CN107576683A - 一种辣木耐冷性的快速鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种辣木耐冷性的快速鉴定方法，包括选取若干待鉴定辣木植株枝条末梢10cm‑20cm的部分作为试材，剪去叶片和侧枝并清洗干净，吸干试材表面上的水分；把试材剪成0.8‑1.2cm长的小段，充分混合制成至少5组样本；取其中一组样本作为对照样本，另外的各组样本为低温胁迫样本；各低温胁迫样本封装于塑料袋后放置于制冷设备中按不同梯度的低温胁迫温度进行8h‑16h的低温胁迫处理，然后在室温下解冻；测定各组样本外渗液的煮前电导值和煮后电导值，计算各低温胁迫样本的细胞伤害率，最后利用细胞伤害率数值、胁迫温度和Logistic方程计算辣木的低温半致死温度LT₅₀，LT₅₀值越低说明该品种的耐冷性越强。本发明可快速评定待鉴定辣木品种的耐冷能力。

Description

一种辣木耐冷性的快速鉴定方法

技术领域

本发明涉及植物耐冷能力鉴定评价的技术领域，尤其是一种辣木耐冷性的快速鉴定方法。

背景技术

辣木(Moringa spp.)又称鼓槌树、奇树，属辣木科(Moringaceae)辣木属(MoringaAdans.)，是一种热带、亚热带多功能植物，富含植物蛋白、维生素、叶酸、钙、铁等多种营养成分，具有独特经济价值和保健功效。

辣木适宜于热带及南亚热带地区种植，耐冷性是制约其向中亚热带及更北地区推广的最大障碍。目前国内外对辣木的研究主要集中在药用价值和饲料利用等方面，而对辣木耐冷性的研究还未见有详细报道，辣木耐冷性的鉴定评价还没有统一标准。因此开展辣木品种资源耐冷性快速鉴定研究，对辣木的推广及耐冷育种具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种辣木耐冷性的快速鉴定方法，其可快速评定待鉴定辣木品种的耐冷能力，有利于辣木耐冷品种的选育及推广。

为达到上述目的，本发明的技术方案是：一种辣木耐冷性的快速鉴定方法，包括以下步骤：

步骤一、选取若干待鉴定辣木植株枝条末梢10cm-20cm的部分作为试材，剪去叶片和侧枝；然后用水清洗干净后，吸干或晾干试材表面上的水分；

步骤二、把吸干或晾干后的试材剪成0.8-1.2cm长的小段，充分混合后分成数量或质量大致相同的n组样本，n≥5；

步骤三、取其中一组样本作为对照样本，不做低温胁迫；另外的各组样本为低温胁迫样本，各低温胁迫样本封装于塑料袋后放置于制冷设备中进行8h-16h的低温胁迫，各组低温胁迫样本的胁迫温度依次为t₂、t₃……t_n，t_n-1-t_n＝t₀，其中t₂为3℃-5℃，t₀为3℃-5℃，各组低温胁迫样本的低温胁迫时间相同；

步骤四、低温胁迫时间到后，从制冷设备中取出各组低温胁迫样本，然后在20℃-25℃的室温下解冻1h-2h；

步骤五、在解冻后的各组低温胁迫样本和未胁迫处理的对照样本中分别取2g-5g的样本，各组样本中取出的样本质量相同，然后分别放入对应试管中，往各试管中加入样本质量8-12倍的去离子水，加入各试管中的去离子水的质量相同；接着把各试管放入密闭容器中，然后利用真空泵对密闭容器进行抽气处理10min-20min，各试管的抽气处理时间相同，再接着取出各试管，用电导仪测定各试管中外渗液的煮前电导值；再接着把各试管放入100℃沸水浴中煮10min-20min，各试管在100℃沸水浴中煮的时间相同，然后取出各试管冷却至20℃-25℃的室温，再利用电导仪测定各试管中外渗液的煮后电导值；其中设定L₁₁为对照样本外渗液的煮前电导值，L₂₁为对照样本外渗液的煮后电导值，其它各低温胁迫样本外渗液的煮前电导值和外渗液的煮后电导值分别为L₁₂、L₂₂，L₁₃、L₂₃……L_1n、L_2n；

步骤六、利用上述测定的电导值和细胞伤害率的计算公式y(％)＝[1-(1-L_1n/L_2n)/(1-L₁₁/L₂₁)]×100％计算经低温胁迫的各组样本的细胞伤害率，获得经低温胁迫的各组样本的细胞伤害率为y₂,y₃……y_n；

步骤七、利用上述计算出来的细胞伤害率y₂,y₃……y_n和Logistic方程“y＝k/(1+a·e^-bt)”计算辣木的低温半致死温度LT₅₀，Logistic方程中，y为上述计算出来的细胞伤害率，即对应为y₂,y₃……y_n，k为细胞伤害率的饱和值，本方法中细胞伤害率消除本底干扰k值为100％，t为胁迫温度，即对应为t₂、t₃……t_n，a、b为参数；先把Logistic方程转换成ln(k-y)/y＝lna-bt，令y’＝ln(k-y)/y＝lna-bt，y’为转化后的细胞伤害率，利用胁迫温度t对应转化后的细胞伤害率y’值按照直线回归方程的方法求出直线回归方程和参数a、b，那么对直线回归方程进行二阶导数变换得方程曲线的拐点值lna/b，即为半致死温度LT₅₀＝lna/b；

根据计算出的低温半致死温度LT₅₀，可以判断该辣木品种的耐冷性，低温半致死温度LT₅₀越低说明该品种的耐冷性越强。

进一步优选，所述步骤一中，选取若干待鉴定辣木植株枝条末梢10cm-15cm的部分作为试材，剪去叶片和侧枝后依次用自来水、去离子水冲洗干净，然后用吸水纸吸干选取试材表面的水分。这样可提高鉴定速度。

优选所述制冷设备为冰箱，步骤三中，每一组低温胁迫样本放置在一台冰箱中。选用冰箱可以降低设备投入。

优选所述的室温为25℃。

进一步优选，所述步骤二中，n＝7，即充分混合后分成数量或质量大致相同的7组样本。选择7组的样本数对鉴定速度和鉴定的准确性起到较好平衡，既减少投入，又能提高效率，确保鉴定的准确性。

再进一步优选，步骤三中、各低温胁迫样本封装于塑料袋后放置于制冷设备中进行8h低温胁迫。

再进一步优选，步骤三中、t₂为4℃，t₀为4℃，各组低温胁迫样本的胁迫温度依次为4℃、0℃、-4℃、-8℃、-12℃和-16℃。

再进一步，所述制冷设备从20℃-25℃室温降至所述胁迫温度的降温速率为4℃/h。

进一步优选，步骤五中，在解冻后的各组低温胁迫样本和未胁迫处理的对照样本中分别取2g的样本，然后分别放入对应试管中，往各试管中加入样本质量10倍的去离子水，即加入20ml的去离子水，各试管的容量为50ml，各试管放入密封容器进行10min的抽气处理。

进一步优选，步骤三中，对照样本一经确定，即按照步骤五的方法测定对照样本外渗液的煮前电导值L₁₁和外渗液的煮后电导值L₂₁。这样可以加快鉴定的速度。

本发明的有益效果为：

1、本发明以辣木枝条末梢10cm-20cm的部分作为试材，由于此部分处于半木质化状态，其植物细胞对寒冷环境比较敏感，通过低温胁迫，测定其耐冷能力比较客观准确，然后借助合理的样本制作和样本数量的确定，通过测定样本的外渗液的煮前电导值和外渗液的煮后电导值，可以较快计算其细胞伤害率，然后利用Logistic方程“y＝k/(1+a·e^-bt)”、细胞伤害率和对应的胁迫温度可以快速计算辣木的低温半致死温度LT₅₀。根据计算出的低温半致死温度LT₅₀，可以判断该辣木品种的耐冷性，低温半致死温度LT₅₀越低说明该品种的耐冷性越强。这种鉴定方法能够快速评定待鉴定辣木品种的耐冷能力，有利于辣木耐冷品种的选育及推广。

2、在测定外渗液的煮前电导值时，把各试管放入密闭容器中，然后利用真空泵对密闭容器进行抽气处理，以抽出细胞间隙空气，使水分容易渗入细胞间隙，细胞内的溶质易于渗出，有效缩短检测时间，也利于提高检测的准确性。

3、本方法操作简便，周期短，准确性高，可多次重复测定，能提供客观、量化数据，适合大量材料的快速筛选。

4、本方法设备简单，除制冷设备外，其他设备相对便宜，鉴定成本低，利于推广。

具体实施方式

下面结合具体的实施方式对本发明作进一步详细说明。

本具体实施方式选取‘多油辣木’、‘狭瓣辣木’、‘PKM1’这3个品种辣木的4年生健康植株作为鉴定对象，进行三次的鉴定操作，该供试植株均定植于福建省热带作物科学研究所辣木种质资源圃。

实施例一，随机选取两棵‘多油辣木’的4年生健康植株作为鉴定对象。一种辣木耐冷性的快速鉴定方法，包括以下步骤：

步骤一，在两棵‘多油辣木’的植株中随机选取若干待鉴定辣木植株枝条末梢10cm-15cm的部分作为试材，选取的枝条必须是健康枝条，特别是选取的部分不受病虫案影响，然后剪去叶片和侧枝；依次用自来水、去离子水冲洗干净，用吸水纸吸干选取试材表面的水分。

步骤二，把吸干后的试材剪成0.8-1.2cm长的小段，充分混合后分成数量或质量大致相同的7组样本。

步骤三、取其中一组样本作为对照样本，不做低温胁迫；另外的6组样本为低温胁迫样本，各低温胁迫样本封装于塑料袋后放置于对应冰箱中进行8h的低温胁迫，各组低温胁迫样本的胁迫温度依次为4℃、0℃、-4℃、-8℃、-12℃和-16℃，各组低温胁迫样本的低温胁迫时间相同；且可设定冰箱从25℃室温降至所述胁迫温度的降温速率为4℃/h。

步骤四、低温胁迫时间到后，从各冰箱中取出各组低温胁迫样本，然后在25℃的室温下解冻1h-2h；

步骤五、在解冻后的各组低温胁迫样本和未胁迫处理的对照样本中分别取2g的样本，然后分别放入对应试管中，往各试管中加入样本质量10倍的去离子水，即加入20ml的去离子水，选用各试管的容量均为50ml；接着把各试管放入密闭容器中，然后利用真空泵对密闭容器进行抽气处理10min，各试管的抽气处理时间相同，再接着取出各试管，用电导仪(DDS-12型)测定各试管中外渗液的煮前电导值；再接着把各试管放入100℃沸水浴中煮10min，各试管在100℃沸水浴中煮的时间相同，然后取出各试管冷却至25℃的室温，再利用电导仪(DDS-12型)测定各试管中外渗液的煮后电导值；其中设定L₁₁为对照样本外渗液的煮前电导值，L₂₁为对照样本外渗液的煮后电导值，其它各低温胁迫样本外渗液的煮前电导值和外渗液的煮后电导值分别为L₁₂、L₂₂，L₁₃、L₂₃……L_1n、L_2n；

上述对照样本的电导值测定，对照样本一经确定，即可按照步骤五的方法测定对照样本外渗液的煮前电导值L₁₁和外渗液的煮后电导值L₂₁。这样可以加快鉴定的速度。

步骤六、利用上述测定的电导值和细胞伤害率的计算公式y(％)＝[1-(1-L_1n/L_2n)/(1-L₁₁/L₂₁)]×100％计算经低温胁迫的各组样本的细胞伤害率，获得经低温胁迫的各组样本的细胞伤害率为y₂,y₃……y_n；

步骤七、利用上述计算出来的细胞伤害率y₂,y₃……y_n和Logistic方程“y＝k/(1+a·e^-bt)”计算辣木的低温半致死温度LT₅₀，Logistic方程中，y为上述计算出来的细胞伤害率，即对应为y₂,y₃……y_n，k为细胞伤害率的饱和值，本方法中细胞伤害率消除本底干扰k值为100％，t为胁迫温度，即对应为t₂、t₃……t_n，a、b为参数；先把Logistic方程转换成ln(k-y)/y＝lna-bt，令y’＝ln(k-y)/y＝lna-bt，y’为转化后的细胞伤害率，利用胁迫温度t对应转化后的细胞伤害率y’值按照直线回归方程的方法求出直线回归方程和参数a、b，那么对直线回归方程进行二阶导数变换得方程曲线的拐点值lna/b，即为半致死温度LT₅₀＝lna/b；

根据计算出的低温半致死温度LT₅₀，可以判断该辣木品种的耐冷性，低温半致死温度LT₅₀越低说明该品种的耐冷性越强。

关于Logistic方程“y＝k/(1+a·e^-bt)”的具体变换过程如下：

y＝k/(1+a·e^-bt)

＝>y(1+a·e^-bt)＝k

＝>y+y·a·e^-bt＝k

＝>y·a·e^-bt＝k-y

＝>a·e^-bt＝(k-y)/y

两边取自然对数可得

＝>ln(a·e^-bt)＝ln(k-y)/y

＝>lna+lne^-bt＝ln(k-y)/y

＝>lna-bt＝ln(k-y)/y

＝>ln(k-y)/y＝lna-bt

令y’＝ln(k-y)/y，则：y’＝lna-bt(式中，y’为转化细胞伤害率，t为样本的胁迫温度)，y’与t形成线性关系。

上述的鉴定还可选取其它低温胁迫样本封装于塑料袋后放置于对应冰箱中进行16h的低温胁迫，然后再计算低温半致死温度LT₅₀。

实施例二，随机选取两棵‘狭瓣辣木’的4年生健康植株作为鉴定对象。一种辣木耐冷性的快速鉴定方法，其鉴定的步骤与实施例一相同。

实施例三，随机选取两棵‘PKM1’的4年生健康植株作为鉴定对象。一种辣木耐冷性的快速鉴定方法，其鉴定的步骤与实施例一相同。

三个实施例的Logistic方程和低温半致死温度LT₅₀如下表所示：

表：3个不同辣木品种的Logistic方程和低温半致死温度(LT₅₀)

从上表可以看出，狭瓣辣木的耐冷能力最强，其次是PKM1辣木，再其次是多油辣木。说明其耐冷能力由强到弱依次为‘狭瓣辣木’>‘PKM1’>‘多油辣木’。

另外，由表可知，三个品种辣木Logistic方程的拟合度R²在低温胁迫处理8h时为0.9195～0.9270，在低温胁迫处理8h时为0.8159～0.8600，各拟合方程均有较好的拟合结果。当然低温胁迫处理8h时方程的拟合度比低温胁迫处理16h的拟合度更高，鉴定的准确性更好。

低温胁迫处理时间为8h时，‘狭瓣辣木’的LT₅₀为-7.62℃，‘PKM1’的LT₅₀为-7.25℃，‘多油辣木’的LT₅₀为-6.57℃；低温胁迫处理时间为16h时，‘狭瓣辣木’的LT₅₀为-5.67℃，‘PKM1’的LT₅₀为-5.21℃，‘多油辣木’的LT₅₀为-4.15℃。虽然不同处理时间下同一品种计算出来的低温半致死温度不同，但所得出的品种间低温半致死温度的高低排序均一致，试验结果的重复性较好。

本鉴定方法还可从恢复处理验证了辣木试材低温半致死温度的准确性，低温胁迫处理8h的辣木枝条样本经恢复后，4℃、0℃和-4℃处理的电解质渗出率均略有降低，说明细胞膜仍具恢复能力，-8℃、-12℃和-16℃处理的电解质渗出率略有升高，说明细胞膜受破坏已不能全部恢复。其中电解质渗出率(％)＝(L1/L2)×100％，L1为外渗液的煮前电导值，L2为外渗液的煮后电导值。这种结果与上表计算出来的低温半致死温度LT₅₀相吻合，进一步验证上述鉴定方法的可行性。

以上的实施例仅是为了更好说明本发明，并不是对本发明的具体限制，本领域的技术人员按权利要求作等同的改变都落入本案的保护范围。

Claims (10)

1.一种辣木耐冷性的快速鉴定方法，包括以下步骤：

步骤一、选取若干待鉴定辣木植株枝条末梢10cm-20cm的部分作为试材，剪去叶片和侧枝；然后用水清洗干净后，吸干或晾干试材表面上的水分；

步骤二、把吸干或晾干后的试材剪成0.8-1.2cm长的小段，充分混合后分成数量或质量大致相同的n组样本，n≥5；

步骤三、取其中一组样本作为对照样本，不做低温胁迫；另外的各组样本为低温胁迫样本，各低温胁迫样本封装于塑料袋后放置于制冷设备中进行8h-16h的低温胁迫，各组低温胁迫样本的胁迫温度依次为t₂、t₃……t_n，t_n-1-t_n＝t₀，其中t₂为3℃-5℃，t₀为3℃-5℃，各组低温胁迫样本的低温胁迫时间相同；

步骤四、低温胁迫时间到后，从制冷设备中取出各组低温胁迫样本，然后在20℃-25℃的室温下解冻1h-2h；

步骤五、在解冻后的各组低温胁迫样本和未胁迫处理的对照样本中分别取2g-5g的样本，各组样本中取出的样本质量相同，然后分别放入对应试管中，往各试管中加入样本质量8-12倍的去离子水，加入各试管中的去离子水的质量相同；接着把各试管放入密闭容器中，然后利用真空泵对密闭容器进行抽气处理10min-20min，各试管的抽气处理时间相同，再接着取出各试管，用电导仪测定各试管中外渗液的煮前电导值；再接着把各试管放入100℃沸水浴中煮10min-20min，各试管在100℃沸水浴中煮的时间相同，然后取出各试管冷却至20℃-25℃的室温，再利用电导仪测定各试管中外渗液的煮后电导值；其中设定L₁₁为对照样本外渗液的煮前电导值，L₂₁为对照样本外渗液的煮后电导值，其它各低温胁迫样本外渗液的煮前电导值和外渗液的煮后电导值分别为L₁₂、L₂₂，L₁₃、L₂₃……L_1n、L_2n；

步骤六、利用上述测定的电导值和细胞伤害率的计算公式y(％)＝[1-(1-L_1n/L_2n)/(1-L₁₁/L₂₁)]×100％计算经低温胁迫的各组样本的细胞伤害率，获得经低温胁迫的各组样本的细胞伤害率为y₂,y₃……y_n；

步骤七、利用上述计算出来的细胞伤害率y₂,y₃……y_n和Logistic方程“y＝k/(1+a·e^-bt)”计算辣木的低温半致死温度LT₅₀，Logistic方程中，y为上述计算出来的细胞伤害率，即对应为y₂,y₃……y_n，k为细胞伤害率的饱和值，本方法中细胞伤害率消除本底干扰k值为100％，t为胁迫温度，即对应为t₂、t₃……t_n，a、b为参数；先把Logistic方程转换成ln(k-y)/y＝lna-bt，令y’＝ln(k-y)/y＝lna-bt，y’为转化后的细胞伤害率，利用胁迫温度t对应转化后的细胞伤害率y’值按照直线回归方程的方法求出直线回归方程和参数a、b，那么对直线回归方程进行二阶导数变换得方程曲线的拐点值lna/b，即为半致死温度LT₅₀＝lna/b；

根据计算出的低温半致死温度LT₅₀，可以判断该辣木品种的耐冷性，低温半致死温度LT₅₀越低说明该品种的耐冷性越强。

2.根据权利要求1所述的一种辣木耐冷性的快速鉴定方法，其特征在于：所述步骤一中，选取若干待鉴定辣木植株枝条末梢10cm-15cm的部分作为试材，剪去叶片和侧枝后依次用自来水、去离子水冲洗干净，然后用吸水纸吸干选取试材表面的水分。

3.根据权利要求1所述的一种辣木耐冷性的快速鉴定方法，其特征在于：所述制冷设备为冰箱，步骤三中，每一组低温胁迫样本放置在一台冰箱中。

4.根据权利要求1所述的一种辣木耐冷性的快速鉴定方法，其特征在于：所述的室温为25℃。

5.根据权利要求1所述的一种辣木耐冷性的快速鉴定方法，其特征在于：所述步骤二中，n＝7，即充分混合后分成数量或质量大致相同的7组样本。

6.根据权利要求5所述的一种辣木耐冷性的快速鉴定方法，其特征在于：步骤三中、各低温胁迫样本封装于塑料袋后放置于制冷设备中进行8h低温胁迫。

7.根据权利要求5所述的一种辣木耐冷性的快速鉴定方法，其特征在于：步骤三中、t₂为4℃，t₀为4℃，各组低温胁迫样本的胁迫温度依次为4℃、0℃、-4℃、-8℃、-12℃和-16℃。

8.根据权利要求7所述的一种辣木耐冷性的快速鉴定方法，其特征在于：所述制冷设备从20℃-25℃室温降至所述胁迫温度的降温速率为4℃/h。

9.根据权利要求1所述的一种辣木耐冷性的快速鉴定方法，其特征在于：步骤五中，在解冻后的各组低温胁迫样本和未胁迫处理的对照样本中分别取2g的样本，然后分别放入对应试管中，往各试管中加入样本质量10倍的去离子水，即加入20ml的去离子水，各试管的容量为50ml，各试管放入密封容器进行10min的抽气处理。

10.根据权利要求1至9任一项所述的一种辣木耐冷性的快速鉴定方法，其特征在于：步骤三中，对照样本一经确定，即按照步骤五的方法测定对照样本外渗液的煮前电导值L₁₁和外渗液的煮后电导值L₂₁。