CN107475379A

CN107475379A - 一种用于肿瘤诊断与预后检测的分子标志物及其检测引物和试剂盒

Info

Publication number: CN107475379A
Application number: CN201710679293.4A
Authority: CN
Inventors: 黄家强; 林博楠; 王晓月; 田荣孟; 林舒晔
Original assignee: Beijing Jiaotong University
Current assignee: Beijing Jiaotong University
Priority date: 2017-08-10
Filing date: 2017-08-10
Publication date: 2017-12-15
Anticipated expiration: 2037-08-10
Also published as: CN107475379B

Abstract

本发明公开一种用于肿瘤诊断与预后检测的分子标志物，所述分子标志物为PRSS3剪接变异体；其中，所述PRSS3剪接变异体为PRSS3‑V1、PRSS3‑V2、PRSS3‑V3和/或PRSS3‑V4，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.1‑4所示。本发明进一步提供了用于检测上述分子标记物的RT‑qPCR引物和试剂盒。本发明用于检测PRSS3剪接变异体的引物或试剂盒可以特异地检测细胞、组织、体液及分泌液等样本中PRSS3剪接变异体转录水平，通过本发明得到的检测结果可以为患者肿瘤个体化诊断及药物治疗的预后判断提供评价方法。此外，本发明检测方法操作简便、精准稳定，具有临床应用意义。

Description

一种用于肿瘤诊断与预后检测的分子标志物及其检测引物和试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域。更具体地，涉及一种用于肿瘤诊断与预后检测的分子标志物及其检测引物和试剂盒。

背景技术

癌症是全球疾病致死的主要原因之一。由于缺乏相对特异的标志物，或敏感性低组织特异性差，多数患者就诊时已届晚期，并由于监测治疗干预手段的限制，致使死亡率极高。尽管越来越多的证据表明肿瘤中许多基因存在表达差异，但仍未发现可靠的生物标志物来用于肿瘤的精确诊断及监测。

因此，筛选敏感性强特异性高的分子标志物，以及建立有效监控手段和建立精准的检测方法，对肿瘤诊断和预后检测具有重要的临床应用价值。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种用于肿瘤诊断与预后检测的分子标志物。

本发明的第二个目的在于提供上述分子标记物在制备肿瘤或感染等疾病诊断与预后检测的试剂中的应用。

本发明的第三个目的在于提供一种用于肿瘤或感染等疾病诊断与预后检测的试剂盒。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

本发明研究发现PRSS3基因在mRNA转录之后、翻译之前经不同的剪接模式所产生了不同剪接变异体，这些剪接变异体的表达具有组织特异性，且在环境刺激、药物作用下或肿瘤发生发展过程中，会发生转录水平改变，从而产生差异表达剪接变异体不同类型呈现组织细胞特异性表达。剪接变异体的特异性表达的变化与肿瘤或感染性疾病关系密切。因此，可将这些可作为肿瘤或炎症感染诊断与预后检测的分子标记物。

基于以上发现，本发明首先提供了一种用于肿瘤诊断与预后检测的分子标志物，所述分子标志物为PRSS3剪接变异体；其中所述PRSS3剪接变异体为PRSS3-V1、PRSS3-V2、PRSS3-V3和/或PRSS3-V4，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.1-4所示。

本发明提供了上述分子标记物在制备肿瘤诊断与预后检测的制剂的应用。

本发明还提供了检测上述分子标记物的物质在制备肿瘤诊断与预后检测的制剂中的应用。

优选的，所述物质为检测上述分子标记物的引物，以及包含上述引物的试剂或试剂盒。

本发明进一步提供了一种用于检测上述分子标记物的RT-qPCR引物，包括用于检测PRSS3-V1、PRSS3-V2、PRSS3-V3和PRSS3-V4的通用引物Vc1或Vc2；

其中，所述引物Vc1的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；所述引物Vc2的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；优选的，所述通用引物为引物Vc1。

本发明通过上述通用引物Vc1或Vc2是针对PRSS3剪接变异体PRSS3-V1、PRSS3-V2、PRSS3-V3和PRSS3-V4共有序列(如SEQ ID No.5所示)设计的，通过PCR扩增可检测或筛选样本中是否存在PRSS3剪接变异体，以利于进一步确定PRSS3剪接变异体的类型。因此可以进行细胞、组织、体液及分泌液等样本中是否存在PRSS3剪接变异体的筛查。

进一步，本发明还提供了一种用于检测上述分子标记物的RT-qPCR引物，包括：

PRSS3-V1的特异性引物V1，其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；

PRSS3-V2的特异性引物V2，其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；

PRSS3-V3的特异性引物V3，其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；

PRSS3-V4的特异性引物V4，其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示。

由于PRSS3剪接变异体V1-V4的引物是分别针对PRSS3剪接变异体PRSS3-V1、PRSS3-V2、PRSS3-V3和PRSS3-V4特异序列序列(如SEQ ID No.1-4所示)设计的，可通过PCR扩增可确定样本中存在PRSS3剪接变异体表达的具体类型。本发明发现PRSS3剪接变异体不同类型呈现组织细胞特异性表达，而这种特异性表达的变化与肿瘤关系密切。因此本发明通过上述各PRSS3剪接变异体的特异性引物进一步可检测细胞、组织、体液及分泌液等样本中存在PRSS3剪接变异体的类型，有助于肿瘤诊断与预后判断。

需要说明的是，本发明上述通用引物和特异性引物可单独使用，也可结合使用。

本发明还提供了一种用于检测上述分子标记物的RT-qPCR试剂盒，包括上述RT-qPCR引物。

进一步，所述RT-qPCR试剂盒还包括用于均一化的内参引物、阳性对照模板、cDNA合成试剂和PCR反应试剂。

其中，所述用于均一化的内参引物为以GAPDH为内参的引物，其核苷酸序列如SEQID No.15和SEQ ID No.16所示；

所述阳性对照模板为经测序验证过的PRSS3剪接变异体PCR扩增产物，或测序验证过的PRSS3剪接变异体克隆质粒；优选的，PRSS3剪接变异体克隆质粒包括PRSS3剪接变异体的共有序列，所述共有序列如SEQ ID No.5所示；

所述阴性对照模板为去离子水。

本发明用于检测上述分子标记物的方法，包括以下步骤：

1)利用上述RT-qPCR引物或RT-qPCR试剂盒，同时用GAPDH作为均一化参照引物对逆转录合成待检测样本cDNA进行qPCR扩增，得到扩增产物；

2)结果判读：

当利用上述通用引物进行检测时，凝胶电泳可见PCR扩增产物，或通过qPCR的溶解曲线观察PCR扩增产物的特异性、通过扩增曲线得到Ct值<或＝33，则说明样本中至少存在一种PRSS3剪接变异体的表达；

凝胶电泳无PCR扩增产物，某一特异性引物(如V1、V2、V3或V4)凝胶电泳可见PCR扩增产物，或通过qPCR观察不到溶解曲线或出现非特异溶解曲线、无扩增曲线或通过扩增曲线得到Ct值＞33，则说明PRSS3剪接变异体在样本中不表达。

当利用上述特异性引物进行检测时，某一特异性引物(如V1、V2、V3或V4)凝胶电泳可见PCR扩增产物，或通过qPCR的溶解曲线观察的某一特异性引物(如V1、V2、V3或V4)PCR扩增产物的特异性、通过扩增曲线得到Ct值<或＝33，则说明样本中对应存在该PRSS3剪接变异体的表达(PRSS3-V1、PRSS3-V2、PRSS3-V3或PRSS3-V4)。

某一特异性引物(如V1、V2、V3或V4)凝胶电泳无PCR扩增产物，或通过qPCR的溶解曲线观察不到某一特异性引物(如V1、V2、V3或V4)PCR扩增产物或出现非特异溶解曲线、无扩增曲线或通过扩增曲线得到Ct值＞33，则说明样本中该PRSS3剪接变异体(PRSS3-V1、PRSS3-V2、PRSS3-V3或PRSS3-V4)不表达。

本发明建立基于RT-qPCR的方法来检测多种肿瘤组织细胞中不同类型PRSS3剪接变异体的差异表达。通过溶解曲线分析PRSS3剪接变异体的特异扩增，测序进一步证实了PCR产物的特异性。通过以梯度稀释的PRSS3-V1质粒为模板进行的PCR扩增，获得CT值与拷贝数之间的线性关系，确定了本方法的特异性与敏感性。

另外，本发明能有效鉴定PRSS3剪接变异体的类型，为PRSS3在肿瘤中的作用提供分子基础，有助于PRSS3剪接变异体在肿瘤的分子诊断与治疗中的转化应用。这些研究发现不仅为肿瘤的发生发展提供了新的机制，也为剪接变异体在肿瘤个体化诊断治疗的临床应用提供新的线索，因而，具有重要的科学价值和临床意义。

本发明的有益效果如下：

本发明所述PRSS3剪接变异体表达的差异可有效用于肿瘤诊断与预后及用药疗效检测。本发明用于检测PRSS3剪接变异体的引物或试剂盒可以特异地检测细胞、组织、体液及分泌液等样本中PRSS3剪接变异体转录水平，通过本发明得到的检测结果可以为患者肿瘤个体化诊断及药物治疗的预后判断提供评价方法。此外，本发明检测方法操作简便、精准稳定，具有临床应用意义。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1示出PRSS3基因转录变异体的结构示意图，RT-qPCR引物位置如箭头指示：Vc1和Vc2：PRSS3通用引物；V1-V4分别代表PRSS3剪接变异体1-4的RT-qPCR特异性引物。

图2示出RT-qPCR分析通用引物Vc1和Vc2扩增人胰腺癌细胞系SW1990、肺癌细胞系A549及胶质瘤细胞系U87中的PRSS3的mRNA表达及电泳分析。A.RT-qPCR结果，RT-qPCR内参为GAPDH；B.琼脂糖凝胶电泳分析人胰腺癌细胞系SW1990中Vc1和Vc2的扩增产物。

图3示出RT-qPCR方法检测PRSS3在HCC细胞系和永生化的正常肝细胞系的表达。

图4示出胰腺癌细胞系SW1990中PRSS3剪接变异体的RT-qPCR分析。A.PRSS3剪接变异体表达分析；B.RT-qPCR方法检测PRSS3剪接变异体在人肺癌细胞系A549及脑胶质瘤细胞系U87中的表达；Vc1:PRSS3通用引物；V1-V4:PRSS3剪接变异体1-4；RT-qPCR内参为GAPDH。C.凝胶电泳分析RT-qPCR扩增产物；Vc1和Vc2：PRSS3通用引物；V1-V4分别代表PRSS3剪接变异体1-4的RT-qPCR特异性引物；RT-qPCR内参为GAPDH。

图5A示出凝胶电泳分析PRSS3质粒10倍梯度稀释；B和C分别示出PRSS3剪接变异体qPCR扩增的溶解曲线和扩增曲线；D.凝胶电泳分析qPCR扩增产物。

图6示出PRSS3剪接变异体V1质粒拷贝数与Ct值的对应关系。

图7示出RT-qPCR检测人GC细胞系中PRSS3剪接变异体表达水平；V1-V4:PRSS3剪接变异体1-4；RT-qPCR内参为GAPDH。

图8示出RT-qPCR检测人GC细胞系表达PRSS3剪接变异体的类型；V1-V4:PRSS3剪接变异体1-4；RT-qPCR内参为GAPDH。

图9示出RT-qPCR检测人胃癌旁组织中PRSS3剪接变异体V1的表达水平；2N,5N,7N,8N,9N：组织样品编号；GAPDH:RT-qPCR内参。

图10示出甲基化特异性PCR(MSP)检测人GC细胞系和永生化正常胃粘膜细胞系中PRSS3基因体DNA甲基化状态；IVD：体外甲基化的DNA，作为甲基化的阳性对照；NL：正常外周淋巴细胞DNA，作为非甲基化的阴性对照；U：非甲基化；M：甲基化。

图11A示出硫化测序验证人GC细胞系中PRSS3基因体甲基化状态；B.甲基化特异性PCR及硫化测序引物位置。实心圆代表甲基化的CpG岛位点；空心圆代表非甲基化的CpG岛位点；TSS：转录起始位点；硫化测序区域为+308bp到+549bp，覆盖MSP扩增区域。

图12示出半定量RT-PCR(A)及RT-qPCR(B)分析GC细胞系和永生化的正常胃粘膜细胞系经5-Aza/TSA处理前后PRSS3的表达变化；5-Aza：5-aza-2’-deoxycytidine；TSA：TrichostatinA；GAPDH：RT-PCR及RT-qPCR内参；“－”表观药未处理组细胞；“+”表观药处理组细胞。

图13示出RT-qPCR检测转染PRSS的3BGC823和SGC7901细胞中的PRSS3表达水平；GAPDH:RT-qPCR内参。

图14示出MTT检测空载与过表达PRSS3的GC细胞系的生长能力；A.BGC823细胞系；B.SGC7901细胞系；总结三次实验数据以平均值±标准差呈现，**P<0.01。

图15示出检测每平方毫米(mm²)空载与过表达PRSS3的GC细胞系的细胞数；A.BGC823细胞系单位面积内细胞数随时间变化情况；B.SGC7901细胞系单位面积内细胞数随时间变化情况；C.BGC823代表性示意图；D.SGC7901代表性示意图；总结三次实验数据以平均值±标准差呈现，**P<0.01。

图16示出克隆形成方法检测空载及过表达PRSS3的GC细胞系的克隆形成能力；A.代表性克隆形成图；B.总结三次实验结果的量化图；以平均值±标准差呈现，**P<0.01。

图17示出划痕愈合实验检测空载及过表达PRSS3的GC细胞系的迁移能力；左侧：BGC823细胞系；右侧：SGC7901细胞系。

图18示出Transwell迁移实验检测空载及过表达PRSS3的GC细胞系的迁移能力；A.代表性迁移结果；B.量化图，总结三次实验数据以平均值±标准差呈现，**P<0.01。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例1 PRSS3基因剪接体RT-qPCR检测方法的建立

1、引物的设计

从NCBI呈现的PRSS3基因序列中排列PRSS3剪接变异体PRSS3-V1、PRSS3-V2、PRSS3-V3和PRSS3-V4的mRNA序列(其核苷酸序列如SEQ ID No.1-4所示)，依据四种剪接体5'端不同的序列(其核苷酸序列如SEQ ID No.1-4所示)设计PRSS3-V1、PRSS3-V2、PRSS3-V3和PRSS3-V4的特异引物V1、V2、V3和V4(SEQ ID No.6-10)；依据四种剪接体3'端完全相同的4个外显子序列(其核苷酸序列如SEQ ID No.5所示)设计PRSS3剪接变异体通用引物Vc1和Vc2(其核苷酸序列如SEQ ID No.11-14所示)，如图1所示，所述PRSS3剪接变异体的引物为：

PRSS3剪接变异体通用引物Vc1(PCR扩增片段大小为122bp):

上游引物5’-CTTCCTTGAGGGAGGCAAGG-3’(SEQ ID No.6)

下游引物5’-CTCCAGGCCTGTTCTTCCAG-3’(SEQ ID No.7)

PRSS3剪接变异体通用引物Vc2(PCR扩增片段大小为101bp):

上游引物5’-ATT CTG GCT CCC ACT TCT GC-3’(SEQ ID No.8)

下游引物5’-CTC TCC CAG TCT CAC CTG GA-3’(SEQ ID No.9)

PRSS3剪接变异体1(trypsinogen transcript variant 1，PRSS3-V1)引物V1(PCR扩增片段大小为124/2521bp):

上游引物5’-CTGCGAGGCGCTGGG-3’(SEQ ID No.10)

PRSS3剪接变异体2(trypsinogen transcript variant 2，PRSS3-V2)引物V2(PCR扩增片段大小为129bp):

上游引物5’-ATCCTTGCCTTTGTGGGAGC-3’(SEQ ID No.11)

PRSS3剪接变异体3(trypsinogen transcript variant 3，PRSS3-V3)引物V3(PCR扩增片段大小为140bp):

上游引物5’-GTGCGCCATTGGTTTTCCAT-3’(SEQ ID No.12)

PRSS3剪接变异体4(trypsinogen transcript variant 4，PRSS3-V4)引物V4(PCR扩增片段大小为131bp):

上游引物5’-CGACTCGCATGGGACCTG-3’(SEQ ID No.13)

PRSS3剪接变异体1-4通用下游引物:

下游引物5’-GCAGAAGTGGGAGCCAGAAT-3’(SEQ ID No.14)

2、通用引物的筛选与验证

RPMI 1640培养基中常规培养胰腺癌细胞系SW 1990，肺癌细胞系A549和人肝癌细胞系及人胶质瘤细胞U87。提取人胰腺癌SW1990、肺癌A549及脑胶质瘤U87细胞mRNA,通过RT-qPCR方法比较引物Vc1和Vc2的扩增效率。结果如图2A所示，PRSS3在三株细胞中均呈现表达状态，而且PRSS3通用引物Vc1和Vc2呈现相似扩增效率；经进一步电泳分析(图2B)，选择Vc1作为扩增PRSS3的通用引物作为检测PRSS3表达的内参控制引物。

通过RT-qPCR比较PRSS3在多株HCC细胞系及永生化的正常肝细胞系中的表达水平，验证PRSS3通用引物Vc1的可靠性。结果显示，与LO₂细胞相比，PRSS3在HCC细胞系BEL-7402、BEL-7404、BEL-7405、HepG2及PLC/PRF/5呈现沉默，在SNU-449、SK-Hep-1、SNU-182、SMMC-7721、SNU-387、QGY-7701、HuH1、HuH7、LM3中的表达水平逐渐增高，以在HuH1、HuH7和LM3细胞的表达最为显著(图3)，表明PRSS3通用引物Vc1作为检测PRSS3表达的内参控制的可靠性。

3、特异引物的特异性及扩增产物可靠性分析

利用针对PRSS3-V1、V2、V3和V4四种剪接变异体的RT-qPCR引物V1、V2、V3和V4，分别检测其在人胰腺癌SW1990、肺癌A549及脑胶质瘤U87细胞中的表达。结果显示，在SW1990中，PRSS3-V1、V2、V3和V4四种剪接变异体均有表达(图4A)；在细胞系A549和U87中，仅引物Vc1和V1呈现明显的扩增，表明在细胞系A549和U87中主要表达的剪接变异体是V1(图4B)。结果表明PRSS3的不同剪接变异体在肿瘤细胞中的差异表达。

为验证引物的特异性及扩增产物的可靠性，首先对SW1990中RT-qPCR扩增产物进行电泳鉴定，图4C电泳结果显示RT-qPCR扩增产物均为单一条带；通过将回收条带进一步进行克隆测序，NCBI blast分析其同源性显示，PRSS3-V1、V2、V3和V4的RT-qPCR引物所扩增的产物测序序列与匹配NCBI资料库中的剪接变异体序列同源度分别为99％(Vc1：BC06949.1)、100％(V1:NM_07343.3)、95％(V2:NM_002771.3)、99％(V3:NM_001197097.2)及97％(V4：NM_001197098.1)(表1)，表明扩增PRSS3-V1、V2、V3和V4的RT-qPCR引物的特异性及RT-qPCR扩增的精准度。以上结果也进一步给出了对PRSS3-V1、V2、V3和V4表达的RT-qPCR检测方法。

表1.PRSS3剪接变异体引PCR扩增产物测序结果的同源度分析

4、PRSS3剪接变异体RT-qPCR检测方法敏感性与稳定性分析

构建PRSS3质粒pLenti6-PRSS3作为标准样品模板，建立标准样品模板浓度，即通过10倍梯度稀释1μg质粒至10^-11(编号分别为1～12)(表2)。图5A显示分子量为11000bp的PRSS3质粒在1μg(编号为1)的起始样本加载量时可见明显条带，在V1质粒稀释倍数为10^-1(即质粒质量为100ng，编号为2)时，可见微弱条带，与预估相符。

选择Vc1引物，并以稀释倍数为10^-2～10^-11(编号为3～12)的PRSS3质粒为模板，观测RT-qPCR扩增的范围，确定该方法的敏感性与稳定性。图5B显示的扩增曲线表明扩增的稳定性及模版倍数关系；图5C溶解曲线则表明每个样品中PCR产物的特异性及其纯度；图5C的琼脂糖凝胶电泳分析进一步显示出RT-qPCR结果中V1质粒最小模板质量为1×10^-4pg(编号为12)时仍然可见与预计一致的单一扩增条带，结合其扩增曲线与熔解曲线，表明qPCR扩增V1质粒的敏感度可低至1×10^-4pg。这些结果说明V1质粒模板作为阳性对照的可行性，及可作为标准品梯度检测Vc1引物RT-qPCR扩增的稳定性、特异性与敏感性。

根据质粒质量与拷贝数之间的计算公式(呈现在材料与方法中)，分析PRSS3质粒在扩增时拷贝数与Ct值之间的关系(表2)，表明RT-qPCR方法的有效扩增范围是1×10^-3pg–1×10⁴pg(表2中黑体字体)，并作出相对应线性关系图，其中R²＝0.99387，斜率M为-3.343，扩增效率E＝1.99(1≤E≤2)。三次重复结果的重叠性(图6)，表明RT-qPCR方法对检测PRSS3表达的精确性与可重复性。据此确定RT-qPCR检测PRSS3剪接变异体的稳定性、特异性与敏感性。

表2分析PRSS3剪接变异体V1质粒在扩增时拷贝数与Ct值之间的关系

5、结果判读

RT-qPCR采用标准曲线法进行数据分析，溶解曲线的特异单一峰说明了引物特异性好，从而保证了产物的特异性。

当利用上述通用引物进行检测时，凝胶电泳可见PCR扩增产物(图4C)，或通过qPCR的溶解曲线观察PCR扩增产物的特异性(图5B)、通过扩增曲线得到Ct值<或＝33(图5C)，则说明样本中至少存在一种PRSS3剪接变异体的表达；

凝胶电泳无PCR扩增产物，或通过qPCR观察不到溶解曲线或出现非特异溶解曲线、无扩增曲线或通过扩增曲线得到Ct值＞33，则说明样本中PRSS3剪接变异体无表达。

当利用上述特异性引物进行检测时，某一特异性引物(如V1、V2、V3或V4)凝胶电泳可见PCR扩增产物(图4C)，或通过qPCR的溶解曲线观察的某一特异性引物(如V1、V2、V3或V4)PCR扩增产物的特异性、通过扩增曲线得到Ct值<或＝33，则说明样本中对应存在该PRSS3剪接变异体(PRSS3-V1、PRSS3-V2、PRSS3-V3或PRSS3-V4)的表达。

实施例2检测用于肿瘤诊断与预后检测的分子标志物的RT-qPCR试剂盒的组成

一种检测用于肿瘤诊断与预后检测的分子标志物的试剂盒，即用于细胞、组织、体液及分泌液等样本中PRSS3剪接变异体转录水平的检测，为肿瘤或感染等疾病诊断与预后及用药提供指导。该试剂盒包含实施例1所述的PRSS3基因剪接变异体RT-qPCR引物(其核苷酸序列如SEQ ID No.6至14所示)、用于均一化的内参引物、阳线对照模板、作为阴性对照模板的去离子水、cDNA合成试剂和PCR反应试剂；

其中，所述用于均一化的内参引物为以GAPDH为内参的引物，

上游引物5’-CCA TGG AGA AGG CTG GG-3’(SEQ ID No.15)

下游引物5’-CGC CAC AGT TTC CCG GA-3’(SEQ ID No.16)；

所述阴性对照模板为去离子水。

实施例3应用建立的PRSS3基因剪接体RT-qPCR检测方法检测胃癌组织细胞中PRSS3剪接变异体的表达及其表观调控与生物学功能，验证方法的可行性

1、细胞培养

(1)胃癌细胞系(BGC823，MGC803，SGC7901，NCI-N87，AGS)，永生化的正常胃粘膜细胞系GES-1，

2、RNA提取、RT-qPCR

(1)细胞内总RNA的提取：选择融合度为90％，生长状态良好的细胞进行总RNA的提取。

1)按1mL/10⁶个细胞加入Trizol试剂于细胞培养皿中，轻柔摇晃均匀，冰上放置10min。随后将液体转移到1.5mL的离心管。

2)将1/5Trizol体积的氯仿加入于上述1.5mL的离心管中，上下颠倒，充分混匀，冰上静置10min，12000rpm，4℃离心15min，将上层液体转移到新的1.5mL离心管中。

3)吸取与氯仿等体积的异丙醇于上述新的1.5mL离心管中并轻柔混匀，冰上放置10min后12000rpm，4℃离心15min，弃上清。

4)1mL 75％的乙醇7500rpm，4℃离心10min，从而对得到的白色沉淀进行洗涤，弃上清。重复该步骤。

5)加入适量RNAse-free Water以溶解RNA。

6)将所得到的RNA分别进行浓度测量和跑胶验证，根据RNA浓度，A260与A280的比值及跑胶结果来判断RNA的浓度及质量。

7)RNA储存于-80℃冰箱中。

(2)RNA逆转录

根据EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒说明书进行第一条链cDNA的合成：

1)将以下组分添加到0.2mL离心管中：

2)轻弹混匀后，65℃孵育5min，再冰浴2min。

3)瞬时离心后向0.2mL离心管中再加入其它反应组分：

4)轻弹混匀后，42℃金属浴，孵育30min。

5)85℃加热1min失活RT/RI。

(3)RT-qPCR

1)引物如前述。

2)用于RT-qPCR扩增的反应体系如下：

3)RT-qPCR反应条件如下：

95℃30s

95℃/30s 60℃/30s 40cycles(收集荧光)

95℃/15s，60℃/1min，95℃/15s，60℃/15s(Melt Curve Stage)

利用上述RT-qPCR引物，同时用GAPDH作为均一化参照引物，以逆转录合成样本中cDNA为模板进行qPCR扩增。

3、根据实施例1结果判读得到的结果：

1)PRSS3在人GC细胞系和永生化的正常胃黏膜细胞系中的表达

首先采用PRSS3通用引物Vc1，RT-qPCR检测PRSS3在人GC细胞系和永生化的正常胃黏膜细胞系中的表达情况。如图7所示，在永生化正常胃黏膜细胞系GES-1中检测出PRSS3的表达，相比之下，在被检测GC细胞系中，PRSS3在BGC823、MGC803和SGC7901表达显著降低，而NCI-N87和AGS则呈现较高水平的表达。

2)检测GC细胞系及胃正常组织中表达的PRSS3剪接变异体类型

根据上述结果，进一步检测PRSS3表达的NCI-N87，AGS和GES-1细胞中具体表达的剪接变异体类型。结果如图8所示，在PRSS3表达的GC细胞系NCI-N87，AGS和永生化正常胃粘膜细胞系GES-1中，只有剪接变异体V1(PRSS3-V1)呈现显著表达(P<0.05)。

进一步检测PRSS3-V1人胃组织样本中的表达。RT-qPCR结果显示，在5例人胃正常组织样品中，PRSS3-V1均有较高水平的表达(图9)。

实施例4通过检测PRSS3的表观沉默，确定PRSS3剪接变异体的差异表达作为肿瘤标志物的可靠性

1、人GC细胞系及永生化正常胃粘膜细胞系中PRSS3基因体DNA甲基化状态

为验证PRSS3-V1在GC中表达降低是否与表观调控相关，分别设计了甲基化特异性PCR(Methylation-specific PCR，MSP)和亚硫酸氢钠测序(Bisulfite sequencing)引物)。甲基化特异性PCR(Methylation-specific PCR，MSP)，检测GC细胞中PRSS3-V1的甲基化变化。

1)引物设计：根据PRSS3基因基因体DNA序列设计并合成MSP引物，从而检测甲基化位点(M)和非甲基化位点(U)。引物序列如下：

①MSP甲基化引物序列(产物大小为152bp)：

上游引物5’-GGT ACG CGG ATA GGG AGG GGA TAT C-3’(SEQ ID No.17)

下游引物5’-TAA TAT ACG CAT CGA TAC CGC AAC CCG-3’(SEQ ID No.18)

②MSP非甲基化引物序列(产物大小为155bp)：

上游引物5’-GGG TAT GTG GAT AGG GAG GGG ATA TT-3’(SEQ ID No.19)

下游引物5’-AAT AAT ATA CAC ATC AAT ACC ACA ACC CA-3’(SEQ ID No.20)

2)用于MS-PCR扩增的反应体系如下：

每一组PCR反应包括一个阳性对照(Human Methylated DNA Standard)和一个阴性对照(正常人外周淋巴细胞DNA)。

3)MS-PCR反应条件如下：

95℃10min

95℃/30s，60℃/30s，72℃/30s，35cycles；

72℃7min

4℃

4)凝胶电泳：MSP产物经2％的琼脂糖凝胶电泳进行验证。

2、亚硫酸氢钠测序验证MSP结果

1)胃癌细胞系(BGC823和SGC7901)和永生化的正常胃粘膜细胞系GES-1的硫化过程如上述步骤一致。

2)引物设计：亚硫酸氢钠测序的引物位于待测序序列的侧面，且覆盖MSP引物，PCR产物的大小为241bp。引物序列如下：

上游引物5’-TTG TTTGT TGGGATTTGTGG-3’(SEQ ID No.21)

下游引物5’-ACCTTCCCCTCACCCTACAAC-3’(SEQ ID No.22)

3)用于PCR扩增的反应体系如下：

4)PCR反应条件如下：

95℃10min

95℃/30s，60℃/30s，72℃/30s，35cycles；

72℃7min

4℃

5)所得的PCR产物经2％的琼脂糖凝胶电泳确认后，在紫外凝胶成像仪内对单一正确的条带进行胶回收。胶回收后的PCR产物保存于-20℃。

6)胶回收产物的连接与转化

将胶回收产物与pEASY-T1克隆载体进行连接，根据Cloning Kit说明书进行步骤操作：

连接产物的制备，在0.2mL离心管中加入以下组分，具体反应体系如下：

混匀后，置于4℃，连接过夜后用于后续转化实验。将制得的连接产物加于刚解冻的50μL Trans1-T1感受态细胞内，轻弹混匀后置于冰水混合物中反应30min；随后立即将其置于42℃水浴锅中热激90s，迅速冰浴2min；向感受态细胞中加入250μL无抗性的LB液体培养基，200rpm，37℃活化1h；向带有氨苄抗性的LB固体培养基上加入4μL，1mol/L IPTG，40μL，20mg/mL X-gal，并用涂布棒使其分布均匀，倒置于37℃恒温培养箱，30min；将活化好的菌液4000rpm离心1min，保留150μL液体，缓慢混匀后加至培养板，涂布均匀后先正置于37℃恒温培养箱中培养30min，后再将其倒置，继续培养14h；用经过高压灭菌的枪头挑取蓝色克隆旁边大的、白色的克隆，将其置于含有0.1％氨苄青霉素的LB液体培养基中，200rpm，37℃摇菌培养14h。

7)质粒提取

按照Plasmid Mini Kit I说明书进行步骤操作，对得到的质粒进行浓度测定，并将其保存于-20℃。

8)重组子鉴定及测序：

向0.2mL离心管中加入BamH I和Xoh I双酶切体系，对提取的质粒进行鉴定，其反应体系为：其反应条件为30℃，30min；37℃，30min，结果经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，用M13R引物进行测序，分析测序结果。

3、表观药物作用

胃癌细胞系和永生化的正常胃粘膜细胞系生长密度达到30％时，向培养皿中加入5-Aza并使其浓度为5μM，并且每隔24h更换一次培养基，同时继续加入5-Aza，维持其浓度为5μM，共作用72h。当细胞密度达到70％时，向培养基中加入TSA，使其终浓度为1μM，作用24h。

4、根据实施例1结果判读得到的结果：

通过MS-PCR的方法检测GC细胞系(BGC823，MGC803，SGC7901，NCI-N87，AGS)及永生化的胃粘膜细胞系(GES-1)中PRSS3-V1甲基化状态。结果表明，PRSS3-V1在BGC823，MGC803和SGC7901中呈完全甲基化状态；在NCI-N87和AGS中呈未甲基化状态；而在GES-1中呈半甲基化状态(图10)。结果与PRSS3在GC细胞系及永生化胃粘膜细胞系中的表达状态相吻合。

采用硫化测序(BSSQ)的方法进一步地确定PRSS3-V1在BGC823、SGC7901和NCI-N87中的甲基化状态，验证上述MSP结果(图11A和B)，表明PRSS3在BGC823和SGC7901中呈完全甲基化状态，而在NCI-N87中呈非甲基化状态，证实MSP结果。

为了观察PRSS3在GC细胞系中的表达下降是否受表观机制调控，通过去甲基化药物5-Aza和/或组蛋白乙酰化酶抑制剂TSA的联用，采用半定量RT-PCR和RT-qPCR的方法来检测用药前后PRSS3在GC细胞系和永生化胃粘膜细胞系中的表达变化。半定量RT-PCR结果显示，PRSS3表达降低的BGC823、MGC803和SGC7901细胞，表观药5-Aza和/或TSA可增加PRSS3的表达；而在表达PRSS3的NCI-N87、AGS及GES-1细胞中，药物处理未见明显变化(图12A)。RT-qPCR进一步分析显示，表观药可显著增加BGC823、MGC803和SGC7901细胞中PRSS3的表达(图12B)，表明在GC细胞系中PRSS3的表达下降受到表观机制调控。另外，qPCR比普通PCR更为简便、精准地评估药物治疗效果。

实施例5 PRSS3作为肿瘤标志物的的生物学功能验证

1、细胞生物学功能实验

(1)MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)实验

将处于对数生长期、生长情况良好的的含空载及过表达PRSS3的BGC823细胞系和SGC7901细胞系进行消化计数，调整细胞悬液的浓度，每孔加入100μL于96孔细胞培养板，BGC823每孔铺2000个细胞，SGC7901每孔铺3000个细胞，设置8个复孔，连续观察4天；每天定时在每孔中加入10μL MTT，使其终浓度为5μg/mL，共培养4h后，弃去培养基。4天后，每孔加入150μL二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，避光轻摇10min后，在酶联免疫检测仪OD490nm处检测各孔吸光值，对所得数据进行分析。

(2)长时间动态活细胞成像***

将处于对数生长期、生长情况良好的含空载及过表达PRSS3的BGC823细胞系和SGC7901细胞系分别消化计数，调整细胞悬液的浓度，每孔加入100μL于96孔细胞培养板，BGC823每孔铺1000个细胞，SGC7901每孔铺500个细胞，设置3个复孔，连续观察5天；IncuCyte ZOOM每2h对96孔细胞培养板拍摄一次，观察细胞增殖能力。

(3)克隆形成实验

将处于对数生长期、生长情况良好的含空载及过表达PRSS3的BGC823细胞系和SGC7901细胞系分别消化计数并接种于60mm²细胞培养皿中，每个培养皿含500个BGC823细胞，300个SGC7901细胞；每3天更换一次培养基，连续培养两周至细胞克隆长到肉眼可见的大小后，弃去培养基，1×PBS清洗数次；用4％多聚甲醛固定30min，用1×PBS清洗两次，0.5％结晶紫染色30min，冲洗晾干后进行拍照，统计克隆个数。

(4)迁移实验

将处于对数生长期、生长情况良好的含空载及过表达PRSS3的BGC823细胞系和SGC7901细胞系分别消化计数，分别加入到8.0μm孔径的Transwell小室的上室，每个上室加入200μL不含血清的细胞悬液，每孔加入4×104个BGC823细胞，2×104个SGC7901细胞；下室中加入600μL完全培养基；37℃细胞培养箱中培养，BGC823细胞培养12h，SGC7901细胞培养8h；用1×PBS小心清洗数次；4％多聚甲醛固定30min，用1×PBS清洗三次；0.5％结晶紫染色30min，冲洗至漂洗液为无色，用棉棒小心移去上室细胞，置于显微镜(100×)下统计迁移细胞的数目。

(5)划痕实验

将处于对数生长期、生长情况良好的含空载及过表达PRSS3的BGC823细胞系和SGC7901细胞系分别消化计数，加入至6孔细胞培养板中，每孔加入6×10⁶个BGC823细胞，5×10⁵个SGC7901细胞，每组设3个复孔；待细胞融合度达90％时，使用白枪头在6孔培养板的底部划一条直线，弃去培养基，用1×PBS清洗两次；将漂浮细胞洗净后后，加入无血清的DMEM，放入观察箱内继续培养；每12h对6孔细胞培养板进行照相，观察其划痕愈合的速度。

(6)统计学分析

实验均重复至少三次。实验结果均采用双侧t检验，其结果用平均值±标准差表示，*p<0.05代表具有显著统计学差异，**p<0.01代表具有极显著有统计学差异。

2、实验结果：

(1)建立外源性高表达剪接变异体V1的稳定转染细胞系

在GC细胞系中采用PRSS3剪接变异体V1的质粒构建过表达细胞模型，用脂质体包装***将过表达PRSS3剪接变异体V1和空载质粒转染至BGC823和SGC7901细胞系内，经过两周杀稻瘟菌素筛选后，建立外源性高表达剪接变异体V1的稳定转染细胞系。实验结果如图13所示，空载对照细胞中未见PRSS3mRNA的表达；PRSS3稳定转染细胞系中可检测出较高的PRSS3mRNA表达。

(2)过表达PRSS3对GC细胞系生长能力的影响

采用MTT实验来检测外源性表达PRSS3对BGC823和SGC7901细胞系生长能力的影响。结果显示(图14)，与稳定转染空载的BGC823和SGC7901细胞系相比，过表达PRSS3可显著抑制BGC823和SGC7901细胞系的细胞生长能力(P<0.01)。同时，进一步利用长时间动态活细胞成像***对含空载及过表达PRSS3的BGC823细胞系和SGC7901细胞系单位面积(每平方毫米/mm²)内细胞数目变化情况。每2h记录一次，连续观察5天。结果显示，与空载组相比，PRSS3稳定过表达的BGC823细胞系和SGC7901细胞系每平方毫米细胞数显著减少(图15)(P<0.01)，与MTT实验结果相一致。

(3)过表达PRSS3对GC细胞系克隆形成能力的影响

进一步分析过表达PRSS3对BGC823和SGC7901克隆形成能力的影响。结果显示，与空载质粒组相比，PRSS3过表达细胞系BGC823和SGC7901的克隆形成能力显著降低(P<0.01)(图16)，提示外源性过表达PRSS3可能抑制GC细胞系BGC823和SGC7901的细胞增殖能力。

(4)过表达PRSS3对GC细胞系迁移能力的影响

采用划痕愈合实验来检测过表达PRSS3对BGC823和SGC7901细胞系迁移能力的影响，结果如图17显示，与空载质粒组相比，PRSS3过表达的GC细胞系BGC823和SGC7901迁移速率显著下降。

通过transwell细胞迁移实验对GC细胞系的迁移能力进行进一步验证，结果显示PRSS3的过表达可显著抑制BGC823和SGC7901细胞系的细胞迁移能力(图18)(P<0.01)。

以上PRSS3的生物学功能验证实验表明，在BGC823和SGC7901细胞中过表达PRSS3，可显著抑制GC细胞系BGC823和SGC7901的细胞活性、增殖能力及迁移，表明PRSS3剪接变异体V1在胃癌细胞系中发挥抑癌基因样作用。为PRSS3剪接变异体的差异表达应用于肿瘤或炎症感染诊断与预后检测的分子标记物奠定了理论基础。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京交通大学

<120> 一种用于肿瘤诊断与预后检测的分子标志物及其检测引物和试剂盒

<130> JLC17I0394E

<160> 22

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 965

<212> DNA

<213> PRSS3-V1序列

<400> 1

ggagttcctg gggccagaga catctccaag ggaaggtcaa gggcctggag gatgtgcgga 60

cctgacgaca gatgccccgc acgctggccg ggaccgggaa gggcggtcaa gtgtggaaag 120

ggtctggcgg ctgccaggcc tggcagagtg gagcggggcg gggcgcagcg gggcggggcg 180

ggcctggagc tgcacccgct tctgggtgga cgcacttggc gagcggcgcg ggatgcagac 240

ggctgcgagg cgctgggcac agttgctgtc ccctttgacg atgatgacaa gattgttggg 300

ggctacacct gtgaggagaa ttctctcccc taccaggtgt ccctgaattc tggctcccac 360

ttctgcggtg gctccctcat cagcgaacag tgggtggtat cagcagctca ctgctacaag 420

acccgcatcc aggtgagact gggagagcac aacatcaaag tcctggaggg gaatgagcag 480

ttcatcaatg cggccaagat catccgccac cctaaataca acagggacac tctggacaat 540

gacatcatgc tgatcaaact ctcctcacct gccgtcatca atgcccgcgt gtccaccatc 600

tctctgccca ccacccctcc agctgctggc actgagtgcc tcatctccgg ctggggcaac 660

actctgagct ttggtgctga ctacccagac gagctgaagt gcctggatgc tccggtgctg 720

acccaggctg agtgtaaagc ctcctaccct ggaaagatta ccaacagcat gttctgtgtg 780

ggcttccttg agggaggcaa ggattcctgc cagcgtgact ctggtggccc tgtggtctgc 840

aacggacagc tccaaggagt tgtctcctgg ggccatggct gtgccggaag aacaggcctg 900

gagtctacac caaggtctac aactatgtgg actggattaa ggacaccatc gctgccaaca 960

gctaa 965

<210> 2

<211> 756

<212> DNA

<213> PRSS3-V2序列

<400> 2

acactctacc accatgaatc cattcctgat ccttgccttt gtgggagctg ctgttgctgt 60

cccctttgac gatgatgaca agattgttgg gggctacacc tgtgaggaga attctctccc 120

ctaccaggtg tccctgaatt ctggctccca cttctgcggt ggctccctca tcagcgaaca 180

gtgggtggta tcagcagctc actgctacaa gacccgcatc caggtgagac tgggagagca 240

caacatcaaa gtcctggagg ggaatgagca gttcatcaat gcggccaaga tcatccgcca 300

ccctaaatac aacagggaca ctctggacaa tgacatcatg ctgatcaaac tctcctcacc 360

tgccgtcatc aatgcccgcg tgtccaccat ctctctgccc accacccctc cagctgctgg 420

cactgagtgc ctcatctccg gctggggcaa cactctgagc tttggtgctg actacccaga 480

cgagctgaag tgcctggatg ctccggtgct gacccaggct gagtgtaaag cctcctaccc 540

tggaaagatt accaacagca tgttctgtgt gggcttcctt gagggaggca aggattcctg 600

ccagcgtgac tctggtggcc ctgtggtctg caacggacag ctccaaggag ttgtctcctg 660

gggccatggc tgtgccggaa gaacaggcct ggagtctaca ccaaggtcta caactatgtg 720

gactggatta aggacaccat cgctgccaac agctaa 756

<210> 3

<211> 1093

<212> DNA

<213> PRSS3-V3序列

<400> 3

ggagttcctg gggccagaga catctccaag ggaaggtcaa gggcctggag gatgtgcgga 60

cctgacgaca gatgccccgc acgctggccg ggaccgggaa gggcggtcaa gtgtggaaag 120

ggtctggcgg ctgccaggcc tggcagagtg gagcggggcg gggcgcagcg gggcggggcg 180

ggcctggagc tgcacccgct tctgggtgga cgcacttggc gagcggcgcg ggatgcagac 240

ggctgcgagg cgctgggcac aggttgccag gacaaccgtg aggctgcata aaaagaacct 300

atgacaggat gcacatgaga gagacaagtg gcttcacatt gaagaagggg aggagtgcgc 360

cattggtttt ccatcctcca gatgcactga ttgctgtccc ctttgacgat gatgacaaga 420

ttgttggggg ctacacctgt gaggagaatt ctctccccta ccaggtgtcc ctgaattctg 480

gctcccactt ctgcggtggc tccctcatca gcgaacagtg ggtggtatca gcagctcact 540

gctacaagac ccgcatccag gtgagactgg gagagcacaa catcaaagtc ctggagggga 600

atgagcagtt catcaatgcg gccaagatca tccgccaccc taaatacaac agggacactc 660

tggacaatga catcatgctg atcaaactct cctcacctgc cgtcatcaat gcccgcgtgt 720

ccaccatctc tctgcccacc acccctccag ctgctggcac tgagtgcctc atctccggct 780

ggggcaacac tctgagcttt ggtgctgact acccagacga gctgaagtgc ctggatgctc 840

cggtgctgac ccaggctgag tgtaaagcct cctaccctgg aaagattacc aacagcatgt 900

tctgtgtggg cttccttgag ggaggcaagg attcctgcca gcgtgactct ggtggccctg 960

tggtctgcaa cggacagctc caaggagttg tctcctgggg ccatggctgt gccggaagaa 1020

caggcctgga gtctacacca aggtctacaa ctatgtggac tggattaagg acaccatcgc 1080

tgccaacagc taa 1093

<210> 4

<211> 735

<212> DNA

<213> PRSS3-V4序列

<400> 4

ggttccgact cgcatgggac ctgcggggga ggttgctgtc ccctttgacg atgatgacaa 60

gattgttggg ggctacacct gtgaggagaa ttctctcccc taccaggtgt ccctgaattc 120

tggctcccac ttctgcggtg gctccctcat cagcgaacag tgggtggtat cagcagctca 180

ctgctacaag acccgcatcc aggtgagact gggagagcac aacatcaaag tcctggaggg 240

gaatgagcag ttcatcaatg cggccaagat catccgccac cctaaataca acagggacac 300

tctggacaat gacatcatgc tgatcaaact ctcctcacct gccgtcatca atgcccgcgt 360

gtccaccatc tctctgccca ccacccctcc agctgctggc actgagtgcc tcatctccgg 420

ctggggcaac actctgagct ttggtgctga ctacccagac gagctgaagt gcctggatgc 480

tccggtgctg acccaggctg agtgtaaagc ctcctaccct ggaaagatta ccaacagcat 540

gttctgtgtg ggcttccttg agggaggcaa ggattcctgc cagcgtgact ctggtggccc 600

tgtggtctgc aacggacagc tccaaggagt tgtctcctgg ggccatggct gtgccggaag 660

aacaggcctg gagtctacac caaggtctac aactatgtgg actggattaa ggacaccatc 720

gctgccaaca gctaa 735

<210> 5

<211> 703

<212> DNA

<213> PRSS3剪接变异体共同序列

<400> 5

ttgctgtccc ctttgacgat gatgacaaga ttgttggggg ctacacctgt gaggagaatt 60

ctctccccta ccaggtgtcc ctgaattctg gctcccactt ctgcggtggc tccctcatca 120

gcgaacagtg ggtggtatca gcagctcact gctacaagac ccgcatccag gtgagactgg 180

gagagcacaa catcaaagtc ctggagggga atgagcagtt catcaatgcg gccaagatca 240

tccgccaccc taaatacaac agggacactc tggacaatga catcatgctg atcaaactct 300

cctcacctgc cgtcatcaat gcccgcgtgt ccaccatctc tctgcccacc acccctccag 360

ctgctggcac tgagtgcctc atctccggct ggggcaacac tctgagcttt ggtgctgact 420

acccagacga gctgaagtgc ctggatgctc cggtgctgac ccaggctgag tgtaaagcct 480

cctaccctgg aaagattacc aacagcatgt tctgtgtggg cttccttgag ggaggcaagg 540

attcctgcca gcgtgactct ggtggccctg tggtctgcaa cggacagctc caaggagttg 600

tctcctgggg ccatggctgt gccggaagaa caggcctgga gtctacacca aggtctacaa 660

ctatgtggac tggattaagg acaccatcgc tgccaacagc taa 703

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成的Vc1上游引物序列

<400> 6

cttccttgag ggaggcaagg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成的Vc1下游引物序列

<400> 7

ctccaggcct gttcttccag 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成的Vc2上游引物序列

<400> 8

attctggctc ccacttctgc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成的Vc2下游引物序列

<400> 9

ctctcccagt ctcacctgga 20

<210> 10

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工合成的V1上游引物序列

<400> 10

ctgcgaggcg ctggg 15

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成的V2上游引物序列

<400> 11

atccttgcct ttgtgggagc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成的V3上游引物序列

<400> 12

gtgcgccatt ggttttccat 20

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成的V4上游引物序列

<400> 13

cgactcgcat gggacctg 18

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> PRSS3 V1-4通用下游引物

<400> 14

gcagaagtgg gagccagaat 20

<210> 15

<211> 17

<212> DNA

<213> GAPDH内参的上游引物序列

<400> 15

ccatggagaa ggctggg 17

<210> 16

<211> 17

<212> DNA

<213> GAPDH内参的下游引物序列

<400> 16

cgccacagtt tcccgga 17

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> MSP甲基化上游引物序列

<400> 17

ggtacgcgga tagggagggg atatc 25

<210> 18

<211> 27

<212> DNA

<213> MSP甲基化下游引物序列

<400> 18

taatatacgc atcgataccg caacccg 27

<210> 19

<211> 26

<212> DNA

<213> MSP非甲基化的上游引物序列

<400> 19

gggtatgtgg atagggaggg gatatt 26

<210> 20

<211> 29

<212> DNA

<213> MSP非甲基化的下游引物序列

<400> 20

aataatatac acatcaatac cacaaccca 29

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 亚硫酸氢钠测序上游引物

<400> 21

ttgtttgttg ggatttgtgg 20

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 亚硫酸氢钠测序下游引物

<400> 22

accttcccct caccctacaa c 21

Claims

1.一种用于肿瘤诊断与预后检测的分子标志物，其特征在于，所述分子标志物为PRSS3剪接变异体；其中，所述PRSS3剪接变异体为PRSS3-V1、PRSS3-V2、PRSS3-V3和/或PRSS3-V4，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.1-4所示。

2.权利要求1所述的分子标记物在制备肿瘤诊断与预后检测的制剂的应用。

3.检测权利要求1所述的分子标记物的物质在制备肿瘤诊断与预后检测的制剂中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述物质为检测权利要求1所述的分子标记物的引物或试剂。

5.一种用于检测权利要求1所述的分子标记物的RT-qPCR引物，其特征在于，包括：用于检测PRSS3-V1、PRSS3-V2、PRSS3-V3和PRSS3-V4的通用引物Vc1或Vc2，其中，所述引物Vc1的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；所述引物Vc2的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，下游引物的核苷酸序列如SEQID No.9所示；优选的，所述通用引物为引物Vc1。

6.一种用于检测权利要求1所述的分子标记物的RT-qPCR引物，其特征在于，包括：

7.一种用于检测权利要求1所述的分子标记物的RT-qPCR试剂盒，其特征在于，包括权利要求5和/或权利要求6所述的RT-qPCR引物。

8.根据权利要求7所述的RT-qPCR试剂盒，其特征在于，还包括用于均一化的内参引物、阳性对照模板、阴性对照模板、cDNA合成试剂和PCR反应试剂。

9.根据权利要求8所述的RT-qPCR试剂盒，其特征在于，所述用于均一化的内参引物为以GAPDH为内参的引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示；

所述阴性对照模板为去离子水。

10.一种检测权利要求1所述的分子标记物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)利用权利要求5和/或6所述的RT-qPCR引物或权利要求7所述的RT-qPCR试剂盒对逆转录合成待检测样本cDNA进行qPCR扩增，得到扩增产物；

2)结果判读：对扩增产物进行判读。