CN107490684A - 一种血液糖化血红蛋白胶体金检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种血液糖化血红蛋白胶体金检测方法。这种检测方法，包括：（1）、胶体金免疫检测试剂盒的制备；（2）、将待检测血液样本放入胶体金免疫检测试剂盒，读取样本糖化血红蛋白的免疫检测结果a以及糖化血红蛋白对应的标准比对品免疫检测结果b；（3）、相同待检测血液样本放入胶体金免疫检测试剂盒，读取样本血红蛋白的免疫检测结果c以及血红蛋白对应的标准比对品免疫检测结果d；（4）、计算得出比值A=a/b，比值B=c/d；（5）、计算糖化血红蛋白的含量=A/B。本发明检测的灵敏度高，特异性强，且可以定量，解决了传统的糖化血红蛋白定量检测方法操作步骤繁琐，检测时间长的问题，同时解决了糖化血红蛋白定性检测准确性低的问题。
Description
技术领域
本发明属于免疫检测分析技术领域，尤其涉及一种血液糖化血红蛋白胶体金检测方法。
背景技术
糖化血红蛋白（HbA1c）是血液葡萄糖通过非酶作用，经细胞膜与红细胞内血红蛋白-链颉氨酸结合形成的产物，其合成速率与红细胞所处环境中糖的浓度成正比，是人体血液中红细胞内的血红蛋白与血糖结合的产物。
血糖和血红蛋白的结合生成糖化血红蛋白是不可逆反应，并与血糖浓度成正比，且保持120天左右。血糖是从食物中的碳水化合物分解而来的血液中的单糖,通常仅指葡萄糖，血糖测试结果反映的是即刻的血糖水平。所以糖化血红蛋白较血糖测定更有临床意义，被誉为糖尿病病情监测的“金标准”，在临床检测中进行日常检测作为血糖控制的指标。
目前临床上测定糖化血红蛋白的主要检测方法有高效液相色谱﹑电泳法﹑亲和层析法等。
离子交换高效液相色谱分析法，它是在经典液相层析法基础上，引进了气相层析的理论具有气相层析的全部优点。测试前需要采用专用仪器对血样中的血红蛋白和糖化血红蛋白进行分离，测试时需使用大型色谱分析设备进行检测，故检测必须在医院由专人进行，难以满足糖化血红蛋白即时检测的需求。
电泳法，相比于非糖化血红蛋白，因糖化而变化的总电荷和糖化血红蛋白的等电点变化是琼脂糖凝胶或者pH梯度5.0～6.5的凝胶等电聚焦电泳分离的基础。琼脂糖凝胶电泳的血红蛋白亚组分分辨率很小，而等电聚焦可以更好地使亚组分分离。可能由于试验的自动化程度不足，重要性已经下降。
亲和层析法，将血样本中的血红蛋白加到层析柱后，所有的糖化血红蛋白（HbA1和旁链糖化的血红蛋白；总糖化血红蛋白）与硼酸结合而非糖化血红蛋白通过层析柱可被测量。在加入高浓度也包含顺式-羟基的多羟基复合物，例如山梨醇后，糖化血红蛋白与硼酸的结合被替换而从柱子上洗脱下来。亲和层析法对经翻译以后修饰的血红蛋白和病理血红蛋白的影响相对不敏感。利用亲和层析法，仅能测定总糖化血红蛋白。广泛使用的亲和层析方法，也仅是用经验算法从总糖化血红蛋白值计算出“标准的HbA1c”，因此存在定量无法精准的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提出一种血液糖化血红蛋白胶体金检测方法，包括如下步骤：
（1）制备胶体金免疫检测试剂盒，其中包括标准比对品的制备, 所述标准比对品为不与血红蛋白、抗血红蛋白抗体、糖化血红蛋白以及抗糖化血红蛋白抗体发生免疫性结合反应的物质；
（2)将待检测血液样本放入胶体金免疫检测试剂盒，以标准比对品作为参比品，与糖化血红蛋白进行免疫检测反应，读取样本糖化血红蛋白的免疫检测结果a以及糖化血红蛋白对应的标准比对品免疫检测结果b；
（3）将与步骤（2）中同一种待检测血液样本放入胶体金免疫检测试剂盒，以与步骤（2）中同一种标准比对品作为参比品，与血红蛋白进行免疫检测反应，读取样本血红蛋白的免疫检测结果c以及血红蛋白对应的标准比对品免疫检测结果d；
（4）计算得出比值A=a/b，比值B=c/d；
（5）计算糖化血红蛋白的含量=A/B。
进一步地，所述检测方法所用原料包括标准比对品、抗血红蛋白抗体、抗糖化血红蛋白抗体、样品垫、金标抗体结合垫、载体、吸水垫和PVC板。
进一步地，所述标准比对品为兔IgG、驴IgG、马IgG、羊IgG、鼠IgG的一种或两种或两种以上。
进一步地，所述抗血红蛋白抗体为抗血红蛋白单克隆抗体和抗血红蛋白多克隆抗体的一种或两种。
进一步地，所述抗糖化血红蛋白抗体为抗糖化血红蛋白单克隆抗体、抗糖化血红蛋白多克隆抗体、抗血红蛋白单克隆抗体、抗血红蛋白多克隆抗体的一种或两种或两种以上。
进一步地，所述载体为硝酸纤维素膜。
具体实施方式
本发明实施例提供了一种糖化血红蛋白胶体金检测试剂盒，包括：
卡壳，血红蛋白试剂条和糖化血红蛋白试剂条；
卡壳包括上卡壳和下卡壳，上卡壳上有观察窗和加样孔，下卡壳的卡壳槽里固定有血红蛋白试剂条和糖化血红蛋白试剂条，上卡壳和下卡壳卡接固定；
血红蛋白试剂条包括样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维膜、吸水垫和PVC板，PVC板位于所述卡壳槽底层，硝酸纤维膜位于所述PVC板上层的中部，金标抗体结合垫位于所述PVC板的上部且与所述硝酸纤维膜上端部分重叠，吸水垫位于所述PVC板的下部且与硝酸纤维膜的下端部分重叠，样品垫位于PVC板的上部且与金标抗体结合垫非靠近硝酸纤维膜一端部分重叠，硝酸纤维膜以靠近样品垫为起始端，靠近吸水垫为终止端，依次包被血红蛋白多克隆抗体和标准比对品，金标抗体结合垫上喷涂有胶体金标记的血红蛋白单克隆抗体。
糖化血红蛋白试剂条包括样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维膜、吸水垫和PVC板，PVC板位于所述卡壳槽底层，硝酸纤维膜位于PVC板上层的中部，金标抗体结合垫位于PVC板的上部且与硝酸纤维膜上端部分重叠，吸水垫位于PVC板的下部且与硝酸纤维膜硝酸纤维膜的下端部分重叠，样品垫位于PVC板的上部且与金标抗体结合垫非靠近硝酸纤维膜一端部分重叠，硝酸纤维膜以靠近样品垫为起始端，靠近吸水垫为终止端，依次包被糖化血红蛋白单克隆抗体和标准比对品，金标抗体结合垫上喷涂有胶体金标记的血红蛋白单克隆抗体。
血红蛋白试剂条上的硝酸纤维膜包被血红蛋白多克隆抗体的为检测线，包被标准比对品的为比对线，且检测线与比对线平行。
糖化血红蛋白试纸上的硝酸纤维膜包被糖化血红蛋白单克隆抗体的为检测线，包被标准比对品的为比对线，且检测线与比对线平行。
实施例1. 糖化血红蛋白胶体金检测试剂盒的制备方法
所述糖化血红蛋白胶体金检测试剂盒的制备主要是所述血红蛋白试剂条和糖化血红蛋白试剂条的制备；
其中，所述血红蛋白试剂条的制备包括胶体金标记、金标结合垫的制备和硝酸纤维膜的包被。
所述胶体金的制备包括：
(1)将100ml 0.01％的AuCl3溶液磁力搅拌下加热至沸腾，准确加入1.5～3ml 1％的柠檬酸三钠溶液。待颜色稳定后继续加热15分钟，冷却后加纯水补充至100ml，避光保存；
(2)用K2CO3调节pH至7～9；
(3)加入K2CO3静置5分钟，每毫升金溶液加入10～30ug 血红蛋白单克隆抗体，优选为20ug，静置30分钟；
(4)加入10％的BSA(牛血清蛋白)溶液，一直到最终浓度为0.1％，静置20分钟；
(5)将上述溶液12000rpm离心50分钟，弃上清，用复溶液等体积复溶。此时胶体金标记完成，接下来是金标结合垫的制备，即将上述复溶后的溶液均匀滴加到6mm宽的结合垫上，37℃干燥12小时，最终制得金标结合垫。
下面是硝酸纤维膜的包被，包括：
血红蛋白多克隆抗体包被及标准比对品包被。
其中标准比对品选取羊抗鼠IgG。
(1)血红蛋白多克隆抗体和羊抗鼠IgG抗体用pH7.4PBS缓冲液稀释，血红蛋白多抗浓度为1mg/ml,羊抗鼠IgG抗体浓度为0.8mg/ml。
(2)按照1ul/cm的速度包被检测线和控制线。为防止扩散，包被好的PVC板立即放到37℃干燥12小时。
所述糖化血红蛋白试剂条的制备也是包括胶体金标记、金标结合垫的制备和硝酸纤维膜的包被。
所述胶体金的制备包括：
(1)将100ml 0.01％的AuCl3溶液磁力搅拌下加热至沸腾，准确加入1.5～3ml 1％的柠檬酸三钠溶液。待颜色稳定后继续加热15分钟，冷却后加纯水补充至100ml，避光保存；
(2)用K2CO3调节pH至7～9；
(3)加入K2CO3静置5分钟，每毫升金溶液加入10～30ug 血红蛋白单克隆抗体，优选为20ug，静置30分钟；
(4)加入10％的BSA(牛血清蛋白)溶液，一直到最终浓度为0.1％，静置20分钟；
(5)将上述溶液12000rpm离心50分钟，弃上清，用复溶液等体积复溶。此时胶体金标记完成，接下来是金标结合垫的制备，即将上述复溶后的溶液均匀滴加到6mm宽的结合垫上，37℃干燥12小时，最终制得金标结合垫。
下面是硝酸纤维膜的包被，包括：
糖血红蛋白单克隆抗体包被及标准比对品包被。
其中标准比对品选取羊抗鼠IgG。
(1)糖化血红蛋白单克隆抗体和羊抗鼠IgG抗体用pH7.4PBS缓冲液稀释，糖化血红蛋白单克隆抗体浓度为1mg/ml羊抗鼠IgG抗体浓度为0.8mg/ml。
(2)按照1ul/cm的速度包被检测线和控制线。为防止扩散，包被好的PVC板立即放到37℃干燥12小时。
在上述步骤均完成后，分别将所述血红蛋白试剂条和糖化血红蛋白试剂条的样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫分别依次黏贴到PVC板上，切成4mm条，装袋封口，室温保存备用。
本发明提供的一种糖化血红蛋白胶体金检测试剂盒，采用胶体金检测试剂盒检测样品中的糖化血红蛋白，与传统胶体金检测条相比，检测的灵敏度更高，特异性更强，且可以定量，解决了传统的糖化血红蛋白定量检测方法操作步骤繁琐，检测时间长的问题，同时解决了糖化血红蛋白定量检测准确性低的问题。
实施例2. 糖化血红蛋白胶体金检测试剂条的检测方法
（1）、取待测血液样本，在上述制得的糖化血红蛋白胶体金检测试剂盒加样孔中加入3～4滴，20min后，放入胶体金检测仪；以羊抗鼠IgG作为比对品，与糖化血红蛋白进行免疫检测反应，读取样本糖化血红蛋白的检测线信号值a以及糖化血红蛋白对应的羊抗鼠IgG比对线信号值b；
（2）、取相同待测血液样本，在与步骤（1）中相同的糖化血红蛋白胶体金检测试剂盒加样孔中加入3～4滴，20min后，放入胶体金检测仪；以羊抗鼠IgG作为比对品，与血红蛋白进行免疫检测反应，读取样本血红蛋白的检测线信号值c以及血红蛋白对应的羊抗鼠IgG比对线信号值d；
（3）、计算得出比值A=a/b，比值B=c/d；
（4）、计算糖化血红蛋白的含量=A/B。
实施例3. 试剂条性能评估试验
1、准确性试验
取同一患者血液标本，用同一批次的试剂条重复检测3次，计算出相对偏差B值为-0.04%。符合产品设计要求；
2、重复性试验
取同一患者血液标本，用同一批次的试剂条同时检测20次，计算出变异系数CV值为11.21%，符合产品设计要求。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (6)
1.一种糖化血红蛋白胶体金检测方法，包括如下步骤：
（1）制备胶体金免疫检测试剂盒，其中包括标准比对品的制备, 所述标准比对品为不与血红蛋白、抗血红蛋白抗体、糖化血红蛋白以及抗糖化血红蛋白抗体发生免疫性结合反应的物质；
（2）将待检测血液样本放入胶体金免疫检测试剂盒，以标准比对品作为参比品，与糖化血红蛋白进行免疫检测反应，读取样本糖化血红蛋白的免疫检测结果a以及糖化血红蛋白对应的标准比对品免疫检测结果b；
（3）将与步骤（2）中同一种待检测血液样本放入胶体金免疫检测试剂盒，以与步骤（2）中同一种标准比对品作为参比品，与血红蛋白进行免疫检测反应，读取样本血红蛋白的免疫检测结果c以及血红蛋白对应的标准比对品免疫检测结果d；
（4）计算得出比值A=a/b，比值B=c/d；
（5）计算糖化血红蛋白的含量=A/B。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述检测方法所用原料包括标准比对品、抗血红蛋白的抗体、抗糖化血红蛋白的抗体、样品垫、金标抗体结合垫、载体、吸水垫和PVC板。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述标准比对品为兔IgG、驴IgG、马IgG、羊IgG、鼠IgG的一种或两种或两种以上。
4.如权利要求1所述的血液糖化血红蛋白的检测方法，其特征在于：所述抗血红蛋白抗体为抗血红蛋白单克隆抗体和抗血红蛋白多克隆抗体的一种或两种。
5.如权利要求1所述的血液糖化血红蛋白的检测方法，其特征在于：所述抗糖化血红蛋白抗体为抗糖化血红蛋白单克隆抗体、抗糖化血红蛋白多克隆抗体、抗血红蛋白单克隆抗体、抗血红蛋白多克隆抗体的一种或两种或两种以上。
6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述载体为硝酸纤维素膜。
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004042364A2 (en) * | 2002-11-05 | 2004-05-21 | Therasense, Inc. | Assay device, system and method |
| CN1522369A (zh) * | 2002-03-29 | 2004-08-18 | ���µ�����ҵ��ʽ���� | 血液处理方法及其装置、血红蛋白类测定方法及其装置 |
| CN104407135A (zh) * | 2014-11-03 | 2015-03-11 | 清华大学深圳研究生院 | A型流感病毒h5和h9亚型检测方法及其试剂盒 |
| CN105866440A (zh) * | 2016-05-31 | 2016-08-17 | 常州博闻迪医药科技有限公司 | 一种血液糖化血红蛋白的检测方法 |
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1522369A (zh) * | 2002-03-29 | 2004-08-18 | ���µ�����ҵ��ʽ���� | 血液处理方法及其装置、血红蛋白类测定方法及其装置 |
| WO2004042364A2 (en) * | 2002-11-05 | 2004-05-21 | Therasense, Inc. | Assay device, system and method |
| CN104407135A (zh) * | 2014-11-03 | 2015-03-11 | 清华大学深圳研究生院 | A型流感病毒h5和h9亚型检测方法及其试剂盒 |
| CN105866440A (zh) * | 2016-05-31 | 2016-08-17 | 常州博闻迪医药科技有限公司 | 一种血液糖化血红蛋白的检测方法 |
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