CN107435055A - 一种两段式补料发酵合成微生物油脂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种两段式补料发酵合成微生物油脂的方法，在发酵培养基中加入糖作为碳源，然后接入浅白隐球菌种子液进行发酵培养，控制发酵罐转速100‑900转/分钟，发酵温度20‑30℃，pH 5‑7，直至溶解氧浓度和pH值上升；当糖浓度为1‑5g/L时，开始流加挥发性脂肪酸混合液代替糖作为碳源，同时实施氮源限制。每当挥发性脂肪酸混合液浓度在1‑5g/L之间，流加挥发性脂肪酸混合液直至总挥发性脂肪酸浓度至5‑20g/L。本发明具有微生物代谢挥发性脂肪酸的速率较高，高浓度有机酸碳源对细胞生长抑制作用小，从而使得最终得到的细胞浓度和产物浓度都较高的优点。本发明可有效帮助降低微生物油脂的生产成本。

Description

一种两段式补料发酵合成微生物油脂的方法
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种两段补料式发酵合成微生 物油脂的方法。
背景技术
油脂作为一种重要原料，可用于生物柴油、绿色柴油、航空燃油、生物 原油等生物燃料的生产。随着世界人口的增长，油脂需求量不断增加。油脂 主要来源为动、植物脂肪，但有限动、植物资源已无法满足人们的食品和生 活中对各种油脂的需求。开发新的油脂资源并实现其产业化已成为全球共识。
生物燃料的研发又进入一个全新的阶段，为应对波动的化石燃料价格、 航空碳税的征收压力、航空燃料的巨大需求量，国内、外各大航空公司都在 积极推进生物航空燃油的研发和生产。油脂作为制备生物航油的一种重要原 料，其供应量成为制约生物航油发展的关键因素。微生物油脂的开发受到高 度关注并成为国内外研究热点。
微生物油脂是由酵母、细菌、霉菌和藻类等产油微生物在发酵过程中， 将底物碳源转化为储存在菌体内的油脂。相比于传统的动、植物油脂，微生 物油脂有着生产周期短、生产效率高、易规模化生产等优势。但价格持续升 高的底物碳源(如糖类)已成为限制该生物技术产业化的主要瓶颈。因此开 发一种可以高效转化低值碳源合成微生物油脂的发酵策略途已成为降低生产 成本的关键。
挥发性脂肪酸，即短链脂肪酸，是由乙酸、丙酸和丁酸组成的混合酸。 其各组分比例随着生产工艺和条件的改变而变化。挥发性脂肪酸主要是通过 厌氧发酵过程利用产酸菌群将城市生活污水、餐厨垃圾、畜禽废物、农林秸 秆、工业废水等废弃物中的碳水化合物和有机物质转化为由乙酸、丙酸和丁 酸组成的混合液。因此，如能将此低值碳源底物进一步开发用于微生物油脂 的合成，不仅能够推动废弃物和挥发性脂肪酸的增资开发利用，而且还将有 效地降低微生物油脂以及其衍生产品的生产成本。
相比较于利用糖类等传统碳源底物，产油微生物代谢挥发性脂肪酸等有 机碳源的速率较低，使得挥发性脂肪酸合成微生物油脂的得率很不理想(小 于10％)。而且由于高浓度有机物碳源(5g/L以上)对细胞生长有明显抑制 作用，简单的高密度批式发酵策略已无法完成挥发性脂肪酸合成微生物油脂 的高密度发酵的目的，从而失去了工业化生产的前景。
发明内容
本发明针对现有技术的上述不足，提供一种微生物代谢挥发性脂肪酸的 速率较高，而且有机物碳源对细胞生长抑制作用小，从而使得最终得到的细 胞浓度、油脂浓度、油脂得率、油脂产率均高的两段补料式发酵合成微生物 油脂的方法。同时为现有技术提供一种高效转化低值挥发性脂肪酸碳源合成 低成本微生物油脂的方法。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为：两段式补料发酵合成微 生物油脂的方法，分两阶段完成，第一阶段：首先在发酵培养基中加入 20.0-50.0g/L的糖作为碳源，然后接入浅白隐球菌种子液于发酵培养基中后 在发酵罐中进行发酵培养，以0.5-1.5vvm的流量将无菌空气连续通入搅拌釜 式发酵罐内，控制发酵罐的搅拌转速为100-900转/分钟，发酵温度20.0-30.0℃，溶解氧浓度10-40％(通过调节搅拌转速使溶解氧浓度在 10-40％，以同温同压下空气中的氧在发酵液中的饱和溶解度值为100％为参 照)；并利用氨水调节pH5.0-7.0(如果不用氨水而用氢氧化钠溶液来调节pH 值时，在发酵过程中需要补给一定量的氮源如氯化铵，以保证发酵过程中微 生物对氮的需求量)；发酵过程中利用在线信号(如溶氧浓度、pH、在线糖 浓度分析仪等)检测发酵过程中碳源(糖)的消耗量；
第二阶段：当溶解氧浓度和pH值同时迅速上升且糖浓度为1.0-5.0g/L 时(在线糖浓度分析仪测量值)后，开始流加挥发性脂肪酸混合液代替糖作 为碳源；同时，利用不含氮的碱性溶液来调节PH值，并停止补加氯化铵和 其它含氮物质，使发酵液中的氮含量逐渐降低至0.01g/L，造成发酵液中氮 源供给不足实现氮限制；随时监控溶解氧浓度和PH值的变化，当二者的值 同时迅速上升时且挥发性脂肪酸混合液浓度为1.0-5.0g/L时(离线有机酸分 析仪器测量值)，流加挥发性脂肪酸混合液是碳源总浓度在5.0-20.0g/L。微 生物就会将发酵液中的挥发性脂肪酸通过代谢合成转为生物油脂。
上述两个阶段的发酵温度和pH值都控制一样。总发酵培养时间在图1 中给出了，至于第一阶段的发酵时间没有明确给出，但要求发酵罐中糖浓度 为1.0-5.0g/L时进入第二阶段，因此给出总发酵培养时间。
上述的发酵培养基组成和配比及微量元素溶液的组成见表1。
上述所述的糖为葡萄糖、蔗糖等。
上述所述的挥发性脂肪酸混合液的组成包括为乙酸、丙酸和丁酸。
上述所述的挥发性脂肪酸混合液中各组分含量为0-100％的乙酸、 0-100％的丙酸和0-100％的丁酸。
本发明的优点和有益效果如下：1.第一阶段，在发酵过程中补给充足的 各种微生物生长代谢所需要的营养物，糖为本阶段唯一碳源，这样微生物可 以充分生长，提高细胞浓度，以免第二阶段流加挥发性脂肪酸时导致微生物 代谢生长受到严重抑制。在第二阶段，同时实施了氮限制和挥发性脂肪酸补 料发酵，可以更好地促进微生物高效地将低值碳源(挥发性脂肪酸)转化为 微生物油脂。采用这一技术工艺，可以实现发酵合成低成本微生物油脂的目 的，最终发酵液中干细胞浓度可以达到33.5g/L，产物微生物油脂的浓度达 到20.2g/L，油脂含量达到60.4％(干重比)。
本发明通过两阶段式补料策略，有效地克服挥发性脂肪酸对细胞代谢生 长的抑制作用，实现高密度发酵，通过增加细胞密度，提高了挥发性脂肪酸 的消耗速率，从而提高了生物油脂得率，最终微生物转化挥发性脂肪酸合成 微生物油脂的得率达到22.4％，产率达到0.24g/L/h。
附图说明
图1为实施例1中底物消耗量、细胞干重浓度和生物油脂量曲线图。
图1中各个组分含义：DCW：细胞干重浓度；Lipid：微生物油脂(即产物)； LipidContent：油脂含量；Glucose：葡萄糖；VFAs：挥发性脂肪酸混合液 (各挥发性脂肪酸比例如下，乙酸：丙酸：丁酸＝6:1:3)。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明不仅仅局限 于以下实施。以购自于韩国生物保存中心的浅白隐球菌Cryptococcus albidus(ATCC 10672)为例，说明本发明的具体实施方式。在不违背本发明 精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属 于本发明的范围。
实施例1：
以表2中所述的两阶段补料发酵方案中的补料方案1实施，具体过程如 下：
(1)第一阶段：配制0.9L基本发酵培养基(其组成见表1)，接入100mL 浅白隐球菌的种子液(液体种子发酵培养基中糖浓度不高于2g/L，其它成分 的浓度与基本发酵培养基的相同，见表l，浅白隐球菌的种子液按照常规技术 制备)于2.5L发酵罐中，在25℃、初始搅拌转速200转/分钟下开始发酵培 养，再以1.0vvm的流量通入无菌空气，尽量保持溶氧浓度不低于20％；用 50％氨水调节pH为6.0，氨水可以同时当做氮源使用，在线监测发酵罐中pH、溶解氧值和碳源消耗量的变化。
(2)当发酵液中糖浓度低于5.0g/L时，发酵进入第二阶段。此时采用 4mol/L NaOH调控pH为6.0，开始实施氮限制；通过在线监测发酵罐中pH 和溶解氧值的变化，当二者的值同时迅速上升时，流加补料碳源即加入补料 I(其组成见表2即挥发性脂肪酸混合液)适量，以保持罐体内挥发性脂肪酸总 浓度低于8.0g/L；每隔一定时间从发酵罐内取出发酵液，离心后测上挥发性 脂肪酸浓度，由测量值判断，适时加入一定量的补料I。
实施例2
以表2中所述的两步分批补料发酵方案中的补料方案2实施，即第二阶 段流加补料II，发酵培养他过程同例1。
实施例3
以表2中所述的两步分批补料发酵方案中的补料方案2实施，即第二阶 段流加补料III，发酵培养其他过程同例1。
实施例4
以表2中所述的两步分批补料发酵方案中的补料方案2实施，即第二阶 段流加补料IV，发酵培养其他过程同例1。
利用上述发酵方法，采取如表2所示的补料策略，发酵终了时细胞干重 浓度、产物微生物油脂的浓度、含量和得率的变化见表3。
表1发酵培养基及微量元素溶液的组成
表2补料方案及补料发酵过程中补加料液的组成和浓度
表3不同补料控制方案对挥发性脂肪酸合成微生物油脂的影响
上述表3中各个组分含义：DCW：细胞干重浓度；Lipid：微生物油 脂(即产物)；Lipid Glucose：葡萄糖；VFAs：挥发性脂肪酸混合液(混 合液中挥发性脂肪酸比例如下，乙酸：丙酸：丁酸＝6:1:3)。
表4为实施例1中微生物油脂里的组成成分及其比例
从表4可以看出，细胞干重浓度在15.1-33.5g/L之间，产物微生物油脂 浓度在6.8-20.2g/L之间变化。微生物油脂主要含有1)长链饱和脂肪酸：棕 榈酸(C16:0)和酸硬脂酸(C18:0)；2)长链不饱和脂肪酸：油酸亚(C18:1)和 油酸(C18:2)，其中油酸亚的含量最高。按照微生物油脂合成情况由高到低的 顺序排列时，依次为补料编号2、1、4、3，即方案2中得到的微生物油脂 浓度、含量、得率和产率最大。因为微生物油脂浓度与发酵液中氮源浓度有 相关性，当氮源受限后，微生物会将全部碳源转化为油脂。而有机酸对细胞 的生长有着抑制作用，所以通过两步补料发酵策略可有效减缓和避免抑制作 用。从表4中可知，通过方案2可以获得细胞浓度为33.5g/L，最终实现利 用挥发性脂肪酸高密度发酵合成微生物油脂的目的。分析表4中各补料策略 获得的细胞干重和油脂合成情况可以发现，相较于转化丙酸、丁酸及挥发性 脂肪酸混合液，微生物利用乙酸合成油脂效率高，所有得到的微生物油脂的 浓度、含量、得率和产率均较高于其他补料。

Claims (5)

1.一种两段补料式发酵合成微生物油脂的方法，其特征在于：制备方法如下：
(1)：首先在发酵培养基中加入20-50g/L的糖作为碳源，然后接入浅白隐球菌种子液于发酵培养基中并在发酵罐中进行发酵培养，控制发酵罐的搅拌转速为100-900转/分钟，以0.5-1.5vvm的流量将无菌空气连续通入发酵罐内，并保持溶解氧浓度在10-40％，发酵温度为20-30℃，并调节pH为5.0-7.0；随时监控发酵过程中溶解氧浓度、pH值和碳源浓度的变化；
(2)：当溶解氧浓度和pH值同时迅速上升且糖浓度为1-5g/L时，开始流加挥发性脂肪酸混合液代替糖作为碳源；同时，利用不含氮的碱性溶液来调节pH值，并停止补加氯化铵和其它含氮物质，使发酵液中的氮含量逐渐降低至0.01g/L，造成发酵液中氮源供给不足实现氮限制，每当挥发性脂肪酸混合液浓度为1.0-5.0g/L时，流加挥发性脂肪酸混合液直至碳源总浓度在5-20g/L，微生物会将发酵液中的挥发性脂肪酸通过代谢合成转化为生物油脂。
2.根据权利要求1所述的两段补料式发酵合成微生物油脂的方法，其特征在于：所述的发酵培养基组成和配比为：每升发酵培养基中含糖20-50g,KH2P04 2-5g,NH4Cl 1-5g，MgS04·7H20 0.5-3g，FeCl3·6H2O 5-20mg，ZnS04·7H20 2-10mg。
3.根据权利要求1所述的两段补料式发酵合成微生物油脂的方法，其特征在于：上述的糖为葡萄糖或蔗糖。
4.根据权利要求1所述的两段补料式发酵合成微生物油脂的方法，其特征在于：上述的挥发性脂肪酸混合液的组成包括为乙酸、丙酸和丁酸。
5.根据权利要求4所述的两段补料式发酵合成微生物油脂的方法，其特征在于：上述的挥发性脂肪酸混合液中各组分含量为0-100％的乙酸、0-100％的丙酸和0-100％的丁酸。
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