CN116121031B - 用于单细胞筛选的多级化微流控芯片及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微流控芯片领域，公开了用于单细胞筛选的多级化微流控芯片及其制备方法，该微流控芯片包括PDMS结构层和与之键合的配套电极，PDMS结构层内设置有用于进行细胞捕获和分选的微通道结构，微通道结构包括依次连通的多级分选单元，分选单元均包括分选腔，分选腔包括分散区、捕获区和出样区。本发明设计了微陷阱阵列用于细胞/微粒捕获，捕获区的挡板结构可以大大提高样品利用率，配套的电极阵列用于负向介电泳力释放，多出口、多流路的芯片通道结构可以实现样品逐级富集、纯化、目标样品收集及回收。
Description
技术领域
本发明涉及微流控芯片领域，具体涉及用于单细胞筛选的多级化微流控芯片及其制备方法。
背景技术
细胞分选是把一种细胞从多细胞样品中分离出来的过程，常见的细胞分选方法包括抗体标记分离、免疫密度离心分离、免疫磁珠分离和流式细胞分离技术。其中，流式细胞分离技术因其具有通量高、设备成熟等特点，在领域内被广泛应用。但是流式细胞分离技术在使用时仍存在如下缺点：其需要昂贵的仪器装置及复杂的操作流程。
微流控芯片技术(Microfluidics)是把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，可自动完成分析全过程。微流控芯片具有液体流动可控、消耗试样和试剂极少、分析速度呈十倍上百倍地提高等特点，在生物、化学、医学等领域的巨大潜力，已经发展成为一个生物、化学、医学、流体、电子、材料、机械等学科交叉的崭新研究领域。目前，微流控技术已经应用到细胞分选中，微流控领域的细胞分选方法集中在群细胞分选，而单细胞水平的监测、操控和分析平台对生物医学领域的发展至关重要，其包括细胞识别、分类、分离、培养、配对以及细胞间相互作用等；单细胞捕获和释放是单细胞水平研究的前提和重要组成部分，但是目前现有技术中尚无成熟的单细胞捕获及可寻址释放技术。传统的流体力及介电泳力操控细胞/微粒技术一般仅可实现初步的群细胞低精度分离，而不能在大量样本中准确挑选出少量目标细胞或微粒。
发明内容
本发明意在提供用于单细胞筛选的多级化微流控芯片及其制备方法，以解决现有技术中无法在低成本的微流控芯片上进行细胞/微粒捕获及少量目标可控释放与收集的问题。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：用于单细胞筛选的多级化微流控芯片，包括PDMS结构层和与之键合的配套电极，PDMS结构层内设置有用于进行细胞捕获和分选的微通道结构，微通道结构包括依次连通的多级分选单元，分选单元均包括分选腔，分选腔包括分散区、捕获区和出样区。
另一方面，本技术方案还提供用于单细胞筛选的多级化微流控芯片的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、绘制微通道结构；
步骤二、设计电极阵列；
步骤三、利用软光刻工艺制备给予PDMS的微通道结构；
步骤四、采用溅射-光刻法制备金电极；
步骤五、将电极阵列与微通道结构进行表面等离子处理并键合封装。
本方案的原理及优点是：实际应用时，本技术方案中，针对现有技术中难以进行细胞/微粒捕获及少量目标物可控精准释放的技术问题，对微流控芯片的结构进行了改进和升级，旨在实现单细胞分选。首先，通过设置多级捕获和分选单元，通过微陷阱阵列实现细胞/微粒的捕获，而后通过配套电极的加电实现不同分选单元内捕获的细胞/微粒的精准筛选，细胞/微粒在上一级分选单元分选后，会进入下一级分选单元进行再次的捕获和分选，通过多级、多通道的结构设计，可以实现样品的逐级富集、纯化和目标样品筛选收集的过程。通过实验验证，采用本方案的芯片可以实现可视化、可寻址式单细胞/微粒精准释放，并且能够极大的提高捕获率(即样品利用率)，15微米颗粒的捕获率可达到90％以上。且本方案的多级分选可以在同一微流控芯片上实现从大量样本中分拣筛选出其中的目标细胞/微粒，具有成本低、便于操作、样本捕获率高、利用率高的优势。
优选的，作为一种改进，分散区内设置有若干分流微柱，若干分流微柱交错设置。
本技术方案中，分散区用于样品的分散，通过交错设置的分流微柱，可以对样品进入后的流向进行分散干预，使得样品被均匀的分散至各个样品通道内，提高捕获、分选的效率。
优选的，作为一种改进，捕获区内设置有若干样品通道，样品通道内均阵列设置有若干捕获腔室，且样品通道靠近出样区的一端均设置有挡板。
本技术方案中，样品通道为样品捕获/分选的流道，通过阵列、条带设置的捕获腔室，能够实现高通量的样品捕获、纯化。在研发初期，还是存在利用流体动力和微柱结构捕获单微粒/细胞的捕获率较低的问题，通过在样品通道内设置挡板，可以改变通道流阻，从而实现微粒/细胞高效捕获。
优选的，作为一种改进，出样区与样品通道连通，出样区连通有出样通道，出样通道内均固定有倾斜设置的截留板。
本技术方案中，截留板起到截留的作用，减缓出样。
优选的，作为一种改进，配套电极为金属电极阵列结构，且配套电极包括与多级分选单元分别对应的多级电极阵列单元。
本技术方案中，通过将配套电极设置为与多级分选单元分别对应的阵列电极结构，能够实现不同分选区(不同级别分选区)的精准加电控制分选，进而实现可视化的单细胞/微粒的精准释放。
优选的，作为一种改进，步骤三中，利用软光刻工艺制备微通道结构的具体造作为：在硅片上旋涂20μm-200μm的光刻胶，用热板软烘后曝光处理，随后放入显影液中显影，再用热板硬烘，制作出通道模板，用PDMS脱模，得到微通道结构层。
本技术方案中，采用软光刻技术进行微通道结构的构建，技术成熟且制备而成的微通道结构能够满足本技术方案的细胞分选、富集需求。
优选的，作为一种改进，步骤四中，制备金电极的具体方法为：在石英玻璃上用磁控溅射仪溅射一层5-10nm的金属层，再溅射一层厚度100nm-300nm的金，并旋涂一层光刻胶，用热板进行软烘后曝光处理，随后放入显影液中显影，放入刻蚀液中刻蚀，最后用除胶液除胶，得到金电极。
本技术方案中，采用磁控溅射的方式结制备金电极，操作简单方便。
优选的，作为一种改进，步骤五中，等离子体处理时间为10-15s，键合的温度为100-150℃。
本技术方案中，等离子体处理的时间主要影响后期的键合效果，等离子体处理时间过长会导致键合过于紧密，样品液难以进入结构；等离子处理时间过短会导致键合不紧，容易出现漏液问题。
优选的，作为一种改进，对键合后的芯片进行真空脱气处理，真空脱气处理的时间＞30min。
本技术方案中，将芯片的各个出入口均浸没在缓冲溶液中，在-1.5至-1.2psi的真空箱内脱气30min以上，能够使通道内完全填充液体，避免气泡对微流体流动的影响
附图说明
图1为本发明实施例中PDMS结构层的结构示意图。
图2为图1中一级分选单元的局部图。
图3为本发明实施例中配套电极的结构示意图。
图4为本发明实施例中多级化微流控芯片键合状态的结构示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施方式所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用的实验方法均为常规方法；所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。
说明书附图中的附图标记包括：一级分选单元1、二级分选单元2、三级分选单元3、样品入口4、分流微柱5、一级样品通道6、一级捕获腔室7、传送通道8、一级样品出口9、二级样品出口10、三级样品出口11、挡板12、截留板13、配套电极14。
实施例1
实施例基本如附图1-图4所示：用于单细胞筛选的多级化微流控芯片，包括PDMS结构层和与之键合的配套电极14(图3)。
结合图1、图2所示，PDMS结构层内设置有微通道结构，用于细胞的捕获和分选，微通道结构包括依次连通的一级分选单元1、二级分选单元2和三级分选单元3；一级分选单元1包括一级分选腔，一级分选腔包括分散区、捕获区和出样区。分散区设置有样品入口4，且分散区内固定有若干分流微柱5，若干分流微柱5之间彼此交错分部；捕获区内设置有七组横向设置的一级样品通道6，一级样品通道6内均设置有若干阵列排布的一级捕获腔室7，一级捕获腔室7均由PDMS绝缘微柱与通道壁围成，形成微陷阱结构阵列，一级样品通道6靠近出样区的一端均设置有回形的挡板12；出样区与一级通道连通，且出样区连通有一级出样通道和一级传送通道8，一级出样通道上设置有一级样品出口9，一级出样通道上固定有倾斜设置的挡截留板13，主要实现样品溶液的截流，提高样品利用率。一级传送通道8远离出样区的一端与二级分选单元2连通。
二级分选单元2与一级分选单元1的结构基本类似，包括二级分选腔，二级分选腔包括分散区、捕获区和出样区，分散区连通一级传送通道8，分散区内同样固定有若干分流微柱5；捕获区内设置有五组横向设置的二级样品通道，二级样品通道内均设置有若干阵列排布的二级捕获腔室，二级捕获腔室均由PDMS绝缘微柱与通道壁围成，形成微陷阱结构阵列，二级样品通道靠近出样区的一端均设置有回形的挡板12；出样区与二级样品通道连通，且出样区连通有二级出样通道和二级传送通道8，二级出样通道上设置有二级样品出口10，二级出样通道上固定有倾斜设置的挡截留板13；二级传送通道8与三级分选单元3连通。
三级分选单元3包括三级分选腔，三级分选腔内设置有三级样品通道，三级样品通道内设置有若干横向阵列排布的三级捕获腔室，三级捕获腔室均由PDMS绝缘微柱与通道壁围成，三级样品通道靠近出样区的一端也设置有回形的挡板12。三级分选腔内远离二级传送通道8的一端设置有倾斜的挡截留板13，且三级分选腔远离二级传送通道8的一端连通有三级出样通道和收集通道，三级出样通道上设置有三级样品出口11。
配套电极14为金属电极阵列结构，包括一级电极阵列单元、二级电极阵列单元和三级电极阵列单元，分别用于控制一级分选单元1、二级分选单元2和三级分选单元3，实现样品逐级富集、纯化、目标样品收集及回收。
用于单细胞筛选的多级化微流控芯片的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、利用软件绘制PDMS结构层的微通道结构，导入仿真软件进行计算分析，并优化结构；
步骤二、设计与结构对应的电极阵列，进行电场计算并优化电极排布；
步骤三、制作对应的掩膜/铬板，利用软光刻的方法制作基于PDMS的微通道结构，具体制备方法为：在3-5英寸的硅片上用匀胶机旋涂一层20μm-200μm的光刻胶，用热板进行软烘，再用光刻机曝光，随后放入显影液中进行显影，再用热板硬烘，制作出通道模板，用PDMS进行脱模，得到微通道结构层；
步骤四、制备阵列电极，采用溅射-光刻法制备金电极，具体制备方法为：在3-5英寸的石英玻璃上用磁控溅射仪溅射一层5-10nm的钛金属，再溅射一层厚度100nm-300nm的金，用匀胶机旋涂一层5μm-10μm的光刻胶，用热板进行软烘，再用光刻机曝光，随后放入显影液中进行显影，放入刻蚀液中刻蚀，最后用除胶液进行除胶，得到所需形状的金电极；
步骤五、将阵列电极与微通道结构层进行表面等离子处理并键合封装，得到用于单细胞筛选的多级化微流控芯片；等离子体处理时间为10-15s，键合的温度为100-150℃；
步骤六、对用于单细胞筛选的多级化微流控芯片进行真空脱气处理，真空脱气处理时间＞30min。
利用上述用于单细胞筛选的多级化微流控芯片进行细胞分选时，首先配置PBS/PM缓冲溶液，利用负压泵对芯片内部的通道结构进行缓冲液浸润及表面处理。
而后开启样品入口，将芯片与信号发生器和负压泵连接，其中，芯片的出口与负压泵相连，芯片的电极部分与信号发生器相连。在样品入口处添加样品，样品在分流微柱的分散作用下被分散至各个一级样品通道内，并被捕获在一级捕获腔室内，剩余样品沿一级出样通道出样，并被收集在一级样品出口处的容器内。
而后关闭一级样品出口，开启二级样品出口，选定一级分选区内的目标样品并使一级分选区对应的一级电极阵列加电，目标样品细胞/微粒群被释放进入二级分选区，剩余的样品沿二级样品出口出样并被收集。而后关闭二级样品出口，开启三级样品出口，并选定二级分选区内的样品，并对二级电极阵列加电，目标样品细胞/微粒群被释放进入三级分选区，剩余样品收集在三级样品出口的容器中。而后关闭三级样品出口，开启收集通道的收集口，选定三级分选区内的目标样品并对三级电极阵列加电，目标样品细胞/微粒群被释放进入最终的样品收集口。
本发明中的多级分选微流控芯片可以在同一块芯片内实现大量样本的逐级富集和精确筛选，能够实现可视化、可寻址单细胞/微粒捕获及释放，可用于细胞分选、细胞计数以及后续的单细胞分析。
对比例1
本对比例与实施例1的区别在于：本对比例中，没有设置挡板结构，结果导致捕获率很低，分析其原因在于：大部分流入的样品随着流体直接流向出口，而不是固定在陷阱结构内。
实验一倾角测试
本实验主要考察不同形状挡板对于捕获率的影响，倾角测试中的倾角指的是每条捕获通道出口处的挡板结构，分别考察了外倾斜挡板、竖直挡板、内倾斜挡板以及回形挡板结构对于捕获率的影响，实验的具体操作为：
步骤一、制作芯片，具体方法详见实施例1；
步骤二、配置缓冲溶液及含有微粒/细胞的溶液；
步骤三、将芯片浸入缓冲溶液中进行真空脱气，排出气泡；
步骤四、将芯片与泵和信号发生器连接；
步骤五、从入口添加含有微粒/细胞的溶液并在显微镜下观察操作，微粒/细胞会随着流体进入通道，并被捕获在每一排的微陷阱中，通过显微镜观察统计各排捕获的单个颗粒数、多个颗粒数和空陷阱，记录和计算陷阱占用数(即陷阱中有捕获到颗粒，无论是单颗粒还是多颗粒)，占用率＝占用数/总陷阱数。结果如表1所示，其中单颗粒是指：一个陷阱里只有一个颗粒；多颗粒是指一个陷阱里有两个及以上颗粒。
表1
结果表明：进样后即刻统计捕获，第5行结构出口出现堵塞(通道出现变形，<15um)；初步统计，第4行的孔占用率和单颗粒率较高，后续芯片设计可以采用该结构，即回形挡板，宽度25微米，底边延伸长度50微米。
实验二
在利用实例1制备而成的芯片进行逃逸与捕获实验，在显微镜下观察第5、10、15秒的时刻的捕获情况，并记下第一次观察到逃逸时的时间点，然后通过视频回放统计各个时间点下的占用率和单颗粒、多颗粒捕获率，结果如表2所示。
表2
从表2数据可知，在前20s，捕获率达到100％，肉眼观察下无颗粒逃逸在第22s以后有2个微粒逃逸，此时芯片捕获能力接近最佳捕获极限在第25s以后有较大量的微粒逃逸，说明芯片捕获能力已达到极限继续保持进样，位点占用率可以达到100％，但此时流失较多。该结构捕获率较理想，且不易出现堵塞现象。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
Claims (7)
1.用于单细胞筛选的多级化微流控芯片，其特征在于：包括PDMS结构层和与之键合的配套电极，所述PDMS结构层内设置有用于进行细胞捕获和分选的微通道结构，所述微通道结构包括依次连通的多级分选单元，分选单元均包括分选腔，分选腔包括依次连通的分散区、捕获区和出样区；
所述分散区内设置有若干分流微柱，所述分流微柱包括交错设置的月牙形微柱和阵列分布的方形微柱两类；
所述捕获区内设置有若干样品通道，样品通道内均阵列设置有若干捕获腔室，捕获腔室均由PDMS绝缘微柱与通道壁围成，形成微陷阱结构阵列；且样品通道靠近出样区的一端均设置有宽度25微米，底边延伸长度50微米的回形挡板；出样区连通有出样通道和传送通道；传送通道远离出样区的一端与下一级分选单元连通；
配套电极为金属电极阵列结构，且配套电极包括与多级分选单元分别对应的多级电极阵列单元。
2.根据权利要求1所述的用于单细胞筛选的多级化微流控芯片，其特征在于：所述出样通道内均固定有倾斜设置的截留板。
3.根据权利要求1-2任一项所述的用于单细胞筛选的多级化微流控芯片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、绘制微通道结构；
步骤二、设计电极阵列；
步骤三、利用软光刻工艺制备给予PDMS的微通道结构；
步骤四、采用溅射-光刻法制备金电极；
步骤五、将电极阵列与微通道结构进行表面等离子处理并键合封装。
4.根据权利要求3所述的用于单细胞筛选的多级化微流控芯片的制备方法，其特征在于：步骤三中，利用软光刻工艺制备微通道结构的具体造作为：在硅片上旋涂20μm-200μm的光刻胶，用热板软烘后曝光处理，随后放入显影液中显影，再用热板硬烘，制作出通道模板，用PDMS脱模，得到微通道结构层。
5.根据权利要求4所述的用于单细胞筛选的多级化微流控芯片的制备方法，其特征在于：步骤四中，制备金电极的具体方法为：在石英玻璃上用磁控溅射仪溅射一层5-10nm的金属层，再溅射一层厚度100nm-300nm的金，并旋涂一层光刻胶，用热板进行软烘后曝光处理，随后放入显影液中显影，放入刻蚀液中刻蚀，最后用除胶液除胶，得到金电极。
6.根据权利要求5所述的用于单细胞筛选的多级化微流控芯片的制备方法，其特征在于：步骤五中，等离子体处理时间为10-15s，键合的温度为100-150℃。
7.根据权利要求6所述的用于单细胞筛选的多级化微流控芯片的制备方法，其特征在于：对键合后的芯片进行真空脱气处理，真空脱气处理的时间＞30min。
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