CN107475202A - 一种肺癌循环肿瘤细胞捕获与活性检测、分析方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种肺癌循环肿瘤细胞捕获与活性检测、分析方法及其应用，采用负向富集肺癌CTCs的基础上，通过对肺癌CTCs的捕获，捕获在滤膜上，通过联合检测细胞核形态与三种特定mRNAs的表达量来识别肺癌CTCs，对从每例血液样本中捕获的疑似CTCs进行细胞核大小和形态学特征分析，结合TTF1 mRNA和pan‑CK mRNA鉴别是否为TTF1阳性肺癌CTCs，进而依据MKI67 mRNA表达是否阳性将其归类为有增殖活性的TTF1阳性肺癌CTCs或无增殖活性的TTF1阳性肺癌CTCs，该发明的检测方法灵敏度高，特异性强，能够高效捕获并计数出肺癌病人外周血中TTF1阳性CTCs数量，能够检测出TTF1阳性CTCs的活性，并分析出每个细胞有无增殖活性。
Description
技术领域
本发明涉及肺癌液体活检领域，具体涉及一种肺癌循环肿瘤细胞捕获与活性检测、分析方法及其应用。
背景技术
循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells，CTCs)检测是肿瘤液体活检领域的主要内容之一，可是现有的循环肿瘤细胞检测技术仅依靠肿瘤细胞具有的某个特征，在肿瘤患者的外周血中捕获CTCs，进行简单计数，这些检测技术的缺点在于：一方面缺少特异性，在外周血中识别的细胞未必就是肿瘤细胞，目前并没有针对TTF1阳性肺癌的特异性检测方法；更为重要的是缺少对CTCs的深入分析，不能获得CTCs的增殖活性信息，无法鉴别出哪些CTCs具有转移侵袭能力，哪些CTCs已进入凋亡阶段。
现有的肺癌CTCs检测技术有三种：
第一种技术是经过美国FDA批准用于临床的Cell search技术，其基本原理是假设肿瘤细胞表面均表达上皮细胞粘附分子(EpCAM)，使用偶联EpCAM抗体的免疫磁珠从全血中正向捕获CTCs，接着应用免疫荧光技术检测捕获细胞内上皮型标志物CK蛋白的表达情况，如果捕获的细胞CK蛋白阳性，则可将该细胞判定为CTC。
第二种技术是经过中国cFDA认证用于临床肺癌病人的外周血叶酸受体阳性细胞检测技术，其基本原理是依据肺癌细胞表面表达一定数量的叶酸受体，将全血标本中的红细胞和白细胞去除后，使用偶联有叶酸配体的寡聚核糖核酸探针特异结合肺癌CTCs表面的叶酸受体，接着应用Real-Time PCR技术定量检测出探针的数量，从而间接计算出叶酸受体的数量，最后通过叶酸受体的总数量估算出对应的CTCs数目。
第三种技术是负向富集CTCs后，在存在少量白细胞的背景下对获得的全部细胞进行特殊标记，具有一定特征的细胞即为CTCs，并可依据CTCs具有的特征不同将其划分为不同类型。具体包括使用探针检测CTC细胞内上皮型和间质型标志物的表达量，若CTC主要表达上皮型标志物则被判定为上皮型CTC；若主要表达间质型标志物则被判定为间质型CTC；二者兼有则被判定为混合型CTC。
以上现有的各类肺癌循环肿瘤细胞(CTCs)检测技术各有缺点。以使用EpCAM抗体为核心的CTCs正向富集技术的缺点是灵敏度低，不能捕获不表达EpCAM分子的CTCs；以去除白细胞为核心的CTCs负向富集技术的缺点在于特异性差，把血液中非肿瘤来源的上皮细胞、血管内皮细胞等误判为CTC。除此之外，现有的肺癌CTCs检测技术都没有对CTCs的增殖活性进行测定，不能说明检测到的CTCs是处于凋亡阶段还是增殖阶段。总体来说，现有的CTCs检测技术存在灵敏度低、特异性不足和缺少活性鉴定这三方面的缺点。
因此，发明一种检测方法灵敏度高，特异性强，能够高效捕获并计数出肺癌病人外周血中TTF1阳性CTCs数量，能够检测出TTF1阳性CTCs的活性，并分析出每个细胞有无增殖活性的肺癌循环肿瘤细胞捕获与活性检测、分析方法及其应用，具有广泛的市场前景。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供发明一种检测方法灵敏度高，特异性强，能够高效捕获并计数出肺癌病人外周血中TTF1阳性CTCs数量，能够检测出TTF1阳性CTCs的活性，并分析出每个细胞有无增殖活性的肺癌循环肿瘤细胞捕获与活性检测、分析方法及其应用。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种肺癌循环肿瘤细胞捕获与活性检测方法，其特征在于：
包括以下步骤：
(1)肺癌CTCs的捕获：
1)采集外周血：按常规操作采静脉血，收集5ml外周静脉血；
2)裂解并去除红细胞：将步骤1)中的5ml外周静脉血加入到45ml红细胞裂解液中，颠倒混匀后室温不间断轻摇20min，以充***解红细胞；500g离心10min，去除上清；用细胞洗涤液重悬细胞沉淀，再次1000g离心10min，去除上清；
3)去除白细胞：利用磁珠结合白细胞，使用500μl细胞洗涤液重悬细胞沉淀，将CD45抗体包被磁珠加入步骤2)中细胞悬液内，放于旋转混合仪上充分结合，150r/min室温反应20min，在磁力架去除白细胞之后，获得残留有少量白细胞的肺癌CTCs细胞悬液；
4)微孔滤膜截留肺癌CTCs：将步骤3)中获得的肺癌CTCs细胞悬液加入50μL、40％中性***溶液固定8min后，转移细胞悬液至带有孔径为8μm微孔滤膜的滤器内，通过负压抽吸将细胞悬液中直径较小的白细胞过滤掉，肺癌CTCs因直径大于滤膜的孔径被截留在滤膜上，得肺癌CTCs细胞，备用；
(2)TTF1阳性肺癌CTCs的识别：
1)细胞固定：在步骤(1)中微孔滤膜捕获的肺癌CTCs细胞中加入1ml、4％中性甲醛溶液充室温充分固定1h，负压抽滤去除固定液，加入1ml细胞洗涤液洗涤2min后，抽滤除尽残留甲醛，得固定的肺癌CTCs细胞；
2)透化：将上述步骤中的含有固定肺癌CTCs细胞的滤膜转移至24孔板孔内，加入0.1％Triton X-100的透化剂，室温反应5min，增加细胞膜的通透性，细胞洗涤液洗膜3次，彻底去除透化剂，得透化后的肺癌CTCs细胞；
3)消化：将透化后的肺癌CTCs细胞浸泡于2.5μg/ml胃蛋白酶工作液内，保持40℃孵育30min，采用细胞洗涤液洗膜3次，彻底去除胃蛋白酶，使mRNA探针能够进入细胞内，得消化的肺癌CTCs细胞；
4)RNA探针杂交结合目的mRNA分子：使用三种特异性mRNA探针与细胞内的目标mRNA分子充分杂交结合，40℃孵育2～3h，采用探针洗涤液洗涤三次，去除未结合的RNA探针；
5)支链DNA技术扩增：在特异探针与目标mRNA特异结合的基础上，应用支链DNA技术放大杂交信号，分别给三种mRNA探针复合物施加三种不同的荧光扩增体系，最终使得每种mRNA分子均特有荧光标记在细胞原位显示；
6)细胞核染色：转移载有肺癌CTCs的微孔滤膜与载玻片上，加DAPI荧光染色液标记细胞核，中性树胶封片后备镜检；
7)全自动荧光显微镜扫描并记录图像：使用多通道荧光显微镜分别扫描每个细胞的4种荧光信号，4种荧光信号分别来自DAPI(标记细胞核)、Cy3(标记TTF1 mRNA)、FITC(标记pan-CK mRNA)和Cy5(标记MKI67 mRNA)荧光染料，扫描结束后对肺癌CTCs细胞按照一定的标准进行活性分析。
一种肺癌循环肿瘤细胞的活性分析方法，其特征在于：
所述的TTF1阳性肺癌CTCs检测结果分析包括：对从血液样品中捕获的每个细胞，依次分析细胞核形态特征、三种mRNA表达结果；
首先，对每个细胞读标准进行归类：
(1)单个受检细胞三种mRNA表达结果判读标准：
受检细胞TTF1 mRNA表达阳性判读标准：Cy3通道下荧光点数≥3；
受检细胞TTF1 mRNA表达阴性判读标准：Cy3通道下荧光点数＜3；
受检细胞pan-CK mRNA表达阳性判读标准：FITC通道下荧光点数≥3；
受检细胞pan-CK mRNA表达阴性判读标准：FITC通道下荧光点数＜3；
受检细胞MKI67 mRNA表达阳性判读标准：Cy5通道下荧光点数≥3；
受检细胞MKI67 mRNA表达阴性判读标准：Cy5通道下荧光点数＜3；
(2)TTF1阳性肺癌CTCs判读标准：
对于受检的每个细胞，若同时满足下列判断标准中的三个条件，则为TTF1阳性肺癌CTCs；
TTF1阳性肺癌CTCs判读标准为：
1)细胞核直径大于白细胞中的中性粒细胞和淋巴细胞；
2)TTF1 mRNA表达为阳性；
3)pan-CK mRNA表达为阳性；
(3)TTF1阳性肺癌CTCs增殖活性判读标准：
有增殖活性的TTF1阳性肺癌CTC：在满足TTF1阳性肺癌CTCs三个判读条件的前提下，MKI67 mRNA表达为阳性；
无增殖活性的TTF1阳性肺癌CTC：在满足TTF1阳性肺癌CTCs三个判读条件的前提下，MKI67 mRNA表达为阴性；
(4)分析总结每个血液样本的检测结果：
根据上述判读标准，对从每例血液样本中捕获的疑似CTCs进行细胞核大小和形态学特征分析，结合TTF1 mRNA和pan-CK mRNA鉴别是否为TTF1阳性肺癌CTCs，进而依据MKI67mRNA表达是否阳性将其归类为有增殖活性的TTF1阳性肺癌CTCs或无增殖活性的TTF1阳性肺癌CTCs。在每个细胞分析完毕之后，汇总出该血液样品中肺来源的TTF1阳性肺癌CTCs总数目，并分别汇总出肺来源的有增殖活性的TTF1阳性肺癌CTCs数目、百分比和肺来源的无增殖活性的TTF1阳性肺癌CTCs数目、百分比。
所述的mRNA探针组合为：pan-CK mRNA、TTF1 mRNA和MKI67mRNA。
所述的红细胞裂解液为：0.8％NH4Cl、0.1％KHCO3和0.1mM EDTA。
所述细胞洗涤液为：8.0g/L NaCl、0.2g/L KCl、1.44g/L Na2HPO4和0.24g/LKH2PO4。
所述探针洗涤液为：0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠和25％甲酰胺。
一种肺癌循环肿瘤细胞的捕获与检测、分析方法，使用mRNA探针组合和细胞核形态对肺癌CTCs进行活性分类。
一种肺癌循环肿瘤细胞的捕获与活性检测、分析方法，应用于肺癌患者的CTCs分类。
一种肺癌循环肿瘤细胞的捕获与活性检测、分析方法，应用于肺癌患者的无创辅助诊断。
本发明具有如下的积极效果：现有的各类肺癌循环肿瘤细胞(CTCs)检测灵敏度或特异度上都存在缺点，以使用EpCAM抗体为核心的CTCs正向富集技术的缺点是灵敏度低，不能捕获不表达EpCAM分子的肺癌CTCs；以去除白细胞为核心的CTCs负向富集技术的缺点在于特异性差，把血液中非肿瘤来源的上皮细胞、血管内皮细胞等误判为肺癌CTCs。
本发明提供的检测方法立足于目前已被公认CTCs捕获效率高于正向富集技术的负向富集技术之上，保证了检测方法的灵敏性足够高；同时本发明采用细胞核较大、pan-CKmRNA表达阳性两个特征可保证检测到的细胞为非血源性细胞，肺癌病人血液样本中细胞TTF1 mRNA表达阳性特征可提示检测到的细胞为肺组织来源细胞，综合细胞核较大、pan-CKmRNA表达阳性与TTF1 mRNA表达阳性三个特征可保证肺癌病人血样中同时具有这三个特征的细胞为TTF1阳性肺癌CTCs，这三个特征的联合使用保证了本检测方法的特异性；总之，上述三个特征的联合使用保证了本发明在检测TTF1阳性肺癌CTCs上灵敏度高、特异性强。
现有的肺癌CTCs检测方法，都不能检测TTF1阳性肺癌CTCs的增殖活性。本发明使用MKI67 mRNA检测探针能够测量出TTF1阳性肺癌CTCs是否表达MKI67 mRNA，依据MKI67mRNA的表达阳性与否能够有效将TTF1阳性肺癌CTCs进行增殖活性分类。
本发明在高效富集肺癌CTCs的微孔滤膜负向富集技术之上，联合检测细胞核大小、pan-CK mRNA、TTF1 mRNA和MKI67 mRNA，能够高效捕获并计数出肺癌病人外周血中TTF1阳性CTCs数量，并且能够检测出TTF1阳性CTCs的活性，能够把肺癌病人血样中的有增殖活性TTF1阳性肺癌CTCs的数量和无增殖活性TTF1阳性肺癌CTCs的数量计量出来，为后续TTF1阳性肺癌的研究和临床应用提供了一种新的检测技术。
因此，综上所述：该发明检测方法灵敏度高，特异性强，能够高效捕获并计数出肺癌病人外周血中TTF1阳性CTCs数量，能够检测出TTF1阳性CTCs的活性，并分析出每个细胞有无增殖活性。
附图说明
图1为本发明对单个肺癌CTCs捕获与增殖活性分类结果示例。
图2为本发明对肺癌患者CTCs计数和增殖活性分类结果示例。
具体实施方式
实施例
首先提前配制以下：
红细胞裂解液，配方为：0.8％NH4Cl、0.1％KHCO3和0.1mM EDTA；
细胞洗涤液配方为：8.0g/L NaCl、0.2g/L KCl、1.44g/L Na2HPO4和0.24g/LKH2PO4；
探针洗涤液配方为：0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠和25％甲酰胺；
mRNA组合探针包括：pan-CK mRNA结合探针、TTF1 mRNA结合探针与MKI67 mRNA结合探针；
一种肺癌循环肿瘤细胞捕获与活性检测方法，
包括以下步骤：
(1)肺癌CTCs的捕获：
1)采集外周血：按常规操作采静脉血，收集5ml外周静脉血；
2)裂解并去除红细胞：将步骤1)中的5ml外周静脉血加入到45ml红细胞裂解液中，颠倒混匀后室温不间断轻摇20min，以充***解红细胞；500g离心10min，去除上清；用细胞洗涤液重悬细胞沉淀，再次1000g离心10min，去除上清；
3)去除白细胞：利用磁珠结合白细胞，使用500μl细胞洗涤液重悬细胞沉淀，将CD45抗体包被磁珠加入步骤2)中细胞悬液内，放于旋转混合仪上充分结合，150r/min室温反应20min，在磁力架去除白细胞之后，获得残留有少量白细胞的肺癌CTCs细胞悬液；
4)微孔滤膜截留肺癌CTCs：将步骤3)中获得的肺癌CTCs细胞悬液加入50μL、40％中性***溶液固定8min后，转移细胞悬液至带有孔径为8μm微孔滤膜的滤器内，通过负压抽吸将细胞悬液中直径较小的白细胞过滤掉，肺癌CTCs因直径大于滤膜的孔径被截留在滤膜上，得肺癌CTCs细胞，备用；
(2)TTF1阳性肺癌CTCs的识别：
1)细胞固定：在步骤(1)中微孔滤膜捕获的肺癌CTCs细胞中加入1ml、4％的中性甲醛溶液充室温充分固定1h，负压抽滤去除固定液，加入1ml细胞洗涤液洗涤2min后，抽滤除尽残留甲醛，得固定后的肺癌CTCs细胞；
2)透化：将上述步骤中的含有固定肺癌CTCs细胞的滤膜转移至24孔板孔内，加入0.1％Triton X-100的透化剂，室温反应5min，增加细胞膜的通透性，细胞洗涤液洗膜3次，彻底去除透化剂，得透化后的肺癌CTCs细胞；
3)消化：将上述步骤中的透化肺癌CTCs细胞浸泡于2.5μg/ml胃蛋白酶工作液内，保持40℃孵育30min，采用细胞洗涤液洗膜3次，彻底去除胃蛋白酶，使mRNA探针能够进入细胞内，得消化后的肺癌CTCs细胞；
4)RNA探针杂交结合目的mRNA分子：使用三种特异性mRNA探针与细胞内的目标mRNA分子充分杂交结合，40℃孵育2～3h，采用探针洗涤液洗涤三次，去除未结合的RNA探针；
5)支链DNA技术扩增：在特异探针与目标mRNA特异结合的基础上，应用支链DNA技术放大杂交信号，分别给三种mRNA探针复合物施加三种不同的荧光扩增体系，最终使得每种mRNA分子均特有荧光标记在细胞原位显示；
6)细胞核染色：转移载有肺癌CTCs的微孔滤膜与载玻片上，加DAPI荧光染色液标记细胞核，中性树胶封片后备镜检；
7)全自动荧光显微镜扫描并记录图像：使用多通道荧光显微镜分别扫描每个细胞的4种荧光信号，4种荧光信号分别来自DAPI(标记细胞核)、Cy3(标记TTF1 mRNA)、FITC(标记pan-CK mRNA)和Cy5(标记MKI67 mRNA)荧光染料，扫描结束后对肺癌CTCs细胞按照一定的标准进行活性分析。
4种荧光信号检测的目标
一种肺癌循环肿瘤细胞的活性分析方法：
所述的TTF1阳性肺癌CTCs检测结果分析包括：对从血液样品中捕获的每个细胞，依次分析细胞核形态特征、三种mRNA表达结果；
首先，对每个细胞读标准进行归类：
(1)单个受检细胞三种mRNA表达结果判读标准：
受检细胞TTF1 mRNA表达阳性判读标准：Cy3通道下荧光点数≥3；
受检细胞TTF1 mRNA表达阴性判读标准：Cy3通道下荧光点数＜3；
受检细胞pan-CK mRNA表达阳性判读标准：FITC通道下荧光点数≥3；
受检细胞pan-CK mRNA表达阴性判读标准：FITC通道下荧光点数＜3；
受检细胞MKI67 mRNA表达阳性判读标准：Cy5通道下荧光点数≥3；
受检细胞MKI67 mRNA表达阴性判读标准：Cy5通道下荧光点数＜3；
(2)TTF1阳性肺癌CTCs判读标准：
对于受检的每个细胞，若同时满足下列判断标准中的三个条件，则为TTF1阳性肺癌CTCs；
TTF1阳性肺癌CTCs判读标准为：
1)细胞核直径大于白细胞中的中性粒细胞和淋巴细胞；
2)TTF1 mRNA表达为阳性；
3)pan-CK mRNA表达为阳性；
(3)TTF1阳性肺癌CTCs增殖活性判读标准：
有增殖活性的TTF1阳性肺癌CTC：在满足TTF1阳性肺癌CTCs三个判读条件的前提下，MKI67 mRNA表达为阳性；
无增殖活性的TTF1阳性肺癌CTC：在满足TTF1阳性肺癌CTCs三个判读条件的前提下，MKI67 mRNA表达为阴性；
(4)分析总结每个血液样本的检测结果：
根据上述判读标准，对从每例血液样本中捕获的疑似CTCs进行细胞核大小和形态学特征分析，结合TTF1 mRNA和pan-CK mRNA鉴别是否为TTF1阳性肺癌CTCs，进而依据MKI67mRNA表达是否阳性将其归类为有增殖活性的TTF1阳性肺癌CTCs或无增殖活性的TTF1阳性肺癌CTCs。在每个细胞分析完毕之后，汇总出该血液样品中肺来源的TTF1阳性肺癌CTCs总数目，并分别汇总出肺来源的有增殖活性的TTF1阳性肺癌CTCs数目、百分比和肺来源的无增殖活性的TTF1阳性肺癌CTCs数目、百分比。
所得检测结果如下表：
表肺癌患者和正常对照CTCs计数和增殖活性分类结果
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种肺癌循环肿瘤细胞捕获与活性检测方法，其特征在于：
包括以下步骤：
(1)肺癌CTCs的捕获：
1)采集外周血：按常规操作采静脉血，收集5ml外周静脉血；
2)裂解并去除红细胞：将步骤1)中的5ml外周静脉血加入到45ml红细胞裂解液中，颠倒混匀后室温不间断轻摇20min，以充***解红细胞；500g离心10min，去除上清；用细胞洗涤液重悬细胞沉淀，再次1000g离心10min，去除上清；
3)去除白细胞：利用磁珠结合白细胞，使用500μl细胞洗涤液重悬细胞沉淀，将CD45抗体包被磁珠加入步骤2)中细胞悬液内，放于旋转混合仪上充分结合，150r/min室温反应20min，在磁力架去除白细胞之后，获得残留有少量白细胞的肺癌CTCs细胞悬液；
4)微孔滤膜截留肺癌CTCs：将步骤3)中获得的肺癌CTCs细胞悬液加入50μL、40％中性***溶液固定8min后，转移细胞悬液至带有孔径为8μm微孔滤膜的滤器内，通过负压抽吸将细胞悬液中直径较小的白细胞过滤掉，肺癌CTCs因直径大于滤膜的孔径被截留在滤膜上，得肺癌CTCs细胞，备用；
(2)TTF1阳性肺癌CTCs的识别：
1)细胞固定：在步骤(1)中微孔滤膜捕获的肺癌CTCs细胞中加入1ml、4％的中性甲醛溶液充室温充分固定1h，负压抽滤去除固定液，加入1ml细胞洗涤液洗涤2min后，抽滤除尽残留甲醛，得固定后的肺癌CTCs细胞；
2)透化：将上述步骤中的含有固定肺癌CTCs细胞的滤膜转移至24孔板孔内，加入0.1％Triton X-100的透化剂，室温反应5min，增加细胞膜的通透性，细胞洗涤液洗膜3次，彻底去除透化剂，得透化后的肺癌CTCs细胞；
3)消化：将上述步骤中的透化肺癌CTCs细胞浸泡于2.5μg/ml胃蛋白酶工作液内，保持40℃孵育30min，采用细胞洗涤液洗膜3次，彻底去除胃蛋白酶，使mRNA探针能够进入细胞内，得消化后的肺癌CTCs细胞；
4)RNA探针杂交结合目的mRNA分子：使用三种特异性mRNA探针与细胞内的目标mRNA分子充分杂交结合，40℃孵育2～3h，采用探针洗涤液洗涤三次，去除未结合的RNA探针；
5)支链DNA技术扩增：在特异探针与目标mRNA特异结合的基础上，应用支链DNA技术放大杂交信号，分别给三种mRNA探针复合物施加三种不同的荧光扩增体系，最终使得每种mRNA分子均特有荧光标记在细胞原位显示；
6)细胞核染色：转移载有肺癌CTCs的微孔滤膜与载玻片上，加DAPI荧光染色液标记细胞核，中性树胶封片后备镜检；
7)全自动荧光显微镜扫描并记录图像：使用多通道荧光显微镜分别扫描每个细胞的4种荧光信号，4种荧光信号分别来自DAPI(标记细胞核)、Cy3(标记TTF1 mRNA)、FITC(标记pan-CK mRNA)和Cy5(标记MKI67 mRNA)荧光染料，扫描结束后对肺癌CTCs细胞按照一定的标准进行活性分析。
2.一种肺癌循环肿瘤细胞的活性分析方法，其特征在于：
所述的TTF1阳性肺癌CTCs检测结果分析包括：对从血液样品中捕获的每个细胞，依次分析细胞核形态特征、三种mRNA表达结果；
首先，对每个细胞读标准进行归类：
(1)单个受检细胞三种mRNA表达结果判读标准：
受检细胞TTF1 mRNA表达阳性判读标准：Cy3通道下荧光点数≥3；
受检细胞TTF1 mRNA表达阴性判读标准：Cy3通道下荧光点数＜3；
受检细胞pan-CK mRNA表达阳性判读标准：FITC通道下荧光点数≥3；
受检细胞pan-CK mRNA表达阴性判读标准：FITC通道下荧光点数＜3；
受检细胞MKI67 mRNA表达阳性判读标准：Cy5通道下荧光点数≥3；
受检细胞MKI67 mRNA表达阴性判读标准：Cy5通道下荧光点数＜3；
(2)TTF1阳性肺癌CTCs判读标准：
对于受检的每个细胞，若同时满足下列判断标准中的三个条件，则为TTF1阳性肺癌CTCs；
TTF1阳性肺癌CTCs判读标准为：
1)细胞核直径大于白细胞中的中性粒细胞和淋巴细胞；
2)TTF1 mRNA表达为阳性；
3)pan-CK mRNA表达为阳性；
(3)TTF1阳性肺癌CTCs增殖活性判读标准：
有增殖活性的TTF1阳性肺癌CTC：在满足TTF1阳性肺癌CTCs三个判读条件的前提下，MKI67 mRNA表达为阳性；
无增殖活性的TTF1阳性肺癌CTC：在满足TTF1阳性肺癌CTCs三个判读条件的前提下，MKI67 mRNA表达为阴性；
(4)分析总结每个血液样本的检测结果：
根据上述判读标准，对从每例血液样本中捕获的疑似CTCs进行细胞核大小和形态学特征分析，结合TTF1 mRNA和pan-CK mRNA鉴别是否为TTF1阳性肺癌CTCs，进而依据MKI67mRNA表达是否阳性将其归类为有增殖活性的TTF1阳性肺癌CTCs或无增殖活性的TTF1阳性肺癌CTCs。在每个细胞分析完毕之后，汇总出该血液样品中肺来源的TTF1阳性肺癌CTCs总数目，并分别汇总出肺来源的有增殖活性的TTF1阳性肺癌CTCs数目、百分比和肺来源的无增殖活性的TTF1阳性肺癌CTCs数目、百分比。
3.根据权利要求1所述的肺癌循环肿瘤细胞的捕获与活性检测方法，其特征在于：所述的mRNA探针组合为：pan-CK mRNA、TTF1 mRNA和MKI67 mRNA。
4.根据权利要求1所述的肺癌循环肿瘤细胞的捕获与活性检测方法，其特征在于：所述的红细胞裂解液为：0.8％ NH4Cl、0.1％ KHCO3和0.1mM EDTA。
5.根据权利要求1所述的肺癌循环肿瘤细胞的捕获与活性检测方法，其特征在于：所述细胞洗涤液为：8.0g/L NaCl、0.2g/L KCl、1.44g/L Na2HPO4和0.24g/L KH2PO4。
6.根据权利要求1所述的肺癌循环肿瘤细胞的捕获与活性检测方法，其特征在于：所述探针洗涤液为：0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠和25％甲酰胺。
7.一种肺癌循环肿瘤细胞的捕获与检测、分析方法，其特征在于：使用mRNA探针组合和细胞核形态对肺癌CTCs进行活性分类。
8.一种肺癌循环肿瘤细胞的捕获与活性检测、分析方法，其特征在于：应用于肺癌患者的CTCs分类。
9.一种肺癌循环肿瘤细胞的捕获与活性检测、分析方法，其特征在于：应用于肺癌患者的无创辅助诊断。
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