMR(400MHz,d-DMSO):9.01(s,1H),8.74(s,1H),7.82-7.58(m,6H),7.49-7.44(m,1H),4.83-4.61(m,3H),4.51-4.27(m,3H),3.87(s,3H),3.71-3.60(m,2H),3.58-3.11(m,6H),3.35(s,1H),3.21(s,3H),3.07-2.85(m,2H),2.65(s,3H),2.45-1.51(m,18H),1.34-1.30(m,3H),1.07(s,9H),0.88-0.79(m,3H).
Figure BDA0001344947020000092
实施例9.(2S,4R)-1-((S)-2-(2-(2-(2-(4-(4-(((R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5,6,7,8-四羟基蝶啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酰胺基)哌啶-1-基)乙氧基)乙酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-yl)苯基)吡咯-2-甲酰胺,质谱:1023(M+H+)。
1H NMR(400MHz,d-DMSO):9.11(s,1H),8.75(s,1H),7.87-7.66(m,6H),7.48-7.49(m,1H),4.81-4.65(m,3H),4.53-4.28(m,4H),3.90(s,3H),3.81-3.75(m,2H),3.61-3.15(m,6H),3.41(s,1H),3.11(s,3H),3.05-2.87(m,2H),2.75(s,3H),2.48-1.43(m,18H),0.98(s,9H),0.89-0.78(m,3H).
Figure BDA0001344947020000093
以下通过试验例的形式说明本发明的有益效果
试验例1本发明化合物对CWR22RV1细胞增殖抑制作用的生物学测定
实验材料：
Figure BDA0001344947020000094
CWR22RV1cell line(中国科学院细胞库，TCHu100)
Figure BDA0001344947020000095
FBS(Gibco,Cat.No.10099-141)
Figure BDA0001344947020000096
0.01M PBS(Biosharp,Cat.No.162262)
Figure BDA0001344947020000101
RIPM1640(Hyclone,Cat.No.308090.01)
Figure BDA0001344947020000102
Penicillin-Streptomycin(Hyclone,Cat.No.SV30010)
Figure BDA0001344947020000103
Cell counting kit-8(Signalway Antibody,Cat.No.CP002)
Figure BDA0001344947020000104
DMSO(Sigma,Cat.No.D5879)
Figure BDA0001344947020000105
Centrifuge Tube,15ml(Excell Bio,Cat.No.CS015-0001)
Figure BDA0001344947020000106
Cell Culture Dish,(Excell Bio,Cat.No.CS016-0128)
Figure BDA0001344947020000107
96-well cell culture cluster(Corning,Cat.No.3599)
实验方法：
1.缓冲液配制
Figure BDA0001344947020000108
2.实验步骤：
(1)CWR22RV1细胞用细胞培养液传代培养，取生长状态良好的细胞接种于96孔板，每孔80μL，每孔细胞数为1500，于37℃，5％CO2细胞孵育箱中培养过夜。
(2)将药物用二甲基亚砜(DMSO)配置成30mM的储存液。临用前再用DMSO稀释3倍，再按3倍梯度稀释，得到9个浓度梯度，再用培养液将各浓度的化合物稀释200倍(以此保证培养体系中DMSO浓度为0.1％)，每个浓度做2个孔重复。取20μL稀释好的化合物加到细胞培养孔(终浓度为10μM,3.3μM,1.1μM…)，轻轻振荡混匀。另外设置3个只加细胞的阴性对照孔和3个只加培养液的空白对照孔(6孔各加20μL培养液稀释200倍的DMSO)。
3.结果检测：
(1)培养6天后，每孔加10μL CCK-8，于37℃，5％CO2细胞孵育箱中继续培养2.5小时。
(2)用多功能酶标仪在450nm处测定吸光度(OD值)。
(3)数据用软件GraphPad Prism6中Dose-response-inhibition方程分析，得出IC50值。
本发明化合物对CWR22RV1的活性抑制的IC50(nM)，结果如表1所示。
表1化合物对CWR22RV1的活性抑制的IC50(nM)
化合物 IC50(nM)
化合物1 1980
化合物2 970
化合物3 1360
化合物4 1420
化合物5 1240
化合物6 620
化合物7 2070
化合物8 2000
化合物9 2003
以上结果表明，本发明提供的化合物对CWR22RV1细胞增殖具有很好的抑制作用，尤其是化合物6和化合物2，抑制效果尤其好，说明本发明化合物可以制备成为抗肿瘤药物，特别是治疗***癌的药物。
试验例2本发明化合物BRD4(Bromodomain containing protein 4)蛋白表达生物学测定实验材料：
Figure BDA0001344947020000111
CWR22RV1cell line(中国科学院细胞库，TCHu100)
Figure BDA0001344947020000112
FBS(Gibco,Cat.No.10099-141)
Figure BDA0001344947020000113
0.01M PBS(Biosharp,Cat.No.162262)
Figure BDA0001344947020000114
RIPM1640(Hyclone,Cat.No.308090.01)
Figure BDA0001344947020000115
Penicillin-Streptomycin(Hyclone,Cat.No.SV30010)
Figure BDA0001344947020000116
DMSO(Sigma,Cat.No.D5879)
Figure BDA0001344947020000117
Centrifuge Tube,15ml(Excell Bio,Cat.No.CS015-0001)
Figure BDA0001344947020000118
Cell Culture Dish,(Excell Bio,Cat.No.CS016-0128)
Figure BDA0001344947020000119
6-well cell culture cluster(Corning,Cat.No.3516)
Figure BDA00013449470200001110
RIPA lysate buffer(Beyotime,Cat.No.P0013B)
Figure BDA00013449470200001111
Protein Loding Buffer(Beyotime，Cat.No.P0015L)
Figure BDA00013449470200001112
BCA Protein Assay Kit(Beyotime,Cat.No.P0012)
Figure BDA00013449470200001113
SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(成都佰和科技有限公司，Cat.No.PG112)
Figure BDA00013449470200001114
Anti-β-tubulin mouse mAb(Zen Bioscience,Cat.No.200608)
Figure BDA00013449470200001115
Anti-BRD4(E2A7X)rabbit mAb(CST,Cat.No.13440)
Figure BDA00013449470200001116
Peroxidase Affinipure(HRP)Goat Anti-Mouse IgG(Zen Bioscience,Cat.No.511103)
Figure BDA00013449470200001117
Peroxidase Affinipure(HRP)Goat Anti-Rabbit IgG(Zen Bioscience,Cat.No.511203)
Figure BDA00013449470200001118
TBST(Biosharp,Cat.No.BL601A)
Figure BDA00013449470200001119
ECL化学发光试剂盒(Beyotime,Cat.No.P0018)
实验方法：
1.缓冲液配制
Figure BDA00013449470200001120
2.实验步骤：
(1)CWR22RV1细胞用细胞培养液传代培养后，取生长状态良好的细胞接种于6孔板，每孔2ml，每孔细胞数为100万，于37℃，5％CO2细胞孵育箱中培养过夜。
(2)将药物用二甲基亚砜(DMSO)配置成30mM的储存液。临用前再用DMSO稀释3倍，取2μl稀释好的化合物加到细胞培养孔(以此保证培养体系中DMSO浓度为0.1％)，每个浓度做2个孔重复，轻轻振荡混匀。另外设置阴性对照孔(加等量DMSO)和阳性对照孔。
(3)培养24小时后，用RIPA细胞裂解液裂解细胞，提取蛋白，用BCA试剂盒测蛋白浓度。加5倍浓缩的蛋白上样缓冲液，100℃加热5分钟后样品放-20℃保存。
(4)每孔蛋白量为30μg的蛋白量上样到聚丙烯酰胺凝胶，进行电泳。
(5)蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶转移到PVDF膜上，加5％脱脂牛奶室温封闭1小时，一抗(Anti-BRD4(E2A7X)rabbit mAb和Anti-β-Tubulin Mouse mAb)4℃孵育过夜，TBST溶液洗膜三次每次10分钟，二抗(辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG)室温孵育2小时，再用TBST溶液洗膜三次每次10分钟。
3.结果检测：
最后加ECL显色液显色，用自动化学发光仪拍照，收集图片，分析。本发明化合物对BRD4蛋白的降解，结果如图1所示。
图1结果表明，本发明提供的化合物可以与BRD4蛋白结合，促使BRD4蛋白更易被蛋白酶降解。化合物1、2、6、7、8、9的效果尤其明显。
试验例3本发明化合物对LNCap细胞增殖抑制作用的生物学测定
实验材料：
Figure BDA0001344947020000121
LNCap cell line(中国科学院细胞库，TCHu173)
Figure BDA0001344947020000122
FBS(Gibco,Cat.No.10099-141)
Figure BDA0001344947020000123
0.01M PBS(Biosharp,Cat.No.162262)
Figure BDA0001344947020000124
RIPM1640(Hyclone,Cat.No.308090.01)
Figure BDA0001344947020000125
Penicillin-Streptomycin(Hyclone,Cat.No.SV30010)
Figure BDA0001344947020000126
Cell counting kit-8(Signalway Antibody,Cat.No.CP002)
Figure BDA0001344947020000127
DMSO(Sigma,Cat.No.D5879)
Figure BDA0001344947020000128
Centrifuge Tube,15ml(Excell Bio,Cat.No.CS015-0001)
Figure BDA0001344947020000129
Cell Culture Dish,(Excell Bio,Cat.No.CS016-0128)
Figure BDA00013449470200001210
96-well cell culture cluster(Corning,Cat.No.3599)
实验方法：
1.缓冲液配制
Figure BDA00013449470200001211
2.实验步骤：
(1)LNCap细胞用细胞培养液传代培养，取生长状态良好的细胞接种于96孔板，每孔80μL，每孔细胞数为1500，于37℃，5％CO2细胞孵育箱中培养过夜。
(2)将药物用二甲基亚砜(DMSO)配置成30mM的储存液。临用前再用DMSO稀释3倍，再按3倍梯度稀释，得到9个浓度梯度，再用培养液将各浓度的化合物稀释200倍(以此保证培养体系中DMSO浓度为0.1％)，每个浓度做2个孔重复。取20μL稀释好的化合物加到细胞培养孔(终浓度为10μM,3.3μM,1.1μM…)，轻轻振荡混匀。另外设置3个只加细胞的阴性对照孔和3个只加培养液的空白对照孔(6孔各加20μL培养液稀释200倍的DMSO)。
3.结果检测：
(1)培养6天后，每孔加10μL CCK-8，于37℃，5％CO2细胞孵育箱中继续培养2.5小时。
(2)用多功能酶标仪在450nm处测定吸光度(OD值)。
(3)数据用软件GraphPad Prism6中Dose-response-inhibition方程分析，得出IC50值。
本发明化合物对LNCap的活性抑制的IC50(nM)，结果如表2所示。
表2化合物对LNCap的活性抑制的IC50(nM)
化合物 IC50(nM)
化合物1 2400
化合物2 1000
化合物3 1990
化合物4 1230
化合物5 1390
化合物6 950
化合物7 1880
化合物8 2100
化合物9 2200
以上结果表明，本发明提供的化合物对LNCap细胞增殖具有很好的抑制作用，尤其是化合物6和化合物2，抑制效果尤其好，说明本发明化合物可以制备成为抗肿瘤药物，特别是治疗***癌的药物。
本发明提供了一种嵌合分子，该分子由靶向作用于目标蛋白的小分子化合物单元、E3泛素连接酶结合单元和连接单元组成，能够与BRD蛋白进行结合，促使BRD蛋白更易被蛋白酶降解，从而起到抑制细胞增殖的作用，尤其化合物2和6，可以作为BRD蛋白降解的药物，用于治疗癌症或冠状动脉疾病。

Claims (6)

1.式（Ⅰ）、式（Ⅱ）或（Ⅲ）所示的化合物或其药学上可接受的盐：
Figure 836296DEST_PATH_IMAGE001
、
Figure 65283DEST_PATH_IMAGE002
、
Figure 66737DEST_PATH_IMAGE003
；
其中，所述连接单元L为
Figure 62375DEST_PATH_IMAGE004
或
Figure 465674DEST_PATH_IMAGE005
；
n表示1~4的整数，s表示1~4的整数。
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于：所述化合物为如下化合物之一：
Figure 629677DEST_PATH_IMAGE006
Figure 118427DEST_PATH_IMAGE007
Figure 652177DEST_PATH_IMAGE008
3.权利要求1或2任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备BRD4抑制剂类药物上的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述药物是治疗癌症的药物。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述癌症是***癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、白血病或直肠癌。
6.一种药物组合物，其特征在于：它是以权利要求1或2任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。
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