CN107466864B - 一种铁皮石斛无性繁殖快速成苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及石斛无性繁殖技术领域。目的是提供一种育苗周期短、幼苗形成率高、操作流程简单的铁皮石斛无性繁殖快速成苗的方法。采用的技术方案是：通过植株筛选，从长势健壮的铁皮石斛上取茎尖或是带一个茎节的茎段作为外植体。制备培养基：以MS或者改良MS作为基本培养基，添加NAA、6‑BA、2,4‑D、琼脂粉、蔗糖、活性炭和土豆汁，调节pH值至5.8，于121℃，102.9kPa条件下灭菌30min。将外植体接种在培养基中，可直接从外植体中培育长出完整的幼苗植株。本发明育苗周期短，成本低，操作流程简单，培育的幼苗形成率高，能够保持母株的优良性状。

Description

一种铁皮石斛无性繁殖快速成苗的方法

技术领域

本发明属于石斛无性繁殖技术领域，具体涉及一种铁皮石斛无性繁殖快速成苗的方法。

背景技术

石斛，是一种药用植物，味甘淡微咸，性寒，归胃、肾、肺经，具有益胃生津、滋阴清热的功效。现代药理学研究证明石斛中所含的石斛碱是良好的退热剂、镇痛剂，具有增强免疫力、延缓衰老、抗肿瘤等作用。石斛不仅具有极高的药用价值，还具有一定的观赏价值，在国际花卉市场占据重要的地位。

我国铁皮石斛资源丰富，以野生为主，但由于人为长期无节制地开采和破坏，以及自然环境的不断改变，近年来野生铁皮石斛资源急剧减少。同时,由于石斛种子无胚乳，自然萌发率很低，在野生条件下通常要在共生菌的帮助下才能萌发。且石斛种苗分株能力弱，繁殖系数低导致繁殖速度慢，进而致使野生铁皮石斛资源面临濒危。目前铁皮石斛已被列为国家重点保护药用植物、中国珍稀濒危二级保护植物和世界二类保护植物。

随着科学技术的不断进步，近年来，组织快繁、低温贮藏和低温保存已经成为实现繁殖和资源保存的重要手段。通过采用组织培养技术对铁皮石斛进行快速繁殖是现下保护铁皮石斛野生资源的研究热点。据外文杂志《In vitro Cellular&DevelopmentalBiology--Plant》(2008，4卷3期)公开的名为“Protocorm-like body(PLB)formation andplant regeneration from the callus culture of Dendrobium candidum Wall exLindl”以及“Zhao,P.,Wu,F.,Feng,F.S.S.,Wang,W.J.J.,2008.Protocorm-like body(PLB)formation and plant regeneration from the callus culture of Dendrobiumcandidum Wall ex Lindl.In Vitro Cellular&Developmental Biology:Plant 44,178–185.”的期刊论文中报道，愈伤组织在石斛组织培养过程中生长缓慢且容易褐化，难以实现铁皮石斛的大规模繁殖。现有技术中，公告号为102499092的专利公开了一种石斛的细胞组织繁育繁殖培养方法，该方法要通过多次转接培养，制备多个不同配方的培养基，培养周期长，这样难以通过该培养方法取得相应的经济效益，不利于实现对铁皮石斛优良品种进行保育和扩繁。

发明内容

本发明的目的是提供一种育苗周期短、幼苗形成率高、操作流程简单的铁皮石斛无性繁殖快速成苗的方法。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种铁皮石斛无性繁殖快速成苗的方法，包括以下步骤：

1)、植株筛选：在生长期1年以上的铁皮石斛植株上，取带一个茎节的茎尖或是至少带一个茎节的茎段作为外植体；

2)、制备培养基：以MS或者改良MS作为基本培养基，添加NAA 0.2～3mg/L、6-BA0.5～1mg/L、2,4-D 0～5mg/L、琼脂粉6g/L、蔗糖30g/L、活性炭2g/L和土豆汁200g/L，调节pH值至5.8，于121℃，102.9kPa条件下灭菌30min；所述的改良MS为钙离子含量加倍的MS培养基；

3)、接种外植体：将步骤1)中的茎尖和茎段洗净、消毒，然后置于培养基中培养20～40d，培养温度为25±1℃，日光灯照射，光周期为12h，光照强度为2500±300lx。

优选的，所述步骤1)中，选用生长期1-2年的铁皮石斛植株，取其茎尖带一个茎节，不带叶片，茎尖长度为0.5-1cm的茎尖或是长度为0.5～1cm带一个茎节的茎段作为外植体。

优选的，所述的外植体为取自生长期1-2年的铁皮石斛植株上，茎尖带一个茎节，不带叶片，长度为0.5-1cm的茎尖。

优选的，所述的步骤3)中，茎尖和茎段先用清水冲洗2-3小时，再分别用0.1％升汞和75％酒精消毒。

优选的，所述的土豆汁为土豆洗净、去皮，切块，用蒸馏水煮熟后用纱布过滤所得的滤液。

优选的，所述的土豆汁为土豆洗净、去皮，切成1-1.5cm见方的小方块，用蒸馏水煮沸20min，用三层纱布过滤所得的滤液。

优选的，所述的培养基为以改良MS为基本培养基，添加NAA 0.5～1.5mg/L、6-BA0.5mg/L、2,4-D 0～1.5mg/L、琼脂粉6g/L、蔗糖30g/L、活性炭2g/L和土豆汁200g/L。

优选的，所述的培养基为以改良MS为基本培养基，添加NAA 1.5mg/L、6-BA 0.5mg/L、琼脂粉6g/L、蔗糖30g/L、活性炭2g/L和土豆汁200g/L。

本发明具有以下有益效果：育苗周期短，成本低，操作流程简单，培育的幼苗形成率高，因是无性繁殖而能够保持母株的优良性状。具体来说，本发明解决了石斛组织培育过程中，组织褐化的问题，利用茎尖、茎段直接诱导形成再生幼苗，不需要转接培养，直接一步成苗，形成的幼苗在接种的40d内就可生根，大大缩短了石斛快繁的周期。同时，在省去转接培养的基础上，该培养方法节省了大量的人力和原材料，节约了育苗成本，显著提高了培育石斛的经济效益，这样能够促进企业扩大对铁皮石斛的培养规模，以实现对铁皮石斛优良品种进行保育和扩繁，也缓解了目前铁皮石斛野生资源濒临绝迹的现状。

附图说明

图1为本发明培养的铁皮石斛再生植株照片；

图2为实施例三的幼苗再生率直方图。

具体实施方式

下面具体提供优选的实施例，以使本领域技术人员更加清楚本发明的技术方案和效果。实施例中所用的材料均是取自中国科学院成都生物所保存的铁皮石斛植株。

实施例一

1)、植株筛选：选用生长期1-2年的铁皮石斛植株，分别取茎尖带一个茎节，不带叶片，茎尖的长度为0.5-1cm的茎尖，或者长度为0.5～1cm带一个茎节的茎段作为外植体。

2)、制备培养基：以改良MS，即添加二倍钙离子的MS作为基本培养基，并向培养基中添加NAA 1.5mg/L、6-BA 0.5mg/L、琼脂粉6g/L、蔗糖30g/L、活性炭2g/L和土豆汁200g/L，调节pH值至5.8，于121℃，102.9kPa条件下灭菌30min。

3)、接种外植体：将步骤1)中的茎尖、茎段置于培养基中，在组织培养间内培养20～40d，培养温度为25℃，日光灯照射，光周期为12h，光照强度为2500lx。

观察、记录茎尖、茎段在培养基上的生长情况；茎尖再生植株的形成率为84.12％，茎段的形成率为45.83％，幼苗长势分别如图1中d、e所示。

实施例二

制备土豆汁：

按比例(每1L培养基200g土豆)称取土豆，将土豆清洗干净、除去外皮，切成1～1.5cm见方的小块，将土豆块置于煮沸的蒸馏水，煮20min，再分别用0.1％升汞和75％酒精消毒。用三层纱布对煮好的土豆和蒸馏水进行过滤，收集滤液，即为土豆汁。

实施例三

1)、分别取生长期1-2年植株上的，茎尖带一个茎节，不带叶片，茎尖长度为0.5-1cm的茎尖，或者长度为0.5～1cm带一个茎节的茎段作为外植体。

2)、按照表1中的添加配比制备培养基，除表1中成分外，培养基中还包括琼脂粉6g/L、蔗糖30g/L、活性炭2g/L和土豆汁200g/L。

表1培养基中添加不同浓度的激素配比

培养基编号	基本培养基	NAA(mg/L)	6-BA(mg/L)	2,4-D(mg/L)
					1	MS	2.0	0.5	0
2	MS	1.5	0.5	0
					3	MS	1.0	0.5	0
4	MS	0.5	0.5	1.5
					5	MS	1.0	0.5	1.5
6	MS	0.5	0.5	2.0
					7	MS	0.4	1.0	5.0
8	MS	0.2	0.5	2.5
					9	改良MS(2倍Ca<sup>2+</sup>)	3.0	1.0	0
10	改良MS(2倍Ca<sup>2+</sup>)	1.5	0.5	0

3)、分别将茎尖和茎段置于上述培养基中，培养方法与实施例一相同。

观察、记录茎尖在培养基上的生长情况，茎段和茎尖在10d萌生黄绿色嫩芽，在30d左右形成幼苗。如图1a、1b所示，少量茎段在培养基几上形成愈伤组织。茎尖和茎段的再生植株形成率如表2和图2所示。

表2茎尖和茎段在不同培养基上再生幼苗形成情况

注：表中字母是显著性差异标记使用的字母。将全部平均数从大到小依次排列，最大的平均数用a标记，依次类推。在各平均数间，凡有一个相同标记的字母的即为差异不显著，凡具有不同标记字母的即为差异显著。

由表2可见，茎尖的再生植株形成率较茎段更高，在30d左右就可长成幼苗。如图1所示，图1f为茎尖在编号7的培养基上通过萌生侧芽获得再生幼苗；图1g为茎尖在编号5的培养基上通过萌生丛生芽获得再生幼苗；图1h为再生幼苗生出的根系；图1i为茎段在编号10的培养基上诱导产生丛生芽获得再生幼苗。

Claims (5)

1.一种铁皮石斛无性繁殖快速成苗的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)、植株筛选：在生长期1年以上的铁皮石斛植株上，取带一个茎节的茎尖作为外植体；

2)、制备培养基：以MS作为基本培养基，添加NAA1.0mg/L、6-BA0.5mg/L、2,4-D1.5mg/L、琼脂粉6g/L、蔗糖30g/L、活性炭2g/L和土豆汁200g/L，调节pH值至5.8，于121℃，102.9kPa条件下灭菌30min；或者以改良MS作为基本培养基，添加NAA1.5mg/L、6-BA0.5mg/L、琼脂粉6g/L、蔗糖30g/L、活性炭2g/L和土豆汁200g/L，调节pH值至5.8，于121℃，102.9kPa条件下灭菌30min；所述改良MS为钙离子含量加倍的MS培养基；

3)、接种外植体：将步骤1)中的茎尖洗净消毒，然后置于培养基中培养20～40d，培养温度为25±1℃，日光灯照射，光周期为12h，光照强度为2500±300lx。

2.根据权利要求1所述的铁皮石斛无性繁殖快速成苗的方法，其特征在于：所述步骤1)中，选用生长期1-2年的铁皮石斛植株，取其茎尖带一个茎节，不带叶片，茎尖长度为0.5-1cm的茎尖作为外植体。

3.根据权利要求1-2中任意一项所述的铁皮石斛无性繁殖快速成苗的方法，其特征在于：所述的步骤3)中，茎尖先用清水冲洗2-3小时，再分别用0.1％升汞和75％酒精消毒。

4.根据权利要求1所述的铁皮石斛无性繁殖快速成苗的方法，其特征在于：所述的土豆汁为土豆洗净、去皮，切块，用蒸馏水煮熟后用纱布过滤所得的滤液。

5.根据权利要求4所述的铁皮石斛无性繁殖快速成苗的方法，其特征在于：所述的土豆汁为土豆洗净、去皮，切成1-1.5cm见方的小方块，用蒸馏水煮沸20min，用三层纱布过滤所得的滤液。