CN107557322A - 一种地衣芽孢杆菌与酪酸菌复合菌剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种地衣芽孢杆菌与酪酸菌复合菌剂的制备方法，属于生物发酵技术领域，将地衣芽孢杆菌二级种子液接入到发酵罐中，镜检活菌数在1.0×10⁹~3.0×10⁹CFU/ml时，将酪酸菌二级种子液按照重量百分比2~6%的比例接入到发酵罐中，当酪酸菌发酵至13~15h时，开始流加葡萄糖溶液；当酪酸菌发酵至14~16h时，开始流加氮源补料培养基，本发明采用联合培养的方式，利用微生物之间的互利共生，既节省了生产成本又提高了生产效益，更有利与于维持动物微生态***，通过分泌的各种消化酶和有机酸提高饲料的消化吸收率，可应用于饲料添加剂中。

Description

一种地衣芽孢杆菌与酪酸菌复合菌剂的制备方法

技术领域

本发明涉及生物发酵技术领域，具体涉及补料分批发酵制备地衣芽孢杆菌与酪酸菌复合菌剂的方法。

背景技术

由于目前饲料中添加抗生素的现象十分普遍，出于安全原因，许多国家禁止利用一些畜产品下脚料生产的肉骨粉等动物蛋白原料用于饲料，因此，从安全与成本角度考虑，将植物源蛋白作为动物蛋白原料的替代品已经成为一种趋势。但是，要高效利用植物源蛋白，需要解决影响消化吸收的抗营养因子、适口性等问题；同时在幼禽畜养殖防治下痢中，抗生素的使用严重威胁了我们的食品安全，因此，在饲料生产中，需要采用在功能上能够替代不良副作用添加剂的微生态添加剂产品。然而传统固态发酵复合菌固态发酵过程中，多菌种同时接种无法同时满足不同菌发酵要求，造成发酵不彻底。多菌种组合固态整体发酵的关键控制点在于把握和控制好好氧与厌氧二个阶段，掌握好好氧向厌氧的转换。

公布号 CN 103478417 A提供了一种二次接种分段固态发酵生产发酵豆粕的方法，将枯草芽孢杆菌液、假丝酵母菌液和乳酸杆菌液混合得到的混合菌液接入到去皮豆粕，混合发酵；将乳酸杆菌液接入到发酵物中，混合，厌氧发酵，得到发酵豆粕。该方法能够满足好氧菌与厌氧菌的不同需求，可生产制备高品质的发酵豆粕。虽然该专利也考虑到了不同菌种发酵的条件，但是菌种的种类是影响复配和发酵条件的关键因素，对于地衣芽孢杆菌和酪酸菌的复配没有相关的技术启示。

地衣芽孢杆菌细胞形态和排列呈杆状、单生，属革兰氏阳性好氧菌，生长过程中可迅速消耗环境中的游离氧气，在肠道创造一个厌氧环境，促进肠道益生菌(乳酸菌、双歧杆菌及丁酸梭菌等)的生长，可促使机体产生抗菌活性物质、杀灭致病菌。地衣芽孢杆菌具有较强的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性，能够降解饲料中的抗营养因子，地衣芽孢杆菌形成芽孢后具有抗逆性强、耐热、存储时间长等优点。

酪酸菌，又名丁酸梭菌，是梭状芽孢杆菌属的其中一种，存在于奶酪、天然酸奶、土壤及人和动物粪便中，是人和动物肠道的正常菌群。丁酸梭菌是一种厌氧的革兰氏阳性芽孢杆菌，菌体呈直或者弯形，单个或成对、短链，有鞭毛可运动，菌体可形成芽孢，芽孢偏心或次端生(内生)，呈圆形或椭圆形，无胞外壁和附属丝。丁酸梭菌通过消化道时，能够耐胃酸及胆盐的恶劣环境，是调节动物肠道微生态平衡的有益菌。

由于酪酸菌是一种严格厌氧菌，单独生产的话，需要通过石蜡油、氮气或二氧化碳等维持的厌氧环境来生产，设备要求较高，生产成本大；而地衣芽孢杆菌属于好氧菌，采用联合培养的方式，常常导致出现两种菌都生长不稳定或严重退化的现象。

发明内容

本发明的目的在于克服单菌培养过程中生产周期长、设备要求高等缺点，提供一种将两段式***发酵工艺，将好氧菌与厌氧菌协同发酵，地衣芽孢杆菌能够为酪酸菌提供厌氧环境和丰富的营养物质，加快了后期酪酸菌的生长速度，同时采用补料分批发酵，提高了菌体密度，简化生产工艺，大大提高生产效率。

本发明所采用的技术方案为：一种地衣芽孢杆菌与酪酸菌复合菌剂的制备方法，包括菌种的活化及扩配、种子罐培养、发酵罐培养、菌体离心收集、载体吸附及低温干燥，具体为：

1、菌种活化及扩大培养。

（1）地衣芽孢杆菌：

a）菌种活化：取地衣芽孢杆菌甘油管菌种，接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，120~160 r/min，30~37℃培养24h，牛肉膏蛋白胨平板计数。

b）菌种扩配：挑选牛肉膏蛋白胨平板计数上的单菌落，接种牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30~37℃，120~160 r/min振荡培养24h。

（2）酪酸菌：

a）菌种活化：取酪酸菌甘油管菌种，接种到相应的种子培养基中，32~37℃厌氧培养12~18h，RCM平板计数。

b）菌种扩配：挑选RCM平板上的单菌落，接种于RCM液体培养基中，置于厌氧袋中，37℃厌氧培养24h。

2、种子罐培养菌种。

（1）一级种子罐培养

a）地衣芽孢杆菌：将经过扩大培养的地衣芽孢杆菌接种到地衣芽孢杆菌一级种子罐中，接种量1~3%，使用无菌空气通入罐中，罐压调整为0.03~0.05MPa，通风比控制为1:0.6~1:1，转速120~180r/min，温度32~37℃，培养时间16~20h。

b）酪酸菌：将经过扩大培养的酪酸菌接种到酪酸菌一级种子罐中，接种量1~3%，使用氮气从罐顶通入罐中，罐压调整为0.02~0.04MPa，转速控制60~120 r/min，温度控制在32~37℃，厌氧培养16~24h。

（2）二级种子罐培养

a）地衣芽孢杆菌：将一级种子罐培养基的地衣芽孢杆菌接种到地衣芽孢杆菌二级种子罐中，接种量5~10%，使用无菌空气通入罐中，罐压调整为0.03~0.05MPa，通风比控制为1:0.6~1:1，转速120~180r/min，温度30~37℃，培养时间10~15h。

b）酪酸菌：接种量5~10%，将一级种子罐培养基的酪酸菌接种到酪酸菌二级种子罐中，使用氮气从罐顶通入罐中，罐压调整为0.02~0.04MPa，转速控制60~120 r/min，温度控制在32~37℃，厌氧培养12~16h。

所述地衣芽孢杆菌种子培养基配方为：牛肉膏0.3~0.5%、蛋白胨0.5~1%、氯化钠0.2~0.5%，培养基pH7.0~7.2。

所述酪酸菌种子培养基(RCM)配方为：酵母膏0.1~0.3%、牛肉膏0.8~1.2%、蛋白胨0.8~1.2%、可溶性淀粉0.07~0.12%、葡萄糖0.3~0.6%、半胱氨酸盐酸盐0.04~0.06%、氯化钠0.2~0.5%、乙酸钠0.2~0.5%。

3、发酵罐培养菌种。

所述的发酵罐培养包括以下步骤。

a）将地衣芽孢杆菌二级种子液按照重量百分比2~6%的比例接入到发酵罐中，罐压控制在0.03MPa~0.05Mpa，通风比控制在1:0.5~1:0.8，转速120~180r/min，30~37℃，培养16-20h，之后停止通气，继续搅拌培养1~3h，镜检活菌数。

b）在步骤a）镜检活菌数在1.0×10⁹~3.0×10⁹CFU/ml时，将酪酸菌二级种子液按照重量百分比2~6%的比例接入到发酵罐中，转速100~120r/min，每隔1h搅拌5分钟，32~37℃培养26~30h，即得地衣芽孢杆菌与丁酸梭菌混合培养物。

当酪酸菌发酵至13~15h时，开始流加浓度为20~30%的葡萄糖溶液，当发酵至22~24h时，结束流加。

当酪酸菌发酵至14~16h时，开始流加由蛋白胨0.5%、0.05%的半胱氨酸盐酸盐、磷酸氢二钾0.02%组成的氮源补料培养基，当发酵至20~22h时，结束流加。

所述的发酵罐培养过程中用10%的稀盐酸或5%的氨水自动调控pH在6.8~7.2。

所述的发酵罐培养过程中碳源补充培养基与氮源补充培养基添加比例为1:1，总添加量控制在15-20%，最终发酵罐装料量控制在80~85%。

所述的发酵罐培养，在发酵结束前3~5h，将温度逐步提高至40~45℃，镜检活菌数在1.0×10⁹~5.0×10⁹CFU/ml，染色观察芽孢率在90%以上时，结束发酵。

4、菌体收集：地衣芽孢杆菌与酪酸菌的混合培养物利用管氏离心机离心，转速≥15000r/min，获得湿菌泥。

5、载体吸附：按照湿菌泥：玉米芯粉：碳酸钙=1:5~10:5~10的重量比混合吸附。

6、低温干燥：吸附后的菌泥通过流化床烘干，温度控制在50℃以下，水分控制在7%以内，粉碎过30目筛，得到地衣芽孢杆菌与酪酸菌的复合菌剂。

本发明中的地衣芽孢杆菌、酪酸菌菌种均来自于中国微生物保藏中心。

与现有技术相比本发明具有以下有益效果：

本发明采用联合培养的方式，培养前期接种地衣芽孢杆菌消耗培养基中的氧气，为酪酸菌的生长提供厌氧环境，同时，地衣芽孢杆菌产生的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等酶制剂将培养基的原料降解成小分子化合物，有利于酪酸菌的生长繁殖，然后接入酪酸菌，酪酸菌便能很快的增殖，利用微生物之间的互利共生，既节省了生产成本又提高了生产效益，酪酸菌产生的丁酸、乙酸等短链脂肪酸能修复小肠绒毛的损伤，并能为小肠提供能量，改善肠道微环境。生产出的地衣芽孢和酪酸菌复合菌剂，相对于单一微生态制剂而言，更有利与于维持动物微生态***，通过分泌的各种消化酶和有机酸提高饲料的消化吸收率。在发酵的过程中，流加碳氮源，进一步提高菌体浓度，有利于提高菌体浓度及芽孢率，同时，由于地衣芽孢杆菌与酪酸菌都属于芽孢杆菌，芽孢杆菌具有耐高温耐挤压等优点，增加了该复合菌剂的稳定性，同时缩短培养周期，降低了生产成本。

具体实施方式

下面结合实施例详细说明本发明的技术方案，但保护范围不被此限制。

实施例1

1、菌种活化及扩大培养。

（1）地衣芽孢杆菌：

a）菌种活化：取地衣芽孢杆菌甘油管菌种，接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，120 r/min，30℃培养24h，牛肉膏蛋白胨平板计数。

b）菌种扩配：挑选牛肉膏蛋白胨平板计数上的单菌落，接种牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃，120 r/min振荡培养24h。

（2）酪酸菌：

a）菌种活化：取酪酸菌甘油管菌种，接种到相应的种子培养基中，32℃厌氧培养12h，RCM平板计数。

b）菌种扩配：挑选RCM平板上的单菌落，接种于RCM液体培养基中，置于厌氧袋中，37℃厌氧培养24h。

2、种子罐培养菌种。

（1）一级种子罐培养

a）地衣芽孢杆菌：将经过扩大培养的地衣芽孢杆菌接种到地衣芽孢杆菌一级种子罐中，接种量1%，使用无菌空气通入罐中，罐压调整为0.03MPa，通风比控制为1:0.6，转速120r/min，温度32℃，培养时间16h。

b）酪酸菌：将经过扩大培养的酪酸菌接种到酪酸菌一级种子罐中，接种量1%，使用氮气从罐顶通入罐中，罐压调整为0.02MPa，转速控制60 r/min，温度控制在32℃，厌氧培养16h。

（2）二级种子罐培养

a）地衣芽孢杆菌：将一级种子罐培养基的地衣芽孢杆菌接种到地衣芽孢杆菌二级种子罐中，接种量5%，使用无菌空气通入罐中，罐压调整为0.03MPa，通风比控制为1:0.6，转速120r/min，温度30℃，培养时间10h。

b）酪酸菌：接种量5%，将一级种子罐培养基的酪酸菌接种到酪酸菌二级种子罐中，使用氮气从罐顶通入罐中，罐压调整为0.02MPa，转速控制60 r/min，温度控制在32℃，厌氧培养12h。

所述地衣芽孢杆菌种子培养基配方为：牛肉膏0.3%、蛋白胨0.5%、氯化钠0.2%，培养基pH7.0。

所述酪酸菌种子培养基(RCM)配方为：酵母膏0.1%、牛肉膏0.8%、蛋白胨0.8%、可溶性淀粉0.07%、葡萄糖0.3%、半胱氨酸盐酸盐0.04%、氯化钠0.2%、乙酸钠0.2%。

3、发酵罐培养菌种。

所述的发酵罐培养包括以下步骤。

a）将地衣芽孢杆菌二级种子液按照重量百分比2%的比例接入到发酵罐中，罐压控制在0.03MPa，通风比控制在1:0.5，转速120r/min，30℃，培养16h，之后停止通气，继续搅拌培养1h，镜检活菌数。

b）在步骤a）镜检活菌数在1.0×10⁹~3.0×10⁹CFU/ml时，将酪酸菌二级种子液按照重量百分比2%的比例接入到发酵罐中，转速100r/min，每隔1h搅拌5分钟，32℃培养26h，即得地衣芽孢杆菌与丁酸梭菌混合培养物。

当酪酸菌发酵至13h时，开始流加浓度为20%的葡萄糖溶液，当发酵至22h时，结束流加。

当酪酸菌发酵至14h时，开始流加由蛋白胨0.5%、0.05%的半胱氨酸盐酸盐、磷酸氢二钾0.02%组成的氮源补料培养基，当发酵至20~22h时，结束流加。

所述的发酵罐培养过程中用10%的稀盐酸或5%的氨水自动调控pH在6.8。

所述的发酵罐培养过程中碳源补充培养基与氮源补充培养基添加比例为1:1，总添加量控制在15%，最终发酵罐装料量控制在80%。

所述的发酵罐培养，在发酵结束前3h，将温度逐步提高至40℃，镜检活菌数在1.0×10⁹~5.0×10⁹CFU/ml，染色观察芽孢率在90%以上时，结束发酵。

4、菌体收集：地衣芽孢杆菌与酪酸菌的混合培养物利用管氏离心机离心，转速≥15000r/min，获得湿菌泥。

5、载体吸附：按照湿菌泥：玉米芯粉：碳酸钙=1:5:5的重量比混合吸附。

6、低温干燥：吸附后的菌泥通过流化床烘干，温度控制在50℃以下，水分控制在7%以内，粉碎过30目筛，得到地衣芽孢杆菌与酪酸菌的复合菌剂。

实施例2

1、菌种活化及扩大培养。

（1）地衣芽孢杆菌：

a）菌种活化：取地衣芽孢杆菌甘油管菌种，接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，140 r/min，34℃培养24h，牛肉膏蛋白胨平板计数。

b）菌种扩配：挑选牛肉膏蛋白胨平板计数上的单菌落，接种牛肉膏蛋白胨液体培养基中，34℃，140 r/min振荡培养24h。

（2）酪酸菌：

a）菌种活化：取酪酸菌甘油管菌种，接种到相应的种子培养基中，34℃厌氧培养15h，RCM平板计数。

b）菌种扩配：挑选RCM平板上的单菌落，接种于RCM液体培养基中，置于厌氧袋中，37℃厌氧培养24h。

2、种子罐培养菌种。

（1）一级种子罐培养

a）地衣芽孢杆菌：将经过扩大培养的地衣芽孢杆菌接种到地衣芽孢杆菌一级种子罐中，接种量2%，使用无菌空气通入罐中，罐压调整为0.04MPa，通风比控制为1:0.8，转速150r/min，温度34℃，培养时间18h。

b）酪酸菌：将经过扩大培养的酪酸菌接种到酪酸菌一级种子罐中，接种量2%，使用氮气从罐顶通入罐中，罐压调整为0.03MPa，转速控制90r/min，温度控制在34℃，厌氧培养20h。

（2）二级种子罐培养

a）地衣芽孢杆菌：将一级种子罐培养基的地衣芽孢杆菌接种到地衣芽孢杆菌二级种子罐中，接种量8%，使用无菌空气通入罐中，罐压调整为0.04MPa，通风比控制为1:0.8，转速150r/min，温度34℃，培养时间12h。

b）酪酸菌：接种量8%，将一级种子罐培养基的酪酸菌接种到酪酸菌二级种子罐中，使用氮气从罐顶通入罐中，罐压调整为0.03MPa，转速控制90 r/min，温度控制在34℃，厌氧培养14h。

所述地衣芽孢杆菌种子培养基配方为：牛肉膏0.4%、蛋白胨0.7%、氯化钠0.3%，培养基pH7.1。

所述酪酸菌种子培养基(RCM)配方为：酵母膏0.2%、牛肉膏1%、蛋白胨1%、可溶性淀粉0.09%、葡萄糖0.4%、半胱氨酸盐酸盐0.05%、氯化钠0.4%、乙酸钠0.4%。

3、发酵罐培养菌种。

所述的发酵罐培养包括以下步骤。

a）将地衣芽孢杆菌二级种子液按照重量百分比4%的比例接入到发酵罐中，罐压控制在0.04Mpa，通风比控制在1:0.6，转速150r/min，34℃，培养18h，之后停止通气，继续搅拌培养2h，镜检活菌数。

b）在步骤a）镜检活菌数在1.0×10⁹~3.0×10⁹CFU/ml时，将酪酸菌二级种子液按照重量百分比4%的比例接入到发酵罐中，转速110r/min，每隔1h搅拌5分钟，34℃培养28h，即得地衣芽孢杆菌与丁酸梭菌混合培养物。

当酪酸菌发酵至14h时，开始流加浓度为25%的葡萄糖溶液，当发酵至23h时，结束流加。

当酪酸菌发酵至15h时，开始流加由蛋白胨0.5%、0.05%的半胱氨酸盐酸盐、磷酸氢二钾0.02%组成的氮源补料培养基，当发酵至21h时，结束流加。

所述的发酵罐培养过程中用10%的稀盐酸或5%的氨水自动调控pH在7。

所述的发酵罐培养过程中碳源补充培养基与氮源补充培养基添加比例为1:1，总添加量控制在17%，最终发酵罐装料量控制在82%。

所述的发酵罐培养，在发酵结束前4h，将温度逐步提高至42℃，镜检活菌数在1.0×10⁹~5.0×10⁹CFU/ml，染色观察芽孢率在90%以上时，结束发酵。

4、菌体收集：地衣芽孢杆菌与酪酸菌的混合培养物利用管氏离心机离心，转速≥15000r/min，获得湿菌泥。

5、载体吸附：按照湿菌泥：玉米芯粉：碳酸钙=1:7:8的重量比混合吸附。

6、低温干燥：吸附后的菌泥通过流化床烘干，温度控制在50℃以下，水分控制在7%以内，粉碎过30目筛，得到地衣芽孢杆菌与酪酸菌的复合菌剂。

实施例3

1、菌种活化及扩大培养。

（1）地衣芽孢杆菌：

a）菌种活化：取地衣芽孢杆菌甘油管菌种，接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，160 r/min，37℃培养24h，牛肉膏蛋白胨平板计数。

b）菌种扩配：挑选牛肉膏蛋白胨平板计数上的单菌落，接种牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃，160 r/min振荡培养24h。

（2）酪酸菌：

a）菌种活化：取酪酸菌甘油管菌种，接种到相应的种子培养基中，37℃厌氧培养18h，RCM平板计数。

b）菌种扩配：挑选RCM平板上的单菌落，接种于RCM液体培养基中，置于厌氧袋中，37℃厌氧培养24h。

2、种子罐培养菌种。

（1）一级种子罐培养

a）地衣芽孢杆菌：将经过扩大培养的地衣芽孢杆菌接种到地衣芽孢杆菌一级种子罐中，接种量3%，使用无菌空气通入罐中，罐压调整为0.05MPa，通风比控制为1:1，转速180r/min，温度37℃，培养时间20h。

b）酪酸菌：将经过扩大培养的酪酸菌接种到酪酸菌一级种子罐中，接种量3%，使用氮气从罐顶通入罐中，罐压调整为0.04MPa，转速控制120 r/min，温度控制在37℃，厌氧培养24h。

（2）二级种子罐培养

a）地衣芽孢杆菌：将一级种子罐培养基的地衣芽孢杆菌接种到地衣芽孢杆菌二级种子罐中，接种量10%，使用无菌空气通入罐中，罐压调整为0.05MPa，通风比控制为1:1，转速180r/min，温度37℃，培养时间15h。

b）酪酸菌：接种量10%，将一级种子罐培养基的酪酸菌接种到酪酸菌二级种子罐中，使用氮气从罐顶通入罐中，罐压调整为0.04MPa，转速控制120 r/min，温度控制在37℃，厌氧培养16h。

所述地衣芽孢杆菌种子培养基配方为：牛肉膏0.5%、蛋白胨1%、氯化钠0.5%，培养基pH7.2。

所述酪酸菌种子培养基(RCM)配方为：酵母膏0.3%、牛肉膏1.2%、蛋白胨1.2%、可溶性淀粉0.12%、葡萄糖0.6%、半胱氨酸盐酸盐0.06%、氯化钠0.5%、乙酸钠0.5%。

3、发酵罐培养菌种。

所述的发酵罐培养包括以下步骤。

a）将地衣芽孢杆菌二级种子液按照重量百分比6%的比例接入到发酵罐中，罐压控制在0.05Mpa，通风比控制在1:0.8，转速180r/min， 37℃，培养20h，之后停止通气，继续搅拌培养3h，镜检活菌数。

b）在步骤a）镜检活菌数在1.0×10⁹~3.0×10⁹CFU/ml时，将酪酸菌二级种子液按照重量百分比6%的比例接入到发酵罐中，转速120r/min，每隔1h搅拌5分钟， 37℃培养30h，即得地衣芽孢杆菌与丁酸梭菌混合培养物。

当酪酸菌发酵至15h时，开始流加浓度为30%的葡萄糖溶液，当发酵至24h时，结束流加。

当酪酸菌发酵至16h时，开始流加由蛋白胨0.5%、0.05%的半胱氨酸盐酸盐、磷酸氢二钾0.02%组成的氮源补料培养基，当发酵至22h时，结束流加。

所述的发酵罐培养过程中用10%的稀盐酸或5%的氨水自动调控pH在7.2。

所述的发酵罐培养过程中碳源补充培养基与氮源补充培养基添加比例为1:1，总添加量控制在20%，最终发酵罐装料量控制在85%。

所述的发酵罐培养，在发酵结束前5h，将温度逐步提高至45℃，镜检活菌数在1.0×10⁹~5.0×10⁹CFU/ml，染色观察芽孢率在90%以上时，结束发酵。

4、菌体收集：地衣芽孢杆菌与酪酸菌的混合培养物利用管氏离心机离心，转速≥15000r/min，获得湿菌泥。

5、载体吸附：按照湿菌泥：玉米芯粉：碳酸钙=1: 10: 10的重量比混合吸附。

6、低温干燥：吸附后的菌泥通过流化床烘干，温度控制在50℃以下，水分控制在7%以内，粉碎过30目筛，得到地衣芽孢杆菌与酪酸菌的复合菌剂。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所做的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施方式仅限于此，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定专利保护范围。

Claims (4)

1.一种地衣芽孢杆菌与酪酸菌复合菌剂的制备方法，包括菌种的活化及扩配、种子罐培养、发酵罐培养、菌体离心收集、载体吸附及低温干燥，其特征在于，所述的发酵罐培养包括以下步骤：

a）将地衣芽孢杆菌二级种子液按照重量百分比2~6%的比例接入到发酵罐中，罐压控制在0.03MPa~0.05Mpa，通风比控制在1:0.5~1:0.8，转速120~180r/min，30~37℃，培养16-20h，之后停止通气，继续搅拌培养1~3h，镜检活菌数；

b）在步骤a）镜检活菌数在1.0×10⁹~3.0×10⁹CFU/ml时，将酪酸菌二级种子液按照重量百分比2~6%的比例接入到发酵罐中，转速100~120r/min，每隔1h搅拌5分钟，32~37℃培养26~30h，即得地衣芽孢杆菌与丁酸梭菌混合培养物；

当酪酸菌发酵至13~15h时，开始流加浓度为20~30%的葡萄糖溶液，当发酵至22~24h时，结束流加；

当酪酸菌发酵至14~16h时，开始流加由蛋白胨0.5%、0.05%的半胱氨酸盐酸盐、磷酸氢二钾0.02%组成的氮源补料培养基，当发酵至20~22h时，结束流加。

2.根据权利要求1所述的一种地衣芽孢杆菌与酪酸菌复合菌剂的制备方法，其特征在于：所述的发酵罐培养过程中用10%的稀盐酸或5%的氨水自动调控pH在6.8~7.2。

3.根据权利要求1所述的一种地衣芽孢杆菌与酪酸菌复合菌剂的制备方法，其特征在于：所述的发酵罐培养过程中碳源补充培养基与氮源补充培养基添加比例为1:1，总添加量控制在15-20%，最终发酵罐装料量控制在80~85%。

4.根据权利要求1所述的一种地衣芽孢杆菌与酪酸菌复合菌剂的制备方法，其特征在于：所述的发酵罐培养，在发酵结束前3~5h，将温度逐步提高至40~45℃，镜检活菌数在1.0×10⁹~5.0×10⁹CFU/ml，染色观察芽孢率在90%以上时，结束发酵。