CN107441160B - 含夏枯草多糖、三萜及挥发油的药物组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物组合物，具体公开了一种含夏枯草多糖、三萜及挥发油的药物组合物。本发明通过试验研究发现了所述夏枯草多糖、三萜及挥发油在配伍使用后，可明显提高抗增殖活性及抗肿瘤活性，并能够有效诱导和促进乳腺癌细胞的凋亡，并且增强机体的免疫功能。由于上述配伍可增强单独药物的抗肿瘤活性，因此，上述配伍还可有效的减少药物的用量，降低药物的不良反应。

Description

含夏枯草多糖、三萜及挥发油的药物组合物及其应用
技术领域
本发明涉及药物组合物，具体地说，涉及含夏枯草多糖、三萜及挥发油的药物组合物。
背景技术
夏枯草属为唇形科多年生草本植物全球约有l5种，广泛分布于欧亚的温带地区及热带山区，非洲西北部及北美洲。我国主要集中分布于淮河流域及长江中下游地区，以江苏、安徽、浙江及河南的野生资源蕴藏量最为丰富，所含化合物主要包括三萜及其皂苷、酚酸、甾醇及其苷、黄酮、有机酸、挥发油及糖类等。
当前乳腺的治疗方法主要包括手术切除、化疗、放疗、内分泌治疗以及分子靶向治疗，但都毒副作用巨大，影响患者的生存生活质量。中药治疗乳腺癌具有独特的优势，夏枯草自古以来应用于乳腺增生的治疗，但是当前对于夏枯草的研究以及应用多集中于提取物及单体成分，但未见将有效组分配伍用于乳腺癌的治疗。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种含夏枯草多糖、三萜及挥发油的药物组合物及其应用，旨在通过对夏枯草单体成分的配伍实现显著的协同增效作用。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了含夏枯草多糖(Polysaccharide)、三萜(Triterpene)及挥发油(Volatile oil)的药物组合物(PPTV，或简称PTV，本发明说明书附图中出现的PPTV和PTV均指同一种物质)。
其中，所述夏枯草多糖、三萜及挥发油均为可通过本领域常规提取手段提取得到的有效成分，所述有效成分在相应提取物中的含量不低于6％即可，本发明对提取方法不另作限定，仅提供可选提取方法如下：
(1)夏枯草多糖：将夏枯草粉碎，称取500g，10倍水量加热回流提取4次，合并提取液，4800r/min离心去除杂质，减压浓缩至2L，加入95％乙醇，使乙醇终浓度达到70％，于4℃冰箱中醇沉24h，再离心分离(4800r/min，10min)，弃去上清液，将所得沉淀依次用无水乙醇、丙酮、无水***各洗涤两次，在55℃条件下真空干燥，得夏枯草粗多糖。提取率大约为7.5％-9.5％之间。
(2)夏枯草三萜：将夏枯草粉碎，称取500g，10倍水量加热回流提取4次，合并提取液，4800r/min离心去除杂质，减压浓缩至800ml。浓缩液通过大孔树脂分离，采用75％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩得到浸膏，冷冻干燥，-20℃存储待用，提取率6％-7％。
(3)夏枯草挥发油：用粉碎机将夏枯草粉碎，称取200g入超临界流体(CO2)提取装置，萃取温度35℃，萃取压力15-18MPa；分离釜1温度35-40℃，分离压力7-9MPa；分离釜2温30℃，分离压力5-7MPa，萃取时间3h，不使用夹带剂。使用相同的提取条件，重新装药重复提取一次，合并两次提取挥发油，放入-20℃冰箱保存备用，提取率大约为4％-6％之间。
本发明通过试验研究发现了所述夏枯草多糖、三萜及挥发油在配伍使用后，可明显提高抗增殖活性及抗肿瘤活性，并能够有效诱导和促进乳腺癌细胞的凋亡，并且增强机体的免疫功能。由于上述配伍可增强单独药物的抗肿瘤活性，因此，上述配伍还可有效的减少药物的用量，降低药物的不良反应。
作为优选，所述夏枯草多糖、三萜及挥发油的配伍比例为3～5:1～3:1～2。
更为优选，所述夏枯草多糖、三萜及挥发油的配伍比例为3:2:1.3。将药物添加与饲料中，并在造模前一周开始给药，将4T1细胞皮下注射于BALB/c小鼠(6-8周龄)右侧脂肪垫，建立小鼠乳腺癌模型，每3天记录一次肿瘤生长情况以及小鼠体重。断颈处死小鼠后，摘取肿瘤组织，脾脏、胸腺，计算脏器指数。小鼠体质量与正常组相比较没有明显变化；小鼠肿瘤的生长速度明显减慢，说明PPTV可以抑制荷瘤小鼠肿瘤的增殖速度。正常组、模型组及治疗组胸腺指数较为相似；而经药物治疗后，小鼠脾脏明显增大，说明PPTV可以增强小鼠免疫***，通过自身免疫***延缓肿瘤的发展过程，平衡机体内免疫微环境，从根本上改变肿瘤细胞的生长与生存环境。此外，肿瘤发生过程中一个重要特征就是细胞凋亡和增殖失衡，因此，诱导细胞凋亡和增殖的比例恢复正常对于肿瘤的治疗是很好的治疗策略，本发明通过H&E染色和TUNEL法检测了乳腺癌小鼠模型的细胞增殖情况以及原位细胞凋亡后发现，PPTV不仅可以抑制肿瘤细胞的增殖并且促可以进肿瘤细胞的凋亡，这就有利于恢复增殖和凋亡的比例，达到“攻补双施”的目的。
因此，本发明提供了前述药物组合物在制备诱导乳腺癌细胞凋亡药物中的应用。
本发明还提供了前述药物组合物在制备促进乳腺癌细胞凋亡药物中的应用。
本发明还提供了前述药物组合物在制备抗细胞增殖药物中的应用。
本发明还提供了前述药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。所述肿瘤优选为乳腺癌。
本发明还提供了前述药物组合物在制备提高免疫力的药物中的应用。
本发明将上述三个组分配伍(PPTV)后可显著增强单独用药时的抗肿瘤活性，并且呈现时间-剂量依赖型；证明：PPTV具有很好的抗肿瘤活性。又将该药品治疗小鼠乳腺癌模型，产生了很好的治疗效果，显著抑制肿瘤生长速度，并且能显著减少肿瘤转移灶。
需要说明的是，在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种含夏枯草多糖、三萜及挥发油的药物组合物(PPTV)，所述的PPTV可用于乳腺癌的治疗，开拓了夏枯草的新用法，为治疗乳腺癌的药物提供了新的选择，PPTV可以抑制肿瘤的生长，并且可以诱导肿瘤细胞凋亡；增强机体免疫***，通过自身免疫***延缓肿瘤的发展过程，平衡机体内免疫微环境，从根本上改变肿瘤细胞的生长与生存环境，夏枯草各活性部位配伍后在抗肿瘤方面具有很大的潜力，可以作为乳腺癌治疗的一个新的有潜力的选择，也值得进一步去研究和探索。
附图说明
图1为本发明实验例1中夏枯草多糖、三萜、挥发油及PPTV处理细胞48h对乳腺癌细胞的影响。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1一种药物组合物
1、原料：
夏枯草多糖：将夏枯草粉碎，称取500g，10倍水量加热回流提取4次，合并提取液，4800r/min离心去除杂质，减压浓缩至2L，加入95％乙醇，使乙醇终浓度达到70％，于4℃冰箱中醇沉24h，再离心分离(4800r/min，10min)，弃去上清液，将所得沉淀依次用无水乙醇、丙酮、无水***各洗涤两次，在55℃条件下真空干燥，得夏枯草粗多糖。提取率大约为7.5％-9.5％之间。
夏枯草三萜：将夏枯草粉碎，称取500g，10倍水量加热回流提取4次，合并提取液，4800r/min离心去除杂质，减压浓缩至800ml。浓缩液通过大孔树脂分离，采用75％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩得到浸膏，提取率6％-7％冷冻干燥-20℃存储待用。
夏枯草挥发油：用粉碎机将夏枯草粉碎，称取200g入超临界流体(CO2)提取装置，萃取温度35℃，萃取压力15-18MPa；分离釜1温度35-40℃，分离压力7-9MPa；分离釜2温30℃，分离压力5-7MPa，萃取时间3h，不使用夹带剂。使用相同的提取条件，重新装药重复提取一次，合并两次提取挥发油，放入-20℃冰箱保存备用，提取率大约为4％-6％之间。
2、制备方法：
夏枯草多糖、三萜、挥发油提取率分别为9.3％、6.2％、4.3％，将三者按此比例，既3：2：1.3组合得到药物。具体来讲：按比例称取多糖、三萜和挥发油，将多糖和三萜溶于纯水；挥发油中加入微量吐温-80助溶(吐温-80终浓度不超过0.1％)；将三者均匀混合得实验样品。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于，将夏枯草多糖、三萜、挥发油按提取率计算有效成分含量，按照有效含量比为5:1:2的利弊组合得到药物。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于，将夏枯草多糖、三萜、挥发油按提取率计算有效成分含量，按照有效含量比为3:3:1的利弊组合得到药物。
实验例1
药物抗增殖活性采用MTT法检测。
取对数生长期MCF-7细胞(1×105个/孔)接种于96孔板，孵育24h，待细胞贴壁。加入浓度梯度的夏枯草多糖、夏枯草三萜、夏枯草挥发油和实施例1所述的药物组合物分别处理细胞48h后，移除含药培养基，每孔加入100ul 0.5mg/ml的MTT，37℃孵育4h后，弃去培养基，加入DMSO溶解结晶。在酶标仪490nm处检测吸光值A，实验重复3次，计算细胞存活率。
细胞存活率＝(实验组A-空白组A)/(对照组A-空白组A)×100％。
试验结果如图1所示。结果显示：夏枯草多糖、三萜、挥发油配伍后，其抗肿瘤活性明显增强，并可以减少药物使用剂量。
实验例2
Babl/c小鼠，雌性，SPF级，体质量18-22g，由湖南省斯莱克景达实验动物中心提供，动物许可证号SCXK湘2014-0002。适应性饲养1周，造模一周前开始预防性给药。将100μl(1.0×106个细胞)4T1细胞皮下注射于BALB/c小鼠(6-8周龄)右侧脂肪垫，将小鼠随机分为对照组、阳性组、高剂量(4g/kg)给药组和低剂量(2g/kg)给药组(每组10只)，继续给药25天。造模后第7天测量肿瘤体积，此后每3天测量一次肿瘤体积和小鼠体重。小鼠肿瘤体积(mm3)＝0.52×L×W2，L代表长度，W代表宽度，断颈处死小鼠后，摘取肿瘤组织与肺组织以及脾脏和胸腺，计算脾脏和胸腺指数。
脏器指数＝脏器重量g/体重g×10。
实验例3
HE染色检查病理学改变：摘取肿瘤组织，将肿瘤组织于4％多聚甲醛固定24h，把固定好的目的部位组织块修剪平整，进行12h左右的流水冲洗，然后将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。冷却凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。置于石蜡切片机上切片，片厚4μm。苏木精-伊红(H&E)染色，肿瘤组织切片组织病理学检查。使用显微镜拍摄200×图像观察肿瘤组织病理结构改变。
实验例4
用TUNEL检测原位细胞凋亡，将肿瘤组织于4％多聚甲醛固定24h，石蜡包埋，切片，梯度酒精脱蜡后放入蒸馏水水化，20μg/ml蛋白酶K于37℃消化30min，PBS冲洗3次，滴加50μlTUNEL染色液，37℃孵育30min，PBS冲洗3次，加50μl碱性磷酸酶偶联的抗荧光抗体(CoverAP)，37℃孵育30min；PBS清洗3次后加底物DAB(二氨基联苯氨)50μl/片,显色10min,脱水后树脂封片，显微镜下观察拍照。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (4)

1.一种用于治疗乳腺癌的由夏枯草多糖、三萜及挥发油组成的药物组合物，其特征在于，所述夏枯草多糖、三萜及挥发油的配伍比例为3～5:1～3:1～2；
其中，所述夏枯草多糖的提取方法如下：
将夏枯草粉碎，称取500g，10倍水量加热回流提取4次，合并提取液，4800r/min离心去除杂质，减压浓缩至2L，加入95％乙醇，使乙醇终浓度达到70％，于4℃冰箱中醇沉24h，再在4800r/min下离心分离10min，弃去上清液，将所得沉淀依次用无水乙醇、丙酮、无水***各洗涤两次，在55℃条件下真空干燥，得夏枯草粗多糖，提取率为7.5％-9.5％；
夏枯草三萜的提取方法如下：
将夏枯草粉碎，称取500g，10倍水量加热回流提取4次，合并提取液，4800r/min离心去除杂质，减压浓缩至800ml；浓缩液通过大孔树脂分离，采用75％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩得到浸膏，提取率为6％-7％，冷冻干燥；
夏枯草挥发油的提取方法如下：
用粉碎机将夏枯草粉碎，称取200g入超临界CO2流体提取装置，萃取温度35℃，萃取压力15-18MPa；分离釜1温度35-40℃，分离压力7-9MPa；分离釜2温30℃，分离压力5-7MPa，萃取时间3h，不使用夹带剂；使用相同的提取条件，重新装药重复提取一次，合并两次提取挥发油，提取率为4％-6％。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述夏枯草多糖、三萜及挥发油的配伍比例为3:2:1.3。
3.权利要求1或2所述的药物组合物在制备抗细胞增殖药物中的应用，所述细胞为乳腺癌细胞MCF-7和/或乳腺癌细胞MDA-MB-231。
4.权利要求1或2所述的药物组合物在制备抗乳腺癌药物中的应用。
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Application publication date: 20171208

Assignee: Hunan DIYing Kangxiang medical incubator management Co.,Ltd.

Assignor: Hunan University of Chinese Medicine

Contract record no.: X2022980019027

Denomination of invention: Pharmaceutical composition containing Prunella vulgaris polysaccharide, triterpene and volatile oil and its application

Granted publication date: 20210416

License type: Common License

Record date: 20221027