CN104087561A

CN104087561A - 水稻白绿叶基因wgl1及其用途

Info

Publication number: CN104087561A
Application number: CN201410326612.XA
Authority: CN
Inventors: 钱前; 朱丽; 曾大力; 康书静; 杨窑龙; 胡江; 张光恒; 徐杰; 郭龙彪; 董国军; 高振宇; 任德勇; 颜美仙
Original assignee: China National Rice Research Institute
Current assignee: China National Rice Research Institute
Priority date: 2014-07-10
Filing date: 2014-07-10
Publication date: 2014-10-08

Abstract

本发明涉及一种利用图位克隆技术克隆水稻白绿叶WGL1(WHITE GREEN LEAF1)基因，以及利用转基因互补实验鉴定该基因的功能；同时还涉及利用该基因研究水稻叶绿素合成和叶绿体发育，用以解释水稻叶色变化的分子机制，提高水稻的产量。具体而言，本发明公开了一种水稻白绿叶基因WGL1编码的蛋白质，该蛋白质为SEQ ID No：3所示的氨基酸序列。本发明还同时公开了编码上述蛋白质的水稻白绿叶基因WGL1，该基因为SEQ ID No：1、SEQ ID No：2所示的核苷酸序列。该水稻白绿叶基因WGL1的用途是：用于构建转基因水稻，所述转基因水稻的叶色得以改良。

Description

水稻白绿叶基因WGL1及其用途

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体的说，本发明涉及一种利用图位克隆技术克隆水稻白绿叶WGL1(WHITE GREEN LEAF1)基因，以及利用转基因互补实验鉴定该基因的功能；同时还涉及利用该基因研究水稻叶绿素合成和叶绿体发育，用以解释水稻叶色变化的分子机制，提高水稻的产量。

背景技术

光合作用为水稻的生长提供了物质来源和能量来源，叶绿体是进行光合作用的重要场所，同时也是光合色素的载体，广泛分布在叶片绿色组织细胞中。叶绿素是植物进行光合作用的主要色素，参与天线复合体上光能的捕获，电荷的分离以及电子传递。叶绿素的合成从谷氨酸(glutamate)开始到最终形成叶绿素a(Chl a)和叶绿素b(Chl b)，共需18种酶催化完成。在此过程中任何内部、外部条件的变化都会导致叶色变异而表现为缺绿症状，如白化、黄化、条纹、斑马等叶色异常表型。目前已分离出多个与叶绿素合成相关的基因，主要有包括编码叶绿素a氧化酶OsCAO1和OsCAO2和编码镁离子螯合酶的OsCHLD、OsCHLH和OsCHLI，而编码联乙烯还原酶的OsDVR基因以及编码叶绿素合成酶的YGL1基因也已经确定与叶绿素合成有关。

高等植物叶绿体的发育需经过一系列复杂的变化过程，需要细胞核基因编码的蛋白和叶绿体编码的蛋白协调参与完成。在黑暗条件中，叶片中非光合作用的前质体发育成黄化质体，黄化质体中含有晶格状的原片层，经光照黄化质体不断分化发育形成叶绿体。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种与水稻叶色变异相关的蛋白质及其基因，以及由此获得的转基因植物细胞，和利用所述基因对水稻叶片颜色进行改造的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种水稻白绿叶基因WGL1编码的蛋白质，该蛋白质为SEQ ID No：3所示的氨基酸序列。

作为本发明的水稻白绿叶基因WGL1编码的蛋白质的改进：所述氨基酸序列还包括在SEQ ID No：3所示的氨基酸序列中添加、取代、***或缺失一个或多个氨基酸或其他物种的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。

本发明还同时提供了编码上述蛋白质的水稻白绿叶基因WGL1，该基因具有SEQ ID No：1、SEQ ID No：2所示的核苷酸序列。

备注说明：SEQ ID NO：1为cDNA全长，该序列起始处的“atg”是起始密码子，末尾处的“tga”为终止密码子。

SEQ ID NO：2为gDNA全长。

作为本发明的水稻白绿叶基因WGL1的改进：所述核苷酸序列还包括在SEQ ID No：1和2所示的核苷酸序列中添加、取代，***或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物。

本发明还同时提供了含有上述基因的质粒。

本发明还同时提供了含有上述基因的植物表达载体。

本发明还同时提供了含有上述基因的宿主细胞。

作为本发明的宿主细胞的改进：该细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。

本发明还同时提供了改良水稻叶片颜色的方法：包括用为SEQ ID No：1、SEQ ID No：2所示的核苷酸序列的基因转化水稻细胞，再将转化后的水稻细胞培育成植株。

本发明还同时提供了上述水稻白绿叶基因WGL1的用途：用于构建转基因水稻，所述转基因水稻的叶色得以改良。

进一步作如下具体说明：

本发明的目的是提供一种从水稻白绿叶突变体wgl1中克隆的新基因WGL1，具有如SEQID No：1和SEQ ID No：2所示的DNA序列，也包括与SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示的DNA序列至少有70％同源性的基因序列。本发明中的SEQ ID No：3所示的蛋白质属于NADPH-原叶绿素酸酯氧化还原酶蛋白，其中进行一个或几个替换，***或缺失所获得的功能类似物。另外，也包括在SEQ ID No：1和SEQ ID No：2中添加、取代、***或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物，具有相同功能的序列也能达到本发明的目的。

本发明的另一个目的是提供一种用WGL1基因进行高效的植物转化的方法，具体地说，本发明提供了具有SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示的序列的基因或基因部分片段的载体，其中，如图4所示的pCAMBIA1300-WGL1，该载体可以表达有上述核苷酸序列编码的多肽或其同源类似物。

本发明还提供了一种利用植物表达载体转化植物细胞影响水稻叶色变化的方法。具体地是利用植物表达载体转化植物细胞以影响水稻叶色的方法。

实现本发明的具体技术步骤如下：

一、水稻叶色白绿叶突变体wgl1分离和遗传分析：

本发明的水稻叶色白绿叶变体wgl1来自日本晴EMS(Ethyl Methyl Sulfonate)诱变产生的突变。wgl1通过与野生型水稻的正交实验，证明该突变体受隐性单基因控制，如图1所示。

二、图位克隆控制水稻白化性状的WGL1基因：

1)、WGL1基因的初步定位：

为了分离WGL1基因，本发明首先组建了一个定位群体，由wgl1与籼稻品种TN1(Indica)杂交组配成F₂定位群体，再通过图位克隆的方法，利用STS、SSR等分子标记对WGL1位点进行初步定位，将其初步定位在第10号染色体长臂上，并介于ks9-37与ks9-39两标记之间，见图2。

2)、WGL1基因的精细定位与预测：

通过对ks9-37与ks9-39两个标记之间的BAC序列分析，发展新的SSR、STS标记将WGL1精确定位于BAC AC068923上ks9-38与ks9-17标记之间54-kb范围之内(图3)，通过分析此区段开放阅读框(ORF)推测候选基因。

3)、WGL1基因的鉴定和功能分析：

通过转基因技术，结果表明本发明获得了使突变体恢复正常表型的转基因水稻(图5)，证明本发明正确克隆了WGL1基因，氨基酸序列分析表明WGL1编码NADPH-原叶绿素酸酯氧化还原酶蛋白(POR)。

水稻叶片白绿的主要原因是由于NADPH-原叶绿素酸酯氧化还原酶突变后叶绿素合成受阻，叶绿体发育缺陷，阐明叶绿素合成与光合作用的分子机制，对解决水稻叶色变异问题，提高光合效率，创制高光效育种具有重要意义。WGL1基因的克隆和应用，能够用于改善叶片颜色，延缓叶片衰老。因而，本发明对进一步阐明水稻叶色变异的机制以及叶绿素合成过程，最终提高水稻产量具有一定理论意义。

综上所述，本发明利用水稻白绿叶突变体，通过图位克隆技术首次在水稻中克隆到了WGL1基因，该基因编码NADPH-原叶绿素酸酯氧化还原酶蛋白(POR)，在水稻中参与叶绿素的合成，其它物种的同源基因主要通过影响叶绿素的合成和叶绿体的发育而引起叶色变异。通过对WGL1基因的功能解读，进一步阐明了叶绿素合成和叶绿体发育的机制，同时为研究叶色变异的分子机制打下基础。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是水稻白绿叶突变体wgl1与野生型材料的表型(从左到右依次为：日本晴、日本晴背景的wgl1)；

图A为：突变体和野生型苗期的表型，突变体老叶叶尖变白；

图B为：突变体和野生型分蘖期的表型，突变体老叶叶尖变白，而且白色部分有少量褐色坏死斑点；

图C为：突变体分蘖期同一叶片叶尖白色(I)和叶片下部淡绿色(II)的表型，叶尖变白并伴随褐色病斑，叶下部淡绿；

图D为：突变体和野生型成熟期的表型，突变体叶片恢复淡绿。

图2是WGL1基因在水稻第10染色体上的初步定位图。

图3是WGL1基因的精细定位图；

图4是pCAMBIA1300-WGL1载体图谱；

图5是功能互补实验T₀代转基因水稻(从左到右依次为：wgl1植株表型为叶尖苍白并伴有褐色病斑；日本晴转化互补载体pCAMBIA1300-WGL1 T₀转基因株，表型与普通日本晴无明显变化；wgl1转化互补载体pCAMBIA1300-WGL1，叶色表型恢复正常)；

备注说明：图5中，“：：”前是材料名称，后是所转载体名称。

图6是突变体wgl1与NIP苗期、分蘖期、成熟期的光合色素含量对比图；

图A为：叶绿素a含量；图B为：叶绿素b含量；图C为：类胡萝卜素含量；图D为：叶绿素a/b；图E为：分蘖期野生型和突变体叶片白色部分和淡绿部分的光合色素含量；图F为：分蘖期野生型和突变体叶片白色部分和淡绿部分的叶绿素a/b。

图7是突变体和野生型的透射电镜结果图；

图A为：野生型叶肉细胞；图B为：突变体wgl1叶片绿色部分的叶肉细胞；图C为：突变体wgl1叶片苍白部分的叶肉细胞；图D为：野生型叶绿体的结构；图E为：突变体wgl1叶片绿色部分的叶绿体的结构；图F为：突变体wgl1叶片苍白部分的叶绿体结构；

CP-叶绿体；G-基粒；SG-淀粉粒。

具体实施方式

实施例1：

1、水稻材料：

水稻(Oryza sativa L.)突变体wgl1(white green leaf1)，原始野生材料为粳稻品种“日本晴”。

水稻白绿叶突变体wgl1来自日本晴EMS(Ethyl Methyl Sulfonate)诱变产生的突变(如图1所示)，该突变体是在中国浙江省境内获得。

wgl1通过与野生型品种(即，籼稻品种TN1)的正交实验构建遗传群体，进行遗传分析。实验的结果为：在M2代群体中随机选择51个单株进行遗传分析，34株为野生型表型，17株为突变型表型，卡平方检测结果(χ²＝1.84<χ²0.05＝3.84)，分离比符合3：1，说明该突变表型由单隐性核基因控制。以突变体wgl1为母本，TN1为父本进行正交所得的F1代植株全部表现为正常表型，F2代种子播种四周后，随机选200个单株其中156株表现为野生型表型，44株表现为突变型表型。卡平方检测结果(χ²＝0.95<χ²0.05＝3.84)，正常植株表型和突变体植株表型分离比符合3：1；进一步证明该突变表型受隐性单隐性核基因控制。

2、分析和定位群体：

纯合的wgl1突变体和野生型品种籼稻品种TN1进行杂交，F₁代自交，得到F₂群体。并从中选出1000株表型明显的白绿叶wgl1突变个体作为定位群体。在三叶期期每株取1克左右的嫩叶，用来提取总DNA。

3、SSR和STS标记定位WGL1基因：

采用水稻微量DNA的快速提取方法从水稻叶片中提取用于基因定位的基因组DNA。取大约0.2g水稻叶片，经液氮冷冻，在直径5cm的小研钵中磨成粉状，转移到1.5ml离心管里提取DNA，获得的DNA沉淀溶解于150μl超纯水中。每一个PCR反应用2μl DNA样品。WGL1基因的初步定位：在wgl1与TN1组合的F₂群体中选取21个隐性个体，根据公布的粳稻和籼稻创建的分子遗传图谱，选取近似均匀分布于各条染色体上的SSR引物，根据已知的反应条件进行PCR扩增，经5％琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙啶(EB)染色，检测PCR产物的多态性，将WGL1初步定位在第10号染色体长臂上，ks9-37与ks9-39两STS标记之间(如图2所示)。

WGL1基因的精细定位：选取wgl1与TN1组合的F₂群体中共630株隐性个体，在初定位的基础上进一步设计SSR和STS标记，最终将WGL1精确定位于精确定位于BAC号为AC068923上54-kb范围之内，两边的分子标记为ks9-38与ks9-17引物序列为：

ks9-38F：ACAGGTCCAACTAATTACATATA，

ks9-38R：AAAGTGAGTCACAAATAAAAG；

ks9-17F：TGCAGCGCAGTTTATACACTGTT，

ks9-17R：TGACACTGTTTCTGGTACTGTTTTACA。

如图3所示。

上文中涉及的引物序列见表1。

表1、WGL1基因的定位标记序列

备注说明：Ks9-35、Ks9-27、RM6737、Ks9-37、Ks9-39、10-7、RM3451和RM4471在“WGL1基因的初步定位”中被用到，其余为精细定位引物。其中RM系列标记属于已公开发表的引物，在公用数据库中均可查到。

4、基因预测和比较分析：

根据精细定位的结果，在54-kb范围内根据Rice Automated Annotation System(http://RiceGAAS.dna.affrc.go.jp)的预测，发现在此区间内共有9个候选基因。根据两标记剩余的重组个体数，我们设计了各基因的测序引物，采用PCR方法分别从wgl1和野生型品种基因组中扩增出候选基因进行测序分析。发现wgl1在基因LOC_Os10g35370的第4个外显子处发生1个碱基的替换突变，由G突变为A，使第235个氨基酸脂肪族类的甘氨酸(Gly)突变为碱性氨基酸类的精氨酸(Arg)。将此结果重复验证两次，发现突变体wgl1基因与野生型和预测序列比较都有突变事件的发生(测序引物序列见表2)。根据BAC克隆AC068923序列的基因注释信息(NCBI)，预测此基因编码OsPORB，该基因全长3733bp(如序列表的NO2所示)，包括五个内含子和三个外显子，cDNA全长1209bp(如序列表的NO1所示)，水稻中的WGL1基因与高粱、大麦、玉米、小麦、短穗二柄草和拟南芥的PORB基因高度同源。

该基因编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表的SEQ ID No：3所示。

表2、WGL1基因的测序引物序列

实施例2：

植物转化：

以粳稻品种“日本晴”基因组为模板，根据目的基因设计引物Ks-BamHI(5′-cacggatccTCTAGCGAGCCCCGGGCTGGGC-3′)and Ks-EcoRI(5′-cacgaattcCACTGGTTTCTGCCGTCTGCTG-3′)，

PCR扩增体系(50μL的PCR反应体系)：模板DNA2μL；2×PCR buffer25μL；2mmoldNTP(罗氏)10μL；KODFX(TOYOBO)酶1μL；10μM PrimerF3μL；10μM PrimerR3μL；ddH₂O6μL；

PCR扩增条件为：94℃预变性2min；98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸7min；共35个循环；68℃下延伸10min，15℃保温。

PCR扩增后进行电泳分离，回收得到6548bp的DNA片段，用BamHI和EcoRI双酶切目的片段和pCAMBIA1300(p1300)后进行连接，获得了互补载体pCAMBIA1300-WGL1，该克隆覆盖了整个ORF的基因组区域(即包含了SEQ ID No：2所示的核苷酸序列)，还包括ATG上游2218-bp启动子序列和TGA下游1153-bp终止子序列(如图4所示)。这个质粒通过电击的方法转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株系EHA105中用于转化水稻愈伤。我们利用突变体wgl1成熟种子诱导愈伤组织，经过诱导培养基培养3周后(培养条件：32℃光照强度13230Lx)，挑选生长旺盛愈伤用作转化的受体。用含有pCAMBIA1300-WGL1互补载体的EHA105菌株侵染wgl1愈伤，25℃暗培养3天后，在含有50mg/L潮霉素B和400mg/L羧苄的筛选培养基上培养(培养条件：32℃，光照强度13230Lx，时间约为2周)，无农杆菌污染，并有新鲜愈伤长出的个体被用于分化培养(培养条件：32℃，光照强度13230Lx，时间以分化出小苗为准)，分化出的小苗转至生根壮苗培养基上培养2周左右(培养条件：32℃，光照强度13230Lx，)，转田间种植。对植株进行鉴定和连续的观察发现，与同时期的突变体比较，wgl1::pCAMBIA1300-WGL1转基因植株叶色恢复为正常绿色。通过上述转基因技术，结果表明：本发明获得了使突变体恢复正常表型的转基因水稻(图5)。

说明：上文中所涉及的各种培养基的配方可参考Toki S.,Hara N.,Ono K.,Onodera H.,Tagiri A.,Oka S.,Tanaka H.(2006)Early infection of scutellum tissue with Agrobacterium allowshigh‐speed transformation of rice.The Plant Journal47:969-976。

实施例3、

光合色素含量测定：

分别取突变体和野生型苗期、分蘖期和成熟期以及突变体分蘖期同一叶片叶尖(苍白部分)和叶下部(淡绿部分)的叶片去掉主脉，剪成1cm左右的片段，称取0.2g浸泡于10ml80％(体积％)丙酮，26℃条件下暗培养48小时。取溶液在紫外分光光度计(DU800,BECKMAN COULTER)663nm、645nm和470nm三种波长下测定叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素的光密度值。3次重复，然后根据Amon(1949)的方法计算出各检测叶片中的叶绿素a(Chl a)、叶绿素b(Chl b)的含量,按照Wellburn(1994)计算类胡萝卜素(Car)的含量，计算公式如下：

chl a＝(12.7×OD₆₆₃－2.69×OD₆₄₅)×V/W

chl b＝(22.9×OD₆₄₅－4.68×OD₆₆₃)×V/W

car＝(1000×OD₄₇₀×V/W－3.27×Chl a－104×Chl b)/198

其中：V为提取液体积(10ml)，W为叶片质量0.2g，OD₆₆₃、OD₆₄₅及OD₄₇₀为在分光光度仪上读取的光密度值，单位：mg/g。

结果显示，与野生型相比，突变体在苗期、分蘖期和成熟期叶绿素a、叶绿素b的含量明显减少；而类胡萝卜素含量只在分蘖期和成熟期较野生型明显减少(图6A，6B，6C)。对突变体分蘖期叶片的苍白部分和淡绿部分的光合色素测定结果表明，苍白部分的叶绿素和类胡萝卜素含量明显下降，而淡绿部分类胡萝卜素的含量与野生型基本一致，叶绿素含量与苍白部分一样也明显减少(图6E)。除苗期外，Chl a/b的比值在各个时期和分蘖期的叶片的各个部位均明显增加(图6D，6F)。总之，突变体的表型变化是由于叶绿素和类胡萝卜素缺失引起的。

实施例4、

叶绿体透射电镜的制备和观察：

(1)样品：取突变体苗期叶片中黄白色部分、淡绿色部分以及对照野生型的叶片，切成0.5～1mm3左右的小块；

(2)固定：将切好的样品块放入2ml离心管中，加入2.5％的戊二醛溶液(PH＝7.2)，在抽真空仪器中抽真空直到叶片完全下沉。0.1M磷酸漂洗三次，每15min一次，然后加入1％锇酸固定2～3小时，直至样品变黑；

(3)脱水：先用50％、70％、和90％的乙醇溶液依次脱水，每个浓度处理20分钟，再用乙醇和丙酮(1：1)溶液处理20分钟，以上均在4度冰箱内进行，最后将样品用纯丙酮室温处理20分钟；

(4)渗透：将样品在无水丙酮和包埋剂(3：1)混合液中作用4小时，再在无水丙酮和包埋剂(1：1)混合液处理3小时，最后在纯的包埋剂中作用12小时；

(5)包埋：将上述步骤中的样品挑的包埋盒内，37℃过夜，45℃处理12小时最后60℃处理24小时，获得包埋样品；

(6)切片、拍照：将包埋样品用超薄切片机切成60-70nm左右的超薄片，然后将切片用柠檬酸铅溶液染色10分钟，再有醋酸铀溶液染色30分钟，双蒸水清洗三次后晾干，用HitachiH-7650型透射电镜观察并且选择清晰地倍数拍照。

结果显示野生型叶片的叶肉细胞中叶绿体数目较多，叶绿体结构完整，叶绿体中基粒排列紧密(图7A，7C)。突变体叶片的淡绿色部分相比野生型虽然叶绿体数目的变化不大，但基粒片层的排列没有野生型那么紧密、整齐(图7B，7D)；苍白色部分能明显观察到叶肉细胞中只有少数叶绿体，基粒数目减少，基粒堆叠层数减少(图7C，7E)。结果表明基因突变造成了突变体中叶绿体结构被破坏。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

<110> 中国水稻研究所

<120> 水稻白绿叶基因WGL1及其用途

<160> 3

<210> 1

<211> 1209

<212> cDNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 1

atggctctcc aggcggccac caccacctcc ttcctcccct ccgcgctctc cgcccgcaag 60

gagggagcgg tgaaggactc ggcgttcttg ggcgttcgtc tcggcgacgg gctcaagctg 120

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gcgcaggcgt cggcggcggt gtcgtccccg acggtgacgc cggcgtcgcc gtcgggcaag 240

cagacgctgc gcaagggcac ggcggtcatc accggcgcgt cgtccgggct tggcctcgcg 300

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ctcaaggcgt cgcgcgccgc caaggccgcc ggcatggaga agggcagcta caccatcgtc 420

cacctcgacc tggcgtcgct cgacagcgtc aggcagttcg tcgccaacgt ccggcggctg 480

gagatgcccg tcgacgtggt ggtgtgcaac gccgccgtgt accagcccac cgccaagcag 540

ccgagcttca ccgccgacgg cttcgagatg agcgtcggcg tcaaccacct cgggcacttc 600

ctcctcgccc gcgagctcct cgccgacctc acctcctccg actacccctc caagcgcctc 660

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gcgaacctgg gggacctccg ggggctcgcc tcgggcctcg acggcgtgtc gagctccgcc 780

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tggagctgga acaacaactc ggcctcgttc gagaaccagc tctccgagga ggcctccgat 1140

ccggagaagg ccaagaaggt ctgggagctc agcgagaagc tcgtcggctt ggccgatcac 1200

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<210> 2

<211> 3733

<212> gDNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 2

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ataaaaacaa aggcctagtt tgttcatata tcttgacatt gttgccacga aaactgaaac 1560

tctcctgcag agggtgagca cgtcgtcggt ggccatccgc gcgcaggcgt cggcggcggt 1620

gtcgtccccg acggtgacgc cggcgtcgcc gtcgggcaag cagacgctgc gcaagggcac 1680

ggcggtcatc accggcgcgt cgtccgggct tggcctcgcg acggcgaagg cgctggcgga 1740

gacgggcagg tggcacgtcg tcatggggtg ccgcgacttc ctcaaggcgt cgcgcgccgc 1800

caaggccgcc ggcatggaga agggcagcta caccatcgtc cacctcgacc tggcgtcgct 1860

cgacagcgtc aggcagttcg tcgccaacgt ccggcggctg gagatgcccg tcgacgtggt 1920

ggtgtgcaac gccgccgtgt accagcccac cgccaagcag ccgagcttca ccgccgacgg 1980

cttcgagatg agcgtcggcg tcaaccacct cgggcacttc ctcctcgccc gcgagctcct 2040

cgccgacctc acctcctccg actacccctc caagcgcctc atcatcgtcg gctccatcac 2100

cggtaatgac aacctttctt cctcaccaga attaggctgt tgtgttctaa tgtcaaagct 2160

tccaacttct actattttgt agttctccac gtacacaatt actacaatta ctgaactgct 2220

aaaaattgca tgttttataa aaaaaattat aggaagttgt tgtgattaat ccaattttta 2280

agtttttctt tttcatcggg aagattgaaa gagaccttct gaatgtatta agaatgagaa 2340

aaagttacaa gaaaaacata ataggaagtt gtcgaggatg atgcgcacca gcgtgtgcgt 2400

tcaagaacca cgagctaacc acacaagcac aaacctctaa aagtgaaaac ttcttcttag 2460

ataatactta attaatggat tatttttctg tgcatggagg gcacaacctt atactgcttt 2520

ctaaaatggg tatgataatt atttgatagt ataaacgaat gaatcaagta ttacaaagtc 2580

gataagctga ttttttttta aaaaaaaact ttataagtgc agttgtaact tttttttaaa 2640

aaaaatatca tatcatttga aagcatatcg gcaacattct attgtaacat gttactataa 2700

gaacatcgtt ctaatttcga tacgatgaat gcagggaaca cgaacacgct ggcggggaac 2760

gtgccgccga aggcgaacct gggggacctc cgggggctcg cctcgggcct cgacggcgtg 2820

tcgagctccg ccatgatcga cggcggcgag ttcgacggcg ccaaggccta caaggacagc 2880

aaggtgtgca acatgctgac gatgcaggag ttccaccgcc ggtaccacgg cgagaccggg 2940

gtgacgttcg cgtcgctcta ccccgggtgc atcgccacca cgggcctctt ccgggagcac 3000

gtcccgctgt tccgcctcct cttcccgccc ttccagaagt acatcaccaa gggctacgtc 3060

tccgaggagg aggccggcaa gcggctggcc caggtcgtca gtgaccccag cctcaccaag 3120

tccggggtgt actggagctg gaacaacaac tcggcctcgt tcgagaacca gctctccgag 3180

gaggcctccg atccggagaa ggccaagaag gtctgggagc tcagcgagaa gctcgtcggc 3240

ttggccgatc acgatcagtg agtgagagtg atgtgctatt gattttcgtc taggattttg 3300

ctgtgctctt cttcttcttc tcctctctac caagaaagat cgatggagga gaatttgtag 3360

gacgcgtttc tcacgaatta cttagctgtt aatgatcagc ttgatgtgta cgatatgatg 3420

gtgcagagtg aaagttgtgt tgttcactgg tggatcatgg gatgggaata tgggattgtt 3480

gtaagatgta actcaagtgt tttctttttt gggattactt ttggtaataa gagcttgggt 3540

gatcgaaaac tacagatggt ttttctttta agttgtatga tctctgtaga gtttttgagt 3600

aatttgtagt tttgtaccct atcaaagatc atctctagct gcctctgagc tctccaactc 3660

tatatgtcca tctctagtat atatgtccca tatttctgac tgaaaatttt caagtcggtt 3720

ggttccctcc gcc 3733

<210> 3

<211> 403

<212> PRT

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 3

MET Ala Leu Gln Ala Ala Thr Thr Thr Ser Phe Leu Pro Ser Ala Leu Ser Ala Arg Lys

1 5 10 15 20

Glu Gly Ala Val Lys Asp Ser Ala Phe Leu Gly Val Arg Leu Gly Asp Gly Leu Lys Leu

21 25 30 35 40

Glu Thr Ser Ala Leu Gly Leu Arg Thr Lys Arg Val Ser Thr Ser Ser Val Ala Ile Arg

41 45 50 55 60

Ala Gln Ala Ser Ala Ala Val Ser Ser Pro Thr Val Thr Pro Ala Ser Pro Ser Gly Lys

61 65 70 75 80

Gln Thr Leu Arg Lys Gly Thr Ala Val Ile Thr Gly Ala Ser Ser Gly Leu Gly Leu Ala

81 85 90 95 100

Thr Ala Lys Ala Leu Ala Glu Thr Gly Arg Trp His Val Val MET Gly Cys Arg Asp Phe

101 105 110 115 120

Leu Lys Ala Ser Arg Ala Ala Lys Ala Ala Gly MET Glu Lys Gly Ser Tyr Thr Ile Val

121 125 130 135 140

His Leu Asp Leu Ala Ser Leu Asp Ser Val Arg Gln Phe Val Ala Asn Val Arg Arg Leu

141 145 150 155 160

Glu MET Pro Val Asp Val Val Val Cys Asn Ala Ala Val Tyr Gln Pro Thr Ala Lys Gln

161 165 170 175 180

Pro Ser Phe Thr Ala Asp Gly Phe Glu MET Ser Val Gly Val Asn His Leu Gly His Phe

181 185 190 195 200

Leu Leu Ala Arg Glu Leu Leu Ala Asp Leu Thr Ser Ser Asp Tyr Pro Ser Lys Arg Leu

201 205 210 215 220

Ile Ile Val Gly Ser Ile Thr Gly Asn Thr Asn Thr Leu Ala Gly Asn Val Pro Pro Lys

221 225 230 235 240

Ala Asn Leu Gly Asp Leu Arg Gly Leu Ala Ser Gly Leu Asp Gly Val Ser Ser Ser Ala

241 245 250 255 260

MET Ile Asp Gly Gly Glu Phe Asp Gly Ala Lys Ala Tyr Lys Asp Ser Lys Val Cys Asn

261 265 270 275 280

MET Leu Thr MET Gln Glu Phe His Arg Arg Tyr His Gly Glu Thr Gly Val Thr Phe Ala

281 285 290 295 300

Ser Leu Tyr Pro Gly Cys Ile Ala Thr Thr Gly Leu Phe Arg Glu His Val Pro Leu Phe

301 305 310 315 320

Arg Leu Leu Phe Pro Pro Phe Gln Lys Tyr Ile Thr Lys Gly Tyr Val Ser Glu Glu Glu

321 325 330 335 340

Ala Gly Lys Arg Leu Ala Gln Val Val Ser Asp Pro Ser Leu Thr Lys Ser Gly Val Tyr

341 345 350 355 360

Trp Ser Trp Asn Asn Asn Ser Ala Ser Phe Glu Asn Gln Leu Ser Glu Glu Ala Ser Asp

361 365 370 375 380

Pro Glu Lys Ala Lys Lys Val Trp Glu Leu Ser Glu Lys Leu Val Gly Leu Ala Asp His

381 385 390 395 400

Asp Gln ***

401 402 403

Claims

1.水稻白绿叶基因WGL1编码的蛋白质，其特征在于：该蛋白质为SEQ ID No：3所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的水稻白绿叶基因WGL1编码的蛋白质，其特征在于：所述氨基酸序列还包括在SEQ ID No：3所示的氨基酸序列中添加、取代、***或缺失一个或多个氨基酸或其他物种的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。

3.编码权利要求1或2所述蛋白质的水稻白绿叶基因WGL1，其特征在于：该基因为SEQ ID No：1、SEQ ID No：2所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的水稻白绿叶基因WGL1，其特征在于：所述核苷酸序列还包括在SEQ ID No：1和2所示的核苷酸序列中添加、取代，***或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物。

5.一种含有权利要求3或4所述基因的质粒。

6.一种含有权利要求3或4所述基因的植物表达载体。

7.宿主细胞，其特征在于：该宿主细胞含有权利要求3或4所述的基因。

8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于：该细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。

9.一种改良水稻叶片颜色的方法，其特征在于：包括用为SEQ ID No：1、SEQ ID No：2所示的核苷酸序列的基因转化水稻细胞，再将转化后的水稻细胞培育成植株。

10.如权利要求3或4所述的水稻白绿叶基因WGL1的用途，其特征在于：用于构建转基因水稻，所述转基因水稻的叶色得以改良。