CN107557370B - 水稻rel1基因在提高植物抗干旱胁迫中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了水稻REL1基因在提高植物抗干旱胁迫中的应用。适度的叶片卷曲和合理的叶夹角利于水稻在胁迫条件下的存活和发育，为拓展REL1基因在水稻抗干旱胁迫中的应用，本发明采对野生型、rel1突变体和超表达REL1水稻材料进行干旱胁迫处理，以叶片内卷和SOD活性变幅作为监控指标，证明rel1突变体和超表达REL1水稻相对于野生型的抗干旱胁迫能力均有提高；同时对5个抗旱基因进行表达分析，从生理和分子学上证明REL1基因表达量的上调能提高水稻对干旱胁迫的抗性。本发明通过增加REL1基因表达量来增强水稻的抗干旱胁迫能力，为水稻抗旱性的遗传改良和分子育种提供新选择。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及水稻REL1基因在提高植物抗干旱胁迫中的应用。
背景技术
叶片形态影响水稻的光合作用能力和蒸腾作用，是理想株型的重要组成部分。植物叶片通常极化成近-远轴端，因此在不良条件下会形成两种不同的叶片形态：远轴卷曲和近轴卷曲。
水稻rel1突变体表现为叶片向外卷曲、叶角度增大，株高和产量下降。电镜观察显示rel1的表型是由于泡状细胞的大小和数量增加所导致的。REL1基因由两个外显子和一个内含子组成，编码一个未知蛋白，在单子叶植物中高度保守。敲减rel1突变体中的REL1表达量能使表型恢复，同时上调野生型中REL1的表达量，植株出现类似rel1突变体的表型，说明REL1正向调控叶片外卷和叶夹角。REL1蛋白定位在质体上，GUS染色结果表明，REL1在根、叶和花序中组成型表达，尤其在成熟叶片中积累。REL1很可能通过调剂BR信号基因调控水稻叶片建成。
通常水稻叶片卷曲是由干旱胁迫，使上表皮的泡状细胞失水而导致的。而REL1引起的叶片卷曲的原因却是泡状细胞增大增多，因此，REL1基因是否有其他方面的功能或应用还未知。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供水稻REL1基因在提高植物抗干旱胁迫中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：水稻REL1基因在提高植物抗干旱胁迫中的应用，该水稻REL1基因在水稻基因组注释计划中基因编号为LOC_Os01g64380。
所述的植物优选为单子叶植物。
所述的单子叶植物为水稻；优选为水稻品种中花11。
含有水稻REL1基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒在提高植物抗旱胁迫中的应用。
水稻REL1基因在培育抗干旱胁迫水稻中的应用。
所述的水稻REL1基因在培育抗干旱胁迫水稻中的应用，通过如下方法实现：在水稻中提高REL1基因的表达量，以提高水稻的抗干旱胁迫能力。
所述的在水稻中提高REL1基因的表达量优选为通过如下方法实现：提高水稻内源REL1基因的表达，或在水稻中超量表达外源REL1基因。
所述的提高水稻内源REL1基因的表达为将T-DNA***REL1基因的3’端，使水稻内源REL1基因的表达量上升。
所述的在水稻中超量表达外源REL1基因为通过转基因技术将带有超量表达REL1基因的载体转入水稻中，使外源REL1基因在水稻中超量表达。
含有水稻REL1基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒在培育抗干旱水稻中的应用。
水稻REL1基因在提高水稻抗旱基因表达量中的应用，提高REL1基因的表达量，可使抗旱基因的表达量上升。
所述的抗旱基因包括LOC_Os05g12400，LOC_Os05g12640，LOC_Os10g26940，LOC_Os11g06980和LOC_Os03g20090。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明首先提出REL1基因在水稻抗干旱胁迫中的应用。为验证该基因在植物干旱胁迫反应中的作用，本发明对在正常条件下生长14天的野生型、rel1突变体和超表达REL1水稻施行不同浓度的PEG处理，野生型在较低浓度的PEG处理下出现叶片内卷，而rel1突变体和超表达REL1水稻在较高浓度的PEG处理下才出现叶片内卷。同时，对20％(w/w)PEG4000处理后4个时间点的超氧化物歧化酶(SOD)活性进行测定，rel1突变体和超表达REL1水稻的SOD活性变化幅度均大于野生型。本发明进一步测定5个抗旱相关基因在野生型、rel1突变体中的表达量差异，在rel1突变体中5个抗旱相关基因的表达量提高。这些结果表明，提高REL1表达量，能提高水稻对干旱胁迫的抵抗能力。
2、本发明提供的REL1在水稻抗干旱胁迫中的应用，适度的叶片卷曲和合理的叶夹角利于水稻在胁迫条件下的存活和发育。拓展REL1基因的应用范围，为水稻抗旱性的遗传改良和分子育种提供新选择。
3、本发明PEG处理模拟干旱胁迫，对野生型、rel1突变体和超表达REL1水稻材料进行干旱胁迫处理，以叶片内卷和SOD活性变化作为监控指标，研究REL1基因在水稻抗干旱胁迫中的作用，证明了rel1突变体和超表达REL1水稻比野生型的抗干旱胁迫能力均有提高。同时，对5个抗旱基因进行表达分析，从生理和分子学上证明REL1基因表达量的上调能提高水稻对干旱胁迫的抗性，说明通过增加REL1基因表达量来增强水稻的抗干旱胁迫能力是切实可行的。
附图说明
图1是实施例1中经不同浓度PEG处理后的叶片卷曲程度对比图。
图2是实施例2中经PEG处理后SOD活性测定结果图。
图3是实施例3中5个抗旱基因在野生型和rel1突变体中的表达差异图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
1、下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
2、本发明中涉及的野生型水稻为中花11。
3、(1)本发明中涉及的rel1突变体来源于以中花11为背景的T-DNA***突变体，该T-DNA***位置在于REL1基因的3’端；
(2)本发明中涉及的超表达REL1水稻(OE3)来源于利用转基因技术将带有超量表达REL1基因的载体转入中花11背景中；
rel1突变体和超表达REL1水稻(OE3)的制备方法可参考文献：Characterizationof Rolled and Erect Leaf 1in regulating leave morphology in rice，doi:10.1093/jxb/erv319。
实施例1PEG处理后叶片卷曲程度
水稻受干旱胁迫失水的典型表现为叶片出现内卷，为鉴定野生型(WT)、rel1突变体和超表达REL1(OE3)水稻的抗旱性对不同浓度PEG(聚乙二醇)处理后的叶片进行观察，具体步骤如下：
(1)野生型、rel1突变体和超表达OE3水稻在37℃发芽，随后转移到1/2MS培养基，在28℃，16小时光照(自然光)，8小时黑暗条件下培养14天。
(2)分别用0％，10％，20％，30％，40％(w/w)的PEG6000溶液处理步骤(1)中获得的植株24小时。
(3)观察处理后植株叶片横切面并分析结果。结果如图1所示，在0％PEG处理下，rel1突变体和超表达OE3均表现为叶片向外卷曲，WT既不内卷也不外卷。在10％(w/w)的PEG处理下，WT开始出现内卷，而rel1突变体和超表达OE3叶片只表现外卷程度降低，并在20％(w/w)的PEG处理下仍保持外卷。30％(w/w)的PEG处理下所有材料均出现内卷，但rel1突变体和超表达OE3的内卷程度低于WT。说明REL1表达量上升的rel1突变体和超表达OE3对干旱胁迫的敏感性低于野生型。
实施例2SOD活性测定
SOD活性被认为是抗旱性的一个重要指标。为鉴定野生型、rel1突变体和超表达REL1(OE3)水稻的抗旱性，对PEG处理后的SOD活性进行测定，具体步骤如下：
(1)水稻的栽培方法同实施例1。
(2)用20％(w/w)PEG6000溶液处理步骤(1)中获得的植株，在处理后3小时，6小时，12小时和24小时分别测定SOD活性。
(3)SOD活性测定结果分析。结果如图2所示，野生型、rel1突变体和超表达OE3均在处理后6小时SOD活性下降，并在12小时处出现峰值。在处理时间为3～6小时，6～12小时和12～24小时的3个过程中，SOD酶活性的上升幅度和下降幅大小依次排序均为:rel1＞OE3＞WT。
实施例3野生型和rel1突变体种抗旱基因的表达差异
为寻找导致rel1突变体表现抗旱表型的分子学证据，分别对野生型和rel1突变体中5个抗旱基因(LOC_Os05g12400，LOC_Os05g12640，LOC_Os10g26940，LOC_Os11g06980，LOC_Os03g20090)的表达量进行检测。具体步骤如下：
(1)Trizol法提取野生型和rel1突变体的RNA。
(2)用TransGen Biotech公司的TransScript First-Strand cDNA SynthesisSuperMix进行逆转录第一链(cDNA)合成，按说明书要求操作。
(3)用Takara公司的
Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)试剂盒对步骤(2)中合成的cDNA进行荧光定量PCR检测，其中，引物对分别为Primer1/2、Primer3/4、Primer5/6、Primer7/8、Primer9/10，内参引物对为Actin1/2，按说明书要求操作。
Primer1(5’-3’):TCCGACATGCCCACACTAAC；
Primer2(5’-3’):GCAGACAGGTGGTAGGCATT；
Primer3(5’-3’):GTGCGCAACTGAATGAAGCA；
Primer4(5’-3’):ATTTCGGGACAGAGGGGAGA；
Primer5(5’-3’):TGCCACTCGGTGCCTAAAAT；
Primer6(5’-3’):TGACCCAGGTCATAGAGCCA；
Primer7(5’-3’):TCTTCGCCCGTTTCTTTTGC；
Primer8(5’-3’):AACAGCAGGCAAGTAAGGGT；
Primer9(5’-3’):GGGCTGAAACGCACAGGCAAGA；
Primer10(5’-3’):CTGCTTGGCGTGCTTCTGC。
PCR反应过程为：95℃变性2min；循环(95℃变性15s，60℃退火1min)共40个循环；融解曲线分析，从65℃到95℃，每隔0.5℃停1s，读板1次。
(4)对野生型和rel1突变体中的5个抗旱基因的相对表达量进行分析。利用2△△Ct方法计算5个抗旱基因的相对表达量，结果显示，在rel1中5个抗旱基因的表达均高于野生型中的表达量(图3)。说明rel1突变体中REL1基因的表达量上升，使抗旱基因的表达量也上升，使rel1突变体的抗旱性提高。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 水稻REL1基因在提高植物抗干旱胁迫中的应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tccgacatgc ccacactaac 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcagacaggt ggtaggcatt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtgcgcaact gaatgaagca 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atttcgggac agaggggaga 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgccactcgg tgcctaaaat 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgacccaggt catagagcca 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcttcgcccg tttcttttgc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aacagcaggc aagtaagggt 20
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gggctgaaac gcacaggcaa ga 22
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctgcttggcg tgcttctgc 19
Claims (5)
1.水稻REL1基因在提高植物抗干旱胁迫中的应用，其特征在于：所述的植物为水稻。
2.水稻REL1基因在培育抗干旱胁迫水稻中的应用。
3.根据权利要求2所述的水稻REL1基因在培育抗干旱胁迫水稻中的应用，其特征在于：在水稻中提高REL1基因的表达量，以提高水稻的抗干旱胁迫能力。
4.根据权利要求3所述的水稻REL1基因在培育抗干旱胁迫水稻中的应用，其特征在于，所述的在水稻中提高REL1基因的表达量通过如下方法实现：提高水稻内源REL1基因的表达，或在水稻中超量表达外源REL1基因。
5.根据权利要求4所述的水稻REL1基因在培育抗干旱胁迫水稻中的应用，其特征在于：
所述的提高水稻内源REL1基因的表达为将T-DNA***REL1基因的3’端；
所述的在水稻中超量表达外源REL1基因为通过转基因技术将带有超量表达REL1基因的载体转入水稻中。
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