CN104946754A - 一种定量检测土壤中青枯菌的方法及其检测试剂盒 - Google Patents

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CN104946754A CN201510314389.1A CN201510314389A CN104946754A CN 104946754 A CN104946754 A CN 104946754A CN 201510314389 A CN201510314389 A CN 201510314389A CN 104946754 A CN104946754 A CN 104946754A
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Abstract

本发明公开了一种定量检测土壤中青枯菌的方法及其检测试剂盒，该方法采用MPN结合PCR的方法来定量检测土壤中的病原微生物。利用了PCR方法快速准确的优势，取代了传统MPN方法中阳性结果的生化鉴定和血清学鉴定等步骤，同时采用选择性培养目的病原菌和特异性引物来提高检测效率。本发明的检测试剂盒和检测方法具有灵敏度高、稳定性好、特异性强的优点，而且操作简单，不需要提取DNA。

Description

一种定量检测土壤中青枯菌的方法及其检测试剂盒
技术领域
本发明属于微生物定量检测技术领域，具体涉及一种定量检测土壤中青枯菌的方法及其检测试剂盒。
背景技术
青枯病是世界上危害较大、分布较广、造成损失相当严重的植物病害之一，广泛流行于热带、亚热带以及暖温带地区，对包括草本、灌木和乔木在内的50多科200多种植物造成危害，包括烟草(Nicotiana tabacum)、芝麻(Sesamumindicum)、花生(Arachis hypogaea)、大豆(Glycine max)、萝卜(Raph-anussativus)等多种农作物以及一些贵重药材和花卉植物，严重危害一些农作物的产量，其中马铃薯、番茄、烟草等茄科作物受害最为严重。已被多个国家列为植物病害检疫对象。由于青枯病为细菌性土传病害，防治比较困难，利用抗性品种是最为经济有效的手段。因此，建立简单快速的青枯病抗性鉴定方法是快速筛选青枯病抗病品种的首要任务。目前对于烟草青枯病菌的防治方法主要从以下两个方面进行：一是幼苗移植前了解大田土壤中Ralstonia solanacearum存活情况；另一方面是在生长过程中，适时了解土壤中烟草青枯病菌数量，预测土壤中致病菌数量变化趋势，及时指导大田生产。
目前在病原微生物定量检测方面主要有平板菌落计数法、MPN计数法，免疫学上的方法和以PCR等分子手段为基础的分子生物学上的方法。其中传统检测方法具有很高的权威性，但是在操作上具有耗时耗力麻烦等缺点，而且用于土壤中病原微生物的定量检测具有一定的复杂性和操作上的难度；随着现代分子生物学方法的发展，PCR技术因其快速准确而被广泛应用于食品中病原微生物的定性检测中，但是PCR方法不能够很好地区分死菌和活菌，而且在定量检测中也显得不足，这就造成结果上的不准确。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种定量检测土壤中青枯菌的方法，以实现提供方便、高效、快速的检测出土壤中的青枯菌，并有效提高检测的灵敏度。本发明的另一目的是提供一种上述方法使用的检测试剂盒。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种定量检测土壤中青枯菌的方法，包括以下步骤：
(1)取土壤，用无菌水稀释成5个稀释度，分别取5个稀释度的稀释样品1mL，控温30℃，用SMSA发酵培养基，摇床震荡培养24h，得增菌液；
(2)取2μL上清液作为PCR扩增模板，进行PCR反应，引物序列为：
P1：5’-CGGTTTTCGCCGCTGATTTCG-3’，
P2：5’-CTTCTTCCGCTTCTTCATCGCACT-3’；
(3)同时扩增PCR产物、阳性对照和阴性对照，然后进行2％琼脂糖凝胶电泳，然后染色成像，与阳性对照比较，在146bp处出现特异性扩增条带者为阳性结果，不出现条带者为阴性结果。
(4)统计阳性和阴性结果个数，查MPN表计算青枯菌个数；计算公式：活菌数/每克土＝菌数近似值×数量指标第一位数的稀释度/土壤干重百分比。
步骤(1)中，稀释成5个稀释度的具体操作为：取10g土壤加至90mL水中，震荡摇匀30min，之后取1mL土壤悬液加至9mL生理盐水，作为10-2g/mL，再依次进行系列稀释至10-3g/mL、10-4g/mL和10-5g/mL。
步骤(2)中，PCR反应体系：：在25μL反应体系中，10×PCR缓冲液2.5μL，20mmol/L Mg2+2.5μL，2.5mmol/L dNTP 2.5μL，2.0μmol/L引物0.5μL，2U/μL TaqDNA聚合酶0.3μL，补水至25μL。
步骤(2)中，PCR反应条件为：94℃预变性7min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸5min。
步骤(3)中，电泳条件为：先以60V电压出孔，再以100V电压电泳30min。
一种定量检测土壤中青枯菌的试剂盒，包括试剂供量为1次反应及以上的试剂I和试剂II；
试剂I：用于增菌培养青枯菌的选择性培养基，成分为SMSA增菌液，配方为：SMSA培养基(semi-selectivemedium,South Africa)：胰蛋白腺10g，甘油5mL，酷蛋白氨基酸1g，琼脂15g，蒸饱水1L。培养基冷却至50℃时每250mL加入：1％的多粘菌素B 2.5mL，1％的结晶紫125μm，1％的四氮唑盐1.25mL，1％的钎菌肽625μm，0.1％的青霉素125μrn，1％的氯霉素125μm，1％的放线菌酮2.5mL；
试剂II：用于MPN-PCR计数法中阳性管数确认的青枯菌PCR反应体系，试剂供量为1次反应及以上，试剂包括：10×PCR缓冲液、20mmol/L Mg2+、2.5mmol/L dNTP、2.0μmol/L上游引物、2.0μmol/L下游引物、2U/μL Taq DNA聚合酶和双蒸水；其中，上游引物为P1引物，序列为：5’-CGGTTTTCGCCGCTGATTTCG-3’，下游引物为P2引物，序列为：5’-CTTCTTCCGCTTCTTCATCGCACT-3’。
本发明的定量检测土壤中青枯菌的方法，采用MPN结合PCR的方法来定量检测土壤中的病原微生物，是一种MPN-PCR定量检测病原微生物方法。在建立MPN-PCR定量检测病原微生物方法之前，首先进行了一个实验来探索MPN计数法及MPN-PCR计数法和平板菌落计数法之间是否存在一个相关性。众所周知，MPN计数法是一种利用数学统计的方法对样品中的活菌数量进行估计，得到的是一个近似值或者估计值；MPN-PCR计数法是在MPN计数法的基础上，通过PCR对样品中的菌数进行估计；平板菌落计数法是一种最常规的活菌定量计数法，它具有一定的准确性和权威性。对同一样品进行了MPN计数法及MPN-PCR计数方法与平板菌落计数法进行了回归分析，建立了两者之间的定量关系，使MPN-PCR计数法具有与平板菌落计数法一样的准确性，从而为病原微生物，甚至功能微生物的定量计数提供更为准确的结果。
有益效果：与现有的病原微生物定量检测方法相比，本发明的定量检测土壤中青枯菌具有的突出优点包括：利用了PCR方法快速准确的优势，取代了传统MPN方法中阳性结果的生化鉴定和血清学鉴定等步骤，同时采用选择性培养目的病原菌和特异性引物来提高检测效率。本发明的检测试剂盒和检测方法具有灵敏度高、稳定性好、特异性强的优点，而且操作简单，不需要提取DNA。具有很好的实用性，能够产生较好的经济效益和社会效益。
附图说明
图1是MPN计数法与平板菌落计数法计数结果对数值的相关性曲线图；
图2是MPN-PCR计数法与平板菌落计数法计数结果对数值的相关性曲线图；
图3是10-7稀释度加入灭菌土壤中培养一天后扩增法扩增青枯菌hrpB基因电泳图；图中，M为DL-2000 DNA Marker，CK为阴性对照；泳道1为10-1浓度梯度土壤稀释液样品，泳道2为10-2浓度梯度土壤稀释液样品，泳道3是10-3浓度梯度土壤稀释液样品，泳道4是10-4浓度梯度土壤稀释液样品，每个样品5个重复；
图4是10-4稀释度加入灭菌土壤中培养一天后扩增法扩增青枯菌hrpB基因电泳图；图中，M为DL-2000 DNA Marker，CK为阴性对照；泳道4为10-4浓度梯度土壤稀释液样品，泳道5为10-5浓度梯度土壤稀释液样品，泳道6是10-6浓度梯度土壤稀释液样品，泳道7是10-7浓度梯度土壤稀释液样品，每个样品5个重复；
图5是原培养物加入灭菌土壤中培养一天后扩增法扩增青枯菌hrpB基因电泳图；M为DL-2000 DNA Marker，CK为阴性对照；泳道8为10-8浓度梯度土壤稀释液样品，泳道9为10-9浓度梯度土壤稀释液样品，泳道10是10-10浓度梯度土壤稀释液样品，泳道11是10-11浓度梯度土壤稀释液样品，每个样品5个重复；
图6是青枯菌hrpB引物扩增结果的电泳图；图中，M为DL-2000 DNAMarker；泳道1为枯草芽孢杆菌168，泳道2为青枯菌TZ01，泳道3为土壤杆菌，泳道4为短杆菌，泳道5为纤维微杆菌，泳道6为微杆菌，泳道7为假单胞菌，泳道8为红球菌，泳道9为沙门氏菌，泳道10为大肠杆菌DH5α；
图7是实施例5中土壤添加纯青枯菌8个/g土壤后扩增图谱；图中，M为DL-2000 DNA Marker，CK为阴性对照；泳道1为10-1浓度梯度土壤稀释液样品，泳道2为10-2浓度梯度土壤稀释液样品，泳道3是10-3浓度梯度土壤稀释液样品，每个样品5个重复。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1
以代表性青枯菌作为实验菌株，制备系列浓度梯度的青枯菌添加至灭菌土壤中进行平板菌落计数法和MPN计数法计数结果相关性分析，首先从平板上刮取纯培养的青枯菌菌落，接种至100mL SMSA增菌培养基中，30℃，200r/min震荡培养13h。再通过十倍稀释制备成不同浓度的系列稀释液添加至灭菌土壤中，分别采用平板菌落计数法和MPN计数法计数青枯菌个数。
平板菌落计数法参照文献【沈萍，范秀荣，李广武。微生物学实验[M]。北京：高等教育出版社，1999，92-94。】进行，首先对上述制备的土壤菌悬液分别进行梯度稀释，取合适稀释度的菌悬液0.1mL涂布于SMSA增菌培养基平板上，30℃条件倒置培养，平板培养2-3天后计数。
MPN计数，首先对上述制备的土壤菌悬液分别进行梯度稀释，取合适稀释度的菌悬液1mL加至5mL SMSA增菌培养基试管，每个稀释度做5管重复，30℃摇床震荡培养24h后进行统计每组样品的阳性管数，据此通过MPN表得出待测样品的微生物数目。
为了建立MPN计数法在微生物计数方面与平板菌落计数法的回归方程，首先采用向灭菌土壤中添加不同浓度的青枯菌纯培养物制备不同梯度的土壤菌悬液，然后采用稀释涂布平板计数法和MPN计数法分别对同一样品进行计数，从而建立起两者之间的回归方程，并对回归方程进行方差分析以及对回归系数进行了t检验。
采用了7个系列浓度的青枯菌悬液添加至灭菌土壤中进行回归方程的建立，表1列出了平板菌落计数法和MPN计数法计数结果。
表1 平板菌落计数法和MPN计数法计数结果
系列浓度编号 稀释涂布平板计数法 MPN计数法
1 1.4×103 1.9×103
2 3.2×104 5.7×104
3 2.9×105 5.0×105
4 4.7×106 8.2×106
5 1.9×107 3.2×107
6 2.4×108 3.8×108
7 5.6×109 9.5×109
以MPN计数法计数结果的对数值为纵坐标，以平板菌落计数法计数结果的对数值为横坐标作相关性曲线，以进行回归分析。曲线见图1。
在图1的基础上进行回归方程的方差分析，表2是回归方程的方差分析结果，F＝17437.129，P＝4.72×10-10<0.01，表明Log(MPN)---Log(DISH)之间存在极显著的线性回归关系。
表2 回归方程的方差分析
方差分析 df SS MS F Significance F
回归分析 1 48.287 48.287 17437.129 4.72E-10
残差 5 0.014 0.003
总计 6 48.301
在图1的基础上进行回归系数的分析，如表3所示，回归方程：y＝1.0368x。t＝132.050，P＝4.72×10-10<0.01，即线性回归系数是极显著的，表明Log(MPN)---Log(DISH)之间存在极显著的线性回归关系，可用所建立的回归方程来进行计算。
表3 回归系数及回归系数的t检验
Coefficients 标准误差 t Stat P-value
Intercept -0.042 0.044 -0.971 0.376
X Variable 1 0.975 0.007 132.050 4.72E-10
实施例2
以代表性青枯菌作为实验菌株，制备系列浓度梯度的青枯菌添加至灭菌土壤中进行平板菌落计数法和MPN-PCR计数法计数结果相关性分析，首先从平板上刮取纯培养的青枯菌菌落，接种至100mL SMSA增菌培养基中，30℃，200r/min震荡培养13h。再通过十倍稀释制备成不同浓度的系列稀释液添加至灭菌土壤中，分别采用平板菌落计数法和MPN-PCR计数法计数青枯菌个数。
平板菌落计数法参照文献【沈萍，范秀荣，李广武。微生物学实验[M]。北京：高等教育出版社，1999，92-94。】进行，首先对上述制备的土壤菌悬液分别进行梯度稀释，取合适稀释度的菌悬液0.1mL涂布于SMSA增菌培养基平板上，30℃条件倒置培养，平板培养2-3天后计数。
MPN-PCR计数，首先对上述制备的土壤菌悬液分别进行梯度稀释，取合适稀释度的菌悬液1mL加至5mL SMSA增菌培养基试管，每个稀释度做5管重复，30℃摇床震荡培养24h后进行PCR扩增，根据电泳结果统计每组样品的阳性管数，据此通过MPN表得出待测样品的微生物数目。
为了建立MPN-PCR计数法在微生物计数方面与平板菌落计数法的回归方程，首先将青枯菌纯培养物进行平板计数，再向灭菌土壤中添加不同稀释的青枯菌纯培养物制备不同梯度的土壤菌悬液，然后采用MPN-PCR计数法对样品进行计数，从而建立起两者之间的回归方程，并对回归方程进行方差分析以及对回归系数进行了t检验。
采用了8个系列浓度的青枯菌悬液添加至灭菌土壤中进行回归方程的建立，表1列出了平板菌落计数法和MPN-PCR计数法计数结果。
表4 平板菌落计数法和MPN-PCR计数法计数结果
系列浓度编号 稀释涂布平板计数法 MPN-PCR计数法
1 5.3×102 4.4×102
2 5.3×103 1.0×104
3 5.3×104 4.4×104
4 5.3×105 6.3×105
5 5.3×106 1.0×107
6 5.3×107 3.1×107
7 5.3×108 2.2×109
8 5.3×109 1.0×1010
以MPN-PCR计数法计数结果的对数值为纵坐标，以平板菌落计数法计数结果的对数值为横坐标作相关性曲线，以进行回归分析。曲线见图2。
在图2的基础上进行回归方程的方差分析，表5是回归方程的方差分析结果，F＝639.949，P＝2.51×10-7<0.01，表明Log(MPN-PCR)---Log(DISH)之间存在极显著的线性回归关系。
表5 回归方程的方差分析
方差分析 df SS MS F Significance F
回归分析 1 41.610 41.610 639.949 2.51E-07
残差 6 0.390 0.065
总计 42.000
在图2的基础上进行回归系数的分析，如表6所示，回归方程：y＝1.0255x。t＝25.297，P＝2.51×10-7<0.01，即线性回归系数是极显著的，表明Log(MPN-PCR)---Log(DISH)之间存在极显著的线性回归关系，可用所建立的回归方程来进行计算。
表6 回归系数及回归系数的t检验
Coefficients 标准误差 t Stat P-value
Intercept 0.202 0.255 0.793 0.458
X Variable 1 0.946 0.037 25.297 2.51E-07
实施例3
PCR检测方法中特异性的高低主要取决于引物特异性的高低，因此靶基因的选择应具有种或者属特异性，才能避免假阳性的出现。根据青枯菌的hrpB基因序列(AF295618.1)，采用引物设计软件Primer 5.0进行设计引物，设计了检测青枯菌用的特异性引物P1和P2，引物扩增片段为146bp(SEQ ID NO.1)；上述两对引物均由金斯瑞公司合成。具体序列如下：
P1：5’-CGGTTTTCGCCGCTGATTTCG-3’，
P2：5’-CTTCTTCCGCTTCTTCATCGCACT-3’。
利用青枯菌的hrpB特异性引物对枯草芽孢杆菌168，恶臭假单胞菌KT2440，青枯菌，短杆菌，纤维微杆菌，微杆菌，假单胞菌，红球菌，沙门氏菌，大肠杆菌DH5α等10个菌株进行常规菌液PCR，PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测见图6。从图6中可以看出利用青枯菌的hrpB特异性引物可以扩增出并且只能扩增出青枯菌的146bp特异性条带。PCR电泳图谱表明该两对引物具有很好的特异性。
实施例4
采用MPN-PCR的方法对土壤中病原菌进行了定量检测，检测方法如下：
取10g土加至90mL水中，震荡摇匀30min，之后取1mL土壤悬液加至9mL生理盐水，作为10-2，依次进行系列稀释至10-3，10-4，10-5；分别取稀释度为10-2，10-3，10-4，10-5的稀释样品1mL加至5mLSMSA培养基试管中，置于摇床，30℃，震荡24h，每个稀释度做5管重复。
取2μL上清液作为PCR扩增模板，进行PCR反应，PCR反应体系：在25μL反应体系中，10×PCR缓冲液2.5μL，20mmol/L Mg2+2.5μL，2.5mmol/L dNTP2.5μL，2.0μmol/LP10.5μL，2.0μmol/L P20.5μL，2U/μL Taq DNA聚合酶0.3μL，补水至25μL。
PCR反应条件为：94℃预变性7min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸5min。
配置2％的琼脂糖凝胶，吸取5μLPCR产物与上样缓冲液1μL混匀后点样，DNA marker上样量为4μL。先以60V电压出孔，再以100V电压电泳30min完毕。电泳结束后置于EB中染色10min，在凝胶成像***下观察，与阳性对照比较，在146bp处出现特异性扩增条带者为阳性结果，不出现条带者为阴性结果。
统计阳性和阴性结果个数，查MPN表计算青枯菌个数，即可；计算公式：活菌数/每克土＝菌数近似值×数量指标第一位数的稀释度/土壤干重百分比。
采用上述方法，对来自安徽池州的土壤样品进行实际定量检测，结果均能实际反应出土壤中的活菌数。
实施例5
首先利用MPN计数方法对土壤中添加的菌进行计数，之后利用MPN-PCR的方法(同实施例4)对土壤菌悬液进行定量检测，来确定MPN-PCR方法的灵敏度和检测限。计数结果如表7，PCR电泳图谱见图7。
表7 青枯菌灵敏度检测结果
MPN计数结果 MPN-PCR计数结果
8个/g土壤 8个/g土壤
从数据中可以看出青枯菌的灵敏度达100％，检出限为8个/g土壤。
实施例6
定量检测土壤中青枯菌的试剂盒，包括试剂供量为1次反应及以上的试剂I和试剂II，
试剂I：用于增菌培养青枯菌的选择性培养基，成分为SMSA增菌液，配方为：SMSA培养基(semi-selectivemedium,South Africa)：胰蛋白腺10g，甘油5mL，酷蛋白氨基酸1g，琼脂15g，蒸饱水1L。培养基冷却至50℃时每250mL加入：1％的多粘菌素B 2.5mL，1％的结晶紫125μm，1％的四氮唑盐1.25mL，1％的钎菌肽625μm,0.1％的青霉素125μrn，1％的氯霉素125μm，1％的放线菌酮2.5mL。
试剂II：用于MPN-PCR计数法中阳性管数确认的青枯菌PCR反应体系，试剂供量为1次反应及以上，试剂包括：10×PCR缓冲液、20mmol/L Mg2+、2.5mmol/LdNTP、2.0μmol/L上游引物、2.0μmol/L下游引物、2U/μL Taq DNA聚合酶和双蒸水；其中，上游引物为P1引物，序列为：5’-CGGTTTTCGCCGCTGATTTCG-3’，下游引物为P2引物，序列为：5’-CTTCTTCCGCTTCTTCATCGCACT-3’。
称取试剂盒I中选择性培养基，分别分装于3mL试管中，115℃高压灭菌30min。
称取10g土壤样品加至100mL带有玻璃珠的无菌水三角瓶中，200r/min震荡混匀30min，按照1mL加至9mL生理盐水中进行10倍梯度稀释，选择合适的5个稀释度，每个稀释度取1mL加至已灭菌的选择性增菌培养液试管中，每个稀释度5管重复，30℃200r/min震荡培养13h。
对于10-1和10-2稀释度的增菌液由于存在着大量的土壤颗粒，所以洗涤的时候尽量轻柔操作只要将沉淀表面的菌体沉淀层重悬开来即可，尽量避免将土壤颗粒重悬起来.
取上述PCR反应模板2μL加至试剂II中的PCR反应管中(管中装有PCR扩增液)，混匀。同时也扩增PCR试剂II中自带的阳性对照和阴性对照。
PCR扩增程序：循环参数为：94℃预变性7min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃延伸5min。
配置2％的琼脂糖凝胶，吸取5μLPCR产物与试剂盒中上样缓冲液1μL混匀后点样，DNA marker上样量为4μL。先以60V电压出孔，再以100V电压电泳30min完毕。电泳结束后置于EB中染色10min，在凝胶成像***下观察，与阳性对照比较，在146bp处出现特异性扩增条带者为阳性结果，不出现条带者为阴性结果。
统计阳性和阴性结果个数，查MPN表计算病原微生物个数。计算公式：活菌数/每克土＝菌数近似值×数量指标第一位数的稀释度/土壤干重百分比。
采用上述试剂盒，对来自安徽池州的土壤样品进行实际定量检测，结果均能实际反应出土壤中的活菌数。
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>  南京农业大学
 
<120>  一种定量检测土壤中青枯菌的方法及其检测试剂盒
 
<130>  100
 
<160>  3    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  146
<212>  DNA
<213>  青枯菌的hrpB基因序列片段
 
<400>  1
tcggttttcg ccgctgattt cgaccgtgcg tatcagctcg tcgaccacca ctcctcccag     60
 
cgaggaaagt ccgacgacta cgcgggcgtg ctggcgatgg ccgatgcctc gctgctgctc    120
 
gagtgcgatg aagaagcgga agaaga                                         146
 
 
<210>  2
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Artificial
 
<220>
<223>  P1引物序列
 
<400>  2
cggttttcgc cgctgatttc g                                               21
 
 
<210>  3
<211>  24
<212>  DNA
<213>  Artificial
 
<220>
<223>  P2引物序列
 
<400>  3
cttcttccgc ttcttcatcg cact                                            24
 
 

Claims (6)

1.一种定量检测土壤中青枯菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取土壤，用无菌水稀释成5个稀释度，分别取5个稀释度的稀释样品1mL，控温30℃，用SMSA发酵培养基，摇床震荡培养24h，得增菌液；
 （2）取2μL上清液作为PCR扩增模板，进行PCR扩增反应，引物序列为：
P1：5’-CGGTTTTCGCCGCTGATTTCG-3’，
P2：5’-CTTCTTCCGCTTCTTCATCGCACT-3’；
（3）同时扩增PCR产物、阳性对照和阴性对照，然后进行2%琼脂糖凝胶电泳，然后染色成像，与阳性对照比较，在146bp处出现特异性扩增条带者为阳性结果，不出现条带者为阴性结果；
（4）统计阳性和阴性结果个数，查MPN表计算青枯菌个数；计算公式：活菌数/每克土=菌数近似值×数量指标第一位数的稀释度/土壤干重百分比。
2.根据权利要求1所述的定量检测土壤中青枯菌的方法，其特征在于：步骤（1）中，稀释成5个稀释度的具体操作为：取10g土壤加至90mL水中，震荡摇匀30min，之后取1mL土壤悬液加至9mL生理盐水，作为10-2g/mL，再依次进行系列稀释至10-3 g/mL、10-4 g/mL和10-5 g/mL。
3.根据权利要求1所述的定量检测土壤中青枯菌的方法，其特征在于：步骤（3）中，PCR反应体系：在25μL反应体系中，10×PCR缓冲液2.5μL，20mmol /L Mg2+ 2.5μL，2.5mmol /L dNTP 2.5μL，2.0μmol/L引物0.5μL，2U/μL Taq DNA聚合酶0.3μL，补水至25μL。
4.根据权利要求1所述的定量检测土壤中青枯菌的方法，其特征在于：步骤（3）中，PCR反应条件为：94℃预变性7min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸5min。
5.根据权利要求1所述的定量检测土壤中青枯菌的方法，其特征在于：步骤（4）中，电泳条件为：先以60V电压出孔，再以100V电压电泳30min。
6.一种定量检测土壤中青枯菌的试剂盒，其特征在于：包括试剂供量为1次反应及以上的试剂I和试剂II；
试剂I：用于增菌培养青枯菌的选择性培养基，配方为：SMSA 培养基：胰蛋白腺 10 g，甘油 5 mL，酷蛋白氨基酸1 g，琼脂15g，蒸饱水1L；SMSA培养基冷却至50℃时，每250 mL加入：1 %的多粘菌素B 2.5 mL，1 %的结晶紫125μm，1 %的四氮唑盐1.25 mL，1 %的钎菌肽625 μm, 0.1 %的青霉素125 μrn，1 %的氯霉素125 μm，1 %的放线菌酮2.5 mL；
试剂II：用于MPN-PCR计数法中阳性管数确认的青枯菌PCR反应体系，试剂包括：10×PCR缓冲液、20mmol /L Mg2+、2.5mmol/L dNTP 、2.0μmol/L上游引物、2.0μmol/L下游引物、2U/μL Taq DNA聚合酶和双蒸水；其中，上游引物为P1引物，序列为：5’-CGGTTTTCGCCGCTGATTTCG-3’，下游引物为P2引物，序列为：5’-CTTCTTCCGCTTCTTCATCGCACT-3’。
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