CN107446923B - rAAV8-CRISPR-SaCas9***及在制备乙肝治疗药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种gRNA序列，所述序列在CRISPR‑Cas9***中能够以乙肝病毒基因组特定位点为靶序列进行DNA序列的编辑，本发明还公开了含有该gRNA序列的CRISPR‑SaCas9***和包装了该***的重组腺相关病毒。所述***及包装病毒显示出在细胞内及转基因小鼠机体内强大的HBV清除能力，在连续两次高剂量注射后的第38天，实验组小鼠血清中HBsAg、HBeAg的含量相比对照组分别下降62.96±7.59％和65.18±3.08％；血清中HBV DNA的含量相比对照组下降92.82±3.67％；实验小鼠肝脏及其他脏器均未出现任何病理改变，而且也未检测到脱靶效应，显示出本发明提供的gRNA序列及相应的CRISPR‑SaCas9***在制备乙肝治疗药物中的应用前景。

Description

rAAV8-CRISPR-SaCas9***及在制备乙肝治疗药物中的应用
技术领域
本发明涉及一种gRNA序列及通过CRISPR-Cas9***对乙肝病毒进行基因编辑的技术，属于基因突变和基因工程技术领域。
背景技术
乙型肝炎(简称：乙肝)是一个严重的全球性公共卫生问题。自1982年以来，乙肝疫苗的应用已经在很大程度上预防了乙肝的传播，但乙型肝炎慢性感染者(乙肝表面抗原HBsAg阳性持续至少6个月)的人数仍居高不下，到2016年的全球HBsAg阳性人数达到2.4亿。据估计，全球每年有超过68.8万人死于慢性乙肝的并发症，包括肝癌和肝硬化。乙型肝炎是由乙肝病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染引起。HBV基因组是部分双链的闭合环状DNA病毒，通过RNA中间体进行复制。在进入细胞后，HBV DNA包含的核心颗粒就被释放进入细胞核，随后HBV双链被宿主细胞修复成为完整的双链结构并进一步形成共价闭合环状的DNA(cccDNA)。cccDNA在病毒聚合酶的辅助下，不断地在人体内产生病毒蛋白和新的病毒颗粒。目前公认的化学治疗方法包括干扰素-α(Interferon-α，IFN-α)和核苷类似物(Nucleosideanalogue，NAs)。核苷类似物通过抑制多功能逆转录酶来阻断病毒DNA的合成。口服核苷类似物可以有效降低病人体内HBV DNA的水平，但存在停药后病毒暴发的危险，因此病人需要长期服药，然而长期服用核苷类似物又会导致抗药性的产生。相比核苷类似物，干扰素-α具有用药周期短，不会产生抗药性的优点。干扰素-α能通过抑制病毒DNA复制和激活机体抗病毒免疫来达到治疗效果。但是在接受干扰素-α治疗的病人中只有不足10％产生持续的治疗作用。并且干扰素-α的副作用多(比如流感样症状、疲劳和血球计数低等)且具有严格的适应症，因此目前乙肝的治疗仍有诸多困难。
为了能实现持续抑制HBV的复制与表达，科研究人员致力于研究各种新型药物。目前正在研究阶段的新型治疗方法主要包括病毒抑制和宿主细胞抑制两种方式。病毒抑制的方式主要为通过药物靶向抑制病毒生命周期的各个时期，包括HBsAg抑制剂、病毒衣壳抑制剂、核糖核酸酶H抑制剂、DNA裂解酶和siRNA药物。而宿主细胞抑制则主要是利用免疫抑制剂类药物抑制宿主的免疫反应进而减轻病毒引发的炎症。然而要想治愈慢性乙肝，则必须彻底破坏或清除HBV的复制根源—HBV DNA，然而目前尚没有药物能够达到这一目的。近些年发展起来的基因编辑技术，有望成为根治乙型肝炎的最佳途径。从人工合成的锌指核酸酶(Zinc Finger Nucleases，ZFNs)到最新的第三代基因编辑技术成簇的规律间隔的短回文重复序列(Clustered RegΜLarly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR)-Cas9***，其发展速度快，能够实现对任意DNA序列的精确编辑。利用这些基因编辑工具，研究人员则可以直接靶向HBV DNA，正因如此，基因编辑技术也为从根本上治愈慢性乙肝提供了新的途径。
最早的基因编辑是利用外源的“好基因”替换内源的“坏基因”。同源重组途径是经典的基因编辑方法，但是这种方法效率低下，耗时较长且需要耗费大量人力筛选阳性克隆。近年来新出现的基因编辑平台为科学界提供了改造基因组的一个新范式，即可以对任何基因序列进行快速、高效、有针对性的***、剪切和修饰。目前比较常用的三种基因编辑技术有：ZFNs，转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription Activator-Like Effector(TALE)-Nucleases，TALENs)和最新的CRISPR-Cas9***。ZFNs和TALENs两个***的核酸酶分别依靠于锌指蛋白和类转录激活因子蛋白的特异性识别DNA序列，然后通过非特异性的Fok I内切酶切割DNA。然而，ZFNs和TALENs两种***的组装与筛选过程复杂，价格昂贵，并且TALENs本身会引起宿主免疫反应，因此并不是最为理想的基因编辑工具。2012年，Matthew等在II型CRISPR***中发现了一种双链RNA，并将这种双链RNA改造为一种能指导Cas9蛋白对几乎所有DNA序列进行剪切的工具，即一种全新的基因组编辑技术—CRISPR-Cas9技术，引发极大轰动。CRISPR-Cas9被认为是继ZFNs、TALENs之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。
CRISPR***存在于绝大多数能够抵抗噬菌体侵袭的细菌和真菌中。该***的结构主要由CRISPR相关的核酸内切酶(Cas)和向导RNA(gRNA)复合体两部分组成。其中gRNA复合体又由三部分：一段回文序列形成的发卡结构(为Cas蛋白的结合位点，由crRNA-tracrRNA改造而成)，一段长度约为12–20bp的可以与目标DNA结合的RNA单链序列(base-pairingregion)以及一段终止序列(terminator)组成。通过宿主核糖核酸酶III(RNase III)和CRISPR相关蛋白Csn1，tracrRNA与crRNAs形成复合物来保护化脓性链球菌不受前噬菌体DNA的侵袭。经研究证实，tracrRNA:crRNA复合物指导Cas9蛋白利用两个特殊的活性域(RuvC和HNH)来定向切割与crRNA互补的目标DNA双链。随后tracrRNA:crRNA复合物被开发成gRNA(5’末端带有20个碱基识别位点和一个序列为NGG的原间区毗邻序列PAM(protospacer adjacent motif)，3’端双链结构与Cas蛋白结合)，仅需要对gRNA进行简单的修改就可以指导CRISPR对含有PAM序列的任意靶DNA序列进行基因修饰，目前比较常用的是产生于酿脓链球菌的II型CRISPR-Cas9***。Cas9蛋白可以造成目标DNA双链断裂，激活错误率高的非同源重组途径(NHEJ)进行修复，进而形成***或缺失(indels)，造成断裂部位发生移码突变或翻译终止，最终影响目标基因的表达。目前，CRISPR-Cas9***已经成功应用在模式动物构建，体细胞基因组编辑，功能基因组筛选以及遗传病和传染病的治疗中。利用CRISPR-Cas9***，研究人员在人多能干细胞(hiPSC)、斑马鱼、视网膜变性小鼠等模型中成功进行了基因编辑。在HBV、HIV、HCV等病毒感染性疾病的治疗中，CRISPR-Cas9***也发挥了重要作用。低成本、易操作、高效快捷的优点使CRISPR-Cas9迅速地成为当下最热门的基因编辑技术，广泛应用于医药、生物等多个领域，被Nature杂志誉为过去十年对生物学研究影响最深的十大科学技术之一。
基因治疗是近年来逐渐发展起来的一种新型的治疗手段，通过对基因编辑工具的不断升级改造，基因治疗的研究也越来越深入。在过去的三年里，CRISPR-Cas9技术逐渐成为基因编辑工具里的佼佼者，被广泛应用到各种疾病的研究和治疗中，利用CRISPR-Cas9技术抑制HBV复制与表达的研究也成为了HBV基因治疗的热门。在目前已经公开发表的文章中所使用的HBV特异性靶点涵盖HBV基因组的各个区域(C、P、X和S)。无论是在细胞系还是高压水动力小鼠模型中都可以达到抑制HBV复制和表达的目的，根据靶点的不同，对HBV的抑制效率从77％到98％不等。
然而目前利用CRISPR-Cas9***高效抑制HBV复制和表达的研究仅限于细胞模型和高压水动力小鼠模型，涉及HBV转基因动物模型的研究并不能真正高效抑制HBV的复制。这主要是由于缺乏能够高效破坏HBV cccDNA及整合状态HBV DNA、抑制HBV复制与表达并且不存在脱靶效应的CRISPR-Cas9靶点，以及将带有特异识别序列的CRISPR-Cas9***高效导入HBV转基因动物体内完成基因定点清除的基因转运载体。
本发明的目的就是提供一种能够高效特异识别机体内处于整合状态HBV DNA的位点，并能够特异清除靶基因的gRNA序列以及含有所述gRNA序列并能被适宜的载体转入动物体内发挥基因编辑的CRISPR-Cas9***，并提供所述***能够用于制备HBV感染基因治疗药物的应用。
发明内容
基于上述发明目的，本发明首先提供了一种gRNA序列，所述序列在CRISPR-Cas9***中能够以乙肝病毒基因组特定位点为靶序列进行DNA序列的编辑，所述gRNA序列如SEQID NO:4、6、10、13、14、15、16或者20所示。
在一个优选的实施方案中，所述gRNA序列如SEQ ID NO:4或者20所示。
在一个更为优选的实施方案中，所述gRNA序列如SEQ ID NO:4所示。
其次，本发明还提供了一种含有上述的gRNA序列的CRISPR-SaCas9***，所述gRNA序列与能表达SaCas9蛋白的表达载体相连接。
在一个优选的实施方案中，所述载体为质粒为pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA；U6::BsaI-sgRNA(Plasmid#61591)。
第三，本发明提供了上述CRISPR-Cas9***在制备***药物中的应用。
在一个优选的实施方案中，所述CRISPR-SaCas9***被包装于重组腺相关病毒基因组中。
在一个更为优选的实施方案中，所述病毒为VIII型重组腺相关病毒。
在一个尤为优选的实施方案中，所述药物被制备为注射剂。
最后，本发明提供了一种将上述CRISPR-SaCas9***包装入VIII型重组腺相关病毒的方法，所述方法包括：
(1)上述的任一gRNA序列与表达载体相连；
(2)步骤(1)获得的表达载体与包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper共同转染至宿主细胞HEK293细胞中；
(3)裂解步骤(2)获得的宿主细胞，并收获位于裂解上清液中的获得包装的病毒。
本发明选取了26种不同基因型不同地区来源的HBV(A-G)，筛选出了含PAM基序“NNGRRT”的位点的21个靶点，并分别构建了21套相应的CRISPR-SaCas9***，并将这些载体与含有HBV基因组的表达载体共转入293T细胞中，所转入的CRISPR-SaCas9***能够将细胞上清中HBsAg、HBeAg的平均含量降低2/3以上，并且对细胞活性没有明显影响，T7EI酶切实验也证实了含有本发明CRISPR-SaCas9******对细胞内HBV DNA的剪切。
本发明提供的包装了上述CRISPR-SaCas9***的VIII型重组腺相关病毒，即，rAAV8::CRISPR-SaCas9***，能够高效抑制HBV转基因小鼠体内HBV的复制与表达，当将高剂量(2*1011v.g./只)的rAAV8::CRISPR-SaCas9经尾静脉注射入整合有HBV基因组的转基因小鼠体内后，在连续两次注射后的第38天，实验组小鼠血清中HBsAg、HBeAg的含量相比对照组分别下降62.96±7.59％和65.18±3.08％；血清中HBV DNA的含量相比对照组下降92.82±3.67％；通过对肝脏切片HBcAg免疫荧光结果的分析发现，全景扫描照片可以看出实验组HBcAg的荧光强度显著低于对照组，实验组肝组织中HBcAg的含量相比对照组下降76.88±18.39％；通过肝组织病理学检测，在对照组小鼠肝组织中观察到了明显的炎性浸润和肝细胞肿大，然而实验组小鼠肝组织中却未观察到相应的炎性病理改变。通过T7EI酶切以及深度测序，证实了rAAV8::CRISPR-SaCas9对HBV转基因小鼠肝脏中HBV基因组相应区域的剪切作用。此外，小鼠其他脏器的病理学检测均未出现任何病理改变，而且也未能检测到rAAV8::CRISPR-SaCas9的脱靶效应。
综上结果表明，本发明提供的gRNA序列显示出了极强的特异性靶向效应，相关的rAAV8::CRISPR-SaCas9***具有极强的体内HBV清除效应，显示出其在制备乙肝治疗药物中的应用前景。
附图说明
图1.适用于SaCas9的gRNA空间结构示意图；
图2.各靶点在HBV基因组的位置；
图3.SaCas9表达载体结构图谱；
图4.SaCas9表达载体连接示意图；
图5.共转染后测定293T细胞上清中HBsAg含量的检测结果；
图6.共转染后测定293T细胞上清中HBeAg含量的检测结果；
图7.293T细胞转染CRISPR-Cas9表达载体CCK8检测结果；
图8.共转染后连续三天测定293T细胞上清中HBeAg的含量；
图9.共转染72小时后测定HuH-7细胞上清中HBsAg和HBeAg的含量；
图10.HuH-7细胞转染72小时后T7E1酶切实验电泳结果；
图11.低剂量注射后HBV转基因小鼠血清中HBV标志物的检测结果；
图12.注射高剂量rAAV8病毒后HBV转基因小鼠血清中HBV DNA含量的变化情况；
图13.注射高剂量rAAV8病毒后转基因小鼠血清中HBsAg含量的变化情况；
图14.注射高剂量rAAV8病毒后转基因小鼠血清中HBeAg含量的变化情况；
图15.注射高剂量rAAV8病毒后转基因小鼠肝脏靶区域T7EI酶切结果；
图16.注射高剂量rAAV8病毒后转基因小鼠肝脏可能的脱靶区域T7EI酶切结果；
图17.Sa4靶区域深度测序Indel频率统计
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
实施例1带有不同靶点的CRISPR-SaCas9***的构建
1.CRISPR-SaCas9靶点选择
查找HBV序列中带有“NNGRRT”PAM原件的区域，并尽量远离GC含量丰富的区域，避免CpG甲基化对gRNA识别造成的可能影响。选择PAM原件前21-23bp为gRNA序列，第一个碱基为G的最佳(gRNA结构见图1)。在筛选到的gRNA序列前添加Bsa I酶切位点：3’端添加AAAC，5’端添加CCAC。
根据靶位点筛选原则，通过比对各基因型的HBV序列，并在保守区域内检索“NNGRRT”PAM基序，最终确定CRISPR-SaCas9靶位点。通过筛选，我们得到21个位于HBV基因组不同基因的靶位点，各位点序列信息见表1，各位点在HBV基因组上的位置见图2。
2.CRISPR-Cas9***表达载体构建
随后分别将这21个靶点构建至相应的CRISPR-SaCas9表达载体中。
(1)引物磷酸化和退火
在0.2mL的EP管中进行磷酸化反应体系：
反应条件：
2)px601质粒的酶切
pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA；U6::BsaI-sgRNA(Addgeneplasmid#61591)购自Addgene网站。详见https://www.addgene.org/61591/
反应体系：
反应条件:
温度 时间 循环数
37℃ 3h 1
(3)酶切质粒的回收纯化；
a.1％琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切条带，紫外灯下切取所需条带放入已经称重的1.5mL EP管中，再次称重，计算切下的凝胶质量。
b.向1.5mL EP管中加入Membrane Binding Solution，10μl/10mg。
c.将混合物置于65℃水浴，不断摇晃直至凝胶完全溶解。
d.10000rpm/min离心1min，使溶液聚集至管下部。
e.取SV离心柱放入收集管，将上一步聚集的液体转移至离心柱中，室温静置1min。14000rpm/min离心1min，过滤液体，弃掉废液。
f.向离心柱中加入700μl Membrane Wash Solution(95％无水乙醇预混)，14000rpm/min离心1min，弃掉废液；再次加入500μl Membrane Wash Solution，14000rpm/min离心1min，弃掉废液。
g.取离心柱放入干净的1.5mL EP管，室温静置5min，使乙醇充分挥发；向离心柱中加入50μl无RNA酶的水，室温静置3min。
h.14000rpm/min离心1min，-20℃保存。
(4)SaCas9-gRNA质粒构建(图3和图4)
反应体系：
反应条件：
温度 时间 循环数
室温(25℃) 10min 1
4℃ 保存 ～
3.大肠杆菌转化(热激法)
a.解冻：stbl3感受态细胞在-80℃保存(每只100μl)，取出后置于冰上融化。
b.转化：待感受态细胞刚刚融化，向其中加入全部20μl的连接产物，轻弹混匀，冰浴静置30min。
c.热激：42℃水浴90s，切勿摇动。热激结束后立刻置于冰上，静置2min。
d.复苏：加入500μl SOC培养液，混匀，置于37℃恒温摇床，以180rpm/min的转速摇菌1h。
e.取出摇好的菌液，4000rpm/min离心3min，使细菌沉底。用移液器吸弃500μl上清，轻轻吹打直至重新混匀。吸取混匀的菌液，均匀地涂布到LB固体培养基表面直至干燥。若转化的质粒带有抗性，则向固体培养基中加入对应抗生素；若为蓝白斑筛选，则配制培养基的时应向培养基中加入1‰的Amp，40μl X-Gal(20mg/mL)和4μl IPTG(20mg/mL)。将平板放置在37℃恒温培养箱培养16h。
f.鉴定：挑取单菌落进行菌落PCR并测序鉴定质粒是否构建成功，对成功构建的菌落进行扩增并于-80℃冰箱保存。
4.单克隆PCR鉴定
a.挑取合适大小的单菌落接到含有氨苄青霉素的5mL LB液体培养基中。
b.37℃恒温摇床，以180rpm/min的转速过夜培养8h。
c.以1μl菌液为模板做PCR，引物使用dSaCas9-F1和dSaCas9-R1。
反应体系：
反应条件：
d.琼脂糖凝胶电泳鉴定条带，选取长度为500bp的条带进行增菌。
5.质粒转染
a.准备：待细胞铺满70％-90％时进行转染，在显微镜下观察细胞状态，必要时可以更换新的细胞培养基。细胞分为三组：
b.预混：将Lipofectamine LTX、DNA和Plus分别装到两个装有Opti-MEM的洁净EP管中，轻轻吹打混合均匀。试剂及用量如下：
DNA和Lipofectamine LTX按照比例确定用量，DNA：LTX＝1：1.5。
c.孵育：将两管溶液混合，轻轻吹打混匀。室温静置20min，期间不要摇晃。
d.加药：将孵育好的溶液滴加到孔中，轻轻摇晃培养板，使液体均匀覆盖整个孔板。
e.显微镜下观察细胞状态，将细胞培养板重新放到37℃温箱培养2-3天后检测转染效果。若每天检测转染情况，则需要在每天同一时间更换培养基，注意不要将贴壁细胞吹起，以免影响结果。
表1 各gRNA的序列信息
实施例2.不同靶点的CRISPR-SaCas9***对细胞内HBV的抑制效率的观察
将实施例1获得的含有不同靶点的21套CRISPR-SaCas9***分别与HBV的表达载体pGL3-HBV1.2共转入293T细胞中，在转染后第3天收取细胞培养上清，用ELISA法检测细胞上清中的HBsAg以及HBeAg的含量。HBsAg的检测结果如图5所示，相比转染gRNA-empty的对照组，该21套CRISPR-Cas9***中的Sa-4、Sa-6、Sa-10、Sa-16以及Sa-20等5套***能够将细胞上清中HBsAg的平均含量降低2/3以上。
细胞上清中HBeAg含量的检测结果如图6所示，相比转染gRNA-empty的对照组，这21套CRISPR-SaCas9***中的Sa-4、Sa-6、Sa-10、Sa-13、Sa-14、Sa-15、Sa-16以及Sa-20等8套***能够将细胞上清中的HBeAg的含量降低2/3以上(图5和图6中，mock表示gRNA-empty；neg表示阴性对照)。
实施例3.CCK-8法性观察不同靶点的CRISPR-SaCas9***对细胞活性影响
为检测以上这8套CRISPR-SaCas9***对HBV的抑制是否为细胞活性受抑制所致，利用CCK-8法对细胞活性进行了检测。实验分为11组：分别转染不带靶点的CRISPR-SaCas9表达载体px601、在上一步实验中能够有效抑制细胞上清中HBsAg或HBeAg的8套CRISPR-SaCas9***、仅加入转染试剂LTX组以及不作处理组，每组设置三个平行孔。转染48小时后，在450nm波长下检测吸光度值，结果如图7所示。相比对照组，除Sa-6与Sa-20以外，其余靶点对细胞活性没有明显影响(p＞0.05)。
实施例4.不同靶点的CRISPR-SaCas9***抑制HBV复制效率的对照研究
将上述实验中筛选到的Sa4、Sa10、Sa14、Sa15、Sa16等5套CRISPR-SaCas9***与不带靶点的CRISPR-SaCas9表达载体px601(阳性对照组)分别与HBV表达载体pGL3-HBV1.2共转入293T细胞中，每组设置三个平行孔。连续四天收集细胞上清用ELISA法检测HBsAg和HBeAg的含量。结果如图8所示(图8中，blank：不做处理(阴性对照组))，与HBV共转染之后，细胞上清中的HBsAg和HBeAg的含量持续上升，两天后基本稳定。相比阳性对照组，各实验组细胞上清中HBsAg的含量与HBeAg含量的上升均受到一定程度的抑制，时间和分组之间无交互作用。在CRISPR-SaCas9***中，Sa4靶点对HBsAg与HBeAg的抑制效率最高(将HBsAg含量降低了76.4±2.53％；将HBeAg的含量降低了84.2±1.92％)。
实施例5.HuH-7细胞内检测Sa4对HBV的抑制效率
为进一步检测Sa4对HBV的抑制效率，在另一种来自肝组织的细胞系HuH-7中再次进行了实验。实验分为三组：pGL3-HBV1.2质粒与不带靶点的CRISPR-SaCas9表达载体px601(阳性对照组)共转，pGL3-HBV1.2质粒与带Sa4靶点的CRISPR-SaCas9表达载体共转(实验组)以及不做转染(阴性对照组)，每组设置三个平行孔。转染72小时后收集细胞上清，用ELISA法检测HBsAg和HBeAg的含量。检测结果如图9所示，图9中，Sa4：带靶点Sa4(实验组)；control：不带靶点(阳性对照组)；blank：不做处理(阴性对照组)。Sa4靶点可以同时抑制Huh-7细胞上清中HBsAg(46.4±4.25％)和HBeAg(86.7±1.22％)的表达。
实施例6.T7EI酶切检测CRISPR-SaCas9:Sa4***的剪切作用
为了验证带有Sa4靶点的CRISPR-SaCas9***对HBV DNA的剪切作用，分别以转染CRISPR-SaCas9转染后HuH-7细胞全基因组DNA(突变型)、pGL3-HBV1.2质粒(野生型)和HuH-7细胞基因组(阴性对照)为模板进行T7EI酶切实验，琼脂糖凝胶电泳结果显示：只有突变型酶切的结果出现两条大小不一的条带，与预计酶切位置(300bp和173bp)相符；而野生型和阴性对照在酶切后并没有产生相应条带。这说明带有Sa4靶点的CRISPR-SaCas9***确实在HuH-7细胞中发挥了有效的剪切作用，并使靶区域序列产生了突变。琼脂糖凝胶电泳结果见图10(图10中，1：突变型；2：野生型；Control：阴性对照；M：DL2000DNA分子量标记；红色标)。
实施例7.低剂量rAAV8:Sa4对转基因小鼠HBV清除效果的观察
1.HBV转基因小鼠模型的构建
SPF级HBV转基因小鼠(C57BL/6)雄性(购自北京维通达生物科技有限公司)，采用转基因领域的常规流程进行构建：
对pUC19-HBV(A)1.28mer质粒(购自北京维通达生物科技有限公司)进行测序验证，序列符合预期后，Sma I/Hind III双酶切线性化pUC19-HBV质粒，获得线性化包含HBV(A)1.28mer的DNA片段(4.2kb)，包含了HBV 4084bp全序列。切胶回收约4.2kb长度片段，按照显微注射用DNA的级别进行纯化。随后对C57BL/6F0代小鼠受精***原核进行DNA显微注射，注射后得到的受精卵移植到假孕母鼠输卵管中，在转基因小鼠出生两周后进行剪尾鉴定，目的片段长度1530bp。
2.AAV8病毒的包装
本次病毒包装采用AAV Helper-free System(由北京五加和分子医学研究所有限公司构建并完成包装)在HEK293细胞中进行。在AAV Helper-free System中，rep和cap基因从病毒载体中被转移到辅助质粒pAAV-RC中，AAV ITRs仍位于病毒载体中。在辅助质粒的帮助下，仅需两端的ITR就能将携带的外源片段包装进入腺相关病毒颗粒。同时，由于不再需要活的辅助病毒，AAV Helper-Free System可以提供一个更安全，更便利的替代逆转录病毒和腺病毒的基因传递***。该方法需要的SaCas9表达载体px601-CMV::SaCas9由本发明人改造并保存，包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper由北京五加和分子生物医学研究所改造并保存。
用LTX with PlusTMReagent体系将三质粒(SaCas9表达载体px601-CMV::SaCas9,包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper)共转染至HEK293细胞中，进行病毒包装过程。转染后的细胞在37℃、5％CO2条件下培养72小时后收毒。通过点杂交检测，得到本次包装的rAAV8病毒载体滴度约为1*1012v.g./mL。通过SDS-PAGE电泳检测rAAV8结构蛋白VP1、VP2和VP3，，包装的rAAV8:Sa4病毒结构完整，且与标准品含量基本一致。
3.低剂量CRISPR-SaCas9***对转基因小鼠HBV的清除
选取HBV转基因小鼠4-6周龄能够稳定表达HBsAg和HBeAg的雄性HBV转基因小鼠，随机分为实验组(rAAV8:Sa4)和对照组(rAAV8:empty)。
小鼠尾静脉注射rAAV8介导的CRISPR-SaCas9***，以低剂量(5*1010v.g/只)实验组小鼠尾静脉注射稀释后的rAAV8:Sa4病毒，完成注射后的第1、3、5、7、10、14、28天采集小鼠眼眶静脉血并分离血清：定量检测HBsAg和HBeAg含量；定量检测HBV DNA含量。检测结果如图11所示，对于低剂量注射的两组小鼠，时间和处理(病毒注射)两个因素对HBV DNA含量的变化均没有影响(p>0.05)，注射后第28天，实验组相比注射前升高了62.65±3.02％，对照组相比注射前升高了51.09±5.07％；注射后第28天，实验组和对照组小鼠血清中HBsAg和HBeAg的含量均高于注射前(p>0.05)。结果显示，低剂量病毒不能抑制HBV转基因小鼠体内HBV的复制和表达。
实施例8.高剂量rAAV8:Sa4对转基因小鼠HBV清除效果的观察
HBV转基因小鼠模型的构建及AAV8病毒的包装同实施例7。以高剂量(2*1011v.g/只，为低剂量的两倍)进行小鼠尾静脉注射rAAV8:Sa4。
注射后HBV DNA含量变化
第1次注射后3天(iv1-d3)，两组小鼠血清中HBV DNA含量较注射前均未发生显著变化(p>0.05)；相比iv1-d3，第2次注射后1天(iv2-d1)实验组小鼠血清中HBV DNA含量下降了68.83±5.08％、对照组小鼠血清中HBV DNA含量下降了48.48±8.93％；随后，实验组小鼠血清中HBVDNA含量先回升至注射前水平(p>0.05)然后持续下降，而对照组小鼠血清中HBV DNA则上升至注射前水平后维持稳定(p<0.05)；两组小鼠血清中HBV DNA含量在iv2-d14均有波动。
到第2次注射后38天(iv2-d38)，实验组小鼠血清中HBV DNA含量与注射前相比下降94.42±1.24％，相比对照组下降了92.82±3.67％；iv2-d38对照组小鼠血清中HBV DNA含量与注射前相比没有差别(p>0.05)；iv2-d7之后的各个时间节点，两组之间的差异均有意义(p<0.01)，且随时间变化两组之间的差异不断增大。
实验结果说明，高剂量的rAAV8:Sa4可以高效抑制HBV转基因小鼠体内HBV DNA的复制，而rAAV8:empty对小鼠血清中HBV DNA含量没有影响。注射高剂量病毒后小鼠血清中HBV DNA含量的检测结果见图12。
注射后小鼠血清HBsAg变化
两组小鼠血清中HBsAg的含量在iv2-d14之前的变化趋势基本一致，且实验组小鼠血清中HBsAg的平均含量在iv2-d14之前始终高于对照组。同时两组小鼠血清中HBsAg含量之间的差异随时间变化逐渐增大，iv2-d18之后的各时间节点两组小鼠血清中HBsAg含量的差异均有意义(p<0.01)。
实验组小鼠血清中的HBsAg含量从iv2-d3后便一直持续下降，到iv2-d14后降至比注射前更低的水平(p<0.05)；在iv2-d38，实验组小鼠血清中HBsAg的含量比注射前下降了52.22±9.79％，比对照组下降了62.96±7.59％。而对照组小鼠血清中HBsAg的含量从iv2-d14后持续上升，从此一直高于实验组(p<0.01)。
实验结果说明，高剂量的rAAV8:Sa4可以高效抑制HBV转基因小鼠体内HBsAg的表达，rAAV8:empty则不能抑制小鼠体内HBsAg的表达。两组小鼠血清中HBsAg含量的检测结果见图13。
注射后小鼠血清HBeAg的变化
对照组小鼠血清中HBeAg的含量总体呈先上升后稳定趋势，但在2次注射后第3天(iv2-d3)和2次注射后第14天(iv2-d14)分别不同程度的下降。iv1-d3实验组小鼠血清中HBeAg的含量比注射前有所上升(p<0.05)，随后持续下降；到iv2-d38，实验组小鼠血清中HBeAg的含量较注射前下降63.09±3.26％，相比对照组下降65.18±3.08％。iv2-d7之后每个时间节点两组之间均有显著差异(p<0.01)，并且两组之间的含量差别随时间不断增大。
实验结果说明，高剂量的rAAV8:Sa4可以高效抑制HBV转基因小鼠血清中HBeAg的表达，rAAV8:empty对小鼠血清中HBeAg的含量没有抑制作用。小鼠血清中HBeAg的含量随时间变化见图14。
为了进一步探究注射后小鼠肝组织中HBc抗原的含量变化，我们分别在实验组及对照组中随机选取了3只小鼠进行解剖，并对其肝组织中HBcAg的含量进行了免疫荧光检测。我们以带有FITC绿色荧光标记的抗体对HBcAg进行标记，用蓝色DAPI对细胞核进行染色。随后利用荧光显微镜在相同的曝光时间下对两组小鼠肝组织中的HBcAg进行检测。全景扫描照片显示，对照组小鼠肝组织整体被激发出了大量的绿色荧光，明显高于实验组小鼠肝组织中的绿色荧光强度。分析结果显示，实验组小鼠肝组织中HBcAg的含量相比对照组下降了76.88±18.39％。这说明高剂量rAAV8:Sa4在抑制了小鼠血清中HBV病毒标志物的同时还高效抑制了小鼠肝脏细胞内HBcAg的表达，而rAAV8:empty则没有抑制小鼠肝组织中的HBcAg含量。随后我们分别在实验组和对照组的3只小鼠肝组织免疫荧光的全景照片中随机选取3个放大后的视野，结果同样显示，对照组的9个视野中肝细胞内均可见到大量的HBcAg，然而实验组的9个视野中则仅可见极少量的HBcAg。以上结果表明，rAAV8:Sa4能够高效降低HBV转基因小鼠肝组织中的HBcAg含量。
实施例9.T7EI酶切验证rAAV8:Sa4***的剪切作用
实验组小鼠肝脏DNA为模板进行PCR扩增后用T7EI酶切实验检测靶区域突变，实验组的3只小鼠均可以检测到T7EI的酶切条带，而对照组在相应位置未检测到明显条带，说明rAAV8:Sa4***在小鼠体内HBV DNA的靶区域造成突变。实验结果见图15，图15中，DNAMarker：DL2000；empty：对照组；3763、3771、3930：实验组。
实施例10.脱靶位点的检测
利用CRISPR脱靶位点在线预测网站CRISPR Design(http://crispr.mit.edu/)，在小鼠参考基因组mm9中检索匹配度较高的位点，选取3’末端为NNGRR或NNGRRT的5个位点作为脱靶位点，根据脱靶位点，利用Primer Primer 5软件进行引物设计，使产物长度为500bp便与进行下一步突变的检测
T7EI酶切检测脱靶位点突变情况
利用T7EI酶切实验检测可能的脱靶位点的突变，结果在各区域均没有检测到突变，T7EI酶切检测突变的结果见图16。图16中，D-off：T7EI酶消化后的产物；off：PCR原液。
实施例11.靶区域深度测序
分别扩增实验组和对照组小鼠肝脏中HBV的Sa4区域，并将PCR产物纯化后进行建库测序(Miseq)，平均测序深度7000×。对测得的原始数据进行质控、去除接头污染和低质量reads后用BWA软件与参考序列进行比对，得出相应的Indel和SNP，随后用IGV软件进行可视化分析。通过分析，发现在实验组(AAV8:Sa4)小鼠Sa4靶区域不同长度的Indel，长度从1-48bp不等，Indel频率为5.37％；对照组(AAV8:empty)在相同区域的Indel频率仅为0.43％(结果见图17)。
序 列 表
<110> 中国人民解放军疾病预防控制所
<120> rAAV8-CRISPR-SaCas9***及在制备乙肝治疗药物中的应用
<160> 21
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<400> 1
ggctgcgagc aaaacaagca act 23
<210> 2
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<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<400> 2
gacgtaaaca aaggacgtcc cgcg 24
<210> 3
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<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<400> 3
aattctttga catactttcc aatc 24
<210> 4
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<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
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ggcacagctt ggaggcttga aca 23
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<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<400> 5
aagaagtcag aaggcaaaaa c 21
<210> 6
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<212> DNA
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<400> 6
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<213> Hepatitis B virus
<400> 7
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<210> 8
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<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<400> 8
gtcaacaaga aaaaccccgc c 21
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<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<400> 9
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<210> 10
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<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<400> 10
cggcagacgg agaaggggac ga 22
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<213> Hepatitis B virus
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<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<400> 21
aaaccccgcc tgtaacacga gc 22

Claims (10)

1.一种gRNA分子，所述gRNA分子在CRISPR-Cas9***中能够以乙肝病毒基因组特定位点为靶序列进行DNA序列的编辑，其特征在于，所述gRNA分子的序列如SEQ ID NO:4、6、10、13、14、15、16或者20所示。
2.根据权利要求1所述的gRNA分子，其特征在于，所述gRNA分子的序列如SEQ ID NO:4或者20所示。
3.根据权利要求1所述的gRNA分子，其特征在于，所述gRNA分子的序列如SEQ ID NO:4所示。
4.一种含有权利要求1-3任一所述的gRNA分子的CRISPR-SaCas9***，其特征在于，所述gRNA分子与能表达SaCas9蛋白的表达载体相连接。
5.根据权利要求4所述的CRISPR-SaCas9***，其特征在于，所述载体为质粒pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA；U6::BsaI-sgRNA。
6.根据权利要求5所述CRISPR-Cas9***在制备***药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述CRISPR-SaCas9***被包装于重组腺相关病毒基因组中。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述病毒为VIII型重组腺相关病毒。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物被制备为注射剂。
10.一种将权利要求5所述CRISPR-SaCas9***包装入VIII型重组腺相关病毒的方法，所述方法包括：
(1)权利要求1-3任一所述的gRNA分子与表达载体相连；
(2)步骤(1)获得的表达载体与包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper共同转染至宿主细胞HEK293细胞中；
(3)裂解步骤(2)获得的宿主细胞，并收获位于裂解上清液中的获得包装的病毒。
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