CN107557373A - 一种基于I‑B型CRISPR‑Cas***基因cas3的基因编辑方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于维吉尼亚链霉菌IBL14染色体中的I‑B型CRISPR‑Cas***的基因cas3所建立的一种新的基因编辑***，首次实现了I型CRISPR‑Cas***对生物细胞基因组的基因编辑，为II型商业化Cas9所构建的基因编辑***提供了新的补充和选择。该***中Cas3即可通过crRNA导向也可通过t‑DNA定位对目标DNA进行专一性切割。应用该***可对原核和真核生物基因组进行无误、简单、快速的基因编辑。优化后的该基因编辑***因其分子量小且能通过DNA导向可望在许多领域中优于已商业化的基于Cas9所构建的基因编辑***。

Description

一种基于I-B型CRISPR-Cas***基因cas3的基因编辑方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域的基因编辑技术，确切地说是一种基于I-B型CRISPR-Cas***基因cas3的基因编辑方法。
背景技术
CRISPR-Cas***广泛存在于古细菌和细菌基因组中。当前已发现的CRISPR-Cas***分为两类六型：1类为多Cas蛋白进行干涉，包括I、III和IV型；2类为单一Cas蛋白进行干涉，包括II、V和VI型；I至VI型分别以Cas3,Cas9，Cas10,undetermined,Cpf1和C2c2为标志蛋白(P.Mohanraju,K.S.Makarova,B.Zetsche,F.Zhang,E.V.Koonin,J.van der Oost,Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cassystems.Science 2016,(353)5147)。其中，I型最为广泛，约占已鉴定的60％以上。遗憾的是：I型CRISPR-Cas***虽有诸多发现，但未见可应用于基因编辑的报道。特别是：通过DNA导向进行基因编辑未见报道。
尽管有报道介绍：极端嗜热的冰岛硫化叶菌(Sulfolobus islandicus)能利用自身I型和III型CRISPR-Cas***通过一个基因编辑载体对自身基因组进行基因编辑(Y.Li,S.Pan,Y.Zhang,M.Ren,M.Feng,N.Peng,L.Chen,Y.X.Liang,Q.She,Harnessing Type Iand Type III CRISPR-Cas systems for genome editing.Nucleic acids research2016,(44)e34-e34)；沙黑纤毛菌(Leptotrichia shahii)中的C2c2蛋白可专一性地敲除mRNA(O.O.Abudayyeh,J.S.Gootenberg,S.Konermann,J.Joung,I.M.Slaymaker,D.B.Cox,S.Shmakov,K.S.Makarova,E.Semenova,L.Minakhin,K.Severinov,A.Regev,E.S.Lander,E.V.Koonin,F.Zhang,C2c2is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector.Science 2016(e353)aaf5573)；环境基因组(metagenomics)中发现有可能用于基因编辑的CasX与CasY(D.Burstein,L.B.Harrington,S.C.Strutt,A.J.Probst,K.Anantharaman,B.C.Thomas,J.A.Doudna,J.F.Banfield,New CRISPR-Cassystems from uncultivated microbes.Nature 2017,(542)237-241)。但目前证实的仅有2类的II型Cas9(化脓链球菌/Streptococcus pyogenes、空肠弯曲杆菌/Campylobacterjejuni等)和V型Cpf1(氨基酸球菌BV3L6/Acidaminococcus sp.BV3L6与毛螺科杆菌MA2020/Lachnospiraceae bacterium MA2020)可对其它生物基因组进行基因编辑(P.Mohanraju,K.S.Makarova,B.Zetsche,F.Zhang,E.V.Koonin,J.van der Oost,Diverseevolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cassystems.Science 2016,(353)aad5147；S.Shmakov,A.Smargon,D.Scott,D.Cox,N.Pyzocha,W.Yan,O.O.Abudayyeh,J.S.Gootenberg,K.S.Makarova,Y.I.Wolf,K.Severinov,F.Zhang,E.V.Koonin,Diversity and evolution of class 2CRISPR-Cassystems.Nat Rev Microbiol 2017,(15)169-182)。目前主要商业应用于基因编辑的仍为II型CRISPR-Cas***中的cas9(单基因体系)为基础所构建的基因编辑工具。
维吉尼亚链霉菌IBL14是本实验室分离纯化的一株能以多种甾体化合物为唯一碳源生长的菌株；是迄今所报道的唯一能酶催化薯蓣皂苷元(diosgenin)(甾体药物的主要原料)F-环(C25羟化)反应的微生物(F.-Q.Wang,C.-G.Zhang,B.Li,D.-Z.Wei,W.-Y.Tong,Newmicrobiological transformations of steroids by Streptomyces virginiae IBL-14.Environmental science&technology2009,(43)5967-5974)。菌株IBL14全基因组测序及生物信息学分析发现：该菌株存在一个I-B-svi型CRISPR-Cas***。特别是：该***通过一个基因编辑载体(由靶向基因片段和模板DNA组成)能对自身基因组进行基因编辑(CN201510999333.4、CN201511002817.3)；且由该***cas7-5-3-4-1-2(6基因体系)和cas7-5-3(3基因体系)为基础所构成的编辑工具可有效的对原核生物基因组进行基因编辑(CN201611113137.3、CN201611089333.1)。
由于2类II型的Cas9(4107nt)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)、CjCas9(2955nt)(E.Kim,T.Koo,S.W.Park,D.Kim,K.Kim,H.Y.Cho,D.W.Song,K.J.Lee,M.H.Jung,S.Kim,J.H.Kim,J.S.Kim,In vivo genome editing with a small Cas9orthologue derivedfrom Campylobacter jejuni.Nat Commun 2017,(8)14500)与2类V型的Cpf1(3924nt)(R.D.Fagerlund,R.H.Staals,P.C.Fineran,The Cpf1CRISPR-Cas protein expandsgenome-editing tools.Genome Biol 2015,(16)251)存在分子量大，许多载体(如：病毒、载体等)只能搭载有限长度的片段，且存在脱靶等不足。故本发明将公开一个以维吉尼亚链霉菌IBL14染色体中I-B型CRISPR-Cas***基因cas3(单基因体系)为基础设计的由Cas3表达载体(vector-cas3)和基因编辑载体(vector-t/g-gene abbreviation)组成的基因编辑***，该基因编辑***首次实现了基于I型CRISPR-Cas***中单一Cas3蛋白对原核生物与真核生物基因组的基因编辑。特别是该蛋白Cas3即可通过crRNA导向也可通过t-DNA定位进行DNA切割；且该蛋白Cas3(2316nt/771aa)的分子量远小于商用蛋白Cas9(1368aa)与最小蛋白CjCas9(984aa)的分子量；在菌株IBL14自打靶基因编辑和其它生物的基因编辑中均表现出高效、无误、无脱靶之特点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种基于I-B型CRISPR-Cas***中单一Cas3蛋白对原核生物与真核生物基因组进行基因编辑的工具。
为达此目的，本发明所采用的技术方案是：
一种基于I-B型CRISPR-Cas***基因cas3的基因编辑方法，其特征在于：包括维吉尼亚链霉菌IBL14中基因cas3构建的蛋白Cas3表达载体与包含模板DNA和/或靶向DNA的基因编辑载体所组成的基因编辑工具对所有生物的遗传物质进行基因编辑。
所述的一种基于I-B型CRISPR-Cas***基因cas3的基因编辑方法，其特征在于，步骤如下：
(1)Cas3表达载体的构建
基于维吉尼亚链霉菌IBL14基因cas3序列信息设计引物，以维吉尼亚链霉菌IBL14基因组为模板，通过PCR反应扩增得到cas3基因，并连接到载体上，得Cas3表达载体；
(2)基因编辑载体的构建
根据靶向基因序列信息设计引物，以靶向生物基因组为模板，设计并通过PCR合成由靶向基因上、下游同源臂和所需遗传功能信息组成的t-DNA片段；
根据生物靶向基因序列信息设计并化学合成顺序包含限制性酶缺位点、转录启动子、转录crRNA的crDNA、转录终止子和限制性酶缺位点组成的g-DNA片段；
将制备得到的t-DNA片段与g-DNA片段分别连接到载体上，得基因编辑载体；
(3)基因编辑重组子的构建与验证
制备感受态细胞或原生质体，并将按步骤(1)得到的cas3表达载体和按步骤(2)得到的基因编辑载体导入感受态细胞或原生质体中，得到基因编辑重组子；对重组子染色体基因进行PCR和基因测序和/或功能分析，以确证编辑后的目的重组子。
所述的基因cas3表达载体指化学和生物合成的由质粒、病毒等核酸载体和能表达Cas3的DNA序列所构成的Cas3表达载体。
所述的t-DNA指化学和生物合成的按所需遗传功能设计的t-DNA片段，该片段分别与Cas3表达载体或基因编辑载体结合或独立存在。
所述的g-DNA指化学或生物合成的可转录得到crRNA的g-DNA片段，该片段可分别结合到Cas3表达载体或基因编辑载体中。
所述的所有生物的遗传物质指包括原核生物细胞、真核生物细胞及无细胞结构的病毒中的遗传物质。
所述的Cas3的基因编辑指Cas3即可通过crRNA导向也可通过t-DNA定位对目标DNA进行专一性切割。
所述的基因编辑指对生物遗传物质DNA进行的敲除、***、无痕点突变及任意组合。
有益效果
本发明是一种基于维吉尼亚链霉菌IBL14染色体中的I-B型CRISPR-Cas***的基因cas3所建立的一种新的基因编辑***，首次实现了I型CRISPR-Cas***对生物细胞基因组的基因编辑，为II型商业化Cas9所构建的基因编辑***提供了新的补充和选择。该***中Cas3即可通过crRNA导向也可通过t-DNA定位对目标DNA进行专一性切割。应用该***可对原核和真核生物基因组进行无误、简单、快速的基因编辑。优化后的该基因编辑***因其分子量小且能通过DNA导向可望在许多领域中优于已商业化的基于Cas9所构建的基因编辑***。
附图说明
图1、pCas-cas3与pKC1139-t/g-ΔlacZ构建图。(A)为Cas3表达载体pCas-cas3，含Cas3蛋白基因与卡那霉素(KanR)抗性基因；(B)为基因编辑载体pKC1139-t/g-ΔlacZ，含t-ΔlacZ基因编辑片段与g-ΔlacZ靶向基因片段。
图2、蓝白斑筛选与PCR验证。(A)为E.coli JM109(DE3)蓝白斑筛选，蓝色表明为原始菌株，白色表明为重组菌株；(B)为基因lacZ外部PCR电泳图，泳道L：5000bp DNA ladder，泳道C：E.coliJM109(DE3)原始菌株基因组中lacZ基因PCR，泳道G：基因编辑突变株基因组中lacZ基因PCR。
图3、基因编辑重组子E.coli JM109(DE3)-ΔlacZ的测序结果。
具体实施方式
为了更充分理解本发明的技术内容，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步介绍和说明，旨在更好的解释本发明的内容，以下实施例不限制本发明的保护范围。此外，在所列实施例中如无特别说明均采用如下材料：
1)菌株与载体
2)缓冲液与培养基
400mL LiAc/DTT/TE缓冲液
4.088g LiAc·2H2O(0.1M)，0.48456g Tris(10mM，pH7.5)，0.1169g EDTA(1mM)，300mL ddH2O溶解，HCL调pH至7.5，定容至400mL，115℃/30min灭菌；0.617g DTT于5ml蒸馏水过滤灭菌后加入。
LB培养基
酵母粉5g，蛋白胨10g，NaCL 10g，加入适量自来水溶解后，定容至1L，pH调至7.0～7.2，分装包扎后,，121℃/20min灭菌(固体培养基：补加15-20g琼脂)。
Spizizen基本培养基
10×Spizzen基本盐培养基100mL/L，50％(w/v)葡萄糖10mL/L，色氨酸母液(5mg/mL)10m L/L，琼脂1.5％w/v)，121℃/20min灭菌。
GM1培养基(5mL)
40％葡萄糖100μL，20mg/mL酸水解酪素100μL，50mg/m L酵母抽提物100μL，20％(w/w)MgSO4.7H2O 5μL，10×Spizzen基本培养基500μL，水3195μL，上述物质混合前需121℃/20min灭菌。
GM2培养基(5mL)
40％葡萄糖100μL，20mg/mL酸水解酪素50μL，20％(w/w)MgSO4.7H2O40μL，10×Spizzen基本培养基500μL，水3310μL，上述物质混合前需121℃/20min灭菌。
YPD培养基
1％(W/V)酵母膏，2％蛋白胨,2％葡萄糖，定容至1升，分装包扎后,115℃灭菌30min(固体培养基，加1.5％w/v琼脂粉)。
ΔAA选择培养基
0.17gYNB(Yeast Nitrogen Base without Amino Acids)，0.5g(NH4)2SO4，2g葡萄糖，18.2g山梨醇、1.5％琼脂粉，加ddH2O至99.6mL，115℃灭菌30min，培养基使用前加入400μLΔAA[ΔAA配方：(1)100mLΔLeu-AA：0.5g Met,0.5g His,0.5g Ura，加ddH2O至100mL，0.22μm滤膜过滤除菌；(2)100mLΔUra-AA：0.5g Met,0.5g His,0.5g Leu，加ddH2O至100mL，0.22μm滤膜过滤除菌；(3)100mLΔLeu-AA：0.5g Met,0.5g His，加ddH2O至100mL，0.22μm滤膜过滤除菌。
100mL液体培养基
0.17gYNB，0.5g(NH4)2SO4，2g葡萄糖，加ddH2O至99.6mL，115℃灭菌30min(使用前加入400μLΔAA,ΔAA配方同上)。
100mL SC-raffinose诱导培养基
0.17gYNB,0.5g(NH4)2SO4,2g半乳糖,1g棉子糖，加ddH2O至99.6mL，115℃灭菌30min(使用前加入400μLΔAA，ΔAA配方同上)。
DMEM培养基：无水氯化钙.2H2O 265mg/L、硝酸铁.9H2O 0.10mg/L、氯化钾400.0mg/L、无水硫酸镁97.67mg/L、氯化钠6400.0mg/L、无水磷酸二氢钠109.0mg/L、丁二酸75.0mg/L、丁二酸钠100.0mg/L、L-盐酸精氨酸84.0mg/L、L-盐酸胱氨酸63.0mg/L、甘氨酸30.0mg/L、L-盐酸组氨酸42.0mg/L、L-异亮氨酸105.0mg/L、L-亮氨酸105.0mg/L、L-盐酸赖氨酸146.0mg/L、L-甲硫氨酸30.0mg/L、L-苯丙氨酸66.0mg/L、L-丝氨酸42.0mg/L、L-苏氨酸95.0mg/L、L-色氨酸16.0mg/L、L-酪氨酸72.0mg/L、L-缬氨酸94.0mg/L、D-泛酸钙4.0mg/L、酒石酸胆碱7.20mg/L、叶酸4.0mg/L、肌醇7.2mg/L、烟酰胺4.0mg/L、核黄素0.40mg/L、盐酸硫胺4.0mg/L、盐酸吡哆辛4.0mg/L、葡萄糖4500.0mg/L、丙酮酸钠110.0mg/L、酚红9.3mg/L。
所用试剂均为市售品。
实施例1 EC JM109(DE3)中lacZ基因的敲除
(1)Cas3表达载体pCas-cas3的构建
根据SV IBL14基因cas-3及载体pCas的DNA序列信息，设计带有与载体pCas互补的基因cas3的特异性正向引物pCas-cas3-F和反向引物pCas-cas3-R。提取SV IBL14基因组DNA，通过常规PCR扩增基因cas3,PCR反应体系(50μL)包括：5μL 10×Pfu buffer,5μLdNTPs(2.5mM each)，1μL 10μM cas3-F，1μL 10μM cas3-R，5μL DMSO，0.5μL Pfu DNAPolymerase，0.5μL SV IBL14基因组DNA，32μL无菌水(nuclease-free)，反应条件：95℃5min，94℃60±30s，55±3℃30s，72℃90±30s，2.5±0.5U DNA聚合酶(TransStartFastPfu DNA Polymerase，全式金生物技术有限公司)，30个循环，72℃10min。PCR产物经1％琼脂糖电泳检测，试剂盒回收，得纯化的cas3全长基因。将纯化的cas3与载体pKD-46连接，得Cas3表达载体pCas-cas3(图1A)。
(2)基因编辑载体pKC1139-t/g-ΔlacZ的构建
(A)t-ΔlacZ的制备
根据EC JM109(DE3)基因组测序信息，设计并合成基因lacZ特异性引物lacZ-F和lacZ-R，提取EC JM109(DE3)基因组DNA，通过方法同步骤(1)的常规PCR扩增基因lacZ。PCR产物经1.5％琼脂糖电泳检测，试剂盒回收，得纯化的lacZ基因DNA备用；根据lacZ基因序列设计并合成可用于通过overlap PCR连接上、下游同源臂的lacZ基因上游同源臂引物lacZ-UF/UR和下游同源臂引物lacZ-DF/DR，以纯化的lacZ基因DNA为模板，通过方法同步骤(1)的常规PCR扩增基因lacZ上、下游同源臂，PCR产物经1.5％琼脂糖电泳检测，试剂盒回收，得纯化后的上、下游同源臂DNA片段备用；用50μL反应体系的overlap PCR扩增基因编辑模板t-ΔlacZ，该overlapPCR反应体系包括：5μL 10×Pfu buffer,5μL dNTPs(2.5mM each)，1μL10μM正向引物，1μL 10μM反向引物，5μL DMSO，0.5μL Pfu DNA Polymerase，0.5μL+0.5μL的上、下游同源臂DNA，31.5μL无菌水(nuclease-free)，反应条件：95℃5min，94℃60±30s，55±3℃30s，72℃90±30s，2.5±0.5U DNA聚合酶(一个循环后加入引物UF与DR各1μL)，继续30个循环，72℃10min。1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物并纯化，得纯化后的上、下游同源臂相连接的基因编辑模板t-ΔlacZ。合成的t-ΔlacZ序列表见表1：
表1 t-ΔlacZ序列
(B)g-ΔlacZ的制备
设计并化学合成顺序包含限制性酶缺位点(BamHI)、转录启动子、crDNA(由repeat和spacer组成)、转录终止子和限制性酶缺位点(EcoRI)组成的靶向基因片段g-ΔlacZ。合成的g-ΔlacZ序列表见表2，表中大写字母代表酶切位点；虚线代表互补区；单下划线代表启动子；双下划线代谢终止子；斜体字母代表spacer；粗体字母代表repeat。
表2 g-ΔlacZ序列
(C)pKC1139-t/g-ΔlacZ的制备
将按步骤(2)(A)和(B)制备得到的t-ΔlacZ与g-ΔlacZ片段酶切后通过T4连接酶分别连接到载体pKC1139上，转化到E.coli DH5α中得基因编辑载体pKC1139-t/g-ΔlacZ(图1B)；
(3)基因编辑重组子EC JM109(DE3)-ΔlacZ的构建与验证
(A)EC JM109(DE3)感受态的制备
用已灭菌的牙签从平板上挑取EC JM109(DE3)单克隆于30ml LB液体培养基中，37±5℃，200±100rpm过夜培养；100±50μl过夜培养液转接至新的LB液体培养基中，37±5℃，200±100rpm培养约3±1h，至菌液OD600值为0.4～0.6；取1mL上述菌液至1.5mL EP管中，4℃下5000rpm离心5min，去除上清液，用50μL冰上预冷的SSCS溶液将菌体沉淀吹打均匀，即得EC JM109(DE3)的感受态细胞，-80℃下保存备用(此过程全程在冰上进行)。
(B)pCas-cas3和pKC1139-t/g-ΔlacZ的共转化
将载体pCas-cas3和pKC1139-t/g-ΔlacZ充分混匀后转化到EC JM109(DE3)感受态中，在涂有5μL异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG 200mg/mL)、40μL5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal 20mg/mL)和20μL***糖(10mM/L)的安普霉素和氨苄青霉素抗性的LB固体培养基中30℃过夜培养，得转化子。
(C)重组子染色体PCR和基因测序分析
挑取白色单克隆进行培养(图2A)，提取DNA基因组为模板，再以lacZ基因验证引物lacZ-F/lacZ-R进行PCR扩增反应，通过方法同步骤(1)的常规PCR扩增基因编辑的模板DNA。PCR产物经1％琼脂糖电泳检测，验证扩增条带分子量大小(图2B)，测序(通用生物***(安徽)有限公司)结果显示上游同源UHA与下游同源DHA的交汇点在389-390bp，与t-ΔlacZ基因编辑片段序列一致，表明基因编辑得到的重组子正确，lacZ基因敲除成功(图3)。
各步骤所涉及的引物及其序列如表3所示，表中大写字母代表酶切位点；虚线代表互补区。
表3引物及其序列
实施例2 BS 168中ldh基因的敲除及氯霉素抗性基因cat的***
(1)Cas3表达载体pHT304-cas3的构建
根据SV IBL14基因cas3及载体pHT304的DNA序列信息，设计带有与载体pHT304互补的基因cas3的特异性正向引物和反向引物PHT304-cas3-F/R，其余步骤同实施例1步骤(1)。
(2)基因编辑载体pKC1139-t/g-Δldh::cat的构建
根据BS 168基因ldh序列设计g-Δldh及设计***至ldh基因上、下游同源臂之间表达氯霉素抗性酶基因cat序列的t-Δldh::cat，其余步骤同实施例1步骤(2)。
合成的t-Δldh::cat序列见表4，表中单下划线代表启动子；双下划线代谢终止子。
表4 t-Δldh::cat序列表
合成的g-Δldh序列见表5，表中大写字母代表酶切位点；单下划线代表启动子；双下划线代谢终止子；斜体字母代表spacer；粗体字母代表repeat。
表5 g-Δldh序列表
(3)基因编辑重组子BS 168-Δldh::cat的构建与验证
(A)BS168感受态的制备
挑取BS168单克隆于5mL GM1培养基中，37℃，130rpm过夜培养。次日转接过夜培养液1mL于9mL GM1培养基中，37℃，200rpm，3.5h。取5mL GM1培养液于45mL GM2培养基中，37℃，130rpm，1.5h。4℃，4000rpm，离心10min。留适量上清重悬细胞，分装到2mL EP管中得BS168感受态备用。
(B)pHT304-cas3和pKC1139-t/g-Δldh::cat的共转化
将载体pHT304-cas3和pKC1139-t/g-Δldh::cat混匀后加入到BS168感受态中，37℃静置1h，220rpm培养3-4h。吸取适量菌液涂布到含有Cm抗性的LB培养基上，于37℃培养箱培养。
(C)重组子染色体PCR和基因测序分析
于含有Cm抗生素的LB平板上挑取单克隆，37℃，200rpm，过夜培养。次日提取基因组进行PCR，产物经1％琼脂糖电泳检测，观察重组子染色体DNA扩增条带大小的改变，并经基因测序证明BS168-ldh基因敲除及氯霉素抗性基因***成功。
各步骤所涉及的引物及其序列如表6所示，表中大写字母代表酶切位点；虚线代表互补区。
表6引物及其序列
实施例3 SC BY4741crtE基因的双质粒敲除
(1)Cas3表达载体pRS415-cas3的构建
除根据载体pRS415的DNA序列信息，设计带有与载体pRS415互补的基因cas3的特异性正向引物和反向引物pRS415-cas3-F/R及基因cas3上游为gal1启动子，下游末端带有核定位信号序列及CYC1终止子，其余步骤同实施例1步骤(1)。
(2)基因编辑载体pYES2-NTA-t/g-ΔcrtE的构建
除根据SC BY4741crtE基因序列设计g-ΔcrtE及设计并合成t-ΔcrtE外，其余步骤同实施例1步骤(2)。
合成的t-ΔcrtE序列见表7。
表7 t-ΔcrtE序列表
合成的g-ΔcrtE序列见表8，表中大写字母代表酶切位点；单下划线代表启动子；双下划线代谢终止子；斜体字母代表spacer；粗体字母代表repeat。
表8 g-ΔcrtE序列
(3)基因编辑重组子SC BY4741-ΔcrtE的构建与验证
(A)SC BY4741感受态的制备
用已灭菌的牙签从平板上挑取SC BY4741单克隆于50ml YPD液体培养基中30℃200rpm培养至OD600 1.3-1.5，冰上放置10min后8000rpm离心5min，沉淀部分加入25mLddH2O，5000rpm 5min离心洗涤，沉淀再加入25mL山梨醇(1M)5000rpm 5min离心洗涤，洗涤后的沉淀先加入2mL LiAc/DTT/TE缓冲液悬浮，再加入25mL该缓冲液，用封口膜封住，30℃培养30min，后5000rpm5min离心收集菌体；菌体用1mL ddH2O悬浮并转接至1.5mL EP管中，4000rpm离心3min；沉淀用1mL冰山梨醇悬浮，4000rpm 3min离心洗涤，洗涤后的细胞加入100-200μL山梨醇悬浮并分装即得感受态细胞，置于-80度保存待用(整个操作于4℃条件下进行)。
(B)SC BY4741-ΔcrtE的转化子获得
在100μL酵母感受态中加入3-10μL的pRS415-cas3，转入电转杯(2mM)中，混匀后于冰上静置5min，电击(1.5kV,5S)后立即加入900μL冰山梨醇，混匀后取1-100μL涂板(选择培养基ΔLeu-AA：Met、His、Ura)，30℃培养3天，将选择性平板上长出的PCR验证后的转化子SCBY4741-pRS415-cas3用平板或甘油管保存；得到的SC BY4741-pRS415-cas3转化子用SC-raffinose诱导蛋白Cas3表达(25℃200rpm诱导1天，再30℃200rpm诱导1天)，诱导的菌株按实施例3(3)(A)制备感受态，得到SC BY4741-pRS415-cas3感受态细胞用pYES2-t/g-crtE质粒按上面制备转化子SC BY4741-pRS415-cas3的方法进行转化，得潜在的SC BY4741-ΔcrtE的转化子。
(C)重组子染色体PCR和基因测序分析
挑取单克隆于YPD液体培养基中30℃200rpm培养1-2天，以提取的基因组DNA为模板，并以crtE基因验证引物crtE-F/crtE-R进行PCR扩增反应，按同实施例1(1)的电泳及测序方法，证明crtE基因敲除成功。
各步骤所涉及的引物及其序列如表9所示，表中大写字母代表酶切位点；虚线代表互补区。
表9引物及其序列
实施例4 SC BY4741crtE基因的单质粒敲除
(1)Cas3表达载体pRS415-cas3的构建
步骤同实施例3步骤(1)。
(2)基因编辑片段t-ΔcrtE的构建
步骤同实施例3步骤(2)中t-ΔcrtE的构建。
(3)基因编辑重组子SC BY4741-ΔcrtE的构建与验证
(A)SC BY4741感受态的制备
步骤同实施例3步骤(3)(A)。
(B)SC BY4741-ΔcrtE的转化子获得
除将t-ΔcrtE片段与pRS415-cas3同时转化SC BY4741感受态细胞外，其余步骤同实施例3步骤(3)(B)。
(C)重组子染色体PCR和基因测序分析
步骤同实施例3步骤(3)(C)。
实施例5 HEK293中drosha基因的敲除及潮霉素B抗性基因hyg的***
(1)Cas3表达载体pCAS9-BFP-cas3的构建
除用实施例3中SV IBL14碱基优化后的基因cas3序列外，其余步骤同实施例1中步骤(1)。
(2)基因编辑载体pUC19-t/g-Δdrosha::hyg
除根据HEK293的drosha基因序列和pUC19载体序列设计g-Δdrosha及***至drosha基因上、下游同源臂之间表达潮霉素B(Hygromycin B)抗性基因hygR(源于质粒pSilencer2.1-U6hygro)的t-Δdrosha::hyg外，其余步骤同实施例1中步骤(2)。
合成的t-Δdrosha::hyg序列见表10。
表10 t-Δdrosha::hyg序列表
合成的g-Δdrosha序列见表11，表中单下划线代表启动子；双下划线代谢终止子；斜体字母代表spacer；粗体字母代表repeat。
表11 g-Δdrosha序列表
(3)基因编辑重组子HEK293-Δdrosha::hyg的构建与验证
将HEK293细胞接种于含DMEM培养基的6孔板中，37℃培养，待细胞汇合率达80％时，将构建好的载体pCAS9-BFP-cas3(1μg)和pUC19-t/g-Δdrosha::hyg(1.5μg)共转染HEK293细胞(Lipofectamine 2000转染试剂)，6小时后更换新鲜细胞培养液，5天后将转染的HEK293细胞接种到大的细胞培养皿中(1×106个/皿)，1天后加入潮霉素B(300μg/mL)，此后每2-3天更换一次新鲜的含潮霉素B的培养基，加入潮霉素B后约10-15天，将细胞培养皿中出现的肉眼可见的单克隆接种传代到另一6孔板中，待细胞培养长满于抗性板上时，提取基因组进行PCR，经1％琼脂糖电泳检测，观察重组子染色体DNA扩增条带大小的改变，并经基因测序证明HEK293细胞drosha基因敲除及潮霉素B抗性基因***成功。
各步骤所涉及的引物及其序列如表12所示，表中虚线代表互补区。
表12引物及其序列
以上所述仅以实施例来进一步说明本发明的技术内容，以便于读者更容易理解，但不代表本发明的实施方式仅限于此，任何依本发明所做的技术延伸或再创造，均受本发明的保护。
序列表
<110> 安徽大学
<120> 一种基于I-B型CRISPR-Cas***基因cas3的基因编辑方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2316
<212> DNA
<213> S. virginiae IBL14
<400> 1
gtgggccgtc tggacgcggt ggaggacgtc ttcggcggca ggttctggcc cgtcgtggaa 60
ctcgctggcc tcacccacga cgccggcaag attcccgaag gcttccagcg gatgctggcg 120
ggatacagcc gtgcctgggg tgagcgtcac gaagtcgcct cgttgggctt cctgcccgcg 180
ctcatcggcg acccggacgt gctgttgtgg gtggcgaccg cggtcgccac ccaccatcgt 240
ccgctgaccg gccagaacgg acgcgacctg cagactctct acagcggtgt caccatcacc 300
gagctcgcgc accgtttcgg gccttttgac ccacgcgctg tccccgcctt ggaggcctgg 360
cttcgtgcga gcgccatccg ggtcggcctc cccgcggccg ctgttccaga cgacggcacg 420
ctcaccgaca ccggagtggt cgctggcgcc caccagctgc tggaggagat tttggaccgt 480
tgggcagacc gtgtgaggcc tgaggtgggc ttggccgctg tactgctgca gggggcggtc 540
accctggccg accacttgtc ctccgcccat caggctctgc ccaccgtcca gccgttgggg 600
gccgggttcc ggtcccggtt ggagaaggag ttcgctgaac gcggcaggac cctgcgtgcc 660
caccagctgg aggccgccac cgttaccgga catcttctgc tgcgcgggcc gaccggcagt 720
gggaagaccg aggctgccct gctgtgggct gccagccagg tcgaggccct gaaggcggaa 780
ggccggggcg tgccgcgtgt gtttttcact ctcccctacc tggcctccat caacgccatg 840
gcaacacggc tgggtgacac tctcggcgat ggtgaggctg tcggcgttgc ccactcccgc 900
gccgcctcct accaccttgc ccaggccatc gccccgcagg acggcgacga ggaggacgaa 960
cacggagccc cctgccgtgt tgacgcggcc gccaaggcct tgtcccgggc cgctgccacc 1020
aagctgttcc gcgagagtgt ccgcgtcgcc accccctacc agcttctgcg ggccgccctg 1080
gccgggccgg cccactccgg catcctcatc gacgccgcga actcggtgtt catcctggac 1140
gaactccacg cctacgacgc ccgcaggctc ggctacatcc tggccagtgc ccggctgtgg 1200
gaacgcctcg gtggacggat cacagtcctg tccgcgaccc tgcccagggc cctggccgac 1260
ctgttcgaga gcaccctcac cgcccccatc accttcctcg acacccccga cctcgggctg 1320
ccggcgcgcc acctcctgca cacccgaggc caccatctca ccgacccggc cacactggag 1380
gagatccgtc tgcggctgtc ccgggacgag tcggtcctgg tgatcgccaa caacgtgtcc 1440
caggccatcg ccctgtacga acagctcgca cccgacgtgt gtgaacgctt cggtcaggac 1500
gccgcgctac tgctgcactc ccggtttcga cggatggacc ggtcccggat tgagcagaag 1560
atcgccgacc ggttcgccac tgtggcacct gatgcccaga acagccgtaa gccgggcctg 1620
gtcgttgcca cgcaggtggt cgaggtcagt ctcgacgtcg acttcgatgt gctgttcact 1680
ggagcggctc cgctcgaggc cctcctgcag cgcttcggcc ggaccaaccg cgtcggggcc 1740
cgcccgccgg ccgacgtcat cgtccaccat cccgcctgga ccacacgccg ccgacagccc 1800
ggcgagtacg ccgacggcat ctacccacgg gagccggtcg agtccgcgtg gcacatcctc 1860
acccgcaatc acgggcgagt catcgacgaa gcggacgcca ccgcgtggct ggacgaggtc 1920
tacgccacgg actggggcag gcaatggcac cgcgaggtgc tggagcggcg agaaagattc 1980
gaccgtgcgt tcctgcagtt ccgctacccc ttcgaagacc gcactgacct ggccgatacc 2040
ttcgacgaac tcttcgacgg ctccgaagcc atcctcgccg aagaccagga cgcctactca 2100
gccgcactgg ccgcaccaga cggcgaccac cccggagctg gccggctcct cgcagaggaa 2160
tacctcatcc ccgttcccca ctgggccagc cccctcagcc gctacgagaa gcagctcaaa 2220
gtccgcgtca tcaacggcga ctaccacccc gaccacggcc tcatggcggt ccgggggctg 2280
ccccagcccg cctaccgcgc cggggaggtc ttgtga 2316
<210> 2
<211> 770
<212> PRT
<213> S. virginiae IBL14
<400> 2
Val Gly Arg Leu Asp Ala Val Glu Asp Val Phe Gly Gly Arg Phe Trp
1 5 10 15
Pro Val Glu Leu Ala Gly Leu Thr His Asp Ala Gly Lys Ile Pro Glu
20 25 30
Gly Phe Gln Arg Met Leu Ala Gly Tyr Ser Arg Ala Trp Gly Glu Arg
35 40 45
His Glu Val Ala Ser Leu Gly Phe Leu Pro Ala Leu Ile Gly Asp Pro
50 55 60
Asp Val Leu Leu Trp Val Ala Thr Ala Val Ala Thr His His Arg Pro
65 70 75 80
Leu Thr Gly Gln Asn Gly Arg Asp Leu Gln Thr Leu Tyr Ser Gly Val
85 90 95
Thr Ile Thr Glu Leu Ala His Arg Phe Gly Pro Phe Asp Pro Arg Ala
100 105 110
Val Pro Ala Leu Glu Ala Trp Leu Arg Ala Ser Ala Ile Arg Val Gly
115 120 125
Leu Pro Ala Ala Ala Val Pro Asp Asp Gly Thr Leu Thr Asp Thr Gly
130 135 140
Val Val Ala Gly Ala His Gln Leu Leu Glu Glu Ile Leu Asp Arg Trp
145 150 155 160
Ala Asp Arg Val Arg Pro Glu Val Gly Leu Ala Ala Val Leu Leu Gln
165 170 175
Gly Ala Val Thr Leu Ala Asp His Leu Ser Ser Ala His Gln Ala Leu
180 185 190
Pro Thr Val Gln Pro Leu Gly Ala Gly Phe Arg Ser Arg Leu Glu Lys
195 200 205
Glu Phe Ala Glu Arg Gly Arg Thr Leu Arg Ala His Gln Leu Glu Ala
210 215 220
Ala Thr Val Thr Gly His Leu Leu Leu Arg Gly Pro Thr Gly Ser Gly
225 230 235 240
Lys Thr Glu Ala Ala Leu Leu Trp Ala Ala Ser Gln Val Glu Ala Leu
245 250 255
Lys Ala Glu Gly Arg Gly Val Pro Arg Val Phe Phe Thr Leu Pro Tyr
260 265 270
Leu Ala Ser Ile Asn Ala Met Ala Thr Arg Leu Gly Asp Thr Leu Gly
275 280 285
Asp Gly Glu Ala Val Gly Val Ala His Ser Arg Ala Ala Ser Tyr His
290 295 300
Leu Ala Gln Ala Ile Ala Pro Gln Asp Gly Asp Glu Glu Asp Glu His
305 310 315 320
Gly Ala Pro Cys Arg Val Asp Ala Ala Ala Lys Ala Leu Ser Arg Ala
325 330 335
Ala Ala Thr Lys Leu Phe Arg Glu Ser Val Arg Val Ala Thr Pro Tyr
340 345 350
Gln Leu Leu Arg Ala Ala Leu Ala Gly Pro Ala His Ser Gly Ile Leu
355 360 365
Ile Asp Ala Ala Asn Ser Val Phe Ile Leu Asp Glu Leu His Ala Tyr
370 375 380
Asp Ala Arg Arg Leu Gly Tyr Ile Leu Ala Ser Ala Arg Leu Trp Glu
385 390 395 400
Arg Leu Gly Gly Arg Ile Thr Val Leu Ser Ala Thr Leu Pro Arg Ala
405 410 415
Leu Ala Asp Leu Phe Glu Ser Thr Leu Thr Ala Pro Ile Thr Phe Leu
420 425 430
Asp Thr Pro Asp Leu Gly Leu Pro Ala Arg His Leu Leu His Thr Arg
435 440 445
Gly His His Leu Thr Asp Pro Ala Thr Leu Glu Glu Ile Arg Leu Arg
450 455 460
Leu Ser Arg Asp Glu Ser Val Leu Val Ile Ala Asn Asn Val Ser Gln
465 470 475 480
Ala Ile Ala Leu Tyr Glu Gln Leu Ala Pro Asp Val Cys Glu Arg Phe
485 490 495
Gly Gln Asp Ala Ala Leu Leu Leu His Ser Arg Phe Arg Arg Met Asp
500 505 510
Arg Ser Arg Ile Glu Gln Lys Ile Ala Asp Arg Phe Ala Thr Val Ala
515 520 525
Pro Asp Ala Gln Asn Ser Arg Lys Pro Gly Leu Val Val Ala Thr Gln
530 535 540
Val Val Glu Val Ser Leu Asp Val Asp Phe Asp Val Leu Phe Thr Gly
545 550 555 560
Ala Ala Pro Leu Glu Ala Leu Leu Gln Arg Phe Gly Arg Thr Asn Arg
565 570 575
Val Gly Ala Arg Pro Pro Ala Asp Val Ile Val His His Pro Ala Trp
580 585 590
Thr Thr Arg Arg Arg Gln Pro Gly Glu Tyr Ala Asp Gly Ile Tyr Pro
595 600 605
Arg Glu Pro Val Glu Ser Ala Trp His Ile Leu Thr Arg Asn His Gly
610 615 620
Arg Val Ile Asp Glu Ala Asp Ala Thr Ala Trp Leu Asp Glu Val Tyr
625 630 635 640
Ala Thr Asp Trp Gly Arg Gln Trp His Arg Glu Val Leu Glu Arg Arg
645 650 655
Glu Arg Phe Asp Arg Ala Phe Leu Gln Phe Arg Tyr Pro Phe Glu Asp
660 665 670
Arg Thr Asp Leu Ala Asp Thr Phe Asp Glu Leu Phe Asp Gly Ser Glu
675 680 685
Ala Ile Leu Ala Glu Asp Gln Asp Ala Tyr Ser Ala Ala Leu Ala Ala
690 695 700
Pro Asp Gly Asp His Pro Gly Ala Gly Arg Leu Leu Ala Glu Glu Tyr
705 710 715 720
Leu Ile Pro Val Pro His Trp Ala Ser Pro Leu Ser Arg Tyr Glu Lys
725 730 735
Gln Leu Lys Val Arg Val Ile Asn Gly Asp Tyr His Pro Asp His Gly
740 745 750
Leu Met Ala Val Arg Gly Leu Pro Gln Pro Ala Tyr Arg Ala Gly Glu
755 760 765
Val Leu
770

Claims (7)

1.一种基于I-B型CRISPR-Cas***基因cas3的基因编辑方法，其特征在于：包括维吉尼亚链霉菌IBL14中基因cas3构建的蛋白Cas3表达载体与包含t-DNA和/或g-DNA的基因编辑载体所组成的基因编辑工具对所有生物的遗传物质进行基因编辑。
2.根据权利要求1所述的一种基于I-B型CRISPR-Cas***基因cas3的基因编辑方法，其特征在于，步骤如下：
（1）Cas3表达载体的构建
基于维吉尼亚链霉菌IBL14基因cas3序列信息设计引物，以维吉尼亚链霉菌IBL14基因组为模板，通过PCR反应扩增得到cas3基因，并连接到载体上，得到Cas3表达载体；
（2）基因编辑载体的构建
（A）根据靶向基因序列信息设计引物，以靶向生物基因组为模板，设计并通过PCR合成由靶向基因上、下游同源臂和所需遗传功能信息组成的t-DNA片段；
（B）根据生物靶向基因序列信息设计并化学合成顺序包含限制性酶缺位点、转录启动子、转录crRNA的crDNA、转录终止子和限制性酶缺位点组成的g-DNA片段；
（C）分别将制备得到的t-DNA片段和g-DNA片段连接到载体上，得基因编辑载体；
（3）基因编辑重组子的构建与验证
制备感受态细胞或原生质体，并将步骤（1）得到的Cas3表达载体和步骤（2）得到的基因编辑载体导入感受态细胞或原生质体中，得到基因编辑重组子；对重组子染色体基因进行PCR和基因测序和/或功能分析，以确证编辑后的目的重组子。
3.根据权利要求1或2所述的一种基于I-B型CRISPR-Cas***基因cas3的基因编辑方法，其特征在于：所述t-DNA指化学或生物合成的按所需遗传功能设计的t-DNA片段，分别与Cas3表达载体或基因编辑载体结合或独立存在。
4.根据权利要求1或2所述的一种基于I-B型CRISPR-Cas***基因cas3的基因编辑方法，其特征在于：所述的g-DNA指化学或生物合成的可转录得到crRNA的g-DNA片段，分别结合到Cas3表达载体或基因编辑载体中。
5.根据权利要求1所述的一种基于I-B型CRISPR-Cas***基因cas3的基因编辑方法，其特征在于：所述的所有生物的遗传物质包括原核生物细胞、真核生物细胞及无细胞结构的病毒中的遗传物质。
6.根据权利要求1所述的一种基于I-B型CRISPR-Cas***基因cas3的基因编辑方法，其特征在于：所述的基因编辑是通过crRNA导向或t-DNA定位对目标DNA进行专一性切割。
7.根据权利要求1所述的一种基于I-B型CRISPR-Cas***基因cas3的基因编辑方法，其特征在于：所述基因编辑指对生物遗传物质DNA进行的敲除、***、无痕点突变及任意组合。
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