CN100394845C - 东方百合脱毒小籽球的瓶内生成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种东方百合脱毒小籽球的瓶内生成方法，它经过外植树体选择、灭菌，诱导培养获得脱毒茎尖，再经增殖培养，继代培养，瓶内直接生成脱毒小籽球。本发明针对东方百合成球周期长，病毒容易累积等难点，使东方百合在瓶内直接生成脱毒小籽球，出瓶后可直接下地种植，且移栽成活率高。通过对整个百合种球的生产程序进行调整与优化，简化了脱毒种球的培育程序，大大缩短了东方百合脱毒的培育时间，在降低了生产成本的同时提高了种球质量，加强了国产自育种球的市场竞争力，适于东方百合脱毒种球的规模化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种在培养瓶内生产东方百合脱毒小籽球的方法，属于百合种球繁育技术领域。
背景技术
百合(Lilium)是百合科百合属的多年生草本鳞茎植物，由于其花大色美，气质高雅，是世界著名的观赏花卉，多年来，其切花销售量一直占居了全球鲜切花销售量的前四位。而东方百合杂种系(Oriental hybrids)是百合杂种类中花朵最大而又最美丽的一大类，花型为碗型或星状碗型，能散发出怡人的香味，故又称之为香水百合，深受人们的喜爱，是世界上广泛栽培的一大类百合杂种系。在百合种球的培育过程中，东方百合种球的生产周期较长，由鳞片扦插繁殖到开花商品球的培育需要2.5～3年。同时常规无性繁殖中的病毒积累是制约种球繁殖、栽培及切花生产的一大因素，所以脱毒种苗(球)的生产与使用是控制百合病毒病的最基本的关键措施之一。在脱毒种苗(球)的生产过程中，已有的报道均是以脱毒苗进行繁殖和生产的，未见在瓶内直接生成脱毒小籽球的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能有效缩短培育周期，减少病毒交叉感染的机会，提高百合种球质量的东方百合脱毒小籽球的瓶内生成方法。
本发明通过下列技术方案完成：一种东方百合脱毒小籽球的瓶内生成方法，其特征在于经过下列步骤：
1)、外植体的选择与灭菌：选择无病虫害、生长健壮、未检测到CMV(黄瓜花叶病毒)和LSV(百合隐症病毒)的百合种球，在3～6℃的低温、黑暗条件下贮藏6～8周后取出，边剥鳞片边用自来水冲洗，去除外部2～3层包裹不紧实的鳞片后，用浓度为0.1％的洗衣粉水浸泡2～5分钟后，用自来水清洗干净，在0.1～0.2％的升汞(Hgcl2)溶液中灭菌15～25分钟，然后在1～3％的次氯酸钠溶液中消毒10～15分钟，用无菌水洗3～5次；
2)、诱导培养：在无菌条件下，将灭菌后的鳞片切块接种到下列诱导培养基中培养，在温度为25±2℃，光照时间10～12h/d，光照强度2000～3000Lx的环境条件下，培养20～25d后，在切口处生成不定芽：
MS基本培养液
6-苄基氨基嘌呤(6-BA) 1.0～2.0mg/L
萘乙酸(NAA) 0.1～0.5mg/L
蔗糖 30000～40000mg/L
琼脂 5000～5500mg/L
pH 5.5～6.0
3)、获得脱毒茎尖：将上述诱导产生的不定芽在36～40℃条件下气热培养10～30天后，在解剖镜下剥取获得0.2～0.5mm的茎尖；
4)、增殖培养：在无菌条件下，将步骤3)获得的脱毒茎尖转入下列增殖培养基中：
MS基本培养液
6-苄基氨基嘌呤(6-BA) 1.0～2.0mg/L
萘乙酸(NAA) 0.2～0.5mg/L
蔗糖 30000～40000mg/L
琼脂 5000～6000mg/L
pH 5.5～6.0
在温度为26±2℃，光照时间10～12小时/天，光照强度1500～2000Lx的条件下，培养20～25d，使1个茎尖生长成多个不定芽；
5)、继代培养：将上述增殖的不定芽在无菌条件下分切为单芽或2～3个一丛，接入同样的增殖培养基中，在相同的培养环境下进行培养，可得到大量的无根不定芽，增殖苗的叶色浓绿，生长健壮，基部膨大成鳞茎形；
6)、瓶内直接生成脱毒小籽球：将继代形成的不定芽切去叶片，基部及鳞片切块，接入下列生球培养基中：
MS基本培养液
萘乙酸(NAA) 0.05～0.1mg/L
蔗糖 80000～120000mg/L
琼脂 4500～6000mg/L
活性炭 500～600mg/L
pH 5.5～6.0
在温度为20±2℃，黑暗条件下，培养60～70d，不定芽切块及周围直接生成直径0.8～1.2cm，围径3.0～3.5cm的小籽球，每个切块可生成小籽球2～4个。
本发明解决了下列技术难点：
1、针对东方百合成球周期长，病毒容易累积的难点，本发明通过上述方法，在瓶内直接生成小籽球，其色白，鳞片紧实，无叶片，出瓶后可直接下地种植，直径、围径已达到常规组培苗在田间生长3个月以上的小籽球，大大缩短了脱毒种球的培育周期，降低了生产成本。同时出瓶后的小籽球无叶片，易于种植前的冷藏处理，定植后成活率较高。
2、在植物组织培养中，培养瓶内的植株均以异养生长为主，糖是植株进行碳物质积累的主要来源。本发明解决的第二个难点是：通过在固体或液体培养基中添加高浓度的蔗糖(8～12g/L)，使不定芽吸收的可溶性糖迅速累积至小籽球中，瓶内的脱毒小籽球得到了高速生长，同时提高了小籽球的品质。
3、在常规的组培脱毒苗培养中，不定芽需诱导出叶片后再进行生根植株的培养。然而常常因为培养瓶内CO2气体的不足，使培养瓶内的组培苗叶片不仅不能正常进行光合作用积累光合产物，相反还由于叶片的存在，消耗了基部籽球所积累的养分，使组培小籽球的生长受到抑制。另外，常规组培条件中提供的光照，仅是保持组培叶片中的叶绿素生成，在百合的小籽球生成中无利用价值。因此在本发明中，解决的第三个难点是：采取在完全黑暗条件下进行脱毒小籽球的培育，抑制叶片的生长，避免养分消耗，从而使培养基中的养分全部累积至小籽球中，提高了小籽球的生长速度。
4、本发明在不同的培养阶段，根据不同的培养目的，对培养基、蔗糖浓度、添加活性炭以及培养条件等关键因子进行调控，既达到高效增殖，又保证了小籽球的质量，尤其在直接生球阶段，采用完全黑暗条件进行培养60～70d，不仅节约了能源的消耗，而且培养环境接近于百合扦插“埋片”生成鳞片球的环境，籽球出瓶后容易处理，移栽成活率高且利于后期生长。
5、本发明利用组织培养中较洁净的环境，使瓶内脱毒小籽球无病虫害，移栽成活容易，便于百合种质资源在国内甚至于国际上的交流，避免了病虫通过种质的交换而发生大爆发。
本发明具有下列优点和效果：通过东方百合的瓶内直接生成脱毒小籽球技术，对整个百合种球的生产程序进行调整与优化，简化了脱毒种球的培育程序，大大缩短了东方百合脱毒的培育时间，在降低了生产成本的同时提高了种球质量，加强了国产自育种球的市场竞争力，适于东方百合脱毒种球的规模化生产。
本发明着重对东方百合瓶内直接生成脱毒小籽球这一步骤中的关键因素进行了研究，具体地讲，也就是从蔗糖的浓度以及培养环境的调控两大方面进行试验研究，其结果报告如下：
1、试验材料：取东方百合品种“Tiber”的种球作为供试材料。
2、方法与结果
外植体的选择、灭菌、脱毒茎尖的获得以及增殖、继代的整个环节同实施例，重点研究了脱毒小籽球在瓶内的直接生成。
(1)蔗糖浓度对瓶内小籽球生成的影响
试验不同的蔗糖浓度对瓶内直接生成小籽球的影响，设计了2％～14％一系列的梯度浓度，在完全黑暗的培养条件下，培养60d，观察籽球的生长情况及籽球大小，平均直径的测量是用直尺测量20个小籽球的直径后，取平均值，平均围径的测量先用细棉线绕籽球的最大处，再用直尺测量得出数值，同样取20个小籽球的平均值，试验结果见表1。
通过以上的比较试验，得出蔗糖浓度在10％以下时，籽球大小的增大与蔗糖浓度呈正相关，到10％时各项指标均达到了最优，生产的籽球数量适中，直径和围径达到了最大，超过10％后，虽然每块外植体所形成的籽球数量有所增多，但单个籽球的指标反而有所下降，且丛生状，不利于籽球的分离与移栽，至14％时，已有部分籽球发生畸变，扁平状。因此，在东方百合瓶内直接生成脱毒小籽球的方法中，以添加8％～12％的蔗糖比较适宜。
(2)培养环境的调控
采用上述调配出的最适蔗糖浓度，将切块接入MS+NAA0.1+蔗糖10％+活性炭0.6％的生球培养基内，在下面不同的培养条件(主要是光照的调整)，温度为20±2℃的环境中进行培养，60d后测量籽球的各项指标，具体结果见表2。
表1：不同蔗糖浓度下籽球的生长状况
| 蔗糖浓度％ | 每块外植体生成的平均小籽球数量 | 平均直径cm | 平均围径cm | 生长状况 |
| 2 | 1.1 | 0.68 | 0.78 | 根数少而粗长，每株苗上有叶2～3片，籽球的鳞片包裹为一个实心体，不似正常的百合鳞茎 |
| 4 | 1.6 | 0.80 | 1.12 | 根数少而粗长，每株苗上有叶2～3片，籽球可见有鳞片的分化 |
| 6 | 2.3 | 0.92 | 2.02 | 根少而细长，每株苗上有叶1～2片，籽球分化的鳞片更多，接近于正常鳞茎 |
| 8 | 2.8 | 1.01 | 3.17 | 根多而细长，每株苗上有叶1～2片，每个籽球分化出10～15片鳞片 |
| 10 | 3.7 | 1.12 | 3.45 | 根多而细长，不形成叶片，每个籽球分化出15～20片鳞片，鳞片肉质化，白色 |
| 12 | 4.1 | 0.96 | 2.58 | 根粗而短，不形成叶片，每个籽球分化出10～12片鳞片，数量较多，但比较小 |
| 14 | 5.8 | 0.78 | 1.07 | 根粗而短，已不形成叶片，每个籽球仅分化出6～7片鳞片，籽球从生状，形状扁平且部分畸变，数量很多，但比较小 |
通过以上的试验最终得出东方百合脱毒小籽球生成的培养条件以完全黑暗的条件下进行培养效果较好，生成的籽球数量适中，同时围径大于3cm的比率在试验组合中最高，籽球质量优。
表2：不同培养条件下脱毒小籽球的生长状况
| 光强1x | 光照时间h/d | 每块外植体生成的平均小籽球数量 | 围径大于3cm籽球所占比率％ | 生长状况 |
| 2000 | 24 | 4.02 | 34 | 籽球深绿并有些发红，形成的小籽球数量多，但围径小于1cm的数量居多，根有些发绿，每株苗上有叶2～3片，叶色深绿 |
| 2000 | 12 | 4.56 | 61 | 籽球深绿，形成的小籽球数量多，每株苗上有叶1～2片，叶色稍淡 |
| 0 | 0 | 3.42 | 87 | 籽球白色，比较壮实，鳞片紧实，形成的小籽球数量适中，无叶片 |
具体实施方式
为了更好地说明本发明的实质内容，下面给出本发明的实施例，但本发明的内容并不仅限于这些。
实施例1
1)、外植体的选择与灭菌：优选生长健壮、开花性状好、无病虫害，无病毒症状表现的东方百合品种“Tiber”的种球作为外植体，在取材前，将准备接种的鳞茎在4℃的低温，黑暗条件下贮藏8周后取出，边剥鳞片边用自来水冲洗，去除鳞茎外皮和外部2～3层包裹不紧实的鳞片后，用浓度为0.1％的洗衣粉水浸泡2分钟，自来水清洗干净，切去少许顶部及基部，剥成带部分基盘的单个鳞片，在0.1％的升汞(Hgcl2)溶液中灭菌25分钟，1％的次氯酸钠溶液中消毒15分钟，无菌水冲洗3次后，鳞片切块接种；
2)、诱导培养：在无菌条件下，将灭菌后的鳞片切块接种到下列诱导培养基中：
MS基本培养液
6-苄基氨基嘌呤(6-BA) 1.0mg/L
萘乙酸(NAA) 0.1mg/L
蔗糖 30000mg/L
琼脂 5000mg/L
pH 5.5
在温度为25±2℃，光照时间12h/d，光照强度2000Lx的环境条件下，培养25d，在切口处直接生成不定芽，或通过愈伤组织脱分化形成不定芽；
3)、脱毒茎尖的获得：将上述诱导产生的不定芽在36℃条件下气热培养30天，在解剖镜下剥取获得0.2～0.5mm的脱毒茎尖；
4)、增殖培养：在无菌条件下，将第3)步获得的脱毒茎尖转入下列增殖培养基中：
MS基本培养液
6-苄基氨基嘌呤(6-BA) 1.0mg/L
萘乙酸(NAA) 0.2mg/L
蔗糖 30000mg/L
琼脂 5000mg/L
pH 5.5
在温度为26±2℃，光照时间10小时/天，光照强度2000Lx的条件下，培养20d，可使茎尖生长为不定芽，由1个可平均增殖为4个；
5)、继代培养：将第4)步增殖所得到的不定芽在无菌条件下分切为单芽或2～3芽一丛，接入同样的增殖培养基中，在相同的培养环境下进行培养，可得到大量的无根不定芽，增殖苗的叶色浓绿，生长健壮，基部膨大成鳞茎形；
6)、瓶内直接生成脱毒小籽球：将继代形成的不定芽切去叶片，基部及鳞片切块，接入下列的生球培养基：
MS基本培养液
萘乙酸(NAA) 0.05mg/L
蔗糖 80000mg/L
琼脂 4500mg/L
活性炭 500mg/L
pH 5.5
在温度为20±2℃，黑暗条件下，培养70d，不定芽切块及周围可直接生成小籽球，平均直径达1cm，平均围径达3.0cm以上，每个切块平均可生成小籽球2.8个。
实施例2
1)、优选生长健壮、开花性状好、无病虫害，无病毒症状表现的东方百合品种“Acapulco”的种球作为外植体，在取材前，将准备接种的鳞茎在6℃的低温，黑暗条件下贮藏8周后取出，边剥鳞片边用自来水冲洗，去除鳞茎外皮和外部2～3层包裹不紧实的鳞片后，用0.1％洗衣粉水浸泡5分钟，自来水清洗干净，切去少许顶部及基部，剥成带部分基盘的单个鳞片，在0.2％的升汞(Hgcl2)溶液中处理15分钟，3％的次氯酸钠溶液中处理10分钟，无菌水冲洗5次后，鳞片切块接种；
2)、诱导培养：在无菌条件下，将灭菌后的鳞片切块接种到下列诱导培养基中：
MS基本培养液
6-苄基氨基嘌呤(6-BA) 2.0mg/L
萘乙酸(NAA) 0.5mg/L
蔗糖 40000mg/L
琼脂 5500mg/L
pH 6.0
在温度为25±2℃，光照时间10h/d，光照强度3000Lx的环境条件下，培养20d，在切口处直接生成不定芽，或通过愈伤组织脱分化形成不定芽；
3)、脱毒茎尖的获得：以第2)步诱导产生的不定芽作材料，针对在百合种植、生产危害较大的病毒病，通过40℃气热培养10天后，在解剖镜下剥取获得0.2～0.5mm的脱毒茎尖；
4)、增殖培养：在无菌条件下，将第3)步获得的脱毒茎尖转入下列增殖培养基中：
MS基本培养液
6-苄基氨基嘌呤(6-BA) 2.0mg/L
萘乙酸(NAA) 0.5mg/L
蔗糖 40000mg/L
琼脂 6000mg/L
pH 6.0
在温度为26±2℃，光照时间12小时/天，光照强度1500Lx的条件下，培养25d，使茎尖生长为不定芽，由1个可平均增殖为5个；
5)、继代培养：将第4)步增殖所得到的不定芽在无菌条件下分切为单芽或2～3芽一丛，接入同样的增殖培养基中，在相同的培养环境下进行培养，可得到大量的无根不定芽，增殖苗的叶色浓绿，生长健壮，基部膨大成鳞茎形；
6)、瓶内直接生成脱毒小籽球：将继代形成的不定芽切去叶片，基部及鳞片切块，接入下列的生球培养基：
MS基本培养液
萘乙酸(NAA) 0.1mg/L
蔗糖 120000mg/L
琼脂 6000mg/L
活性炭 600mg/L
pH 6.0
在温度为20±2℃，黑暗条件下，培养70d，不定芽切块及周围直接生成小仔球，平均直径为0.96cm，平均围径2.58cm，平均可生成小籽球4个。
Claims (1)
1.一种东方百合脱毒小籽球的瓶内生成方法，其特征在于经过下列步骤：
1)、外植体的选择与灭菌：选择无病虫害、生长健壮、未检测到黄瓜花叶病毒CMV和百合隐症病毒LSV的百合种球，在3～6℃的低温、黑暗条件下贮藏6～8周后取出，边剥鳞片边用自来水冲洗，去除外部2～3层包裹不紧实的鳞片后，用浓度为0.1％的洗衣粉水浸泡2～5分钟后，用自来水清洗干净，在0.1～0.2％的Hgcl2升汞溶液中灭菌15～25分钟，然后在1～3％的次氯酸钠溶液中消毒10～15分钟，用无菌水洗3～5次；
2)、诱导培养：在无菌条件下，将灭菌后的鳞片切块接种到下列诱导培养基中培养，在温度为25±2℃，光照时间10～12h/d，光照强度2000～3000Lx的环境条件下，培养20～25d后，在切口处生成不定芽：
MS基本培养液
6-苄基氨基嘌呤6-BA 1.0～2.0mg/L
萘乙酸NAA 0.1～0.5mg/L
蔗糖 30000～40000mg/L
琼脂 5000～5500mg/L
pH 5.5～6.0
3)、获得脱毒茎尖：将上述诱导产生的不定芽在36～40℃条件下气热培养10～30天后，在解剖镜下剥取获得0.2～0.5mm的茎尖；
4)、增殖培养：在无菌条件下，将步骤3)获得的脱毒茎尖转入下列增殖培养基中：
MS基本培养液
6-苄基氨基嘌呤6-BA 1.0～2.0mg/L
萘乙酸NAA 0.2～0.5mg/L
蔗糖 30000～40000mg/L
琼脂 5000～6000mg/L
pH 5.5～6.0
在温度为26±2℃，光照时间10～12小时/天，光照强度1500～2000Lx的条件下，培养20～25d，使1个茎尖生长成多个不定芽；
5)、继代培养：将上述增殖的不定芽在无菌条件下分切为单芽或2～3个一丛，接入同样的增殖培养基中，在相同的培养环境下进行培养，得到大量的无根不定芽，增殖苗的叶色浓绿，生长健壮，基部膨大成鳞茎形；
6)、瓶内直接生成脱毒小籽球：将继代形成的不定芽切去叶片，基部及鳞片切块，接入下列生球培养基中：
MS基本培养液
萘乙酸NAA 0.05～0.1mg/L
蔗糖 80000～120000mg/L
琼脂 4500～6000mg/L
活性炭 500～600mg/L
pH 5.5～6.0
在温度为20±2℃，黑暗条件下，培养60～70d，不定芽切块及周围直接生成直径0.8～1.2cm，围径3.0～3.5cm的小籽球，每个切块生成小籽球2～4个。
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| 百合组培快速育苗试验. 王雅茹等.陕西农业科学，第3期. 1987 |
| 百合组培快速育苗试验. 王雅茹等.陕西农业科学，第3期. 1987 * |
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| CN1762205A (zh) | 2006-04-26 |
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