CN107519486A - 于感染性与恶性疾病的治疗中提升免疫反应的方法 - Google Patents

于感染性与恶性疾病的治疗中提升免疫反应的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种治疗感染性及恶性疾病的新颖方法。本发明提供新颖DNA及蛋白疫苗，通过提升免疫反应，以治疗感染性及恶性疾病。

Description

于感染性与恶性疾病的治疗中提升免疫反应的方法
本申请是申请人为台北荣民总医院，发明名称为于感染性与恶性疾病的治疗中提升免疫反应的方法，申请号为201210210339.5，申请日为2012年06月25日的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种治疗感染性与恶性疾病的新颖方法。
背景技术
细胞毒T淋巴细胞抗原4(Cytotoxic T-lymphocyte antigen-4，CTLA-4)于1987年被发现为免疫球蛋白超家族中的一新成员，其特征在于其亦具有变异(V)或恒定(C)免疫球蛋白区的重要结构性特征(Brunet et al.,Nature 328,267-270)。报导指出CTLA-4对于调节免疫***亦扮演一重要的角色(Keilholz,U.,J Immunother 31,431-439)。CTLA-4被报导可通过与CD28竞争CD80/CD86的结合位置以降低T细胞的活化(Rudd et al.,ImmunolRev 229,12-26)。虽然CTLA-4可保护个体免于罹患自体免疫性疾病，但它亦会抑制抗癌的免疫力。为了避免CTLA-4于癌症治疗中可能造成的不良的免疫反应，已有许多方法在探讨如何操控T细胞的共刺激路径，以提升抗癌免疫反应。标靶CTLA-4疗法为众多先进的方法中的一种，且此方法已于后期的临床试验中显示出具潜力的结果(Hodi et al.,N Engl JMed 363,711-723；Hodi,F.S.,Asia Pac J Clin Oncol 6Suppl 1,S16-23；Weber,J.,Oncologist 13Suppl 4,16-25；及Ribas,A.,Oncologist 13Suppl 4,10-15)。抗CTLA-4的一种单株抗体，ipilimumab，已于2011年三月被FDA核准用以治疗转移性黑色素瘤。除了转移性黑色素瘤外，目前CTLA-4抗体于众多的临床试验中用于治疗恶性肿瘤，包括胰脏癌、大肠直肠癌、肝细胞癌、淋巴癌、激素抗拒性***癌、卵巢癌、及急性骨髓性白血病。
计划性死亡-1(Program death-1，PD-1)为CD28超家族中的一员，当与其的配体，计划性死亡配体1及2(PD-L1及PD-L2)，结合时可触发负向的讯号路径(Riley,J.L.,Immunol Rev 229,114-125)。PD-1与其配体间的交互作用会抑制增生、细胞激素的生成、及T细胞的细胞溶解功能，从而耗尽T细胞，并抑制其免疫反应。PD-1/PD-L路径对于耐受性及免疫力十分重要。此路径保护组织及器官免受免疫调控的伤害。然而，此路径已知会被慢性感染的病原菌及肿瘤所利用，以抑制抗微生物性及抗癌的免疫力。为了调控PD-1/PD-L路径的免疫调控活性，已有标靶此路径的疗法被发展，以用于治疗包含感染、自体免疫、乃至癌症等疾病(Weber,J.,Semin Oncol 37,430-439)。
虽然已有许多方法可通过标靶CTLA-4、PD-1/PD-L1/PD-L2、及其它免疫调控蛋白，以调控免疫反应来对抗感染性及恶性疾病；然而仍需一种可通过提升免疫力且同时避免抑制免疫反应的新颖方法，以用于抗癌及抗感染的治疗中。
发明内容
本发明提供一种医药组合物，可于治疗感染性或恶性疾病时，提升受治疗个体的免疫反应，该医药组合物包含一与表达载体结合的DNA构筑体，及医药可接受的载剂，其中该DNA构筑体包含一多核苷酸序列，该多核苷酸编码选自由细胞毒T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)、计划性死亡-1(PD-1)、计划性细胞死亡1配体1(PD-L1)、其片段或其功能性变异体、及其组合所组成的群组中任一者。
在另一方面中，本发明提供一种医药组合物，可于治疗感染性或恶性疾病时，提升受治疗个体的免疫反应，该医药组合物包含一重组多胜肽及一医药可接受的载剂，其中该重组多胜肽包含一多胜肽序列，该多胜肽序列选自由CTLA-4、PD-1、PD-L1、其片段或其功能性变异体、及其组合的多胜肽序列所组成的群组。
附图说明
于附图所示的具体实施例，其目的用于阐述本发明。然而，应明了的是，本发明并不局限于所示的较佳具体实施例。
于附图中：
图1a提供pVAC-1-IL2ss-hCTLA-4-PLAP的DNA及氨基酸序列。
图1b提供pVAC-1-IL2ss-mCTLA4-PLAP的DNA及氨基酸序列。
图2a显示经pVAC-1-IL2ss-hCTLA-4-PLAP免疫的小鼠，其产生的抗人类及鼠的CTLA-4抗体的结果。
图2b提供经pVAC-1-IL2ss-hCTLA-4-PLAP免疫的小鼠，于稀释1:50、1:100、1:200、1:400、及1:800倍时，所产生的抗体的效价标准曲线。
图3显示经以pVAC-1-IL2ss-hCTLA-4-PLAP免疫的小鼠，小鼠的B16黑色素瘤(B16F10肿瘤细胞)生长被抑制的结果。
图4提供经以pVAC-1-IL2ss-hCTLA-4免疫的小鼠及施以pVAC-1载体的对照组小鼠的体重比较结果，结果显示两组的间无差异。
图5a提供B16F10细胞数目与荧光酵素活性的关连性；其中该B16F10细胞可稳定表达荧光酵素(B16F10-luc)。
图5b结果显示源自pVAC-1-IL2ss-hCTLA-4-PLAP免疫的小鼠的脾细胞，其细胞毒杀能力被提升，使得B16F10-luc细胞存活率减少(于效应因子(脾细胞)：肿瘤细胞(B16F10-luc)为100:1及30:1的比例)。
图6提供经以pVAC-1-IL2ss-hCTLA-4-PLAP免疫的小鼠，经由B16F10-luc的刺激，提升脾细胞的干扰素γ的分泌量。
图7a显示以未与阳离子微脂体(即”裸露的DNA”)结合的pVAC-1-mCTLA-4-PLAP免疫小鼠，于1:50稀释的血清中无显著的抗鼠CTLA-4的抗体效价被诱发。
图7b及图7c提供相较于以裸露DNA对照组所免疫的小鼠，以与微脂体结合的pVAC-1-mCTLA-4-PLAP免疫小鼠，可产生抗人类及鼠的CTLA-4抗体的结果。
图8提供以pVAC-1-mCTLA-4DNA-微脂体复合物免疫的小鼠，其抑制RENCA肿瘤生长的结果。
图9a-图9n提供纯化的hCTLA-4及其受器B7.1及B7.2间的交互作用；该受器B7.1及B7.2分别稳定地在CHO-B7.1及CHO-B7.2上表达。该交互作用会被经以pVAC-1-IL2ss-hCTLA-4-PLAP免疫的小鼠的血清抑制。
图10提供标靶免疫调控蛋白的疫苗选殖策略，这些蛋白可为膜连结的蛋白(a)、或分泌的蛋白(b)，其可分别具有或不具有胎盘碱性磷酸酶(placental alkalinephosphatase，PLAP)的穿膜区域序列。于图10所示的A及B区域的DNA序列可编码选自由：CTLA-4、PD-1、PD-L1、其片段或其功能性变异体、及其组合所组成的群组中任一者。
图11a-图11h提供部分具体实施例的DNA及氨基酸序列，分别标靶根据本发明的人类蛋白，包括以下载体：图11a pVAC1-IL2ss-hPD-1(21-170aa)-PLAP(4167bp)、图11bpVAC1-IL2ss-hPD-1(21-170aa)(4171bp)、图11cpVAC1-IL2ss-hPD-L1(19-238aa)-PLAP(4377bp)、图11d pVAC1-IL2ss-hPD-L1(19-238aa)(4381bp)、图11e pVAC1-IL2ss-hCTLA4-hPD-1(21-170aa)-PLAP(4545bp)、图11f pVAC1-IL2ss-hCTLA4-hPD-1(21-170aa)(4443bp)、图11gpVAC1-IL2ss-hCTLA4-hPD-L1(19-238aa)-PLAP(4752bp)、及图11hpVAC1-IL2ss-hCTLA4-hPD-L1(19-238aa)(4650bp)。
图12a-图12h提供部分具体实施例的DNA及氨基酸序列，分别标靶根据本发明的鼠蛋白，包括以下载体：图12a pVAC1-IL2ss-mPD-1(21-170aa)-PLAP(4173bp)、图12b pVAC1-IL2ss-mPD-1(21-170aa)(4177bp)、图12cpVAC1-IL2ss-mPD-L1(19-127aa)-PLAP(4053bp)、图12dpVAC1-IL2ss-mPD-L1(19-127aa)(4057bp)、图12e pVAC1-IL2ss-mCTLA4-mPD-1(21-170aa)-PLAP(4560bp)、图12f pVAC1-IL2ss-mCTLA4-mPD-1(21-170aa)(4458bp)、图12gpVAC1-IL2ss-mCTLA4-mPD-L1(19-127aa)-PLAP(4440bp)、及图12h pVAC1-IL2ss-mCTLA4-mPD-L1(19-127aa)(4338bp)。
图13a-图13d提供部分具体实施例的DNA及氨基酸序列，分别标靶根据本发明的人类蛋白，包括以下载体：图13apVAC1-IL2ss-hCTLA4-hPD1(31-147aa)-hPDL1(19-127aa)、图13b pVAC1-IL2ss-hCTLA4-hPD1(31-147aa)-hPDL1(19-238aa)、图13c pVAC1-IL2ss-mCTLA4-mPD1(31-147aa)-mPDL1(19-127aa)、及图13d pVAC1-IL2ss-mCTLA4-mPD1(31-147aa)-mPDL1(19-237aa)。
图14a-图14b提供经以pVAC-1-IL2ss-mPD-L1-PLAP、pVAC-1-IL2ss-GM-CSF-mPD-L1-PLAP、pVAC-1-IL2ss-mCTLA4-mPD-L1-PLAP、pVAC-1-IL2ss-mPD-L1-mCTLA4-PLAP、及pVAC-1对照组载体免疫小鼠的结果。相较于对照组的pVAC-1载体，DNA疫苗所诱发的抗mPD-L1(图14a)及mCTLA-4(图14b)两者的抗体效价如图所示。
图15a-图15c提供经以pVAC-1-IL2ss-mCTLA4-mPD-L1-PLAP、pVAC-1-IL2ss-mCTLA4-mPD-1-PLAP、pVAC-1-IL2ss-mCTLA4-mPD-L1、pVAC-1-IL2ss-mCTLA4-mPD-1、及pVAC-1载体对照组免疫小鼠的结果。相较于对照组的pVAC-1载体，DNA疫苗所诱发的抗mCTLA-4、PD-1及mPD-L1的抗体效价如图所示。
图16提供经以pVAC-1-IL2ss-mCTLA4-mPD-L1-PLAP、pVAC-1-IL2ss-mCTLA4-mPD-1-PLAP、pVAC-1-IL2ss-mCTLA4-mPD-L1、及pVAC-1-IL2ss-mCTLA4-mPD-1免疫小鼠的结果，其可抑制RENCA肿瘤的生长。
图17提供经以pVAC-1-IL2ss-mCTLA4-mPD-L1-PLAP、pVAC-1-IL2ss-mCTLA4-mPD-1-PLAP、pVAC-1-IL2ss-mCTLA4-mPD-L1、及pVAC-1-IL2ss-mCTLA4-mPD-1，并与GM-CSF DNA结合以免疫小鼠的结果。结果显示可抑制RENCA肿瘤的生长。
图18提供经以pVAC-1-IL2ss-mCTLA4-mPD-L1及pVAC-1-IL2ss-mCTLA4-mPD-1免疫小鼠的结果，其可抑制CT26肿瘤的生长。
具体实施方式
除非另有定义，所有于此处所使用的技术性及科学性术语具有的意义，对于属于本发明的技术领域中技术人员为常识。当于此处使用时，以下术语具有其所属的意义，除非另有特别定义。
于此处使用到“一”时，是指一个或一个以上(如：至少一者)的文述的物体。例如，“一组件”意指一个组件或一个以上的组件。
“多核苷酸”或“核酸”一词指由核苷酸单元组成的聚合体。多核苷酸包括自然存在的核酸，像是脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)、及核糖核酸(ribonucleicacid，RNA)，以及核酸类似物，包括这些具有非天然存在的核苷酸，像是重组多核苷酸。多核苷酸可被合成，如：可使用一自动化DNA合成仪合成的。“核酸”一词典型地指大的多核苷酸。当核苷酸序列以DNA序列(如A、T、G、C)代表时，应可了解的是亦包括RNA序列(如A、U、G、C)；其中“U”取代“T”。“cDNA”一词指一DNA与mRNA成互补或与mRNA相同，且该cDNA可为单股或双股形式。
“编码”一词是指于多核苷酸(如：基因、cDNA、或mRNA)中的核苷酸的特定序列的固有功能，该序列可作为模板，用以合成生物反应中的其它聚合物及巨分子，这些聚合物及巨分子具有一定义的核苷酸序列(如rRNA、tRNA及mRNA)、或可为一定义的氨基酸序列，藉此以得到生物活性。因此，若由基因所产生的mRNA经过转录及转译而于细胞或其它生物***生成一蛋白，则称该基因编码该蛋白。应可为本技术领域的技术人员所理解的是，因遗传密码的简并性，多种不同的多核苷酸及核酸可编码相同的多胜肽。对于本技术领域的技术人员亦可理解的是，使用常规技术使核苷酸进行替换，且不会改变所述的多核苷酸所编码的多胜肽序列，以对应任何特定宿主生物体所需使用的密码子，以于该宿主生物体中表达该多胜肽。因此，除非另有特别所指，“多核苷酸编码一氨基酸序列”包括所有多核苷酸，其可互为简并形式，且其编码相同的氨基酸序列。多核苷酸编码蛋白质及RNA，可能包括内含子。
“重组多核苷酸”一词指一多核苷酸具有非天然连结成的序列。一重组多核苷酸可以一载体形式存在。“载体”可包含特定的感兴趣核苷酸序列，及一调控序列；载体可被用以表达该特定的核苷酸序列、或用以维持该核苷酸序列以供复制、操控、或于不同位置间进行转移(如：不同生物体间)。载体可被引入一适当宿主细胞，以进行前述的目的。
载体的例子包含，但不限于：质体、黏质体、噬菌体、YACs、或PACs。典型地，于载体中，特定的核苷酸序列可与调控序列连结，像是当该载体被引入一宿主细胞内时，该特定的核苷酸序列可经由调控序列的控制，于该宿主细胞内表达。该调控序列可包含，例如但非局限，启动子序列、起始密码子、复制子、增强子、操控子序列、分泌信号序列(如IL2信号胜肽)、及其它控制序列。较佳地，载体可进一步含有标记子序列(如：抗生素抗性的标记子序列)，供后续筛选步骤所用。
“多胜肽”一词指分子或多分子，由氨基酸残基透过胜肽键连结所组成。多胜肽可被合成，例如，使用一自动化多胜肽合成仪。“蛋白”一词典型地指大型的多胜肽。“胜肽”一词典型地指短的多胜肽。
氨基酸可通过三个字母或一个字母所表示。表1所列为标准氨基酸缩写。
表1：标准氨基酸缩写
氨基酸 3个字母 1个字母
丙氨酸 Ala A
精氨酸 Arg R
天冬酰氨 Asn N
天门冬氨酸 Asp D
半胱氨酸 Cys C
谷氨酸 Glu E
谷氨酰氨 Gln Q
甘氨酸 Gly G
组氨酸 His H
异白氨酸 Ile I
白氨酸 Leu L
赖氨酸 Lys K
甲硫氨酸 Met M
苯丙氨酸 Phe F
脯氨酸 Pro P
丝氨酸 Ser S
苏氨酸 Thr T
色氨酸 Trp W
酪氨酸 Tyr Y
缬氨酸 Val V
“疫苗”一词是指一含有活性成分的药剂或组合物；该活性成分可有效诱导个体产生治疗程度的免疫力，已对抗特定病原菌或疾病。传统上，疫苗的活性成分为衍生自病原菌的多胜肽，该病原菌即为疫苗的目标。“DNA疫苗”一词指活性成分为DNA的疫苗。“蛋白疫苗”一词指活性成分为多胜肽的疫苗。
“医药组合物”一词指适用于个体的医药用途的组合物。医药组合物包含有效量的活性物质及医药可接受的载剂。“有效量”一词指该物质的量可有效产生所欲的结果，像是本发明中的免疫反应。“医药可接受的载剂”一词指任何标准的医药载剂、缓冲液及赋形剂，像是磷酸缓冲盐水溶液、5％葡萄糖液态溶液、及乳化剂，像是油包水、或水包油乳化剂，及各种不同形式的润湿剂、及/或佐剂。较佳的医药载剂需视活性物质的欲投予的模式决定。投予的典型模式包括肠内的(如口服)、或非经口的(如皮下的、肌肉、静脉、或腹腔注射；或局部、经皮的、或经黏膜的投予)。“佐剂”一词指药学的或免疫学的药剂，其可修饰其它药剂(如药物、疫苗)的作用，当单独投予佐剂时，仍可具有少量的直接效果。佐剂通常包括于疫苗内，以提升接受对象对于所提供的抗原的免疫反应，同时使所注射的外来物质维持于低量。
“个体”一词为人类或非人类的哺乳动物。非人类的哺乳动物包括，但不限于灵长类、有蹄类、犬、及猫。
“裸露的DNA”一词指DNA构筑体(用以投予一个体)，其未与微脂体结合。
多胜肽(或蛋白)的“片段”一词指一多胜肽的氨基端及/或羧基端被去除，但所剩余的氨基酸序列与对应位置的天然存在的序列所演绎者相同，例如，来自全长的DNA序列。片段典型地为至少10个氨基酸长度，较佳地为10至50个氨基酸长度、更佳地为50至100个氨基酸长度、再佳地为超过100个氨基酸长度。
一多胜肽(或蛋白)的“功能性变异体”指将本发明的多胜肽(或蛋白)的主要氨基酸序列进行一个或多个修饰的多胜肽，其仍可保有于本文所述的免疫促进功效。若本发明的多胜肽(或蛋白)的功能性变异体涉及氨基酸的替换、保守氨基酸替换典型地较佳为，如：替换时仍保有原本氨基酸的一特性，如大小、电荷、疏水性、构形等。保守氨基酸替换的实例包括于下列群组中的氨基酸进行替代：(1)M、I、L、V；(2)F、Y、W；(3)K、R、H；(4)A、G；(5)S、T；(6)Q、N；及(7)E、D。其它适用的替换可由具技艺者所轻易建立，且亦可额外地通过参考公开文献决定如Voet,Biochemistry,Wiley,1990；Stryer Biochemistry 4th Ed.,FreemanN.Y.,1995；Peptide Chemistry.A Practical Textbook,2nd ed.,Miklos Bodanszky,Springer-Verlag,Berlin,1993；Principles of Peptide Synthesis,2nd ed.,MiklosBodanszky,Springer-Verlag,Berlin,1993；Chemical Approaches to the Synthesis ofPeptides and Proteins,P.Lloyd-Williams,F.Albericio,E.Giralt,CRC Press,BocaRaton,1997；Bioorganic Chemistry:Peptides and Proteins,S.M.Hecht,Ed.,OxfordPress,Oxford,1998,Synthetic Peptides:A User's Guide,Gregory A.Grant(Editor),Oxford University Press,2002、及其类似文献，前述所有文献皆被引用于本文中。
本发明的医药组合物可由公知方法，伴随一个或多个医药可接受的载剂制备。于此处所用的“医药可接受的载剂”一词包含任何标准的医药载剂。该载剂可包括，但不限于：食盐水、缓冲食盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其组合。
本发明提供一种医药组合物，可于治疗感染性或恶性疾病时，提升受治疗个体的免疫反应，该医药组合物包含一与表达载体结合的DNA构筑体，及医药可接受的载剂，其中该DNA构筑体包含一多核苷酸序列，该多核苷酸编码选自由胞毒T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)、计划性死亡-1(PD-1)、计划性细胞死亡1配体1(PD-L1)、其片段或其功能性变异体、及其组合所组成的群组中任一者。
根据一具体实施例，本发明的医药组合物包含一DNA构筑体，其包含一多核苷酸序列，该多核苷酸序列编码CTLA-4，并与pVAC-1载体融合，且该组合物于黑色素瘤及肾细胞癌模式中提供保护效果。
可推测的是，同时阻断CTLA-4及PD-1及/或PD-L1应可进一步提升抗病原菌及癌细胞的免疫力。根据特定具体实施例，本发明的医药组合物有能力可诱发专一抗CTLA-4及PD-1及/或PD-L1的免疫力。于部分具体实施例中，本发明的医药组合物包含一DNA构筑体，其编码CTLA-4及PD-1，并与一载体融合，如：pVAC-1-IL2ss-CTLA4-PD-1-PLAP及pVAC-1-IL2ss-CTLA4-PD-1。于部分具体实施例中，本发明的DNA疫苗包含DNA构筑体，其编码CTLA-4及PD-L1，如：pVAC-1-IL2ss-CTLA4-PD-L1-PLAP及pVAC-1-IL2ss-CTLA4-PD-L1。于这些具体实施例中，于试验小鼠的抗两种抗原的抗体效价皆被提高，以及其内的肿瘤生长皆被大幅度抑制。
根据本发明，该DNA疫苗具有多种优点超越已存在的疗法，这些已存在的疗法亦标靶与CTLA-4、PD-1、PD-L1及其它免疫调控路径有关连的相似路径，像是使用抗体来对抗CTLA-4、PD-1、PD-L1及其它免疫调控分子。例如，相较于抗体，DNA疫苗的大量生产较为容易，以及成本较低。再者，本发明的CTLA-4-PD-1、CTLA-4-PD-L1及CTLA-4-PD-1-PD-L1融合DNA疫苗提供一种单一疗法，可用以同时抑制此二或三种重要的药物目标。若欲投予多种专一辨识CTLA-4、PD-1、或PD-L1的抗体以可能达到更多可能的免疫力，此方式则较为困难，且增加递送多种抗体的费用。此外，投予两种实验性药物相关的管制问题将会阻碍此种结合性疗法的初期试验。该融合基因DNA疫苗策略可提供一同时操控多种免疫统路径的方式，且不需投予多种试验性疗法，这些投予多种试验性疗法既不具经济效益的可行性，亦不为多数国家的官方政体所允许。
本发明的其它具体实施例中，多种DNA构筑体被选殖为DNA疫苗，其可由一个以上的人类、鼠、人类及鼠的嵌合体、其它生物、或人类及其它生物的嵌合体的DNA序列(像是这些编码CTLA-4、PD-1、PD-L1、或其它的DNA序列)所组成。该DNA序列可能编码与免疫统功能、或感染性疾病的致病机转、或恶性肿瘤的肿瘤生成有关的蛋白，像是CTLA-4、PD-1、PD-L1、其片段或其功能性变异体、及其组合。
在另一方面中，本发明提供一种医药组合物，可于治疗感染性或恶性疾病时，提升受治疗个体的免疫反应，该医药组合物包含一重组多胜肽及一医药可接受的载剂，其中该重组多胜肽包含一多胜肽序列，该多胜肽序列选自由CTLA-4、PD-1、PD-L1、其片段或其功能性变异体、及其组合的多胜肽序列所组成的群组。
本发明的具体实施例中，该个体以抗感染性或抗癌药物治疗，造成该个体的免疫反应受到刺激。于本发明的一实例中，该个体受恶性疾病的治疗。
根据本发明，该恶性疾病可为转移性黑色素瘤、胰脏癌、大肠直肠癌、肝细胞癌、淋巴癌、激素抗拒性***癌、卵巢癌、急性骨髓性白血病、或非小细胞肺癌。
根据一具体实施例，本发明的医药组合物包含重组多胜肽，该重组多胜肽包含CTLA-4及PD-1、CTLA-4及PD-L1或CTLA-4及PD-1及PD-L1的多胜肽序列，且该组合物于黑色素瘤及肾细胞癌模式中提供保护效果。
本发明进一步以下列实施例阐述，这些实施例仅意欲供证实的例，而非用以局限本发明。
实施例1：DNA疫苗构筑体的选殖
为了构筑CTLA-4的DNA疫苗，选殖人类或小鼠的CTLA-4序列，并于N端及C端分别与IL2分泌信号序列(IL2ss)及胎盘碱性磷酸酶(PLAP)的穿膜区域序列融合，再将之构筑入哺乳动物表达质体，pVAC-1。所得的pVAC1-IL2ss-hCTLA-4-PLAP(SEQ ID NO:1)及pVAC1-IL2ss-mCTLA-4-PLAP(SEQ ID NO:2)的DNA序列皆列示于图1a及图1b中。这些DNA疫苗，如单独仅有人类或鼠的PD-1或PD-L1者、以及由CTLA-4及PD-1及/或PD-L1所组成的人类或鼠的融合基因构筑体，以及于C端具有或不具有PLAP的穿膜区域者，皆被构筑并列示于下文及图10中：
(1)pVAC-1-IL2ss-hPD-L1(含有编码人类PD-L1的DNA序列)；
(2)pVAC-1-IL2ss-hPD-1(含有编码人类PD-1的DNA序列)；
(3)pVAC-1-IL2ss-hCTLA4-hPD-L1(含有编码人类CTLA-4及PD-L1的DNA序列)；
(4)pVAC-1-IL2ss-hCTLA4-hPD-1(含有编码人类CTLA-4及PD-1的DNA序列)；
(5)pVAC-1-IL2ss-hCTLA4-hPD-1-hPD-L1(含有编码人类CTLA-4、PD-1及PD-L1的DNA序列)；
(6)pVAC-1-IL2ss-mPD-L1(含有编码小鼠PD-L1的DNA序列)；
(7)pVAC-1-IL2ss-mPD-1(含有编码小鼠PD-1的DNA序列)；
(8)pVAC-1-IL2ss-mCTLA4-mPD-L1(含有编码小鼠CTLA-4及PD-L1的DNA序列)；
(9)pVAC-1-IL2ss-mCTLA4-mPD-1(含有编码小鼠CTLA-4及PD-1的DNA序列)。
(10)pAC-1-IL2ss-mCTLA4-mPD-1-mPD-L1(含有编码小鼠CTLA-4、PD-1及PD-L1的DNA序列)。
实施例2：重组多胜肽的构筑及纯化
为了构筑CTLA-4-PD-1及CTLA-4-PD-L1的重组多胜肽，以与PD1或PD-L1融合的小鼠CTLA-4构筑入E.Coli表达载体，pET56。以镍-树脂亲和柱(nickel-resin affinitycolumn)纯化所得的mCTLA-4-mPD-1-His6及mCTLA-4-mPD-L1-His6的蛋白序列分别为SEQ IDNO:31及SEQ ID NO:32。
实施例3：制备微脂体及微脂体/DNA复合物
PC-PEG-PE微脂体如下所制备：将5.9mg的PC(l,2-二棕榈酰-sn-甘油-3乙基磷酸胆碱)与14.6mg的PEG(1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3磷酸乙醇氨-N-聚乙二醇-5000)(AvantiPolar Labs,Inc.)分别溶解于2ml的溶剂(90％氯仿、10％MeOH)及1ml的MeOH中，并置入500ml圆底烧瓶中。将烧瓶置于旋转蒸发器上，于55℃、真空下进行旋转，直到液体消失。将烧瓶进一步进行真空干燥，于室温30分钟、加热5分钟的三个循环。将溶于6ml PBS中的6mg聚乙烯亚氨(PE)(Sigma Aldrich)加入旋转中的烧瓶，并进行10分钟加热、30分钟室温的五个循环。将最终溶液以蒸馏水调整至6ml，并进行一次冷冻解冻步骤(从-20℃至4℃)。将该溶液以一列滤膜(1.2、0.8、0.45、及0.22μm)过滤，且仍维持于60℃的水浴中，以得到PC-PEG-PE微脂体。该微脂体/DNA(如实施例1所得的DNA构筑体)复合物需于注射入小鼠前两小时内新鲜制备。将微脂体与制备好的DNA(1mg/ml)以等量体积、于室温混合20分钟。于投予各试验老鼠前，再将该微脂体/DNA复合物以PBS调整至100μL。
实施例4：以pVAC-1-IL2ss-mCTLA-4、pVAC-1-IL2ss-hCTLA-4、pVAC-1-IL2ss-mCTLA-4-mPD-L1、及pVAC-1-IL2ss-mCTLA-4-mPD-1免疫小鼠
将不同量(从0、25、50至100μg)的pVAC-1-IL2ss-mCTLA-4、pVAC-1-IL2ss-hCTLA-4、及pVAC-1对照组载体，以肌肉注射至6-7周龄的C57BL/6及Balb/c小鼠。其中这些DNA分别可为裸露DNA形式、或分别与两种微脂体中的一者结合，Nancy-Templeton(Templeton etal.,Nat Biotechnol 15,647-652)所发展的DOTAP:Chol、或前述制备的PC-PEG-PE。每周进行一次免疫，长达四周。
实例5：检测抗CTLA-4、PD-1、及PD-L1的血清抗体
经以前述DNA疫苗肌肉注射免疫四周的小鼠，采小鼠血清并分析其对于PD-1、PD-L1、以及人类及小鼠CTLA-4的专一性。为了检测抗mCTLA-4、hCTLA-4、mPD-L1及mPD-1的可能的抗体，将1μg/ml(于pH 8.4的硼酸盐(BS)缓冲液中)的这些蛋白(R&D systems,Minneapolis,MN,USA)于室温下固着于96孔的EIA盘4小时，再以含有1％(w/v)的牛血清白蛋白(BS–BSA)的硼酸盐水进行封闭。以BS–BSA将小鼠血清进行2倍的连续稀释(1:100至1:3200)后，将其加入二重复孔洞中，并将的置于4℃培养隔夜。的后，将盘子以含有0.05％(v/v)Tween-20的PBS冲洗，并与经BS–BSA稀释至1:2000且与HRP结合的山羊抗鼠IgG，于室温培养2小时。将HRP受质(2,2’-次偶氮基-双(乙基苯并噻唑啉磺酸))加入，并于室温培养20分钟。吸光值以405nm于ELISA分析仪上测量。于图2中，来自被pVAC-1-IL2ss-hCTLA4-PLAP免疫的小鼠血清表达出对于重组人类CTLA4专一的免疫力，且对于小鼠的CTLA4具有较低程度的免疫力；然而，经以pVAC-1对照组载体免疫的小鼠的血清，对于人类及小鼠的CTLA4，皆无显著的结合活性。当试验小鼠以编码融合基因的DNA疫苗免疫时，这些融合基因包括mCTLA4-PD-L1-PLAP、mCTLA4-PD-L1、mCTLA4-PD-1-PLAP、或mCTLA4-PD-1，其皆可诱发mCTLA4及mPD-1、或mCTLA4及mPD-L1的抗血清，如图15所示。
实施例6：CTLA4DNA疫苗的效力研究
黑色素瘤细胞(B16F10)被用以探讨本发明的DNA疫苗的效力。为了分析抗CTLA-4的免疫力的保护效果，以B16F10黑色素瘤细胞接种经本发明的pVAC-1-IL2ss-hCTLA-4-PLAP(“hCTLA4”)免疫的c57/BL小鼠。如图3所示，经hCTLA4免疫的小鼠的B16F10肿瘤生长速率显著地低于投予对照组pVAC-1载体(p＝0.004)的小鼠。虽然经hCTLA4免疫的小鼠获得对抗CTLA-4的免疫反应足以抑制肿瘤生长，但这些小鼠并无出现任何结肠炎的症状，此症状为投予抗CTLA-4单株抗体的癌症病患的试验中最常见副作用(Di Giacomo et al.,CancerImmunol Immunother 58(8):1297-306)。经以pVAC-1-IL2ss-hCTLA-4-PLAP DNA疫苗或对照组pVAC-1载体处理五周的小鼠，其于体重增重上并无可区别的差异(参见图4)。
实施例7：分析对于癌细胞的细胞毒杀能力
为了要了解pVAC-1-IL2ss-CTLA-4-PLAP疫苗的抗癌效果的机制，牺牲免疫后的小鼠，并收集其脾细胞，用以分析对于癌细胞的细胞毒杀效果。由脾细胞所调控的细胞毒杀能力，使用先前筛选所得的可稳定表达荧光酵素的B16F10细胞(B16F10-luc细胞)测量，其细胞数目已证实与荧光酵素活性有很好的关连性；该荧光酵素活性以每秒的光子计数来表示(参见5a)。将B16F10-luc细胞(2000细胞/孔)置于含有100倍、或30倍(2x105或6x104细胞)的脾细胞的96孔中。经培养一天后，将荧光酵素受质，荧光素(luciforin)，加入这些细胞中，并以IVIS影像统以每秒的光子计数来量化细胞存活率。结果证实源自以pVAC-1-IL2ss-CTLA-4-PLAP免疫的小鼠的脾细胞对于B16F10细胞存活率上有显著的功效(参见图5b)。
实施例8：干扰素γ的测量
为了要了解脾细胞对于B16F10-luc的免疫反应，遂测量干扰素γ产生的量。将免疫小鼠的脾细胞与CTLA4抗原一起培养，并以专用于测量干扰素γ的ELISA套组(R&Dsystem)测量受刺激而分泌的干扰素γ。相似地，源自经对照组pVAC-1或本发明的pVAC-1-IL2ss-CTLA-4-PLAP免疫的含肿瘤小鼠的脾细胞，以相应的肿瘤细胞刺激，再测量干扰素γ的分泌量。取自pVAC-1-IL2ss-CTLA-4-PLAP DNA疫苗免疫的小鼠的脾细胞所产生的干扰素γ高于取自以pVAC-1免疫的对照组小鼠者(参见图6)。
实施例9：经微脂体结合的DNA疫苗的效力研究
鼠肾细胞癌(RENCA)亦被用于效力试验。以鼠肾细胞癌模式的balb/c小鼠的动物试验进行。将该小鼠以pVAC-1-mCTLA-4-PLAP免疫以于小鼠中产生更专一于自体抗原的抗体。在无与阳离子微脂体结合情况下，该”裸露的”pVAC-1-mCTLA-4DNA疫苗无法引起显著的抗mCTLA-4抗体效价(参见图7a)。既然如实施例3所制备的阳离子微脂体与DNA疫苗结合者后可增加转染效率及提升免疫反应，遂探讨该pVAC-1-mCTLA-4-微脂体复合物于诱发抗小鼠CTLA-4的免疫反应，以提供一更佳形式的DNA疫苗。此一方法实质地诱发抗小鼠CTLA-4的抗体效价，及较低程度的抗人类CTLA-4抗体效价(图7b及图7c)。相较于以对照组pVAC-1DNA疫苗、或仅经裸露的pVAC-1-mCTLA-4DNA疫苗免疫者，经以pVAC-1-mCTLA-4-微脂体复合物免疫的小鼠亦显示对于肾细胞癌(RENCA)的生长抑制(参见图8，pVAC-1-mCTLA4-微脂体复合物与对照组DNA疫苗相比较：p<0.01)。
实施例10：流式细胞分析法
考虑到CTLA-4是通过与抗原呈现细胞表面上的CD-80(B7.1)及CD-86(B7.2)结合而发挥其功能的，遂以纯化的被6个组氨酸(His6)标记的CTLA-4蛋白及可稳定表达B7.1及B7.2的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞来探讨小鼠血清对此等蛋白间交互作用的抑制效果。可稳定表达B7.1或B7.2的CHO细胞由台湾、台北的中央研研院的Dr.M.H.所提供。将细胞(5x105)与2ng/ml的6个组氨酸标记的人类CTLA，以及与或不与经pVAC-1-IL2ss-hCTLA-4DNA疫苗或对照组DNA疫苗免疫小鼠的血清，于4℃培养30分钟。结合的蛋白可由FITC标记的鼠抗his6抗体，于1:200倍时检测，并进行FACS分析。结果显示于图9，结果指出His6-人类CTLA-4(2ng/ml)与于稳定转染的CHO细胞(5x105细胞/试验)上所表达的B7.1/B7.2的间的交互作用会被经pVAC-1-IL2ss-hCTLA-4-PLAP DNA疫苗免疫小鼠的血清所阻断，其中于1：25稀释时，这些对照组的血清并无发现此种抑制作用的现象(参见图9)。
实施例11：抗CTLA-4、PD-1及PD-L1的DNA疫苗的其它研究
除了pVAC-1-IL2ss-CTLA-4-PLAP DNA疫苗的具潜力的结果的外，其它标靶多种免疫抑制蛋白，包括CTLA-4、PD-1及PD-L1的DNA疫苗遂被构筑(参见图11及图12)，并探讨其效力；其构筑亦基于pVAC-1载体，且相似于pVAC-1-IL2ss-CTLA-4-PLAP。根据本发明，这些疫苗包括：
pVAC1-IL2ss hPD-1-PLAP(SEQ ID NO:3)；
pVAC1-IL2ss hPD-1(SEQ ID NO:4)；
pVAC1-IL2ss hPD-L1-PLAP(SEQ ID NO:5)；
pVAC1-IL2ss hPD-L1(SEQ ID NO:6)；
pVAC1-IL2ss hCTLA4-hPD-1-PLAP(SEQ ID NO:7)；
pVAC1-IL2ss hCTLA4-hPD-1(SEQ ID NO:8)；
pVAC1-IL2ss hCTLA4-hPD-L1-PLAP(SEQ ID NO:9)；
pVAC1-IL2ss hCTLA4-hPD-L1(SEQ ID NO:10)；
pVAC1-IL2ss mPD-1-PLAP(SEQ ID NO:11)；
pVAC1-IL2ss mPD-1(SEQ ID NO:12)；
pVAC1-IL2ss mPD-L1-PLAP(SEQ ID NO:13)；
pVAC1-IL2ss mPD-L1(SEQ ID NO:14)；
pVAC1-IL2ss mCTLA4-mPD-1-PLAP(SEQ ID NO:15)；
pVAC1-IL2ss mCTLA4-mPD-1(SEQ ID NO:16)；
pVAC1-IL2ss mCTLA4-mPD-L1-PLAP(SEQ ID NO:17)；及
pVAC1-IL2ss mCTLA4-mPD-L1(SEQ ID NO:18)；
其中该IL2讯号胜肽(IL2ss)(SEQ ID NO:19)作为讯号胜肽，其含有21个氨基酸，且与其它分泌蛋白的讯号胜肽一样具有常见的特征，该特征关于疏水性氨基酸的丰裕度及位置；IL2ss的细胞内切割会发生在Ser20的后，并导致该抗原蛋白的分泌；限制性酶切位点为BamHI或EcoRI；疏水性COOH-端序列的32个残基(“PLAP”衍生自胎盘碱性磷酸酶)为一穿膜区域，以拴住被转译的蛋白质至细胞膜上(SEQ ID NO:20)；标靶hCTLA4的序列为编码hCTLA4(SEQ ID NO:21)的第37至160个残基的氨基酸序列的DNA序列；标靶mCTLA4的序列为编码mCTLA4(SEQ ID NO:22)的第36至161个残基的氨基酸序列的DNA序列；标靶hPD-1的序列为编码人类计划性细胞死亡蛋白1(hPD-1)(SEQ ID NO:23)的第21至170个残基的氨基酸序列的DNA序列；标靶mPD-1的序列为编码老鼠计划性细胞死亡蛋白1(mPD-1)(SEQ ID NO:24)的第21至170个残基的氨基酸序列的DNA序列；标靶hPDL-1的序列为编码人类计划性细胞死亡1配体1(hPD-L1)(SEQ ID NO:25)的第19至238个残基的氨基酸序列的DNA序列；以及标靶mPD-L1的序列为编码老鼠计划性细胞死亡1配体1(mPD-L1)(SEQ ID NO:26)的第19至127个残基的氨基酸序列的DNA序列；标靶hCTLA4及hPD-1的序列为编码hCTLA4的第37至160个残基的氨基酸序列及hPD-1的第21至170个残基的氨基酸序列的DNA序列(hCTLA4-hPD-1)(SEQ ID NO:27)；标靶hCTLA4及hPD-L1的序列为编码hCTLA4的第37至160个残基的氨基酸序列及PD-L1的第19至238个残基的氨基酸序列的DNA序列(hCTLA4-hPD-L1)(SEQ ID NO:28)；标靶mCTLA4及mPD-1的序列为编码mCTLA4的第36至161个残基的氨基酸序列及mPD-1的第21至170个残基的氨基酸序列的DNA序列(mCTLA4-mPD-1)(SEQ ID NO:29)；以及标靶mCTLA4及mPD-L1的序列为编码mCTLA4的第36至161个残基的氨基酸序列及mPD-L1的第19至127个残基的氨基酸序列的DNA序列(mCTLA4-mPD-L1)(SEQ ID NO:30)。
根据本发明，亦可构筑其它DNA疫苗标靶多于两种免疫抑制蛋白，如pVAC1-IL2ss-CTLA4-PD-1-PD-L1。部分具体实施例显示于图13并列于下方：
(1)pVAC1-IL2ss-hCTLA4-hPD1-hPDL1(SEQ ID NO:33or SEQ ID NO:34)；及
(2)pVAC1-IL2ss-mCTLA4-mPD1-mPDL1(SEQ ID NO:35or SEQ ID NO:36)；其中标靶hCTLA4、hPD-1及hPD-L1的序列为编码hCTLA4的第37至160个残基的氨基酸序列、hPD-1的第31至147个残基的氨基酸序列的DNA序列及hPD-L1的第19至127或19至238个残基的氨基酸序列的DNA序列(hCTLA4-hPD-1-hPD-L1)；标靶mCTLA4、mPD-1及mPD-L1的序列为编码mCTLA4的第36至161个残基的氨基酸序列、mPD-1的第31至147个残基的氨基酸序列的DNA序列及mPD-L1的第19至127或19至237个残基的氨基酸序列的DNA序列(mCTLA4-mPD-1-mPD-L1)。
以如同前述实施例中所采用的pVAC-1-IL2ss-CTLA4-PLAP DNA疫苗的相似的免疫步骤来探讨这些抗原的免疫力。从这些构筑体所得的正面结果，证实通过以pVAC-1-IL2ss-mCTLA4-PD-L1-PLAP或pVAC-1-IL2ss-mPD-L1-CTLA-4-PLAP免疫小鼠，就同时增加抗鼠CTLA-4及PD-L1的抗体效价而言，可提升其免疫力(图14)。如图14所示，该虚线代表经注射对照组pVAC-1载体的对照组的血清抗体效价，而来自受前述DNA疫苗注射的小鼠的血清以对照组小鼠的数据标准化(疫苗组vs.对照组相：*＝p<0.05，**＝p<0.01)。
实施例12：以pVAC-1-IL2ss-mCTLA-4-mPD-L1-PLAP、pVAC-1-IL2ss-mCTLA-4-mPD-L1、pVAC-1-IL2ss-mCTLA-4-mPD-1-PLAP、pVAC-1-IL2ss-mCTLA-4-mPD-1、或pVAC-1对照组载体免疫小鼠
以70μg的pVAC-1-IL2ss-mCTLA-4-mPD-L1-PLAP、pVAC-1-IL2ss-mCTLA-4-mPD-L1、pVAC-1-IL2ss-mCTLA-4-mPD-1-PLAP、pVAC-1-IL2ss-mCTLA-4-mPD-1、或pVAC-1DNA疫苗，肌肉注射至6至7周龄的Balb/c小鼠，每周一次，长达三周。第四次免疫亦是使用相同量的DNA疫苗，但在肌肉注射DNA后立刻将两支电极针置于注射部位的侧面，并以2脉冲的电压、1,000V/cm进行电穿孔。诱发的抗CTLA4、PD-1及PD-L1的抗血清的测量方式如同实施例5中所述者。相较于源自pVAC-1(载体对照组)免疫小鼠者，经以pVAC-1-IL2ss-mCTLA-4-mPD-L1-PLAP、pVAC-1-IL2ss-mCTLA-4-mPD-L1、pVAC-1-IL2ss-mCTLA-4-mPD-1-PLAP、及pVAC-1-IL2ss-mCTLA-4-mPD-1免疫小鼠的血清皆显示增加的抗CTLA4的抗体效价(pVAC-1-IL2ss-mCTLA-4-mPD-L1与pVAC-1相比较：p<0.05，图15a)。再者，相较于源自pVAC-1免疫小鼠的血清，源自以pVAC-1-IL2ss-mCTLA-4-mPD-1-PLAP、pVAC-1-IL2ss-mCTLA-4-mPD-1、及这些以pVAC-1-IL2ss-mCTLA-4-mPD-L1-PLAP及pVAC-1-IL2ss-mCTLA-4-mPD-L1免疫的小鼠血清，皆分别显示出具有抗PD-1的抗体效价(图15b)及PD-L1的抗体效价(图15c)。
实施例13：以融合DNA构筑体免疫小鼠以提供对抗肾细胞癌的保护功效
在一并投予30μg的pORF-GM-CSF(作为疫苗佐剂)或pORF载体(对照组)的情况下，以pVAC-1-IL2ss-mCTLA-4-mPD-L1-PLAP、pVAC-1-IL2ss-mCTLA-4-mPD-L1、pVAC-1-IL2ss-mCTLA-4-mPD-1-PLAP、pVAC-1-IL2ss-mCTLA-4-mPD-1、或pVAC-1DNA疫苗免疫小鼠。这些小鼠受四周的DNA肌肉注射。于第四周最后一次注射后亦于注射部位施行实施例12所述的立即性电穿孔。最后一次注射后一周，将小鼠以皮下注射方式接种鼠的肾细胞癌，RENCA(2x104细胞/小鼠)。如图16及图17所示，相较于以pVAC-1载体对照组免疫的小鼠，经融合DNA疫苗免疫的小鼠，尤其是pVAC-1-IL2ss-mCTLA4-mPD-L1及pVAC-1-IL2ss-mCTLA4-mPD-1，显示可显著地抑制肿瘤的生长(有与GM-CSF DNA共同投予免疫(图17)或没有与GM-CSFDNA共同投予免疫(图16))。
对于该领域技术人员可明了的是，上述具体实施例可于不背离本发明的广义概念下而修改。因此，应明了本发明并非局限于所公开的特定具体实施例，但此意欲包含属于本发明的精神及范畴内的各种变化，即如同所附的权利要求。

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atgtatagga tgcaactgct gtcttgcatt gctctgtctc tggcactggt cactaactct 60
gccaggatcc tggcaatgca cgtggcccag cctgctgtgg tactggccag cagccgaggc 120
atcgccagct ttgtgtgtga gtatgcatct ccaggcaaag ccactgaggt ccgggtgaca 180
gtgcttcggc aggctgacag ccaggtgact gaagtctgtg cggcaaccta catgatgggg 240
aatgagttga ccttcctaga tgattccatc tgcacgggca cctccagtgg aaatcaagtg 300
aacctcacta tccaaggact gagggccatg gacacgggac tctacatctg caaggtggag 360
ctcatgtacc caccgccata ctacctgggc ataggcaacg gaacccagat ttatgtaatt 420
gatccagaac cgtgcccaga ttctgaattc accactgatg ctgcccatcc tggaaggtct 480
gtggtgcctg ccttgctgcc tctgctggct ggcactctgc tgctgctgga gactgccact 540
gctccctaa 549
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gccaggatcc ctgaattcat ggaagccata caggtgaccc aaccttcagt ggtgttggct 120
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tgcaaggtgg aactcatgta cccaccgcca tactttgtgg gcatgggcaa cgggacgcag 420
atttatgtca ttgatccaga accatgcccg gattctgacc aattcaccac tgatgctgcc 480
catcctggaa ggtctgtggt gcctgccttg ctgcctctgc tggctggcac tctgctgctg 540
ctggagactg ccactgctcc ctaa 564
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tccaacacat cggagagctt cgtgctaaac tggtaccgca tgagccccag caaccagacg 240
gacaagctgg ccgccttccc cgaggaccgc agccagcccg gccaggactg ccgcttccgt 300
gtcacacaac tgcccaacgg gcgtgacttc cacatgagcg tggtcagggc ccggcgcaat 360
gacagcggca cctacctctg tggggccatc tccctggccc ccaaggcgca gatcaaagag 420
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aatatgacaa ttgaatgcaa attcccagta gaaaaacaat tagacctggc tgcactaatt 180
gtctattggg aaatggagga taagaacatt attcaatttg tgcatggaga ggaagacctg 240
aaggttcagc atagtagcta cagacagagg gcccggctgt tgaaggacca gctctccctg 300
ggaaatgctg cacttcagat cacagatgtg aaattgcagg atgcaggggt gtaccgctgc 360
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aacaaaatca accaaagaat tttggttgtg gatccagtca cctctgaaca tgaactgaca 480
tgtcaggctg agggctaccc caaggccgaa gtcatctgga caagcagtga ccatcaagtc 540
ctgagtggta agaccaccac caccaattcc aagagagagg agaagctttt caatgtgacc 600
agcacactga gaatcaacac aacaactaat gagattttct actgcacttt taggagatta 660
gatcctgagg aaaaccatac agctgaattg gtcatcccag aactacctct ggcacatcct 720
ccaaatgaaa gggaattcac cactgatgct gcccatcctg gaaggtctgt ggtgcctgcc 780
ttgctgcctc tgctggctgg cactctgctg ctgctggaga ctgccactgc tccctaa 837
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caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg cccaacgggc gtgacttcca catgagcgtg 720
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tgcaaggtgg aactcatgta cccaccgcca tactttgtgg gcatgggcaa cgggacgcag 420
atttatgtca ttgatccaga accatgcccg gattctgacc aattctcagg ttggttgcta 480
gaggtcccca atgggccctg gaggtccctc accttctacc cagcctggct cacagtgtca 540
gagggagcaa atgccacctt cacctgcagc ttgtccaact ggtcggagga tcttatgctg 600
aactggaacc gcctgagtcc cagcaaccag actgaaaaac aggccgcctt ctgtaatggt 660
ttgagccaac ccgtccagga tgcccgcttc cagatcatac agctgcccaa caggcatgac 720
ttccacatga acatccttga cacacggcgc aatgacagtg gcatctacct ctgtggggcc 780
atctccctgc accccaaggc aaaaatcgag gagagccctg gagcagagct cgtggtaaca 840
gagagaatcc tggagacctc aacaagatat cccagcccct cgcccaaacc agaaggccgg 900
tttcaaggca tggttcaatt caccactgat gctgcccatc ctggaaggtc tgtggtgcct 960
gccttgctgc ctctgctggc tggcactctg ctgctgctgg agactgccac tgctccctaa 1020
<210> 16
<211> 918
<212> DNA
<213> 
<220>
<223> IL2ss-mCTLA4-mPD-1
<400> 16
atgtatagga tgcaactgct gtcttgcatt gctctgtctc tggcactggt cactaactct 60
gccaggatcc ctgaattcat ggaagccata caggtgaccc aaccttcagt ggtgttggct 120
agcagccatg gtgtcgccag ctttccatgt gaatattcac cgtcacacaa cactgatgag 180
gtccgggtga ctgtgctgcg gcagacaaat gaccaaatga ctgaggtctg tgccacgaca 240
ttcacagaga agaatacagt gggcttccta gattacccct tctgcagtgg tacctttaat 300
gaaagcagag tgaacctcac catccaagga ctgagagctg ttgacacggg actgtacctc 360
tgcaaggtgg aactcatgta cccaccgcca tactttgtgg gcatgggcaa cgggacgcag 420
atttatgtca ttgatccaga accatgcccg gattctgacc aattctcagg ttggttgcta 480
gaggtcccca atgggccctg gaggtccctc accttctacc cagcctggct cacagtgtca 540
gagggagcaa atgccacctt cacctgcagc ttgtccaact ggtcggagga tcttatgctg 600
aactggaacc gcctgagtcc cagcaaccag actgaaaaac aggccgcctt ctgtaatggt 660
ttgagccaac ccgtccagga tgcccgcttc cagatcatac agctgcccaa caggcatgac 720
ttccacatga acatccttga cacacggcgc aatgacagtg gcatctacct ctgtggggcc 780
atctccctgc accccaaggc aaaaatcgag gagagccctg gagcagagct cgtggtaaca 840
gagagaatcc tggagacctc aacaagatat cccagcccct cgcccaaacc agaaggccgg 900
tttcaaggca tggtttaa 918
<210> 17
<211> 900
<212> DNA
<213> 
<220>
<223> IL2ss-mCTLA4-mPD-L1-PLAP
<400> 17
atgtatagga tgcaactgct gtcttgcatt gctctgtctc tggcactggt cactaactct 60
gccaggatcc ctgaattcat ggaagccata caggtgaccc aaccttcagt ggtgttggct 120
agcagccatg gtgtcgccag ctttccatgt gaatattcac cgtcacacaa cactgatgag 180
gtccgggtga ctgtgctgcg gcagacaaat gaccaaatga ctgaggtctg tgccacgaca 240
ttcacagaga agaatacagt gggcttccta gattacccct tctgcagtgg tacctttaat 300
gaaagcagag tgaacctcac catccaagga ctgagagctg ttgacacggg actgtacctc 360
tgcaaggtgg aactcatgta cccaccgcca tactttgtgg gcatgggcaa cgggacgcag 420
atttatgtca ttgatccaga accatgcccg gattctgacc aattcatgtt tactatcacg 480
gctccaaagg acttgtacgt ggtggagtat ggcagcaacg tcacgatgga gtgcagattc 540
cctgtagaac gggagctgga cctgcttgcg ttagtggtgt actgggaaaa ggaagatgag 600
caagtgattc agtttgtggc aggagaggag gaccttaagc ctcagcacag caacttcagg 660
gggagagcct cgctgccaaa ggaccagctt ttgaagggaa atgctgccct tcagatcaca 720
gacgtcaagc tgcaggacgc aggcgtttac tgctgcataa tcagctacgg tggtgcggac 780
tacaagcgaa tcacgcaatt caccactgat gctgcccatc ctggaaggtc tgtggtgcct 840
gccttgctgc ctctgctggc tggcactctg ctgctgctgg agactgccac tgctccctaa 900
<210> 18
<211> 798
<212> DNA
<213> 
<220>
<223> IL2ss-mCTLA4-mPD-L1
<400> 18
atgtatagga tgcaactgct gtcttgcatt gctctgtctc tggcactggt cactaactct 60
gccaggatcc ctgaattcat ggaagccata caggtgaccc aaccttcagt ggtgttggct 120
agcagccatg gtgtcgccag ctttccatgt gaatattcac cgtcacacaa cactgatgag 180
gtccgggtga ctgtgctgcg gcagacaaat gaccaaatga ctgaggtctg tgccacgaca 240
ttcacagaga agaatacagt gggcttccta gattacccct tctgcagtgg tacctttaat 300
gaaagcagag tgaacctcac catccaagga ctgagagctg ttgacacggg actgtacctc 360
tgcaaggtgg aactcatgta cccaccgcca tactttgtgg gcatgggcaa cgggacgcag 420
atttatgtca ttgatccaga accatgcccg gattctgacc aattcatgtt tactatcacg 480
gctccaaagg acttgtacgt ggtggagtat ggcagcaacg tcacgatgga gtgcagattc 540
cctgtagaac gggagctgga cctgcttgcg ttagtggtgt actgggaaaa ggaagatgag 600
caagtgattc agtttgtggc aggagaggag gaccttaagc ctcagcacag caacttcagg 660
gggagagcct cgctgccaaa ggaccagctt ttgaagggaa atgctgccct tcagatcaca 720
gacgtcaagc tgcaggacgc aggcgtttac tgctgcataa tcagctacgg tggtgcggac 780
tacaagcgaa tcacgtaa 798
<210> 19
<211> 63
<212> DNA
<213> 醇
<400> 19
atgtatagga tgcaactgct gtcttgcatt gctctgtctc tggcactggt cactaactct 60
gcc 63
<210> 20
<211> 96
<212> DNA
<213> 醇
<400> 20
accactgatg ctgcccatcc tggaaggtct gtggtgcctg ccttgctgcc tctgctggct 60
ggcactctgc tgctgctgga gactgccact gctccc 96
<210> 21
<211> 372
<212> DNA
<213> 醇
<400> 21
gcaatgcacg tggcccagcc tgctgtggta ctggccagca gccgaggcat cgccagcttt 60
gtgtgtgagt atgcatctcc aggcaaagcc actgaggtcc gggtgacagt gcttcggcag 120
gctgacagcc aggtgactga agtctgtgcg gcaacctaca tgatggggaa tgagttgacc 180
ttcctagatg attccatctg cacgggcacc tccagtggaa atcaagtgaa cctcactatc 240
caaggactga gggccatgga cacgggactc tacatctgca aggtggagct catgtaccca 300
ccgccatact acctgggcat aggcaacgga acccagattt atgtaattga tccagaaccg 360
tgcccagatt ct 372
<210> 22
<211> 378
<212> DNA
<213> 產鴞公
<400> 22
gaagccatac aggtgaccca accttcagtg gtgttggcta gcagccatgg tgtcgccagc 60
tttccatgtg aatattcacc gtcacacaac actgatgagg tccgggtgac tgtgctgcgg 120
cagacaaatg accaaatgac tgaggtctgt gccacgacat tcacagagaa gaatacagtg 180
ggcttcctag attacccctt ctgcagtggt acctttaatg aaagcagagt gaacctcacc 240
atccaaggac tgagagctgt tgacacggga ctgtacctct gcaaggtgga actcatgtac 300
ccaccgccat actttgtggg catgggcaac gggacgcaga tttatgtcat tgatccagaa 360
ccatgcccgg attctgac 378
<210> 23
<211> 450
<212> DNA
<213> 醇
<400> 23
ccaggatggt tcttagactc cccagacagg ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc 60
ctgctcgtgg tgaccgaagg ggacaacgcc accttcacct gcagcttctc caacacatcg 120
gagagcttcg tgctaaactg gtaccgcatg agccccagca accagacgga caagctggcc 180
gccttccccg aggaccgcag ccagcccggc caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg 240
cccaacgggc gtgacttcca catgagcgtg gtcagggccc ggcgcaatga cagcggcacc 300
tacctctgtg gggccatctc cctggccccc aaggcgcaga tcaaagagag cctgcgggca 360
gagctcaggg tgacagagag aagggcagaa gtgcccacag cccaccccag cccctcaccc 420
aggccagccg gccagttcca aaccctggtg 450
<210> 24
<211> 450
<212> DNA
<213> 產鴞公
<400> 24
tcaggttggt tgctagaggt ccccaatggg ccctggaggt ccctcacctt ctacccagcc 60
tggctcacag tgtcagaggg agcaaatgcc accttcacct gcagcttgtc caactggtcg 120
gaggatctta tgctgaactg gaaccgcctg agtcccagca accagactga aaaacaggcc 180
gccttctgta atggtttgag ccaacccgtc caggatgccc gcttccagat catacagctg 240
cccaacaggc atgacttcca catgaacatc cttgacacac ggcgcaatga cagtggcatc 300
tacctctgtg gggccatctc cctgcacccc aaggcaaaaa tcgaggagag ccctggagca 360
gagctcgtgg taacagagag aatcctggag acctcaacaa gatatcccag cccctcgccc 420
aaaccagaag gccggtttca aggcatggtt 450
<210> 25
<211> 660
<212> DNA
<213> 醇
<400> 25
ttcactgtca cggttcccaa ggacctatat gtggtagagt atggtagcaa tatgacaatt 60
gaatgcaaat tcccagtaga aaaacaatta gacctggctg cactaattgt ctattgggaa 120
atggaggata agaacattat tcaatttgtg catggagagg aagacctgaa ggttcagcat 180
agtagctaca gacagagggc ccggctgttg aaggaccagc tctccctggg aaatgctgca 240
cttcagatca cagatgtgaa attgcaggat gcaggggtgt accgctgcat gatcagctat 300
ggtggtgccg actacaagcg aattactgtg aaagtcaatg ccccatacaa caaaatcaac 360
caaagaattt tggttgtgga tccagtcacc tctgaacatg aactgacatg tcaggctgag 420
ggctacccca aggccgaagt catctggaca agcagtgacc atcaagtcct gagtggtaag 480
accaccacca ccaattccaa gagagaggag aagcttttca atgtgaccag cacactgaga 540
atcaacacaa caactaatga gattttctac tgcactttta ggagattaga tcctgaggaa 600
aaccatacag ctgaattggt catcccagaa ctacctctgg cacatcctcc aaatgaaagg 660
<210> 26
<211> 327
<212> DNA
<213> 產鴞公
<400> 26
tttactatca cggctccaaa ggacttgtac gtggtggagt atggcagcaa cgtcacgatg 60
gagtgcagat tccctgtaga acgggagctg gacctgcttg cgttagtggt gtactgggaa 120
aaggaagatg agcaagtgat tcagtttgtg gcaggagagg aggaccttaa gcctcagcac 180
agcaacttca gggggagagc ctcgctgcca aaggaccagc ttttgaaggg aaatgctgcc 240
cttcagatca cagacgtcaa gctgcaggac gcaggcgttt actgctgcat aatcagctac 300
ggtggtgcgg actacaagcg aatcacg 327
<210> 27
<211> 828
<212> DNA
<213> 
<220>
<223> hCTLA4-hPD-1
<400> 27
gcaatgcacg tggcccagcc tgctgtggta ctggccagca gccgaggcat cgccagcttt 60
gtgtgtgagt atgcatctcc aggcaaagcc actgaggtcc gggtgacagt gcttcggcag 120
gctgacagcc aggtgactga agtctgtgcg gcaacctaca tgatggggaa tgagttgacc 180
ttcctagatg attccatctg cacgggcacc tccagtggaa atcaagtgaa cctcactatc 240
caaggactga gggccatgga cacgggactc tacatctgca aggtggagct catgtaccca 300
ccgccatact acctgggcat aggcaacgga acccagattt atgtaattga tccagaaccg 360
tgcccagatt ctgaattccc aggatggttc ttagactccc cagacaggcc ctggaacccc 420
cccaccttct ccccagccct gctcgtggtg accgaagggg acaacgccac cttcacctgc 480
agcttctcca acacatcgga gagcttcgtg ctaaactggt accgcatgag ccccagcaac 540
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ttccgtgtca cacaactgcc caacgggcgt gacttccaca tgagcgtggt cagggcccgg 660
cgcaatgaca gcggcaccta cctctgtggg gccatctccc tggcccccaa ggcgcagatc 720
aaagagagcc tgcgggcaga gctcagggtg acagagagaa gggcagaagt gcccacagcc 780
caccccagcc cctcacccag gccagccggc cagttccaaa ccctggtg 828
<210> 28
<211> 1035
<212> DNA
<213> 
<220>
<223> hCTLA4-hPD-L1
<400> 28
gcaatgcacg tggcccagcc tgctgtggta ctggccagca gccgaggcat cgccagcttt 60
gtgtgtgagt atgcatctcc aggcaaagcc actgaggtcc gggtgacagt gcttcggcag 120
gctgacagcc aggtgactga agtctgtgcg gcaacctaca tgatggggaa tgagttgacc 180
ttcctagatg attccatctg cacgggcacc tccagtggaa atcaagtgaa cctcactatc 240
caaggactga gggccatgga cacgggactc tacatctgca aggtggagct catgtaccca 300
ccgccatact acctgggcat aggcaacgga acccagattt atgtaattga tccagaaccg 360
tgcccagatt ctgaattcac tgtcacggtt cccaaggacc tatatgtggt agagtatggt 420
agcaatatga caattgaatg caaattccca gtagaaaaac aattagacct ggctgcacta 480
attgtctatt gggaaatgga ggataagaac attattcaat ttgtgcatgg agaggaagac 540
ctgaaggttc agcatagtag ctacagacag agggcccggc tgttgaagga ccagctctcc 600
ctgggaaatg ctgcacttca gatcacagat gtgaaattgc aggatgcagg ggtgtaccgc 660
tgcatgatca gctatggtgg tgccgactac aagcgaatta ctgtgaaagt caatgcccca 720
tacaacaaaa tcaaccaaag aattttggtt gtggatccag tcacctctga acatgaactg 780
acatgtcagg ctgagggcta ccccaaggcc gaagtcatct ggacaagcag tgaccatcaa 840
gtcctgagtg gtaagaccac caccaccaat tccaagagag aggagaagct tttcaatgtg 900
accagcacac tgagaatcaa cacaacaact aatgagattt tctactgcac ttttaggaga 960
ttagatcctg aggaaaacca tacagctgaa ttggtcatcc cagaactacc tctggcacat 1020
cctccaaatg aaagg 1035
<210> 29
<211> 834
<212> DNA
<213> 
<220>
<223> mCTLA4-mPD-1
<400> 29
gaagccatac aggtgaccca accttcagtg gtgttggcta gcagccatgg tgtcgccagc 60
tttccatgtg aatattcacc gtcacacaac actgatgagg tccgggtgac tgtgctgcgg 120
cagacaaatg accaaatgac tgaggtctgt gccacgacat tcacagagaa gaatacagtg 180
ggcttcctag attacccctt ctgcagtggt acctttaatg aaagcagagt gaacctcacc 240
atccaaggac tgagagctgt tgacacggga ctgtacctct gcaaggtgga actcatgtac 300
ccaccgccat actttgtggg catgggcaac gggacgcaga tttatgtcat tgatccagaa 360
ccatgcccgg attctgacca attctcaggt tggttgctag aggtccccaa tgggccctgg 420
aggtccctca ccttctaccc agcctggctc acagtgtcag agggagcaaa tgccaccttc 480
acctgcagct tgtccaactg gtcggaggat cttatgctga actggaaccg cctgagtccc 540
agcaaccaga ctgaaaaaca ggccgccttc tgtaatggtt tgagccaacc cgtccaggat 600
gcccgcttcc agatcataca gctgcccaac aggcatgact tccacatgaa catccttgac 660
acacggcgca atgacagtgg catctacctc tgtggggcca tctccctgca ccccaaggca 720
aaaatcgagg agagccctgg agcagagctc gtggtaacag agagaatcct ggagacctca 780
acaagatatc ccagcccctc gcccaaacca gaaggccggt ttcaaggcat ggtt 834
<210> 30
<211> 714
<212> DNA
<213> 
<220>
<223> mCTLA4-mPD-L1
<400> 30
gaagccatac aggtgaccca accttcagtg gtgttggcta gcagccatgg tgtcgccagc 60
tttccatgtg aatattcacc gtcacacaac actgatgagg tccgggtgac tgtgctgcgg 120
cagacaaatg accaaatgac tgaggtctgt gccacgacat tcacagagaa gaatacagtg 180
ggcttcctag attacccctt ctgcagtggt acctttaatg aaagcagagt gaacctcacc 240
atccaaggac tgagagctgt tgacacggga ctgtacctct gcaaggtgga actcatgtac 300
ccaccgccat actttgtggg catgggcaac gggacgcaga tttatgtcat tgatccagaa 360
ccatgcccgg attctgacca attcatgttt actatcacgg ctccaaagga cttgtacgtg 420
gtggagtatg gcagcaacgt cacgatggag tgcagattcc ctgtagaacg ggagctggac 480
ctgcttgcgt tagtggtgta ctgggaaaag gaagatgagc aagtgattca gtttgtggca 540
ggagaggagg accttaagcc tcagcacagc aacttcaggg ggagagcctc gctgccaaag 600
gaccagcttt tgaagggaaa tgctgccctt cagatcacag acgtcaagct gcaggacgca 660
ggcgtttact gctgcataat cagctacggt ggtgcggact acaagcgaat cacg 714
<210> 31
<211> 288
<212> PRT
<213> 
<220>
<223> mCTLA4-mPD1-His6
<400> 31
Met Met Glu Ala Ile Gln Val Thr Gln Pro Ser Val Val Leu Ala Ser
1 5 10 15
Ser His Gly Val Ala Ser Phe Pro Cys Glu Tyr Ser Pro Ser His Asn
20 25 30
Thr Asp Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Thr Asn Asp Gln Met
35 40 45
Thr Glu Val Cys Ala Thr Thr Phe Thr Glu Lys Asn Thr Val Gly Phe
50 55 60
Leu Asp Tyr Pro Phe Cys Ser Gly Thr Phe Asn Glu Ser Arg Val Asn
65 70 75 80
Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Val Asp Thr Gly Leu Tyr Leu Cys
85 90 95
Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Phe Val Gly Met Gly Asn
100 105 110
Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp
115 120 125
Gln Phe Ser Gly Trp Leu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp Arg Ser
130 135 140
Leu Thr Phe Tyr Pro Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala Asn Ala
145 150 155 160
Thr Phe Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met Leu Asn
165 170 175
Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala Ala Phe
180 185 190
Cys Asn Gly Leu Ser Gln Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln Ile Ile
195 200 205
Gln Leu Pro Asn Arg His Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp Thr Arg
210 215 220
Arg Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu His Pro
225 230 235 240
Lys Ala Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val Thr Glu
245 250 255
Arg Ile Leu Glu Thr Ser Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Pro Lys Pro
260 265 270
Glu Gly Arg Phe Gln Gly Met Val Leu Glu His His His His His His
275 280 285
<210> 32
<211> 248
<212> PRT
<213> 
<220>
<223> mCTLA4-mPDL1-His6
<400> 32
Met Met Glu Ala Ile Gln Val Thr Gln Pro Ser Val Val Leu Ala Ser
1 5 10 15
Ser His Gly Val Ala Ser Phe Pro Cys Glu Tyr Ser Pro Ser His Asn
20 25 30
Thr Asp Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Thr Asn Asp Gln Met
35 40 45
Thr Glu Val Cys Ala Thr Thr Phe Thr Glu Lys Asn Thr Val Gly Phe
50 55 60
Leu Asp Tyr Pro Phe Cys Ser Gly Thr Phe Asn Glu Ser Arg Val Asn
65 70 75 80
Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Val Asp Thr Gly Leu Tyr Leu Cys
85 90 95
Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Phe Val Gly Met Gly Asn
100 105 110
Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp
115 120 125
Gln Phe Met Phe Thr Ile Thr Ala Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu
130 135 140
Tyr Gly Ser Asn Val Thr Met Glu Cys Arg Phe Pro Val Glu Arg Glu
145 150 155 160
Leu Asp Leu Leu Ala Leu Val Val Tyr Trp Glu Lys Glu Asp Glu Gln
165 170 175
Val Ile Gln Phe Val Ala Gly Glu Glu Asp Leu Lys Pro Gln His Ser
180 185 190
Asn Phe Arg Gly Arg Ala Ser Leu Pro Lys Asp Gln Leu Leu Lys Gly
195 200 205
Asn Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val
210 215 220
Tyr Cys Cys Ile Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr
225 230 235 240
Leu Glu His His His His His His
245
<210> 33
<211> 1131
<212> DNA
<213> 
<220>
<223> pVAC1-IL2ss-hCTLA4-hPD1(31-147aa)-hPDL1(19-127aa)
<400> 33
atgtatagga tgcaactgct gtcttgcatt gctctgtctc tggcactggt cactaactct 60
gccaggatcc tggcaatgca cgtggcccag cctgctgtgg tactggccag cagccgaggc 120
atcgccagct ttgtgtgtga gtatgcatct ccaggcaaag ccactgaggt ccgggtgaca 180
gtgcttcggc aggctgacag ccaggtgact gaagtctgtg cggcaaccta catgatgggg 240
aatgagttga ccttcctaga tgattccatc tgcacgggca cctccagtgg aaatcaagtg 300
aacctcacta tccaaggact gagggccatg gacacgggac tctacatctg caaggtggag 360
ctcatgtacc caccgccata ctacctgggc ataggcaacg gaacccagat ttatgtaatt 420
gatccagaac cgtgcccaga ttctgaattg ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc 480
ctgctcgtgg tgaccgaagg ggacaacgcc accttcacct gcagcttctc caacacatcg 540
gagagcttcg tgctaaactg gtaccgcatg agccccagca accagacgga caagctggcc 600
gccttccccg aggaccgcag ccagcccggc caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg 660
cccaacgggc gtgacttcca catgagcgtg gtcagggccc ggcgcaatga cagcggcacc 720
tacctctgtg gggccatctc cctggccccc aaggcgcaga tcaaagagag cctgcgggca 780
gagctcaggg tgacagagag agaattcact gtcacggttc ccaaggacct atatgtggta 840
gagtatggta gcaatatgac aattgaatgc aaattcccag tagaaaaaca attagacctg 900
gctgcactaa ttgtctattg ggaaatggag gataagaaca ttattcaatt tgtgcatgga 960
gaggaagacc tgaaggttca gcatagtagc tacagacaga gggcccggct gttgaaggac 1020
cagctctccc tgggaaatgc tgcacttcag atcacagatg tgaaattgca ggatgcaggg 1080
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atgtatagga tgcaactgct gtcttgcatt gctctgtctc tggcactggt cactaactct 60
gccaggatcc tggcaatgca cgtggcccag cctgctgtgg tactggccag cagccgaggc 120
atcgccagct ttgtgtgtga gtatgcatct ccaggcaaag ccactgaggt ccgggtgaca 180
gtgcttcggc aggctgacag ccaggtgact gaagtctgtg cggcaaccta catgatgggg 240
aatgagttga ccttcctaga tgattccatc tgcacgggca cctccagtgg aaatcaagtg 300
aacctcacta tccaaggact gagggccatg gacacgggac tctacatctg caaggtggag 360
ctcatgtacc caccgccata ctacctgggc ataggcaacg gaacccagat ttatgtaatt 420
gatccagaac cgtgcccaga ttctgaattg ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc 480
ctgctcgtgg tgaccgaagg ggacaacgcc accttcacct gcagcttctc caacacatcg 540
gagagcttcg tgctaaactg gtaccgcatg agccccagca accagacgga caagctggcc 600
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gagctcaggg tgacagagag agaattcact gtcacggttc ccaaggacct atatgtggta 840
gagtatggta gcaatatgac aattgaatgc aaattcccag tagaaaaaca attagacctg 900
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cagctctccc tgggaaatgc tgcacttcag atcacagatg tgaaattgca ggatgcaggg 1080
gtgtaccgct gcatgatcag ctatggtggt gccgactaca agcgaattac tgtgaaagtc 1140
aatgccccat acaacaaaat caaccaaaga attttggttg tggatccagt cacctctgaa 1200
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<400> 36
atgtatagga tgcaactgct gtcttgcatt gctctgtctc tggcactggt cactaactct 60
gccaggatcc ctgaattcat ggaagccata caggtgaccc aaccttcagt ggtgttggct 120
agcagccatg gtgtcgccag ctttccatgt gaatattcac cgtcacacaa cactgatgag 180
gtccgggtga ctgtgctgcg gcagacaaat gaccaaatga ctgaggtctg tgccacgaca 240
ttcacagaga agaatacagt gggcttccta gattacccct tctgcagtgg tacctttaat 300
gaaagcagag tgaacctcac catccaagga ctgagagctg ttgacacggg actgtacctc 360
tgcaaggtgg aactcatgta cccaccgcca tactttgtgg gcatgggcaa cgggacgcag 420
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ttctacccag cctggctcac agtgtcagag ggagcaaatg ccaccttcac ctgcagcttg 540
tccaactggt cggaggatct tatgctgaac tggaaccgcc tgagtcccag caaccagact 600
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atcatacagc tgcccaacag gcatgacttc cacatgaaca tccttgacac acggcgcaat 720
gacagtggca tctacctctg tggggccatc tccctgcacc ccaaggcaaa aatcgaggag 780
agccctggag cagagctcgt ggtaacagag agatctttta ctatcacggc tccaaaggac 840
ttgtacgtgg tggagtatgg cagcaacgtc acgatggagt gcagattccc tgtagaacgg 900
gagctggacc tgcttgcgtt agtggtgtac tgggaaaagg aagatgagca agtgattcag 960
tttgtggcag gagaggagga ccttaagcct cagcacagca acttcagggg gagagcctcg 1020
ctgccaaagg accagctttt gaagggaaat gctgcccttc agatcacaga cgtcaagctg 1080
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tactgtacgt tttggagatc acagccaggg caaaaccaca cagcggagct gatcatccca 1440
gaactgcctg caacacatcc tccacagaac agg 1473

Claims (10)

1.一种医药组合物用于制备在治疗一个体罹患感染性或恶性疾病时，提升受治疗个体的免疫反应的药物的用途，该医药组合物是以局部注射、经皮注射或肌肉注射的方式投予，包含一与表现载体结合的DNA构筑体，及医药可接受的载剂，其中该DNA构筑体包含一多核苷酸序列，该多核苷酸编码为细胞毒T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)和计划性细胞死亡配体1(PD-L1)的融合。
2.如权利要求1的用途，其中该表现载体为pVAC-1。
3.如权利要求1的用途，其进一步包含佐剂。
4.如权利要求1的用途，其中该DNA构筑体系与微脂体结合。
5.如权利要求1的用途，其中该个体罹患感染性或恶性疾病，且以抗感染性或抗癌药物治疗后，造成该个体的免疫反应受到影响。
6.如权利要求1的用途，其中该恶性疾病选自由转移性黑色素瘤、胰脏癌、大肠直肠癌、肝细胞癌、淋巴癌、激素抗拒性***癌、卵巢癌、急性骨髓性白血病、及非小细胞肺癌所组成的群组。
7.一种医药组合物用于制备在治疗一个体罹患感染性或恶性疾病时，提升受治疗个体的免疫反应的药物的用途，该医药组合物是以局部注射、经皮注射或肌肉注射的方式投予，包含一重组多胜肽及一医药可接受的载剂，其中该重组多胜肽为CTLA-4及PD-L1的融合多胜肽。
8.如权利要求7的用途，其进一步包含佐剂。
9.如权利要求7的用途，其中该个体罹患感染性或恶性疾病，且以抗感染性或抗癌药物治疗后，造成该个体的免疫反应受到影响。
10.如权利要求7的用途，其中该恶性疾病选自由转移性黑色素瘤、胰脏癌、大肠直肠癌、肝细胞癌、淋巴癌、激素抗拒性***癌、卵巢癌、急性骨髓性白血病、及非小细胞肺癌所组成的群组。
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