CN107446820B - 基于微流控芯片的单细胞采样与原位检测质谱接口装置 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于微流控芯片的单细胞采样与原位检测质谱接口装置，其特征在于：该装置包括微流控芯片、单细胞液体喷墨打印装置和检测装置；细胞样品培养在培养皿内，设置在固定架上的所述微流控芯片位于所述培养皿上方；所述细胞样品经所述微流控芯片进入所述单细胞液体喷墨打印装置，由所述单细胞液体喷墨打印装置形成含有单个细胞的液滴落入所述检测装置，进而获取单个细胞的全组分信息。本发明的检测装置集微流控芯片、单细胞液滴形成、单细胞液体离子化及检测于一体，可以对任意单细胞进行采集，溶剂更换，液滴形成及在线的质谱检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种细胞研究技术领域，特别是关于一种基于微流控芯片的单细胞提取与原位质谱检测接口装置。
背景技术
细胞作为组成大部分生物体的结构和功能单元，细胞研究一直备受关注。这些研究对人体药物代谢，生物体行为，信号传递等具有重大意义。传统的细胞研究方法都是基于大量的细胞，不管是对细胞形态学还是代谢组学的研究都是大量细胞的平均水平。这些研究方法无法用于细胞差异性的研究。近年来，科学工作者对单细胞的研究越来越重视，单细胞研究的作用也越来越大。不仅涉及到药物代谢，新药开发，还能很好的解释细胞分子机制，细胞通路等问题。因而，开发单细胞的原位提取与检测技术至关重要。
用于细胞分析的仪器手段有很多种，包括光学成像，荧光分析，电泳分析，色谱及质谱分析等。其中质谱是最受关注的检测手段，因为它能够获得更多的细胞信息，物质水平等。单细胞质谱技术已经发展了很多年，可以检测细胞内的部分物质。但是无法对细胞膜，细胞表面蛋白，细胞核等进行分析。已经开发的几种单细胞技术都是要对细胞进行多步处理，在这个过程中细胞的物质含量，活性及物质水平已经发生了巨大的变化。因为，如何建立一种原位的细胞提取与检测技术就显得尤为重要。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种基于微流控芯片的单细胞采样与原位检测质谱接口装置，其能最大程度保持细胞的原始状态，提取速度快。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：一种基于微流控芯片的单细胞采样与原位检测质谱接口装置，其特征在于：该装置包括微流控芯片、单细胞液体喷墨打印装置和检测装置；细胞样品培养在培养皿内，设置在固定架上的所述微流控芯片位于所述培养皿上方；所述细胞样品经所述微流控芯片进入所述单细胞液体喷墨打印装置，由所述单细胞液体喷墨打印装置形成含有单个细胞的液滴落入所述检测装置，进而获取单个细胞的全组分信息。
进一步，位于所述培养皿下方设置有显微镜。
进一步，所述微流控芯片包括芯片基底和设置在所述芯片基底上的第一微通道、第二微通道、连接通道和第三微通道，以及第一连接管、第二连接管、第三连接管和第四连接管；所述第一微通道第一端与所述第一连接管一端连接，所述第一连接管另一端穿过所述芯片基底与现有溶液注射泵连接，驱动溶液经所述第一连接管进入所述第一微通道；所述第二微通道的第一端与所述第二连接管一端连接，所述第二连接管另一端与现有溶液回收装置连接实现溶液回抽；所述第一微通道的第二端与所述第二微通道的第二端平行设置，且所述第一微通道的第二端与所述第二微通道的第二端均为尖端结构；所述第一微通道的第二端与所述第二微通道的第二端均与所述培养皿接触以获取细胞；所述第三微通道位于所述第二微通道第一端下方，且所述第二微通道第一端中部通过所述连接通道与所述第三微通道中部连接，所述第三微通道一端与所述第三连接管连接，由所述连接管补给有机溶剂至所述第三微通道内；所述第三微通道另一端经所述第四连接管与所述单细胞液体喷墨打印装置连接。
进一步，所述芯片基底采用T型结构，所述第一微通道的第二端与所述第二微通道的第二端沿所述芯片基底的T型结构垂直伸出端平行设置。
进一步，所述第四连接管采用聚四氟乙烯管。
进一步，所述第四连接管上方设置有摄像机。
进一步，所述单细胞液体喷墨打印装置包括具有腔室的微通道、压电陶瓷片、连接导电线、电源及计算机控制模块和开关；所述具有腔室的微通道进口端与所述微流控芯片连接，出口端位于所述检测装置上方；所述具有腔室的微通道一侧设置有所述压电陶瓷片，所述压电陶瓷片经所述连接导电线与所述开关一端连接；所述开关另一端连接至所述电源及计算机控制模块，由所述电源及计算机控制模块控制所述具有腔室的微通道工作状态。
进一步，所述检测装置包括钨丝、高压电源和质谱仪；所述钨丝一端与所述高压电源连接，所述钨丝另一端为尖端，该尖端与所述单细胞液体喷墨打印装置出口端呈纵向对应设置，与所述钨丝尖端横向对应设置有所述质谱仪，含有单个细胞的液滴在所述钨丝尖端形成喷雾后进入所述质谱仪。
进一步，所述微流控芯片采用标准的光刻方法进行制作，具体制作步骤如下：1)将硅片放于浓硫酸与双氧水的重量比为3:1的混合溶液中加热，微沸30分钟；2)将硅片洗干净并烘干，在匀胶机上对硅片进行旋涂，控制所需要的微通道的高度；3)将旋涂好的硅片放入烘箱中进行前烘处理，保温温度为65℃，时间为30分钟；4)使用曝光机将光刻掩膜对该硅片进行紫外曝光，再将硅片放入烘箱中进行后烘，保温温度为65℃，时间为15分钟左右；5)对硅片进行显影和硅烷化处理，得到所需要的模具，将模具放入烘箱中，蒸发掉多余的显影剂和硅烷化试剂；6)将聚二甲基硅氧烷和引发剂以10:1的重量比混合，导入到模具上，脱气后，放入烘箱中烘干4-6个小时，得到具有微流控芯片通道的固体状PDMS模块；7)将PDMS模块从硅片中脱离，用打孔器进行打孔，再与玻璃片进行等离子体键合后得到微流控芯片。
本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：1、本发明的单细胞取样及原位质谱检测接口装置集微流控芯片、单细胞提取、细胞载液更换，单细胞液滴形成以及检测于一体，可以对培养皿中培养的贴壁细胞或者组织切片上的细胞进行定点提取，并实现原位质谱检测，实现对单细胞的原位全组分分析。2、本发明的微流控芯片能够对单细胞进行逐个取样，而且提取的活细胞最大程度的保持着原始的状态。3、本发明的细胞提取速度快，可以在5秒钟以内完成单个细胞的取样。4、本发明通过连接通道将细胞的溶剂从培养基更换成有机溶剂，大大提高了离子化效率，从而灵敏度大大提高。5、本发明可以利用喷墨打印技术，将单细胞包裹在有机溶剂液滴里然后再高压钨丝尖端离子化，进而被质谱检测器检测。
附图说明
图1为本发明的整体结构示意图；
图2为本发明的微流控芯片结构示意图；
图3为本发明的细胞观察及单细胞液滴形成装置示意图；
图4为本发明的喷雾用尖端与检测器的部分结构示意图。
具体实施方式
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“前”、“后”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。下面结合附图和实施例对本发明进行详细的描述。
如图1所示，本发明提供一种基于微流控芯片的单细胞采样与原位检测质谱接口装置，其包括微流控芯片1、单细胞液体喷墨打印装置2和检测装置3。细胞样品培养在培养皿4内，设置在固定架(图中未示出)上的微流控芯片1位于培养皿4上方。细胞样品经微流控芯片1进入单细胞液体喷墨打印装置2，由单细胞液体喷墨打印装置2形成含有单个细胞的液滴26落入检测装置3，从而获取单个细胞的全组分信息。
上述实施例中，位于培养皿4下方设置有显微镜5，培养在培养皿4内的细胞6可以由显微镜5观察。
在一个优选的实施例中，如图1、图2所示，微流控芯片1包括芯片基底7和设置在芯片基底7上的第一微通道8、第二微通道10、连接通道13和第三微通道12，以及第一连接管9、第二连接管11、第三连接管14和第四连接管15。芯片基底7采用近似T型结构，第一微通道8第一端与第一连接管9一端连接，第一连接管9另一端穿过芯片基底7与现有溶液注射泵连接，驱动溶液经第一连接管9进入第一微通道8。第二微通道10的第一端与第二连接管11一端连接，第二连接管11另一端与现有溶液回收装置连接，经第二连接管11实现溶液回抽。第一微通道8的第二端与第二微通道10的第二端沿芯片基底7的T型结构垂直伸出端平行设置，且第一微通道8的第二端与第二微通道10的第二端均为尖端结构；第一微通道8的第二端与第二微通道10的第二端均与培养皿4接触，以便获取培养皿4内的细胞6。第三微通道12位于第二微通道10第一端下方，且第二微通道10第一端中部通过连接通道13与第三微通道12中部连接，当提取的单细胞达到连接通道13时，会进入下游的载有有机溶剂的第三微通道12，从而更换细胞的溶液环境，便于后续检测。第三微通道12一端与第三连接管14连接，由第三连接管14补给有机溶剂至第三微通道12内以作为单细胞的溶液环境；第三微通道12另一端与第四连接管15一端连接，第四连接管15另一端与单细胞液体喷墨打印装置2连接。
使用时，溶液经注射泵从第一连接管9持续注入，经过第一微通道8从第一微通道8第二端的尖端结构16流出，同时溶液经第二微通道10从第二连接管11回抽。在这种情况下，就可以在微流控芯片的尖端结构形成稳定的开放流体区域，将这个区域靠近细胞就能够实现活细胞的提取。在第二微通道10的第二端溶液被持续抽回到微流控芯片，同时从第一微通道8流出的液体及表面单细胞也会被抽回第二微通道10。培养在培养皿4的细胞6可以由显微镜5观察，从而可以确认尖端结构16对准了单个细胞。从第一连接管9载入的溶液为胰蛋白酶溶液，该溶液持续作用于培养皿4中的细胞6，经过极短的时间，细胞6被采集进入第二微通道10，然后经过连接通道13进入第三微通道12，进而经第四连接管15进入单细胞液体喷墨打印装置2。
上述实施例中，第四连接管15采用聚四氟乙烯管。在第四连接管15上方还设置有摄像机22，单细胞达到连接管13时可以由摄像机22观察到并记录。
在一个优选的实施例中，如图1、图3所示，单细胞液体喷墨打印装置2包括具有腔室的微通道17、压电陶瓷片18、连接导电线19、电源及计算机控制模块21和开关20；其中，计算机控制模块为已有成熟通用设备，在此不再赘述其结构及工作原理。具有腔室的微通道17进口端与第四连接管15连接，出口端位于检测装置3上方。具有腔室的微通道17一侧设置有压电陶瓷片18，压电陶瓷片18经连接导电线19与开关20一端连接；开关20另一端连接至电源及计算机控制模块21，由电源及计算机控制模块21控制具有腔室的微通道17工作状态。
使用时，单细胞达到第四连接管15时可以被摄像机22观察到并记录，然后再有机溶剂氛围的单细胞进入单细胞液体喷墨打印装置2，含有单个细胞的液滴从具有腔室的微通道17出口端喷出。
在一个优选的实施例中，如图1、图4所示，检测装置3包括钨丝23、高压电源24和质谱仪25，钨丝23作为辅助离子化用。钨丝23一端与高压电源24连接，钨丝23另一端为尖端，该尖端与单细胞液体喷墨打印装置2中具有腔室的微通道17出口端呈纵向对应设置，以保证单细胞液体喷墨打印装置2喷出的含有单个细胞的液滴26落到钨丝23的尖端。与钨丝23尖端横向对应设置有质谱仪25，含有单个细胞的液滴26在钨丝23尖端形成喷雾后进入质谱仪25，进而被检测，实现对单个细胞的原位全组分分析。
上述各实施例中，本发明的微流控芯片1采用标准的光刻方法进行制作，具体制作步骤如下：
1)将硅片放于浓硫酸与双氧水的重量比为3:1的混合溶液中加热，微沸大约30分钟。
2)将硅片洗干净并烘干，在匀胶机上对硅片进行旋涂，控制所需要的微通道的高度。
3)将旋涂好的硅片放入烘箱中进行前烘处理，保温温度为65℃，时间为30分钟。
4)使用曝光机将光刻掩膜对该硅片进行紫外曝光，再将硅片放入烘箱中进行后烘，保温温度为65℃，时间为15分钟左右，以使所需要的微通道被进一步加固。
5)经过上述处理过程之后，对硅片进行显影和硅烷化处理，即可得到了所需要的模具。将模具放入烘箱中，蒸发掉多余的显影剂和硅烷化试剂。
6)将聚二甲基硅氧烷(PDMS)和引发剂以10:1的重量比混合，导入到模具上，脱气后，放入烘箱中烘干4-6个小时，得到具有微流控芯片通道的固体状PDMS模块。
7)将此PDMS模块从硅片中脱离，用打孔器进行打孔，再与玻璃片进行等离子体键合后就得到本发明中所使用的微流控芯片。
上述各实施例仅用于说明本发明，各部件的结构、尺寸、设置位置及形状都是可以有所变化的，在本发明技术方案的基础上，凡根据本发明原理对个别部件进行的改进和等同变换，均不应排除在本发明的保护范围之外。
Claims (8)
1.一种基于微流控芯片的单细胞采样与原位检测质谱接口装置，其特征在于：该装置包括微流控芯片、单细胞液体喷墨打印装置和检测装置；细胞样品培养在培养皿内，设置在固定架上的所述微流控芯片位于所述培养皿上方；所述细胞样品经所述微流控芯片进入所述单细胞液体喷墨打印装置，由所述单细胞液体喷墨打印装置形成含有单个细胞的液滴落入所述检测装置，进而获取单个细胞的全组分信息；
所述微流控芯片包括芯片基底和设置在所述芯片基底上的第一微通道、第二微通道、连接通道和第三微通道，以及第一连接管、第二连接管、第三连接管和第四连接管；所述第一微通道第一端与所述第一连接管一端连接，所述第一连接管另一端穿过所述芯片基底与现有溶液注射泵连接，驱动溶液经所述第一连接管进入所述第一微通道；所述第二微通道的第一端与所述第二连接管一端连接，所述第二连接管另一端与现有溶液回收装置连接实现溶液回抽；所述第一微通道的第二端与所述第二微通道的第二端平行设置，且所述第一微通道的第二端与所述第二微通道的第二端均为尖端结构；所述第一微通道的第二端与所述第二微通道的第二端均与所述培养皿接触以获取细胞；所述第三微通道位于所述第二微通道第一端下方，且所述第二微通道第一端中部通过所述连接通道与所述第三微通道中部连接，所述第三微通道一端与所述第三连接管连接，由所述连接管补给有机溶剂至所述第三微通道内；所述第三微通道另一端经所述第四连接管与所述单细胞液体喷墨打印装置连接。
2.如权利要求1所述的装置，其特征在于：位于所述培养皿下方设置有显微镜。
3.如权利要求1所述的装置，其特征在于：所述芯片基底采用T型结构，所述第一微通道的第二端与所述第二微通道的第二端沿所述芯片基底的T型结构垂直伸出端平行设置。
4.如权利要求1或3所述的装置，其特征在于：所述第四连接管采用聚四氟乙烯管。
5.如权利要求1或3所述的装置，其特征在于：所述第四连接管上方设置有摄像机。
6.如权利要求1所述的装置，其特征在于：所述单细胞液体喷墨打印装置包括具有腔室的微通道、压电陶瓷片、连接导电线、电源及计算机控制模块和开关；所述具有腔室的微通道进口端与所述微流控芯片连接，出口端位于所述检测装置上方；所述具有腔室的微通道一侧设置有所述压电陶瓷片，所述压电陶瓷片经所述连接导电线与所述开关一端连接；所述开关另一端连接至所述电源及计算机控制模块，由所述电源及计算机控制模块控制所述具有腔室的微通道工作状态。
7.如权利要求1所述的装置，其特征在于：所述检测装置包括钨丝、高压电源和质谱仪；所述钨丝一端与所述高压电源连接，所述钨丝另一端为尖端，该尖端与所述单细胞液体喷墨打印装置出口端呈纵向对应设置，与所述钨丝尖端横向对应设置有所述质谱仪，含有单个细胞的液滴在所述钨丝尖端形成喷雾后进入所述质谱仪。
8.如权利要求1所述的装置，其特征在于：所述微流控芯片采用标准的光刻方法进行制作，具体制作步骤如下：
1)将硅片放于浓硫酸与双氧水的重量比为3:1的混合溶液中加热，微沸30分钟；
2)将硅片洗干净并烘干，在匀胶机上对硅片进行旋涂，控制所需要的微通道的高度；
3)将旋涂好的硅片放入烘箱中进行前烘处理，保温温度为65℃，时间为30分钟；
4)使用曝光机将光刻掩膜对该硅片进行紫外曝光，再将硅片放入烘箱中进行后烘，保温温度为65℃，时间为15分钟左右；
5)对硅片进行显影和硅烷化处理，得到所需要的模具，将模具放入烘箱中，蒸发掉多余的显影剂和硅烷化试剂；
6)将聚二甲基硅氧烷和引发剂以10:1的重量比混合，导入到模具上，脱气后，放入烘箱中烘干4-6个小时，得到具有微流控芯片通道的固体状PDMS模块；
7)将PDMS模块从硅片中脱离，用打孔器进行打孔，再与玻璃片进行等离子体键合后得到微流控芯片。
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