CN205539004U - 一种检测ngal和糖化血红蛋白的检测试纸 - Google Patents
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Abstract
本实用新型涉及免疫层析检测技术领域，具体涉及一种检测NGAL和糖化血红蛋白的检测试纸，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸、检测线a、检测线b、质控线和PVC底板，所述样品垫、所述结合垫、所述硝酸纤维素膜及所述吸水纸依次搭接在所述PVC底板上，所述检测线a、检测线b、所述质控线依次包被于硝酸纤维素膜，所述结合垫包被有NGAL、HbA1c单克隆抗体—胶体金标记物层；所述检测线a包被有NGAL单抗，所述检测线b包被有HbA1c单抗，所述质控线包被有羊抗鼠IgG；采用本方案的一种检测NGAL和糖化血红蛋白的检测试纸具有灵敏度高、特异性强、操作简便、批间差异小、检测快速、准确的优点。
Description
技术领域
本实用新型涉及免疫层析检测技术领域，具体涉及一种采用胶体金免疫层析法测定人血液中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白和糖化血红蛋白含量的一种检测NGAL和糖化血红蛋白的检测试纸。
背景技术
NGAL分子量为25kD，是脂质运载蛋白lipocalin超家族的2号成员，Kjeldsen在1993年在人中性粒细胞中发现。NGAL与明胶酶B，即基质金属蛋白酶9(MMP-9)共价结合，形成1351kD的异二聚体蛋白，由人类中性粒细胞分泌。研究表明，机体暴露在外界有害理化及生物因素下，全血NGAL浓度明显高于正常水平。现代研究显示，生理状态下，NGAL不仅在中性粒细胞表达，还在其他一些组织如胃壁细胞、肝胆管细胞、小肠潘氏细胞和肾近曲小管细胞等均有表达。NGAL参与不同的生理及病理过程，涉及炎症免疫应答、肿瘤的发生发展的各阶段，并且与肾损伤的发生发展密不可分。在缺血、中毒等损伤因素造成肾小管上皮细胞NGAL高表达，使其在血液和尿液中能够被检出，而且升高早于血肌酐升高。
NGAL作为新型AKI早期诊断标志物，在缺血性、脓毒性、肾移植以及早期糖尿病等的情况下均能在尿液和血液中检测到，并且灵敏度高，能作为更早的诊断指标。
糖化血红蛋白(HbA1c)是人体血液中红细胞内的血红蛋白与血糖结合的产物。血糖和血红蛋白的结合生成糖化血红蛋白是不可逆反 应，并与血糖浓度成正比，且保持120天左右，所以可以观测到120天前。糖化血红蛋白的含量变化可以作为糖尿病监测和诊断的指标。
我国肾病患者已达1.5亿人，其中糖尿病患者已高达9800万人，其他检测方法由于时间长、费用高。为我国糖尿病和肾病监控和诊断带来了巨大的困难。
鉴于此，本实用新型研究和设计了一种检测人血液中中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白和糖化血红蛋白的一种检测NGAL和糖化血红蛋白的检测试纸。
实用新型内容
本实用新型的目的在于提供一种灵敏度高、特异性强、操作简便、批间差异小、检测快速、准确并适合床旁检测人血液中中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量和糖化血红蛋白(HbA1c)的一种检测NGAL和糖化血红蛋白的检测试纸，以便对急性肾损伤、糖尿病的早期诊断和治疗监控。
为实现上述目的，本实用新型提供一种检测NGAL和糖化血红蛋白的检测试纸，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸、检测线a、检测线b、质控线和PVC底板，所述样品垫、所述结合垫、所述硝酸纤维素膜及所述吸水纸依次搭接在所述PVC底板上，所述检测线a、检测线b、所述质控线依次包被于硝酸纤维素膜，所述结合垫包被有NGAL、HbA1c单克隆抗体—胶体金标记物层；所述检测线a包被有NGAL单抗，所述检测线b包被有HbA1c单抗，所述质控线包被有羊抗鼠IgG。
本实用新型一种检测NGAL和糖化血红蛋白的检测试纸的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、胶体金的制备：取1个500mL圆底烧瓶，加入100mL去离子水，圆底烧瓶上端接一回流冷凝管，于恒温磁力搅拌器上使用温度档350℃对其进行加热，转速420r/min，加热至第5min，加入125μL 1％氯金酸。继续加热5min至沸腾状态后，沸腾的标准是水温为100℃，向圆底烧瓶中快速加入250μL 10％柠檬酸三钠溶液，圆底烧瓶中溶液由紫变红后继续加热反应10min，直至溶液透亮后，停止加热，继续以420r/min搅拌5min，冷却至室温，4℃密封保存，即制得胶体金。
步骤二、金标抗体的制备：取1mL胶体金于1.5mL离心管中，调节pH至8.5。向离心管中加入10μg/mL的NGAL单克隆抗体、8ug/mL的HbA1c单克隆抗体，混匀后静置10min，向离心管中加入100μL 10％BSA溶液，混匀后静置5min，制得金标抗体，即NGAL、HbA1c抗体—胶体金标记物。
将制得的金标抗体溶液于4℃13500r/min离心10min，去除上清液，将沉淀用金标稀释溶液稀释至原体积3/2，于4℃保存备用。
步骤三、NGAL单克隆抗体、HbA1c单克隆抗体、羊抗鼠IgG包被：取稀释至0.5mg/mL NGAL单克隆抗体、0.5mg/mL HbA1c单克隆抗体和1.0mg/mL羊抗鼠IgG，采用dispent划膜仪分别包被至硝酸纤维素膜的检测线a、检测线b和质控线位置。其中0.5mg/mL NGAL单克隆抗体中含0.3％甲醇，0.5mg/mLHbA1c单克隆抗体中含 2.5％蔗糖，检测线a距质控线距离为14mm，检测线b距质控线距离为8mm，划膜浓度均为1μL/cm，平台移动速度为40mm/s。
步骤四、试纸条的组装：(1)将硝酸纤维素膜，即NC膜，和吸水纸分别粘贴于PVC底板上，吸水纸压住NC膜上方2mm；(2)将粘贴好NC膜和吸水纸的PVC底板在切条机上切割成4mm宽的试纸(3)将样品垫和结合垫切成4mm宽的条，同时将结合垫浸泡于金标抗体溶液中，并放置于37摄氏度恒温恒湿干燥箱中烘干，制得金标垫；(4)烘干后的金标垫按长度1cm进行裁剪。将金垫粘贴于PVC底板上，压住NC膜下方2mm，同时用样品垫压住金标垫下方2mm。
与现有技术相比，本实用新型具有下列优点：
1、本实用新型的检测人血液中中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白和糖化血红蛋白一种检测NGAL和糖化血红蛋白的检测试纸，具有特异性强、灵敏度高、检测时间短、批间差异小、结果稳定可靠等优点
2、本实用新型的检测试纸条检测时间短，出报告时间快。
3、本实用新型的检测试纸条操作简便，不需要专业人员操作。
4、本实用新型对胶体金的制备实现程序化操作，大大降低了批间差异。
5、本实用新型的抗体标记时间短，比传统时间缩短了30min以上。
6、本实用新型的样品垫和金垫具有优异的释放能力和吸水能力，有着更高准确度。
7、本实用新型中抗体在NC膜上包被方式可以提高免疫层析试纸条的稳定性和亲水性。
8、本实用新型采用氯化钠破坏法确定最终抗体标记浓度，提高试纸条灵敏度的同时降低抗体用量，节约了成本。
附图说明
图1为本实用新型一种检测NGAL和糖化血红蛋白的检测试纸的结构示意图：
图2为本实用新型一种检测NGAL和糖化血红蛋白的检测试纸检测模式图；
图3为制备本实用新型一种检测NGAL和糖化血红蛋白的检测试纸的NGAL的线性范围相关性；
图4为制备本实用新型一种检测NGAL和糖化血红蛋白的检测试纸的HbA1c的线性范围相关性。
其中，1为样品垫，2为结合垫，3为硝酸纤维素膜，4为吸水纸，5为检测线a，6为检测线b，7为质控线，8为PVC底板，9为加样孔，T为层析方向。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本实用新型作进一步详细的说明：
如图1、2所示本实用新型揭示了一种检测NGAL和糖化血红蛋白的检测试纸，包括样品垫1、结合垫2、硝酸纤维素膜3、吸水纸4、检测线a 5、检测线b 6质控线7和PVC底板8。所述样品垫1、所 述结合垫2、所述硝酸纤维素膜3及所述吸水纸4依次粘接在所述PVC底板8上；所述结合垫2包被有NGAL、HbA1c克隆抗体—胶体金标记物；所述检测线a 5上包被有中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体，所述检测线b 6上包被有糖化血红蛋白单克隆抗体，所述质控线7上包被有羊抗鼠IgG。
一种制备一种检测NGAL和糖化血红蛋白的检测试纸的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、胶体金的制备：取一个500mL的圆底烧瓶，加入100mL去离子水，圆底烧瓶上端接一根回流冷凝管，于恒温磁力搅拌器上使用温度挡350℃对其进行加热，转速420r/min，加热至第5min，加入125uL 1％氯金酸。继续加热5min至沸腾状态后，沸腾的标准是水温为100℃，向圆底烧瓶中快速加入250μL 10％柠檬酸三钠溶液，圆底烧瓶中溶液由紫变红后继续加热反应10min，直至溶液透亮后，停止加热，继续以420r/min搅拌5min，冷却至室温，4℃密封保存，即制得胶体金。
步骤二、金标抗体的制备：取1mL胶体金于1.5mL离心管中，调节pH至8.5。向离心管中加入10μg/mL的NGAL单克隆抗体、8ug/mL的HbA1c单克隆抗体，混匀后静置10min，向离心管中加入100μL 10％BSA溶液，混匀后静置5min，制得金标抗体，即NGAL、HbA1c抗体—胶体金标记物。
将制得的金标抗体溶液于4℃13500r/min离心10min，去除上清液，将沉淀用金标稀释溶液稀释至原体积3/2，于4℃保存备用。
步骤三、NGAL单克隆抗体、HbA1c单克隆抗体、羊抗鼠IgG包被：取稀释至0.5mg/mL NGAL单克隆抗体、0.5mg/mL HbA1c单克隆抗体和1.0mg/mL羊抗鼠IgG，采用dispent划膜仪分别包被至硝酸纤维素膜的检测线a、检测线b和质控线位置。其中0.5mg/mL NGAL单克隆抗体中含0.3％甲醇，0.5mg/mLHbA1c单克隆抗体中含2.5％蔗糖，检测线a距质控线距离为14mm，检测线b距质控线距离为8mm，划膜浓度均为1μL/cm，平台移动速度为40mm/s。
步骤四、试纸条的组装：(1)将硝酸纤维素膜，即NC膜，和吸水纸分别粘贴于PVC底板上，吸水纸压住NC膜上方2mm；(2)将粘贴好NC膜和吸水纸的PVC底板在切条机上切割成4mm宽的试纸条；(3)将样品垫和结合垫切成4mm宽的条，同时将结合垫浸泡于金标抗体溶液中，并放置于37摄氏度恒温恒湿干燥箱中烘干，制得金标垫；(4)烘干后的金标垫按长度1cm进行裁剪。将金垫粘贴于PVC底板上，压住NC膜下方2mm，同时用样品垫压住金标垫下方2mm。
作为实施的优选方式：在所述步骤一之前对实验所用容器的清洗：首先将实验用玻璃容器浸泡于5％二氯二甲硅烷的氯仿溶液中1分钟，室温干燥后蒸馏水冲洗，再干燥备用。
作为实施的优选方式：在所述步骤一中，所用去离子水电阻率为18.2Ω。
作为实施的优选方式：在所述步骤二中，金标稀释液为含有3％β-环糊精、0.01％酪蛋白、0.5％BSA、0.05％吐温的pH为7.4,的0.01M 的PBS。
作为实施的优选方式：在所述步骤四(3)中，还包括对样品垫进行前处理的步骤，即将样品垫用切条机分别切成4mm的长条，用含有5％的蔗糖、1％BSA、0.2％吐温的pH为7.6的0.01M的PBS。
抗体最佳标记量的确定：
氯化钠破坏法：取20支1.5mL离心管，对其从1—20编号，分别加入1mL胶体金溶液，然后加入10μl 0.1M K2CO3调节pH，混匀。1—10管加入0μg、2μg、4μg、6μg、8μg、10μg、12μg、14μg、16μg、18μg中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体，11—20管加入0μg、2μg、4μg、6μg、8μg、10μg、12μg、14μg、16μg、18μg糖化血红蛋白抗体，震荡混匀。最后1至20号管分别100μL 10％NaCl溶液，静置观察每支离心管的颜色变化，当有离心管颜色变为紫色时说明该抗体浓度不是最适合标记浓度，颜色保持红色不变的标记浓度为适合标记浓度，保持红色不变的最低标记浓度为最小标记量。
表一：中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体最佳蛋白标记量的确定
表二：糖化血红蛋白抗体最佳标记量确定
抗体最佳标记pH值的确定
氯化钠破坏法：取7支1.5mL离心管，对其从1—7编号，分别加入1mL胶体金溶液，然后按1—7序号分别将胶体金溶液pH值调整至6、7、7.5、8、8.5、9、9.5，混匀。再加入10ng中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体和8ng糖化血红蛋白抗体，震荡混匀。最后1至7号管分别100μL 10％NaCl溶液，静置观察每支离心管的颜色变化，当有离心管颜色变为紫色时说明该pH值不是最适合标记pH值，颜色保持红色不变的pH值为最适合标记pH值。
表三：最佳标记pH值的确定
试纸条性能测试
1试纸条的灵敏度
将0.5mg/mL中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白标准品溶液用阴性全血分别稀释为0ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1500ng/mL的一系列标准溶液，每个标准浓度取50μl，加入200μL0.01M pH7.6PBS中，混匀，取75μL加入加样孔，计时3min后检测。仪器可以检测到产生变化的最小OD值对应浓度为20ng/mL，因此中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的最低检出限为20ng/mL。取糖化血红蛋为16％的患者全血样本，分别稀释至0％、1.5％、3％、6％、12％、16％的一系列标准浓度，每个标准浓度取50μl，加入200μL0.01M pH7.6PBS中，混匀，取75μL加入加样孔，计时3min后检测。仪器可以检测到产生变化的最小OD值对应浓度为3％，因此糖化血红蛋白的最低检出限为3％。
2试纸条的重复性测试
配制浓度为0ng/mL(0％)、50ng/mL(6％)、1000ng/mL(16％)的NGAL和HbA1c混合标准品溶液，括号里面为HbA1c的浓度。取同一批次的90条试纸条进行检测，每个浓度用30条试纸条进行测定，测试OD值，浓度为0ng/mL(0％)的CV值为7％、50ng/mL(6％)的CV值为8％、1000ng/mL(16％)的CV值为6.5％。根据检测结果可知，该试纸条具有较好的重复性。
3试纸条的稳定性测试
将试纸条保存于装有干燥剂的铝箔袋中，置于37℃恒温干燥箱 中，密封保存。分别在1、2、3、4周后进行测试。配制浓度为0ng/mL(0％)、50ng/mL(6％)、1000ng/mL(16％)的NGAL和HbA1c混合标准品溶液，括号里面为HbA1c的浓度，进行测试。在第4周，各浓度标准品检测OD值没有降低。说明该试纸条可以稳定存放两年。
标准曲线的绘制
1.NGAl标准曲线绘制
取0.5mg/mL的NGAl标准品用阴性全血分别稀释成0ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、125ng/mL、312ng/mL、782ng/mL、1500ng/mL的一系列标准浓度。每个浓度重复测试3次，取平均值，以浓度为X，以OD值为Y绘制标准工作曲线，经统计拟合标准工作曲线的表达式列出方程为Y＝3.28638/[1+(X/457.86033)-2.32345]+0.11853,拟合系数R2＝0.99618.结果见附图3，图3为线性检测标准工作曲线，NGAL测定范围为20ng/mL～1500ng/mL.
2.HbA1c标准曲线绘制
取HbA1c为16％的患者抗凝全血标本，配制成HbA1c为1.5％、3％、6％、8％、16％的全血标本，每个浓度重复测试3次，记录OD值，以浓度为X，测定OD值为Y绘制标准工作曲线，经拟合标准工作曲线的表达式列出方程为：Y＝2.81517/[1+(X/6.39003)-2.69146]-0.09493，拟合系数R2＝0.99342.结果见附图4，图4为线性检测标准工作曲线。HbA1c测定范围为3％～16％。
干扰试验
一、将一新鲜抗凝全血标本分成6份，每份1mL，第1、2份加入葡萄糖分别为30mmol/L、50mmol/L的100μL高糖物质，第3、4份加入总胆红素分别为0.2mmol/L、0.4mmol/L的血清100μL，第5、6份加入甘油三酯分别为7mmol/L、10mmol/L的血清100μl，混匀后测定HbA1c和NGAL值。
二、采集患者全血标本，分别注入含EDTA、肝素、构橼酸钠3种抗凝剂，混匀后测定HbA1c和NGAL值。
三、结果表明，在葡萄糖为30mmol/L以下高糖标本，总胆红素为0.2mmol/L以下的黄疸标本以及甘油三酯为10mmol/L以下的血脂标本对本方法测定HbA1c和NGAL无明显干扰。采用EDTA、肝素抗凝剂对实验结果也无明显干扰。
本领域的科研人员从本实用新型公开内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本实用新型的保护范围。
Claims (1)
1.一种检测NGAL和糖化血红蛋白的检测试纸，其特征在于：包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸、检测线a、检测线b、质控线和PVC底板，所述样品垫、所述结合垫、所述硝酸纤维素膜及所述吸水纸依次搭接在所述PVC底板上，所述检测线a、检测线b、所述质控线依次包被于硝酸纤维素膜，所述结合垫包被有NGAL、HbA1c单克隆抗体—胶体金标记物层；所述检测线a包被有NGAL单抗，所述检测线b包被有HbA1c单抗，所述质控线包被有羊抗鼠IgG。
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