CN107475228B

CN107475228B - 一种底物特异性提高的角蛋白酶突变体及其制备方法

Info

Publication number: CN107475228B
Application number: CN201710845163.3A
Authority: CN
Inventors: 张娟; 方真; 堵国成; 陈坚; 刘柏宏
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2015-03-18
Filing date: 2015-03-18
Publication date: 2020-08-04
Anticipated expiration: 2035-03-18
Also published as: CN107475229B; CN104726436A; CN104726436B; CN107475228A; CN107475229A

Abstract

本发明公开了一种底物特异性提高的角蛋白酶突变体及其制备方法，属于酶工程领域。本发明通过分析得出最佳突变点进行定点突变，获得角蛋白酶酶活和底物专一性提高的优秀突变体。该角蛋白酶及其突变体能够有效水解羽毛，羊毛等非水溶性角蛋白底物，可用于皮革纺织工业和饲料工业。

Description

一种底物特异性提高的角蛋白酶突变体及其制备方法

本申请是申请号为：201510119684.1，申请日为：2015年3月18日，申请名称为：一种底物特异性提高的角蛋白酶突变体及其制备方法的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种底物特异性提高的角蛋白酶突变体及其制备方法，属于酶工程领域。

背景技术

角蛋白酶(Keratinase)为一种可以特异性降解角蛋白的酶类，由真菌、放线菌和细菌等多种微生物产生。角蛋白酶在食品、医药、饲料、精化和制革等工业中广泛应用，具有嫩化肉类、生产高级营养品、免疫制剂和饲料添加剂以及美容、软化皮革等作用，并可导致疯牛病和人类克雅氏症的阮蛋白(Prion)的降解。虽然角蛋白酶有着巨大的应用和研究价值，但是从野生菌中筛选出的角蛋白酶热稳定性差，底物专一性不高，大大降低了角蛋白酶的开发和运用。目前已经报道的角蛋白酶基因主要来自国外的一株地衣芽胞杆菌的kerA基因。本发明将来自嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)BBE11-1的角蛋白酶KerSMD进行分子改造，提高角蛋白酶对酪蛋白或羽毛的底物专一性，对角蛋白酶的规模化生产及推广具有深远的技术指导意义。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种底物特异性提高的角蛋白酶突变体，是将来源于嗜麦芽窄食单胞菌的角蛋白酶的第180位的丝氨酸替换成甘氨酸，或者第208位的谷氨酸替换为丝氨酸，或者第215位的酪氨酸替换成甘氨酸或者丙氨酸或者丝氨酸或者苯丙氨酸，或者第180位的丝氨酸替换成甘氨酸同时将第215位的酪氨酸替换成丙氨酸或者丝氨酸。

在本发明的一种实施方式中，所述来源于嗜麦芽窄食单胞菌的角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述角蛋白酶突变体为第180位丝氨酸替换成甘氨酸的S180G。

在本发明的一种实施方式中，所述角蛋白酶突变体为第208位谷氨酸替换为丝氨酸的E208S。

在本发明的一种实施方式中，所述角蛋白酶突变体为第215位酪氨酸替换成甘氨酸或者丝氨酸或者丙氨酸的Y215G、Y215S、Y215A。

在本发明的一种实施方式中，所述角蛋白酶组合突变体为第180位丝氨酸替换成甘氨酸和215位的酪氨酸替换成丙氨酸的S180G/Y215A。

在本发明的一种实施方式中，所述角蛋白酶组合突变体为第180位丝氨酸替换成甘氨酸和215位的酪氨酸替换成丝氨酸S180G/Y215S。

本发明要解决的第二个技术问题是提供获得所述角蛋白酶突变体的方法，具体步骤如下：

(1)根据从嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)BBE11-1中获得编码角蛋白酶KerSMD基因，克隆到pET22b(+)中，构建重组质粒pET22b+kerSMD；

(2)采用滚环PCR的方法，设计中间含有突变氨基酸代表的密码子碱基的互补引物，PCR扩增质粒pET22b+kerSMD得到含有编码角蛋白酶突变体的基因序列的开环重组载体；

(3)将含有编码正确突变体的基因的PCR反应液经过DpnI内切酶消化，除去未突变的原来质粒，反应液直接转化感受态大肠杆菌JM109，挑取正确复制子，并提取正确突变质粒；

(4)将正确的重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达，发酵上清液即角蛋白酶突变体粗酶液。

所述方法还进一步包括使用AKTA蛋白纯化仪和HisTrap FF crude 1ml的镍柱对角蛋白酶进行纯化。

将所述方法中步骤(4)获得的重组菌在含有100μg/L的氨苄青霉素的LB培养基中37℃液体培养过夜，后接入含有100μg/L的氨苄青霉素的LB发酵液体培养基37℃培养至OD₆₀₀＝0.6，降温至20℃培养，加入最终浓度0.1mM的诱导剂IPTG诱导，72h时离心获得上清酶液，即为粗酶液。

通过对对选定位点的定点突变以及组合突变，本发明所得角蛋白酶突变体对酪蛋白或羽毛的底物特异性明显增强，突变体S180G、E208S、Y215S、Y215A、S180G/Y215A对羽毛底物的特异性提高，突变体Y215G、S180G/Y215S对酪蛋白底物的特异性提高。且部分角蛋白酶突变体热稳定性显著提高，角蛋白酶酶活显著提高，比酶活也得到提升。对比原始角蛋白酶，突变体E208S和Y215S，以及组合突变体S180G/Y215S最适反应温度从原来的50℃提升到60℃，并且孵育90min酶活损失不到35％。本发明提供的角蛋白酶突变体在40-70℃、pH9.0下与不溶性角蛋白底物反应，能够很好的水解羽毛粉、羊毛，在洗涤、皮革纺织、饲料消化、医药等领域具有很好的应用前景。

附图说明

图1角蛋白酶KerSMD同源性模拟结构示意图。A：角蛋白酶KerSMD的卡片结构及三角催化中心(D42，H105，S289)和S1口袋组成氨基酸残基(S180，E208，Y215，R216)。B：角蛋白酶KerSMD的表明结构及相应氨基酸残基。

图2构建角蛋白酶突变体质粒的滚环PCR基因操作图，其中Primer 1和2分别是互补引物。

图3角蛋白酶KerSMD及其突变体的SDS-PAGE电泳图。M，蛋白分子量(kDa)，所有蛋白的分子大小接近46kDa。

图4角蛋白酶突变体在不同温度下的酶活(A)和在60℃下孵育不同时间后的残余酶活(B)。

图5任意组合突变体在60℃下的角蛋白酶活性和酪蛋白酶活性。

图6角蛋白酶KerSMD及其各种突变体的S1口袋模拟结构图，A：WT，B：Y215A，C：Y215S，D：Y215G，E：S180G/Y215A，F：S180G/Y215S，图中所圈出的线条示意口袋大小。

具体实施方式

角蛋白酶酶活测定原理：角蛋白酶水解角蛋白底物，释放出酪氨酸，通过酪氨酸与福林酚显色，在660nm下测定吸光度值。吸光值的大小直接与酶活力的高低成正比。

角蛋白酶酶活测定步骤：0.1mL经适当稀释的酶液，加入0.1mL的1％(w/v)羽毛粉或不可溶性角蛋白底物(使用前和0.1mol/L的pH9.0的Gly-NaOH缓冲液混合)，在50℃反应20min，每个反应样品中加入0.2mLTCA反应终止蛋白沉淀剂，摇匀后10,000r/min离心5min，取0.2mL上清液加入1mL的4％(w/v)Na₂CO₃，再加入0.2mL上海生工公司购买的福林酚试剂(预先稀释3倍)在50℃下反应15分钟。使用0.5cm的石英比色杯测定清液在660nm处的吸光值。空白对照是在加入底物之前已经加入同等体积的TCA终止酶活，其他步骤相同。酶活定义为每毫升酶液每分钟释放出多少微克酪氨酸。

实施例1 编码角蛋白酶突变体S180G的基因的构建

(1)先使用一对30bp互补引物S180G-F和S180G-R，以含有嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)BBE11-1(于2011年4月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M 2011193)角蛋白酶基因kerSMD的质粒pET22b+kerSMD为模版，进行滚环PCR扩增如图1。反应条件为：95℃预变性5min后进入一下循环：98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸7min 50s，15个循环；72℃延伸10min，然后再降温到12℃得到最终反应液。使用的DNA扩增酶为TaKaRa公司的Primer STAR，使用配方参照产品说明书。

(2)将扩增后的PCR产物用DpnⅠ处理，消化模板。

(3)将消化液直接进行转化感受态大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，37℃培养过夜，挑取单菌落验证，将此质粒进行序列测定。选择正确的测序结果即为我们所需要的重组质粒。

(4)正确的突变质粒转化大肠杆菌BL21，37℃培养过夜，挑取单菌落为我们所需的产重组角蛋白酶工程菌。

表1 角蛋白酶突变体的重叠PCR引物序列

实施例2 培养重组菌发酵生产角蛋白酶

将参照实施例1的方法构建的分别携带编码突变体E208S、Y215G、Y215S、Y215A、S180G/Y215A和S180G/Y215S基因的重组表达载体转化E.coli BL21获得表达角蛋白酶的基因工程菌；将所得基因工程菌在含有100μg/l的氨苄青霉素的LB培养基中37℃液体培养过夜，后接入含有100μg/l的氨苄青霉素的LB发酵液体培养基37℃培养至OD₆₀₀＝0.6，降温至20℃培养，加入最终浓度0.1mM的诱导剂IPTG诱导培养，72h时离心获得上清酶液，即为粗酶液。

实施例3 角蛋白酶突变体的纯化及比酶活性和热稳定性酶学性质测定

(1)含有突变体基因的质粒的重组大肠杆菌在20℃下诱导培养3天后获得粗酶液。

(2)使用AKTA蛋白纯化仪(美国GE公司)和HisTrap FF crude 1ml的镍柱，从粗酶液中纯化出纯度90％以上的角蛋白酶KerSMD及其各种突变体。角蛋白酶的SDS-PAGE见图3，每个蛋白分子量大小都接近46kDa.

(3)将纯化好的角蛋白酶突变体加入到50mM的Gly-NaOH缓冲液(pH 9.0)中，置于60℃下孵育不同时间后，测定酶活。以最初的没有加热过的角蛋白酶为100％的残余酶活，之后测定的酶活对比最初酶活的百分比值作为残余酶活。

(4)由图4可知，角蛋白酶突变体S180G/Y215A热稳定性最差，其中突变体S180G/Y215A在100min的60℃孵育后，酶活损失可达60％。而其他突变体Y215G、Y215S、S180G/Y215S热稳定性略微提高，最佳反应温度提升到60℃，突变体Y215S在60℃下获得最高酶活7000U/mg，是野生型KerSMD单位酶活(3000U/mg)的2倍多。突变体Y215G、S180G/Y215A和S180G/Y215S在40-50℃下，单位酶活也得到相应提升。因此，本实验使用的分子改造技术的确能在一定程度上改善角蛋白酶的单位酶活。

实施例4 角蛋白酶突变体的底物专一性

参照实施例1的方法构建多个角蛋白酶突变体及任意组合突变体，并测定这些突变体对不同底物的酶活情况。如图5所示，对于选定的三个氨基酸位点S180，E208和Y215进行任意组合的定点突变，获得不同突变体，并测定其酪蛋白酶活性和角蛋白酶活性。结果表明最佳突变位点的任意组合并不能全部提高角蛋白酶活性或者酪蛋白酶活性，例如三重突变体S180G/E208S/Y215S不但对酪蛋白酶活性造成了降低而且降低了角蛋白酶活性，二重突变体E208S/Y215S得到了最低酪蛋白酶和角蛋白酶活性。如表2所示，相比出发酶，部分角蛋白酶突变体底物专一性显著改变，对酪蛋白底物和羽毛粉底物的酶活有明显提高。其中突变体Y215G获得最高酪蛋白单位酶活7200U/mg，S180G/Y215S的酪蛋白单位酶活次之但获得最高角蛋白酶单位酶活4780U/mg。突变体S180G/Y215A获得最高比酶活，具有最好的底物专一性。总的来说，突变体S180G、E208S、Y215S、Y215A、S180G/Y215A对羽毛底物的特异性提高，突变体Y215G、S180G/Y215S对酪蛋白底物的特异性提高。

通过Discovery Studio 2.5软件进行分子模拟，得出角蛋白酶突变体的结构，对比S1口袋，发现口袋大小以及口袋入口氨基酸残基侧链的柔韧性对底物专一性和最适反应温度有着重要影响(如图6)。发现随着缩短第215位的酪氨酸和第180位的丝氨酸氨基酸残基侧链，可以有效增加S1口袋入口大小。由于角蛋白属于大分子疏水底物，增加结合口袋的疏水性和大小可以增加对其的比酶活。但是过于短小的残基比如甘氨酸和丙氨酸的介入，增加口袋的柔韧性，并影响周围其他氨基酸之间的氢键，从而影响蛋白稳定性，比如突变体S180G和S180G/Y215A虽然获得较高单位酶活，但是明显降低了稳定性。另外，疏水氨基酸的介入，比如突变体Y215A和S180G/Y215A，其对于亲水性底物酪蛋白的结合和催化能力明显下降，反而增加对疏水底物羽毛的反应能力，预示着以后的角蛋白酶定向改造的思路和发展方向。

表2 角蛋白酶突变体对于不同底物的酶活

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种底物特异性提高的角蛋白酶突变体及其制备方法

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 467

<212> PRT

<213> 嗜麦芽窄食单胞菌

<400> 1

Leu Ala Pro Asn Asp Pro Tyr Tyr Gln Gln Tyr Gln Trp His Leu His

1 5 10 15

Asn Ala Thr Gly Gly Ile Asn Ala Pro Ser Ala Trp Asp Val Ser Gln

20 25 30

Gly Glu Gly Val Val Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Ile Leu Pro Gln

35 40 45

His Pro Asp Leu Val Gly Asn Leu Leu Glu Gly Tyr Asp Phe Ile Ser

50 55 60

Asp Ala Glu Thr Ser Arg Arg Ala Thr Asn Asp Arg Val Pro Gly Ala

65 70 75 80

Gln Asp Tyr Gly Asp Trp Val Glu Asn Asp Asn Glu Cys Tyr Thr Gly

85 90 95

Ser Val Ala Glu Asp Ser Ser Trp His Gly Thr His Val Ala Gly Thr

100 105 110

Val Ala Glu Gln Thr Asn Asn Gly Val Gly Met Ala Gly Val Ala His

115 120 125

Lys Ala Lys Val Leu Pro Val Arg Val Leu Gly Lys Cys Gly Gly Tyr

130 135 140

Leu Ser Asp Ile Ala Asp Ala Ile Thr Trp Ala Ser Gly Gly Thr Val

145 150 155 160

Ala Gly Val Pro Ala Asn Ala Asn Pro Ala Glu Ile Ile Asn Met Ser

165 170 175

Leu Gly Gly Ser Gly Ser Cys Asp Gly Thr Tyr Gln Asp Ala Ile Asn

180 185 190

Gly Ala Ile Ser Arg Gly Thr Thr Val Val Val Ala Ala Gly Asn Glu

195 200 205

Thr Asp Asn Ala Ser Lys Tyr Arg Pro Ala Ser Cys Asp Gly Val Val

210 215 220

Thr Val Gly Ala Thr Arg Ile Thr Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Ser Asn

225 230 235 240

Tyr Gly Thr Arg Val Asp Leu Ser Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Val

245 250 255

Asp Gly Asn Pro Gly Gly Tyr Val Trp Gln Ser Gly Ser Asp Ala Ala

260 265 270

Thr Thr Pro Glu Ser Gly Ser Tyr Ser Tyr Met Gly Met Gly Gly Thr

275 280 285

Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Ala Val Ala Ala Leu Val Gln Ser

290 295 300

Ala Leu Ile Ala Lys Gly Lys Asp Pro Leu Ala Pro Ala Ala Met Arg

305 310 315 320

Thr Leu Leu Lys Glu Thr Ala Arg Pro Phe Pro Val Ser Ile Pro Ala

325 330 335

Ala Thr Pro Ile Gly Thr Gly Ile Val Asp Ala Lys Ala Ala Leu Ala

340 345 350

Lys Ala Leu Glu Glu Pro Cys Thr Glu Ser Cys Gly Pro Val Ala Thr

355 360 365

Pro Leu Thr Asn Lys Ala Ala Val Gly Gly Leu Asn Gly Thr Ala Gly

370 375 380

Ser Ser Arg Leu Tyr Ser Phe Glu Ala Ala Ala Gly Lys Gln Leu Ser

385 390 395 400

Val Ile Thr Tyr Gly Gly Thr Gly Asn Val Ser Val Tyr Ile Ala Gln

405 410 415

Gly Arg Glu Pro Ser Ala Ser Asp Asn Asp Gly Lys Ser Thr Arg Pro

420 425 430

Gly Thr Ser Glu Thr Val Arg Val Asn Lys Pro Val Ala Gly Thr Tyr

435 440 445

Tyr Ile Lys Val Val Gly Glu Ala Ala Tyr Asn Gly Val Ser Ile Leu

450 455 460

Ala Thr Gln

465

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgagcctgg gtggaggcgg cagctgtgac 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtcacagctg ccgcctccac ccaggctcat 30

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcggccggca actcgaccga caacgctt 28

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aagcgttgtc ggtcgagttg ccggccgc 28

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

acaacgcttc caaggcccgt ccggccagtt g 31

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

caactggccg gacgggcctt ggaagcgttg t 31

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

acaacgcttc caagacccgt ccggccagtt g 31

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

caactggccg gacgggtctt ggaagcgttg t 31

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

acaacgcttc caagtcacgt ccggccagtt g 31

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

caactggccg gacgtgactt ggaagcgttg t 31

Claims

1.一种角蛋白酶突变体，其特征在于，是将来源于嗜麦芽窄食单胞菌的角蛋白酶的第215位的酪氨酸替换成甘氨酸；所述来源于嗜麦芽窄食单胞菌的角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述角蛋白酶突变体的基因。

3.携带权利要求2所述基因的载体或重组细胞。

4.一种获得权利要求1所述角蛋白酶突变体的方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)将从嗜麦芽窄食单胞菌BBE11-1中获得的编码角蛋白酶的基因，克隆到pET22b(+)中，构建重组质粒pET22b+kerSMD；

(2)采用滚环PCR的方法，设计含有代表突变氨基酸的密码子碱基的互补引物，PCR扩增质粒pET22b+kerSMD得到含有编码角蛋白酶突变体的基因序列的开环重组载体；

(3)将含有编码正确突变体的基因的PCR反应液经过DpnI内切酶消化，除去未突变的原质粒，反应液直接转化感受态大肠杆菌JM109，挑取正确复制子，并提取正确突变质粒；

(4)将正确的重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达，发酵上清液即角蛋白酶突变体粗酶液；

所述嗜麦芽窄食单胞菌BBE11-1的保藏编号为CCTCC No：M 2011193。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，还进一步包括使用AKTA蛋白纯化仪和HisTrap FF crude 1ml的镍柱对角蛋白酶进行纯化。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将步骤(4)获得的重组菌在含有100μg/L的氨苄青霉素的LB培养基中37℃液体培养过夜，后接入含有100μg/L的氨苄青霉素的LB发酵液体培养基37℃培养至OD₆₀₀＝0.6，降温至20℃培养，加入最终浓度0.1mM的诱导剂IPTG诱导，72h时离心获得上清酶液，即为粗酶液。

7.权利要求1所述角蛋白酶突变体在制备日化洗涤产品中的应用。

8.权利要求1所述角蛋白酶突变体在纺织领域的应用。

9.权利要求1所述角蛋白酶突变体在制备饲料添加剂中的应用。