CN107427559A - 局部用红细胞生成素制剂和用其提高伤口愈合的方法及其美容用途 - Google Patents

Abstract

含有红细胞生成素(EPO)并且优选地含有纤连蛋白(FN)的局部用制剂，特别是凝胶制剂，被用于，与不使用这种制剂的愈合过程相比，加速例如来***伤的伤口愈合。还提供了制备制剂的方法。

Description

局部用红细胞生成素制剂和用其提高伤口愈合的方法及其美 容用途

本申请要求于2015年9月4日提交的美国临时专利申请62/214,618的优先权，其内容通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明涉及含有红细胞生成素(EPO)并且优选含有纤连蛋白(FN)的局部用制剂，特别是凝胶制剂。本发明还涉及与没有应用这种制剂的愈合过程相比，这些局部用制剂用于加速例如来***伤的伤口愈合的用途。制备制剂的方法也是本发明的一部分。

背景技术

根据美国疾病控制和预防中心(CDC)，全世界超过3.8亿人患有糖尿病(DM)。CDC还估计，这些个体中5％会发展成糖尿病皮肤溃疡(DSU)，1％将需要下肢截肢。尽管在伤口护理和管理方面有许多进展(Sen，2009)，但是由于伤口愈合的细胞和生化事件的协调级联的所有阶段都被破坏(Brown，1992；Shukla，1998；Mustoe，2004)，因此DM中的伤口愈合会被延迟。另外，因为血管生成受损，血流量不足，炎症增加，成纤维细胞的增殖减少(Hehenberger，1999)，以及角化细胞的上皮形成减少(Mansbridge，1999；Stadelmann，1998；Sheetz，2002)因此DSU的愈合会推迟。

糖蛋白激素，红细胞生成素(EPO)，调节红细胞量，是一种经批准治疗贫血的药物。EPO在皮肤中还具有非造血靶标，并且已经显示这些靶标参与皮肤伤口的愈合(Hamed，2014)。之前已有报道，在局部施用重组人EPO到皮肤伤口后，通过(a)刺激血管生成，上皮形成和胶原沉积，以及(b)抑制炎症反应和凋亡(Hamed，2011)，具有实验诱导DM的大鼠和小鼠的皮肤伤口愈合加速。EPO对DM中伤口愈合的有益作用归因于纤连蛋白(FN)。FN促进了临时伤口基质的形成并防止其***(Hamed，2011)。

水通道蛋白(AQP)是完整的膜蛋白，其功能是通过使水和甘油转运来调节细胞内液体止血。AQP在皮肤的基底层和肾脏的髓质收集管中的角质形成细胞的质膜中表达(Agre，1998)。AQP的下调表达可能是急性肾衰竭中尿浓缩能力降低的原因，EPO可以预防这种下调(Gong，2004)。AQP3是在皮肤中表达的AQP(Hara-Chikuma，2005)，其在伤口愈合期间促进细胞迁移、增殖和再上皮化(Hara-Chikuma 2006；Levin，2006；Hara-Chikuma，2008)。水分在治愈皮肤伤口中的积极作用首次显示在1962年，Winter在调查痂形成和皮肤表面伤口的上皮化的速度时发现湿性伤口愈合比干燥伤口更快(Winter，1962)。作为推论，足部皮肤的干燥与DM患者的足部溃烂相关(Tentolouris，2010)。在DM大鼠的全层皮肤伤口愈合期间发现AQP3在再生表皮中下调，AQP3在糖尿病伤口愈合中的特定作用因此被确定(Sugimoto，2012)。该工作表明EPO可用于刺激未愈合伤口的愈合。这些发现还表明DM中受损的AQP3表达和延迟的上皮再形成之间存在因果关系，其涉及(a)参与血管生成的那些细胞的运动和增殖受损，(b)成纤维细胞的细胞外基质(ECM)的生成减少，和(c)角质细胞不能在皮肤伤口上再上皮化。

发明内容

本发明涉及含有红细胞生成素(EPO)并且优选含有纤连蛋白(FN)的局部用制剂，特别是凝胶制剂。在一些实施例中，描述了包含凝胶、红细胞生成素和纤连蛋白的药物组合物。一方面，纤连蛋白以一定量存在于组合物中，所述量增强红细胞生成素施用于伤口时的有益作用。另一方面，一种治疗伤口的方法，包括局部施用治疗有效量的包含凝胶、红细胞生成素和纤连蛋白的药物组合物，其中所述纤连蛋白以一定量存在于所述组合物中，当施用于伤口以治疗伤口时增强红细胞生成素的有益作用。在有些实施方案中，伤口是经诊断或怀疑患有高血糖的受试者的伤口。在其它实施方案中，伤口是被诊断或怀疑患有胰岛素耐受的受试者的伤口。在其他实施方案中，伤口是被诊断或怀疑具有胰岛素产生缺陷或胰岛素耐受的受试者的伤口。在另外的实施方案中，伤口是被诊断为或怀疑为糖尿病的受试者的伤口。在进一步的实施方案中，伤口是人类受试者的伤口。

凝胶制剂优选含有来自包括以下的非限制性赋形剂列表中的至少一种，例如苯甲醇、甘油或其它醇，聚合物如聚乙烯基羧基聚合物如Carbomer 940，其可用作例如粘度增稠剂、胶凝剂或悬浮剂(Carbomer 940与季戊四醇的醚交联)，对羟基苯甲酸酯如对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯；三乙醇胺和本领域已知的用于制备凝胶的其它赋形剂，及其任何组合。本发明的凝胶制剂还应包括水。

在包含凝胶、红细胞生成素和纤连蛋白的药物组合物的某些方面，红细胞生成素的浓度为5％w/w。此外，纤连蛋白的浓度为30％w/w。在其它方面，组合物包含浓度为0.01％至30％(w/w)的红细胞生成素和浓度为0.01％至50％(w/w)的纤连蛋白。在其它实施方案中，组合物包含浓度为0.01％至30％(w/w)的红细胞生成素和浓度为0.01％至50％(w/w)的纤连蛋白、浓度为0.01％至30％(w/w)的甘油、浓度为0.01％至30％(w/w)的Carbomer 940、浓度为0.01％至30％(w/w)的苯甲醇、浓度为0.01％至30％(w/w)的三乙醇胺、浓度为0.01％至30％(w/w)的对羟基苯甲酸甲酯、浓度为0.01％至30％(w/w)的对羟基苯甲酸丙酯。在另外的方面，组合物包含5％(w/w)的甘油、1％(w/w)的Carbomer 940、2％(w/w)的苯甲醇、0.9％的三乙醇胺、0.2％(w/w)的对羟基苯甲酸甲酯、0.05％(w/w)的对羟基苯甲酸丙酯。在具体方面，组合物包含5％(w/w)的甘油，1％(w/w)的Carbomer 940，2％(w/w)的苯甲醇，0.9％(w/w)的三乙醇胺，0.2％(w/w)，0.05％(w/w)的对羟基苯甲酸丙酯和添加至100％(w/w)的水。在有些实施方案中，凝胶是纤维蛋白、胶原或透明质酸凝胶。在其它实施方案中，凝胶包含纤维蛋白、胶原或透明质酸。在具体实施方案中，凝胶是水凝胶。

在某些方面描述了包含红细胞生成素的药物组合物，其中所述组合物配制为凝胶。在具体实施方案中，组合物包含纤连蛋白。在其它实施方案中，红细胞生成素浓度为5％w/w。在其它实施方案中，纤连蛋白浓度为30％w/w。在其它方面，组合物包含浓度为0.01％至30％(w/w)的红细胞生成素、浓度为0.01％至50％(w/w)的纤连蛋白、浓度为0.01％至30％(w/w)、浓度为0.01％至30％(w/w)的Carbomer940、浓度为0.01％至30％(w/w)的苯甲醇、浓度为0.01％至30％(w/w)的三乙醇胺、浓度为0.01％至30％(w/w)的对羟基苯甲酸甲酯、浓度为0.01％至30％(w/w)的对羟基苯甲酸丙酯。在其它方面，组合物包含5％(w/w)的甘油、1％(w/w)的Carbomer 940、2％(w/w)的苯甲醇、0.9％(w/w)的三乙醇胺、0.2％(w/w)的对羟基苯甲酸甲酯、0.05％(w/w)的对羟基苯甲酸丙酯。在其它实施方案中，组合物包含5％(w/w)的甘油、1％(w/w)的Carbomer 940、2％(w/w)的苯甲醇、0.9％(w/w)的三乙醇胺、0.2％(w/w)的对羟基苯甲酸甲酯、0.05％(w/w)的对羟基苯甲酸丙酯和添加至100％(w/w)的水。在某些方面，凝胶是纤维蛋白、胶原或透明质酸凝胶。在其它方面，凝胶包含纤维蛋白、胶原或透明质酸。在一些实施方案中，凝胶是水凝胶。

还提供了治疗受试者伤口的方法，包括向受试者施用治疗有效量的包含红细胞生成素的组合物，其中所述组合物是凝胶。在某些实施方案中，组合物包含纤连蛋白。在其它实施方案中，红细胞生成素的浓度为5％w/w。在一些其它实施方案中，纤连蛋白浓度为30％w/w。在其它实施方案中，所述组合物包含浓度为0.01％至30％(w/w)的红细胞生成素、浓度为0.01％至50％(w/w)的纤连蛋白、浓度为0.01％至30％(w/w)的甘油、浓度为0.01％至30％(w/w)的Carbomer 940、浓度为0.01％至30％(w/w)的苯甲醇、浓度为0.01％至30％(w/w)的三乙醇胺、浓度为0.01％至30％(w/w)的对羟基苯甲酸甲酯、浓度为0.01％至30％(w/w)的对羟基苯甲酸丙酯。在其它具体实施方案中，组合物包含5％(w/w)的甘油、1％(w/w)的Carbomer 940、2％(w/w)的苯甲醇、0.9％-0.2％(w/w)的对羟基苯甲酸甲酯和0.05％(w/w)的对羟基苯甲酸丙酯。在其它实施方案中，组合物包含5％(w/w)的甘油、1％(w/w)的Carbomer 940、2％(w/w)的苯甲醇、0.9％(w/w)的三乙醇胺、0.2％(w/w)的对羟基苯甲酸甲酯、0.05％(w/w)的对羟基苯甲酸丙酯和添加至100％(w/w)的水。在其它方面，凝胶是纤维蛋白、胶原或透明质酸凝胶。仍然在其它方面，凝胶包含纤维蛋白、胶原或透明质酸。在具体方面，凝胶是水凝胶。

在有些方面，处理受试者的伤口的方法包括向受试者施用治疗有效量的包含红细胞生成素的组合物，其中所述组合物是凝胶，其中所述受试者被诊断或怀疑患有高血糖。在其它方面，受试者被诊断或怀疑患有胰岛素耐受。在其它方面，所述受试者被诊断或怀疑患有胰岛素产生缺陷。在另外的方面，受试者被诊断为或怀疑患有糖尿病。在一些实施方案中，受试者是人受试者。在其它实施方案中，组合物经多次施用提供。在具体方面，所述组合物施用2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多次。在另外的方面，组合物被提供1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24周。在另外的实施方案中，所述组合物被提供1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个月。在另外的实施方案中，施用之间的时间间隔为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天。在其它实施方案中，施用之间的时间间隔为1、2、3、4、5、6、7或8周。在另外的实施方案中，凝胶被制剂用于皮肤施用或被经皮肤施用。在其它实施方案中，伤口是溃疡或烧伤。在一些其他方面，伤口是糖尿病性溃疡。在另外的实施方案中，伤口是慢性糖尿病性溃疡。在一些实施方案中，伤口是四肢的慢性糖尿病性溃疡。在另外的方面，伤口是慢性糖尿病足溃疡。

还提供了治疗受试者的伤口的方法，包括向受试者施用治疗有效量的诱导水通道蛋白表达的组合物。在具体实施方案中，水通道蛋白是水通道蛋白-3。在一些方面，组合物是纤维蛋白、胶原或透明质酸凝胶。在其它实施方案中，凝胶包含纤维蛋白、胶原或透明质酸。在其它实施方案中，凝胶是水凝胶。在具体实施方案中，受试者被诊断或怀疑患有高血糖。在其它方面，受试者被诊断或怀疑患有胰岛素耐受。在其它方面，所述受试者被诊断或怀疑患有胰岛素产生缺陷。在另外的方面，受试者被诊断为或怀疑患有糖尿病。在一些实施方案中，受试者是人受试者。在其它实施方案中，组合物经多次施用提供。在具体方面，施用所述组合物1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多次。在另外的方面，组合物被提供1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24周。在另外的实施方案中，所述组合物被提供1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个月。在另外的实施方案中，施用之间的时间间隔为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天。在其它实施方案中，施用之间的时间间隔为1、2、3、4、5、6、7或8周。在另外的实施方案中，凝胶被配制用于皮肤施用或被经皮肤施用。在其它实施方案中，伤口是溃疡或烧伤。在一些其他方面，伤口是糖尿病性溃疡。在另外的实施方案中，伤口是慢性糖尿病性溃疡。在一些实施方案中，伤口是四肢的慢性糖尿病性溃疡。在另外的方面，伤口是慢性糖尿病足溃疡。

在一些组合物或方法中，红细胞生成素和/或纤连蛋白被掺入基质中。在某些方面，红细胞生成素和/或纤连蛋白被掺入基质中并且至少一种是可裂解的。在其它方面，基质掺入一种或多种可裂解的趋化因子、化学引诱物、化学趋向物，生长因子或一种或多种可切割的细胞因子。例如，趋化因子可以是选自由CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL17、XCL1、XCL2和CX3CL1构成的组中的一种或任意组合。与本文公开的方法或组合物一起使用的细胞因子可包括IL17、IL-10、白细胞介素、淋巴因子、单核因子、肌细胞、肿瘤坏死因子或促炎细胞因子家族的成员。与本文所述的方法和组合物一起使用的细胞因子的具体实例包括GcMAF、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、肝细胞生长因子、IL1A、干扰素、干扰素β-1a、干扰素β-1b、干扰素γ、I型干扰素、II型干扰素、III型干扰素、白介素1β、白细胞介素1受体拮抗剂、白细胞介素10、白细胞介素12、白细胞介素13、白细胞介素16、白细胞介素2、白细胞介素23、白细胞介素23亚基α、白细胞介素34、白介素35、白细胞介素6、白细胞介素7、白介素8、白细胞介素-1家族、白细胞介素-12亚基β、白细胞介素36、白血病抑制因子、白细胞促进因子、淋巴毒素、淋巴毒素α、淋巴毒素β、巨噬细胞集落刺激因子、巨噬细胞炎症蛋白、巨噬细胞激活因子、Myonectin、烟酰胺磷酸核糖转移酶、制瘤素M、Oprelvekin、血小板因子4、Promegapoietin、RANKL、基质细胞衍生因子1、肿瘤坏死因子α或血管内皮生长抑制剂。生长因子特别包括例如FGF1、FGF2、IGF1、IGF2、PDGF、EGF、KGF、HGF、VEGF、SDF-1、GM-CSF、CSF、G-CSF、TGFα、TGFβ、NGF和ECGF。还涵盖缺氧诱导因子(例如HIF-1α和β和HIF-2)、激素(例如胰岛素、生长激素(GH)、CRH、瘦蛋白、催乳素和TSH)、血管生成因子(例如血管生成素和血管生成素)、凝血和抗凝血因子[例如因子I、因子XIII、组织因子、钙、vWF、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、纤连蛋白、抗凝血酶、肝素、纤溶酶原、低分子量肝素(Clixan)、高分子量激肽原(HMWK)、前激肽释放酶、纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI1)、纤溶酶原激活物抑制剂-2(PAI2)、尿激酶、血栓调节蛋白、组织纤溶酶原激活物(tPA)、α2-抗纤溶酶和蛋白Z-相关蛋白酶抑制剂(ZPI)。

在有些实施方案中，基质是凝胶。在其他实施方案中，基质是水凝胶。在某些情况下，水凝胶是指可吸收大量水和生物流体而不溶解的三维亲水***联聚合物网状织物。水凝胶可由因物理交联(例如，结晶区，分子间相互作用和缠结)或化学交联(例如共价键)而不溶的聚合物组成。在具体实施方案中，水凝胶是纤维蛋白水凝胶或纤维蛋白结构域修饰的聚乙二醇水凝胶。

在一个实施方案中，水凝胶是与交联剂交联的纤维蛋白水凝胶凝胶。在某些实施方案中，交联的纤维蛋白水凝胶具有适用于植入受试者或患者特别是皮下植入的用途的化学、物理或机械性质。

不构成限制地，凝胶可以包含任何比例的交联剂与纤维蛋白。因此，凝胶可以包含约0.1:1至约10:1范围内的交联剂与纤维蛋白比。在本文所述方面的一些实施方案中，凝胶包含的交联剂：纤维蛋白比为0.1:1至5:1、0.1:1至4:1、0.1:1至2:1、0.1:1至1.5:1、0.1:1至1:1、0.1：1至0.9:1、0.2至0.8:1和/或0.25至0.75:1。在一些实施方案中，凝胶包含0.20:1至0.5:1的交联剂:纤维蛋白比。在一些实施方案中，凝胶包含0.25:1或0.5:1的交联剂:纤维蛋白比。

水凝胶可以由包含宽浓度范围的纤维蛋白的纤维蛋白溶液制成。因此，凝胶可以由纤维蛋白溶液制成，所述纤维蛋白溶液包含约50mg/ml至约500mg/ml、约100mg/ml至约400mg/ml、150mg/ml至约300mg/ml、20mg/ml至约250mg/ml的纤维蛋白，或其中可衍生的任何范围。在本文所述方面的一些实施方案中，凝胶由包含约200mg/ml纤维蛋白的纤维蛋白溶液制成。在本文所述方面的一些实施方案中，水凝胶由包含约250mg/ml纤维蛋白的纤维蛋白溶液制成。在本文所述方面的一些其它实施方案中，水凝胶由包含约300mg/ml纤维蛋白的纤维蛋白溶液制成。

在其它实施方案中，水凝胶是指通过亲水性单体溶液的自由基聚合形成的聚合物，其被胶凝和交联以形成三维聚合物网状锚固大分子。所述大分子可以包含组织的基底物质的成分，例如天然胶原。胶原可以散布在形成胶原水凝胶的聚合网中。在一些实施方案中，胶原水凝胶能够促进上皮细胞生长。

用于交联的可溶性胶原可以通过本领域已知的技术制备。此外，支持细胞附着和生长的其他蛋白质可以用于形成交联的水凝胶。已知支持细胞生长的另外的蛋白质的一个实例是纤连蛋白。

多糖和粘多糖也可以加入本发明的水凝胶中。

通过单体溶液的自由基聚合形成的水凝胶聚合物需要交联以形成网状物的三维聚合物结构以使水溶液凝胶化。向聚合过程中加入交联剂如乙二醇二甲基丙烯酸酯可改变所得的水凝胶。通常，添加交联剂倾向于增加水凝胶的刚性和机械强度。在天然胶原存在下向聚合混合物中加入交联剂如乙二醇二甲基丙烯酸酯和甲基丙烯酸甲酯，仍然改变水凝胶的物理性质，并且这种到聚合混合物的添加与天然胶原相容，并生成胶原水凝胶。其它已知交联剂包括二丙烯酸酯和二甲基丙烯酸酯或其它二价分子可以令人满意地用于制备胶原水凝胶。

不构成限制地，凝胶可以包含任何比例的交联剂与胶原。因此，凝胶可以包含约0.1:1至约10:1范围内的交联剂与胶原比。在本文所述的方面的一些实施方案中，凝胶包含交联剂：胶原比为0.1:1至5:1、0.1:1至4:1、0.1:1至2:1、1至1.5：1、0.1:1至1:1、0.1:1至0.9:1，0.2至0.8:1和/或0.25至0.75:1。在一些实施方案中，凝胶包含0.20:1至0.5:1的交联剂:胶原比。在一些实施方案中，凝胶包含0.25:1或0.5:1的交联剂:胶原比。

水凝胶可以由包含宽浓度范围的胶原的胶原溶液制成。因此，凝胶可以由包含约50mg/ml至约500mg/ml、约100mg/ml至约400mg/ml、150mg/ml至约300mg/ml、20mg/ml至约250mg/ml的胶原，或其中可衍生的任何范围的胶原溶液制成。在本文所述方面的一些实施方案中，凝胶由包含约200mg/ml胶原的胶原溶液制成。在本文所述方面的一些实施方案中，水凝胶由包含约250mg/ml胶原的胶原溶液制成。在本文所述方面的一些其它实施方案中，水凝胶由包含约300mg/ml胶原的胶原溶液制成。

可用作合成“刺激响应性”聚合物的水凝胶可基于合成聚合物，例如聚(乙二醇)(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(poly(NiPAAm))。这样的水凝胶已经用于许多再生医学应用中(参见例如N.A.Peppas,P.Bures,W.Leobandung,andH.Ichikawa.Hydrogels in pharmaceutical formulations.Eur.J.Pharm.Biopharm.50:27-46(2000)，通过引用并入本文)。

在某些方面，用各种聚合物如聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或聚丙烯酰胺制备水凝胶。示例性的基于PVA的水凝胶公开于例如美国专利号6,231,605；5,346,935；5,981,826；4,663,358；和4,988,761，其内容通过引用并入本文。在某些实施方案中，基于聚乙二醇(PEG)的水凝胶在水溶液中提供大程度的溶胀。各种基于PEG的水凝胶公开于美国专利5,514,379；6,362,276和6,541,015，其内容通过引用并入本文。通过引用并入本文的PCT申请WO2006125082提供了在前体水凝胶溶液中含有预固化的水凝胶颗粒的水凝胶制剂。

不构成限制地，凝胶可以包含任何比例的交联剂与聚(乙二醇)(PEG)。因此，凝胶可以包含约0.1:1至约10:1范围内的交联剂:PEG比。在本文所述方面的一些实施方案中，凝胶包含交联剂:PEG比例为0.1:1至5:1、0.1:1至4:1、0.1:1至2:1、1至1.5:1、0.1:1至1:1、0.1:1至0.9:1、0.2至0.8:1和/或0.25至0.75:1。在一些实施方案中，凝胶包含0.20:1至0.5:1的交联剂:PEG比。在一些实施方案中，凝胶包含0.25:1或0.5:1的交联剂:PEG比。

水凝胶可以由包含宽浓度范围的PEG的PEG溶液制成。因此，凝胶可以由包含约50mg/ml至约500mg/ml、约100mg/ml至约400mg/ml、150mg/ml至约300mg/ml、20mg/ml至约250mg/ml的PEG，或其中可衍生的任何范围的PEG溶液制成。在本文所述的方面的一些实施方案中，凝胶由包含约200mg/ml PEG的PEG溶液制成。在本文所述的方面的一些实施方案中，水凝胶由包含约250mg/ml PEG的PEG溶液制成。在本文所述方面的一些其它实施方案中，水凝胶由包含约300mg/ml PEG的PEG溶液制成。

在另一个实施方案中，水凝胶是与交联剂交联的透明质酸水凝胶凝胶。在某些实施方案中，交联透明质酸水凝胶具有适合于植入受试者或患者，特别是皮下植入的化学、物理或机械性质。在其它实施方案中，交联透明质酸水凝胶具有适用于处理受试者或患者的皮肤伤口，特别是皮肤施用的化学、物理或机械性质。

不构成限制地，凝胶可以包含任何比例的交联剂与透明质酸。因此，凝胶可以包含在约0.1:1至约10:1范围内的交联剂与透明质酸比。在本文所述的方面的一些实施方案中，凝胶包含交联剂:透明质酸比率为0.1:1至5:1、0.1:1至4:1、0.1:1至2:1、0.1:1至1.5:1、0.1:1至1:1、0.1:1至0.9:1、0.2至0.8:1和/或0.25至0.75:1。在一些实施方案中，凝胶包含0.20:1至0.5:1的交联剂:透明质酸比。在一些实施方案中，凝胶包含0.25:1或0.5:1的交联剂:透明质酸比。

水凝胶可以由包含宽浓度范围的透明质酸的透明质酸溶液制成。因此，凝胶可以由包含约50mg/ml至约500mg/ml、约100mg/ml至约400mg/ml、150mg/ml至约300mg/ml、20mg/ml至约250mg/ml的透明质酸，或其中可衍生的任何范围的。透明质酸溶液制成在本文所述的方面的一些实施方案中，凝胶由包含约200mg/ml透明质酸的透明质酸溶液制成。在本文所述的方面的一些实施方案中，水凝胶由包含约250mg/ml透明质酸的透明质酸溶液制成。在本文所述的方面的一些其它实施方案中，水凝胶由包含约300mg/ml透明质酸的透明质酸溶液制成。

如在本说明书中使用的，“一个”可以表示一个或多个。如本文在权利要求中使用的，当与词语“包括”结合使用时，词语“一个”可以表示一个或多于一个。

权利要求中的术语“或”的使用用于表示“和/或”，除非明确指出仅指代替代物或替代物是相互排斥的，但是本公开支持仅指替代物的定义和“和/或”。如本文所用，“另一个”可以指至少第二个或更多个。在本申请中，术语“约”用于表示包括装置误差的固有变化值，用于确定值的方法或存在于研究对象之间的变化。

从下面的详细描述中，本发明的其它目的、特征和优点是显而易见的。然而，应当理解，虽然指示本发明的优选实施方案的详细描述和具体实施例仅以说明的方式给出，因为在本发明的精神和范围内的各种改变和修饰对于本领域技术人员来说是显而易见的。

附图说明

以下附图形成本说明书的一部分，并且被包括以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个并结合本文给出的具体实施例的详细描述，可以更好地理解本发明。

图1：局部EPO以剂量依赖性方式加速伤口闭合并增加糖尿病伤口的再生皮肤中的血流量；FN的增强效应。在各种处理后的第0、2、4、7、9、11和14天，测定非糖尿病和糖尿病猪的再生皮肤中的伤口闭合和血流速率。(A)糖尿病猪中溶剂处理、FN处理、EPO处理和EPO/FN处理的烧伤伤口的伤口闭合率。(B)在糖尿病猪上溶剂处理、低剂量EPO处理和高剂量EPO处理的烧伤伤口的伤口闭合率。(C)在第0、2、4、7、9、11及14天，在非糖尿病(左)和糖尿病猪中的溶剂处理、FN处理、EPO处理和EPO/FN处理的烧伤伤口的代表性摄影图像和激光多普勒扫描图(右)。(D)在非糖尿病(左)和糖尿病猪的第0、2、4、7、9、11及14天，对相同溶剂处理、FN处理、EPO处理和EPO/FN处理的烧伤创面的代表性摄影图像和激光多普勒扫描(右)。激光多普勒扫描中的白色圆圈表示在第0天的烧伤创面面积。深蓝色代表非血管化区域，黄色和红色代表血管化区域，表示比黄色区域更血管化的区域的红色区域的血管化区域。每个处理组中的样品大小为12个，除了低剂量EPO处理的烧伤组样品数为6。*p<0.05和**p<0.01是根据具有Bonferroni校正的双因素方差分析的结果表示溶剂处理的烧伤创伤与其他处理之间的差异的显著性。是根据具有Bonferroni校正的双因素方差分析的结果，表示(a)EPO处理或EPO/FN处理的烧伤伤口和FN-处理的烧伤伤口和(b)高剂量EPO处理的烧伤伤口之间的差异显著。

图2：局部FN不影响非糖尿病伤口的再生皮肤中的伤口闭合和血流速率。在各种处理后的第0、4、9和14天测定非糖尿病猪的再生皮肤中的伤口闭合和血流速率。(A)非糖尿病猪中溶剂处理、FN处理、EPO处理和EPO/FN处理的烧伤伤口的伤口闭合率。(B)一组溶剂处理、FN处理的烧伤伤口、EPO处理的烧伤伤口和EPO/FN处理的烧伤伤口的代表性的摄影图像(左)和激光多普勒扫描(右)-激光多普勒扫描中的白色圆圈表示第0天的烧伤创面积。深蓝色代表非血管化区域，黄色和红色代表血管化区域，红色区域描绘比黄色区域更具血管化的区域。两个非糖尿病猪的每个处理组的样品大小为12。*p<0.05和**p<0.01是根据双因素ANOVA与Bonferroni的校正结果，表示溶剂处理的烧伤创面和其它处理之间的差异显著。是根据双尾学生t检验的结果，表示EPO/FN-处理和EPO-处理的烧伤伤口之间的差异显著。

图3：局部EPO施用增加糖尿病伤口的再生皮肤中的微血管密度(MVD)和eNOS表达，并且这些效应通过FN增强。(A)是对处理第14天非糖尿病猪(上图)和糖尿病猪(下图)的溶剂、FN-、EPO和EPO/FN-处理的烧伤创面的再生皮肤中的毛细血管内皮细胞的CD31表达的免疫组织化学染色的代表性组的显微照片。通过对每个伤口部位的光学显微镜下的五个随机微观视野(x200放大率)计数毛细血管数来确定再生皮肤中的MVD。(B)在非糖尿病猪上溶剂处理、FN处理、EPO处理和EPO/FN处理的烧伤创面的再生皮肤中的MVD。(C)糖尿病猪的溶剂处理、FN处理、EPO处理和EPO/FN处理的烧伤创面的再生皮肤中的MVD。(D和E)在第14天收集的组织中eNOS表达的代表性蛋白质印迹，然后在从非糖尿病猪(D)和糖尿病猪(E)上的溶剂处理、FN-处理、EPO-处理和EPO/FN-处理的非致死性瘢痕的烧伤伤口的再生皮肤上制备的裂解物上测量。α-肌动蛋白用于标准化蛋白质负载，并且印迹源自在单独的凝胶上同时分析的样品。每个处理组的样品量为12，数据表示为每个处理组的重复测量的平均值±SD(B和C)。*p<0.05和**p<0.01是根据使用Tukey's事后检验(B和C)的单因素方差分析的结果，表示溶剂处理的烧伤创面和其他处理之间的差异显著。并且是根据Tukey's事后检验(C)的单因素方差分析的结果，EPO/FN-处理的和EPO-处理的烧伤伤口之间的差异的显著性。比例尺：200μm(A)。

图4：局部EPO增加糖尿病伤口的再生皮肤中羟脯氨酸(HP)和透明质酸(HA)合成的量，并且该作用通过FN增强。(A)代表性的一组显微照片，表示在第14天非糖尿病猪(上图)和糖尿病猪(下图)上采用溶剂处理、FN-处理、EPO-处理和EPO/FN-处理的烧伤创面的再生皮肤中通过马松三色染色的HP量的免疫组织化学染色。(B)在第14天非糖尿病猪的溶剂处理、FN处理、EPO处理和EPO/FN处理的烧伤创面的再生皮肤中的HP含量。(C)糖尿病猪在溶剂处理、FN处理、EPO处理和EPO/FN处理的烧伤创面的再生皮肤中的HP含量。(D)非糖尿病猪经溶剂处理、FN处理、EPO处理和EPO/FN处理的烧伤创面的再生皮肤中的HA含量。(E)糖尿病猪的溶剂处理、FN处理、EPO处理和EPO/FN处理的烧伤创面的再生皮肤中的HA量。(F和G)在第14天收集的组织中HAS1和HAS2表达水平的代表性蛋白质印迹，然后在非糖尿病猪(F)和糖尿病猪(G)溶剂处理、FN-处理、EPO处理和EPO/FN的再生皮肤制备的裂解物中测量。α-肌动蛋白用于标准化蛋白质负载，并且印迹源自在单独的凝胶上同时分析的样品。每个处理组的样品量为12，数据表示为HP(B和C)或HA(D和E)量±SD的重复测量的平均值。*p<0.05和**p<0.01是根据Tukey's事后检验的单因素方差分析的结果，表示溶剂处理的烧伤伤口和其他处理之间的差异显著。是根据Tukey's事后检验的单因素方差分析的结果，表示EPO/FN-处理的(C)和EPO-处理的烧伤创伤(E)之间的差异显著。比例尺：200μm(A)。

图5：在无创伤的糖尿病皮肤中AQP3表达降低。有代表性的一组非糖尿病猪(A)和糖尿病猪(B)的无创伤皮肤中AQP3的免疫组织化学染色显微照片。比例尺：(左)50μm；(右)200μm(A和B)。(C)有代表性的一组非糖尿病猪和糖尿病猪(D)的无创伤皮肤中AQP3的免疫荧光染色的显微照片。比例尺：200μm(C和D)。(E)DM诱导后30天糖尿病猪和非糖尿病猪的无创伤皮肤中AQP3表达的代表性蛋白质印迹。值表示为AQP3蛋白表达的一式三份测定的平均值±标准偏差和作为无创伤非糖尿病皮肤(100％)中的值的百分比。(G)α-肌动蛋白用于标准化蛋白质负载，并且印迹来自在单独的凝胶上同时运行的样品。(F)从两个糖尿病和两个非糖尿病猪并在第14天收集的烧伤组织的再生皮肤样品制备的无创伤皮肤裂解物中分离总RNA。通过RT-PCR定量AQP3mRNA。值表示为AQP3mRNA表达的一式三份测量的平均值±SD，并且表示为无创伤的非糖尿病皮肤(100％)中的表达的百分比。**p<0.01是根据双尾学生t检验的结果，表示健康和糖尿病猪之间的差异显著。

图6：局部EPO刺激糖尿病伤口的再生皮肤中的AQP3表达，并且该作用通过FN增强。(A和B)在处理14天后收集的非糖尿病猪(A)和糖尿病猪(B)的溶剂处理、FN处理、EPO处理和EPO/FN处理的烧伤创面的再生皮肤中AQP3的免疫组织化学染色的代表性显微照片。比例尺：(A或B；左)50μm；(A或B；右)200μm。(C和D)在两个非糖尿病猪(C)和两个糖尿病猪(D)的溶剂处理、FN处理、EPO处理和EPO/FN凝胶处理创面14天后，AQP3蛋白表达的代表性蛋白质印迹，含有EPO/FN的凝胶值表示为在非糖尿病猪(100％)的溶剂处理的烧伤伤口中AQP3蛋白表达的三次测量的平均值±SD。在处理14天后，来自非糖尿病猪(E)和糖尿病猪(F)的烧伤创面再生皮肤的裂解物中AQP3蛋白表达的代表性蛋白质印迹。α-肌动蛋白用于标准化蛋白质负载，并且印迹来自在单独的凝胶(G和H)上同时运行的样品。从非糖尿病猪(G)和糖尿病猪(H)的溶剂处理、FN处理、EPO处理和EPO/FN处理的烧伤创面的再生皮肤的裂解物中分离总RNA。通过RT-PCR定量AQP3mRNA。值表示为AQP3mRNA表达的重复测量的平均值±SD，并且表示为非创伤性非糖尿病皮肤(100％)中表达的百分比。**p<0.01是根据具有Bonferroni校正的双因素方差分析的结果，表示溶剂处理的烧伤创伤与其它处理之间的差异显著。是根据双尾学生t检验的结果，表示EPO/FN-处理的烧伤伤口和EPO-处理的烧伤伤口之间的差异显著。

图7：AQP3蛋白表达与血管生成度和糖尿病创伤的再生皮肤中的羟脯氨酸(HP)和透明质酸(HA)的量正相关。AQP3蛋白表达与(a)烧伤中的微血管密度(MVD)(r＝0.61)，(b)非糖尿病猪伤口上HP的量(r＝0.79)和(c)HA的量(r＝0.88)。AQP3蛋白表达还与糖尿病猪的烧伤创伤中的(a)MVD(r＝X)、(b)HP量(r＝0.60)和(c)HA量(r＝0.93)显著相关。每个点代表AQP3蛋白表达、MVD以及6个伤口中的HP和HA的量的平均值。

图8：通过HgCl₂抑制AQP3减少了局部EPO对伤口闭合率、血管发生程度以及糖尿病伤口中羟基脯氨酸(HP)和透明质酸(HA)量的影响。在用含溶剂、含高剂量EPO和含EPO/HgCl₂的凝胶处理14天后，测定糖尿病猪再生皮肤的伤口闭合和血流速率。(A)糖尿病猪的溶剂处理、EPO处理和EPO/HgCl₂处理的烧伤的伤口闭合率。(B)在处理14天后，在糖尿病猪上溶剂处理、EPO处理和EPO/HgCl₂处理的烧伤创伤的有代表性的一组摄影图像(上图)和激光多普勒扫描(下图)。深蓝色表示非血管化区域，黄色和红色代表血管化区域，表示比黄色区域更血管化的区域的红色区域的血管化区域。对糖尿病猪中每个处理组中的烧伤创面(n＝6)进行评估和比较。(C)在第14天收集的组织中的eNOS、HAS1和HAS2表达水平的代表性Western印迹，然后在从溶剂处理、FN处理、EPO处理和EPO/FN处理的糖尿病猪的烧伤创面再生皮肤的裂解物中测量。α-肌动蛋白用于标准化蛋白质负载，并且印迹来自在单独的凝胶(D)上同时运行的样品。溶剂处理、EPO处理和EPO/HgCl₂处理的烧伤创面的糖尿病猪的再生皮肤的MVD。(E)糖尿病猪的溶剂处理、EPO处理和EPO/HgCl₂处理的烧伤创面的再生皮肤的HP量。(F)糖尿病猪的溶剂处理、EPO处理和EPO/HgCl₂处理的烧伤创面的再生皮肤的HA量。*p<0.05和**p<0.01是根据Bonferroni校正(A)的双因素方差分析结果，表示溶剂处理烧伤创伤和其他处理之间的差异显著。**p<0.01是根据Tukey's事后检验(D-F)的单因素方差分析的结果，表示溶剂处理的烧伤创伤和其他处理之间的差异显著。是根据双尾学生t检验(D-F)的结果，表示EPO/HgCl₂处理和EPO处理的烧伤创伤之间的差异显著。

图9：高葡萄糖下调人皮肤的角质形成细胞和成纤维细胞中的AQP3表达；EPO的阻断作用。(A)EPO对低葡萄糖(正常)和高葡萄糖培养基中HEKC增殖的影响。(B)EPO对低葡萄糖(正常，NG)和高葡萄糖(HG)培养基(C和D)中NHBC增殖的影响。在NG或HG培养基中培养5天后被制备成EPO处理的HEKCs和NHBCs的裂解物中AQP3表达水平的代表性蛋白质印迹。使用α-肌动蛋白在单独的凝胶(E和F)上进行标准化。HEKCs(E)和NHBC(F)中AQP3表达水平的免疫组织化学染色的代表性的一组显微照片。比例尺：500μm。**p<0.01是根据Tukey's事后检验的单因素方差分析的结果，表示差异显著。

图10：表示EPO/FN处理的多周内慢性糖尿病足溃疡的长度和宽度减小的线形图。

图11：表示EPO/FN处理多周后慢性糖尿病足溃疡的溃疡面积减少的线形图。

图12：EPO/FN处理多周后慢性糖尿病足溃疡的伤口闭合的代表性照片。

图13：在EPO/FN处理的多周之前和之后的慢性糖尿病足溃疡的代表性照片。

具体实施方式

I.本发明

正是在这种背景下，本发明人假定EPO对DSU愈合的处理有益的作用部分是由于其刺激皮肤中AQP3表达的能力。该假设在具有实验诱导的1型DM和部分深度皮肤烧伤的猪中测试。结果发现在糖尿病猪上局部EPO处理烧伤可通过刺激血管生成和ECM生成的AQP3依赖性机制加速其愈合。另外的证据表明FN可以加强EPO对糖尿病猪的烧伤的愈合的加速作用。还建议糖尿病足部伤口可以根据本发明进行治疗。人的治疗也考虑在内。

因此，本发明部分涉及如上文和本文其它地方所述的制剂和伤口治疗。它还部分涉及含有凝胶、红细胞生成素和纤连蛋白的药物组合物，其中在所述组合物中含有一定量的纤连蛋白，在施用于伤口时可以增强红细胞生成素的有益作用。

一种处理伤口的方法，包括向伤口局部施用治疗有效量的如上所述和本文其它部分的制剂，以便治疗和/或加速伤口愈合，例如烧伤或糖尿病足伤。

不限于任何特定的理论，据说愈合通过激活血管生成，触发胶原和透明质酸合成和细胞外基质(ECM)形成，并刺激角质形成细胞的上皮形成的AQP3依赖性机制起作用。在制剂中加入纤连蛋白可以加强EPO对烧伤损伤愈合的加速作用。

II.定义

因此，根据本发明的一个方面，提供了在有需要的受试者中促进伤口愈合和***重建的方法。在一些实施方案中，受试者被诊断或怀疑患有糖尿病。在其他实施方案中，受试者被诊断患有或怀疑患有高血糖或胰岛素耐受。

本文使用的短语“***”是指其中细胞外基质(ECM)和特异性胶原形成主要部分的动物组织，该组织起到支持并将其它身体组织和部分彼此结合的作用。典型的例子是皮肤和内脏。

本文使用的短语“***重建”是指对受损或不健康的组织恢复美学、结构、功能和生理学。这种重建导致再生愈合。此外，***重建是指健康组织中胶原产生的增加。在示例性实施例中，重建导致组织恶化停止。在其他示例性实施方案中，***重建避免纤维化。

本文使用的短语“受损或不健康的组织”是指偏离健康的功能组织。在皮肤的情况下，比健康皮肤更弱，更没弹性，更容易受伤的皮肤。不健康或受损皮肤的结构劣于健康皮肤(例如，真皮和表皮含有较少的细胞和胶原)。处理不健康皮肤的一个目的是减少皮肤的进一步恶化并将其功能恢复到正常或接近正常水平。

本文所用的短语“健康组织”是指坚固、有弹性、光滑和丰满的皮肤。处理健康皮肤的一个目的是防止由老化或环境应激(包括过度的阳光和微生物感染)引起的皮肤老化。

关于***的术语“促进”是指以允许组织再生的方式增加皮肤细胞例如成纤维细胞和角质形成细胞的胶原产生的过程。因此，在本发明的一些实施方案中，促进指组织再生的至少约10％、20％、50％、80％的增加或组织降解中至少约10％、20％、50％、80％的抑制。本领域技术人员将理解，可以使用各种方法和测定来评估组织再生的促进，并且类似地，可以使用各种方法和测定来评估组织降解的停滞。

本文所用的术语“伤口”广泛地指皮肤和皮下组织以及以各种方式中的任一种引发的内部器官的损伤(例如，糖尿病性溃疡、来自扩张床休息的压疮、由创伤引起的伤口、在外科手术期间或之后产生的伤口等)并且具有不同的特性。实例包括但不限于瘀伤、刮伤、烧伤、晒伤、切口伤口、切除伤口、手术伤口、坏死性筋膜炎、溃疡、静脉淤滞性溃疡、糖尿病性溃疡、褥疮性溃疡、口疮性溃疡、斑秃、皮炎、过敏性接触性皮炎、特应性皮炎、伯洛克性皮炎、尿布性皮炎、汗性皮炎、银屑病、湿疹、红斑、疣、***疣、血管瘤、樱桃血管瘤、足癣、非典型痣、基底细胞癌、大疱性类天疱疮、念珠菌、软骨炎性皮炎、克拉克氏痣、伤口疮、疣状瘤、囊肿、Darier病、皮肤纤维瘤、盘状红斑狼疮、钱币性湿疹、特应性湿疹、异常性皮肤湿疹、手湿疹、多形性红斑结膜炎、Fordyce病、毛囊炎、肉芽肿、格罗弗氏病、热疹、单纯疱疹、带状疱疹(带状疱疹)、化脓性汗腺炎、荨麻疹、多汗症、鱼腥草、脓疱病、睑缘炎、瘢痕疙瘩、扁平癣、扁平苔癣样角化病、、扁桃腺炎、淋巴瘤样***状瘤、皮肤皱me病、莱姆病、扁癣、粘液囊肿、真菌病、真菌病、痣、指甲真菌、糖尿病脂性渐进坏死、钱币状皮炎、Onychosizia、灰指甲、斑丘疹性红皮病、玫瑰糠疹、毛发红糠疹、足底疣、毒葛、Poison Oak、Pompholyx、须部假性毛囊炎、***瘙痒和白色糠疹。

根据伤口的深度，伤口通常分为四个等级中：(i)I级：限于上皮的伤口；(ii)II级：延伸到真皮中的伤口；(iii)III级：延伸到皮下组织中的伤口；(iv)IV级(或全层伤口)：骨暴露的伤口(例如，骨压力点，例如大转子或骶骨)。

本文使用的术语“部分厚度伤口”是指涵盖I-III级的伤口；部分厚度伤口的实例包括烧伤、压疮、静脉淤滞性溃疡和糖尿病性溃疡。

本文使用的术语“深部伤口”意在包括III级和IV级伤口。

本文使用的术语“慢性伤口”是指在三十天内没有愈合的伤口。

关于伤口的“愈合”术语是指例如通过瘢痕形成修复伤口的过程(在示例性实施例中，愈合没有纤维化组织形成)。

在具体实施方案中，本发明的一些实施方案的组合物促进，即加速愈合过程。

短语“诱导或加速皮肤伤口的愈合过程”是指诱导伤口收缩的肉芽组织形成和/或诱导上皮形成(即，上皮中新细胞的产生)。伤口愈合通过减少伤口面积方便地测量。

在一些方面，考虑了治疗所有伤口类型，包括深部伤口和慢性伤口。

如本文所用，术语“治疗”是指例如通过增强灌注来预防、治愈、逆转、减弱、减轻、最小化、抑制或停止缺血性病症的有害作用。本领域技术人员将理解，可以使用各种方法和测定来评估病症的发展，并且类似地，可以使用各种方法和测定来评估病症的减轻、缓解或消退。

可以通过常规实验评价治疗，例如下文实施例部分中描述的模型。可以采用诸如灌注和存活的结果测量以及组织学和功能标准来评估改变不同参数的功效，以便在治疗皮肤伤口时获得具有最大治疗价值的细胞数目的最佳效率。本领域已知的可以量化以确定受影响组织中的灌注的其它参数是血管造影术和MRI，以及临床参数，例如受影响区域中的组织坏死程度，组织溃烂和手指和/或肢体的截肢。

在伤口愈合的上下文中，“促进”是指以允许其治疗的方式，允许或辅助伤口愈合的能力。因此，在本发明的一些实施方案中，促进是指实现愈合所需的时间减少至少约10％、20％、50％、80％或至少约10％、20％、50％、80％伤口闭合。

如本文所用，术语“受试者”是指在任何阶段和/或程度经历或可能经历组织损伤或患有伤口或缺血的任何年龄的任何哺乳动物(例如人或驯养动物)，男性或女性。

如上所述，根据本发明的该方面的方法通过向受试者局部施用指定剂量的EPO和FN来实现。

如本文所用，术语“红细胞生成素”(EPO)是指哺乳动物(例如人)红细胞生成素蛋白(与多肽可互换使用)或其模拟物，如GenBank登录号NP_000790中所述。红细胞生成素可以使用重组DNA技术或固相技术合成。红细胞生成素也可商购获得(例如，Cytolab/Peprotech，Rehovot，Israel；Arenesp，Amgen，Thousand Oaks，CA，USA；以及Epogen，Amgen，Thousand Oaks，Calif。，USA，Bristol-Myers Squibb，Roche和Sanofi-Aventis)。红细胞生成素可以用作整个糖蛋白或仅作为缺乏结合糖的蛋白质亚基。由于本发明实施方案的红细胞生成素用于临床应用，其优选是无菌的或可对可能的污染因子(例如细菌或细菌组分，例如通过过滤器)进行纯化。

如本文所用，术语“纤连蛋白”(FN)是指哺乳动物(例如人)纤连蛋白(蛋白与多肽可互换使用)或其模拟物，如GenBank登录号NP_002017中所述。纤连蛋白可以使用重组DNA技术或固相技术合成。纤连蛋白也是可商购的(例如，Chemicon International Inc.，Temecula，Calif，USA)。由于本发明的纤连蛋白用于临床应用，其优选是无菌的或可对可能的污染因子(例如细菌或细菌组分，例如通过过滤器)进行纯化。

应当理解，当使用模拟组合物时，FN和EPO的剂量应当根据摩尔值校准。这样的校准是本领域普通技术人员的常规计算。

本发明的药物或化妆品组合物可以包含共制剂中的红细胞生成素和纤连蛋白(例如在下文实施例1中提供的)或两种分开的组合物。

如本文所用，短语“局部施用”是指将本发明的组合物施用或铺展到身体表面，即皮肤、头皮、毛发、指甲等上，优选在受损组织的表面上(例如，皮肤)，伤口或在伤口或糖尿病性溃疡的表面上。当不共制剂时，红细胞生成素和纤连蛋白的施用可以伴随地或顺序地进行。

应当理解，根据本发明的教导施用的红细胞生成素和纤连蛋白的剂量可以变化。因此，红细胞生成素可以以10-30μg/cm²组织的剂量施用，这取决于待治疗的组织损伤或伤口的严重程度。在一个实施方案中，红细胞生成素的剂量为15-25μg/cm²组织。在另一个实施方案中，红细胞生成素的剂量为约20μg/cm²组织。

根据待治疗的组织损伤或伤口的严重程度，纤连蛋白可以以100-300μg/cm²组织的剂量施用。在一个实施方案中，纤连蛋白的剂量在150-250μg/cm²组织之间。在另一个实施方案中，纤连蛋白的剂量为约200μg/cm²组织。

在具体实施方案中，所施用的红细胞生成素的剂量为0.1-10μg/cm²组织。在其它实施方案中，施用的纤连蛋白的剂量在10-100μg/cm²组织之间。在某些实施方案中，红细胞生成素和/或纤连蛋白的剂量适用于化妆品。例如，红细胞生成素和/或纤连蛋白的剂量可适于治疗受伤的皮肤。因此，本发明的制剂还可以用于美容和/或用于小伤口愈合以治疗皮肤病症，所述皮肤病症具有由于刮擦，软皮肤裂纹，痤疮等非限制性实例造成的小的或微小的伤口。因此，本发明部分涉及通过将足量的本发明的组合物施用于受伤的皮肤表面以美容治疗所述表面，例如其中受伤的皮肤表面是由刮擦、软皮肤裂纹、痤疮等造成的。

本发明还涉及一种通过将足量的本发明组合物施用到受伤的皮肤表面以愈合受伤的皮肤表面，例如其中受伤的皮肤表面是由刮擦、软皮肤裂纹、痤疮等造成的。

包含实施方案的红细胞生成素和/或纤连蛋白的组合物可以依其本身或在药物或化妆品组合物中施用于受试者。在一些方面，将实施方案的红细胞生成素和/或纤连蛋白配制在基质中。在具体方面，基质是凝胶。在其他具体实施方案中，凝胶是水凝胶。

如本文所用，“药物或化妆品组合物”是指本文所述的活性成分与其它化学组分如生理学合适的溶剂和溶剂的制剂。所述组合物的目的是促进活性成分(例如EPO和FN)给予受试者。

如本文所用，术语“活性成分”是指对预期的生物效应负责(即，促进伤口愈合、***重建和治疗缺血)的红细胞生成素和纤连蛋白组合物。

在下文中，可互换使用的短语“生理学上可接受的溶剂”和“药学上可接受的溶剂”是指不对受试者造成显著刺激且不消除所施用的活性成分的生物活性和性质的溶剂或稀释剂。在这些短语下包括佐剂。

本文中，术语“赋形剂”是指添加到组合物(药物组合物或化妆品组合物)中以进一步促进本发明的活性成分的施用的惰性物质。

用于配制和施用药物的技术可以在“Remington's Pharmaceutical Sciences，”Mack Publishing Co.,Easton,Pa.最新版本中找到，其通过引用并入本文。

组合物可以配制成单位剂型。在这种形式中，制剂被细分为含有适当量的活性成分的单位剂量，例如用于单次施用。单位剂型可以是包装的制剂，包装含有离散量的制剂，例如胶粘绷带、非胶粘绷带、擦拭物、婴儿擦巾、纱布、垫和卫生巾。

根据本发明的教导的单位剂型可以包含约10-30μg的剂量的红细胞生成素，约100-300μg的剂量的纤连蛋白或者约10-30μg的剂量的红细胞生成素和纤连蛋白剂量为约100-300μg。在一个实施方案中，单位剂型包含约15-25μg的剂量的红细胞生成素，约150-250μg的剂量的纤连蛋白或约15-25μg的剂量的红细胞生成素和约15-25μg的剂量的纤连蛋白150-250μg。在另一个实施方案中，单位剂型包含约20μg的剂量的红细胞生成素，约200μg的剂量的纤连蛋白或约20μg的剂量的红细胞生成素和约200μg的剂量的纤连蛋白。另外，根据本发明的教导的单位剂型可以包含约0.1-10μg的剂量的红细胞生成素，约10-100μg的剂量的纤连蛋白或者约0.1-10μg的剂量的红细胞生成素和约10-100μg剂量的纤连蛋白。

单位剂量制剂中活性化合物的量可以根据具体应用而改变或调整。

本发明的组合物(例如药物或化妆品组合物)可以以局部方式施用，例如通过将组合物直接施用于患者的组织区域(例如伤口)上。适当组合物的施用途径可以例如包括局部(例如，施用于角质组织，例如皮肤，毛发，指甲，头皮)和粘膜(例如口腔，***，眼睛)施用。

本发明的组合物本发明也可以通过注射包含活性成分(例如EPO和FN)的组合物和生理学上可接受的溶剂来施加。对于局部施用，组合物可以注射到伤口中，和/或注射到围绕伤口皮肤的健康皮肤中，或两者。本发明的组合物可以通过本领域熟知的方法制备，例如通过常规混合、溶解、制粒、糖衣丸制造、研磨、乳化、包封、包埋或冻干方法制备。

活性成分也可以是在使用前用合适的溶剂例如无菌、无热原的水基溶液配制的粉末形式。

因此，根据本发明使用的组合物可以以常规方式使用一种或多种生理学上可接受的包括赋形剂和助剂的载体配制，其有助于将活性成分加工成制剂。适当的制剂取决于所选择的施用方法。

确定治疗有效量完全在本领域技术人员的能力范围内，特别是根据本文提供的详细公开内容。

对于在本发明的方法中使用的任何制剂，(治疗)有效量或剂量可以最初从体外测定法估计。此外，可以在组织培养***或动物模型中配制剂量以达到所需的浓度或滴度。这样的信息可以用于更准确地确定人体中的有用剂量。

本文所述的活性成分的毒性和治疗功效可以通过体外、细胞培养或实验动物中的标准药学程序来确定。从这些体外和细胞培养测定和动物研究中获得的数据可用于配制用于人的剂量范围。剂量可以根据所使用的剂型和所使用的施用途径而变化。确切的制剂、施用途径和剂量可以由个体医生根据患者的状况来选择。(参见例如Fingl，E。等人(1975)，“The Pharmacological Basis of Therapeutics，”Ch.1，第1页)。

取决于病症的严重程度(例如，组织损伤、伤口或缺血的面积、深度和程度)和组织的反应性，施用可以是单次或多次施用，治疗过程持续从几天到几周或直到实现治愈或实现皮肤病症的减轻。优选地，本发明的组合物每天至少施用一次。待施用的组合物的量当然将取决于所治疗的受试者，痛苦的严重程度，施用方式，判断的处方医师等。

如果需要，本发明的组合物可以存在于包装或分配器装置中，例如FDA批准的试剂盒，其可以含有活性成分的一个或多个单位剂型。包装可以例如包括金属或塑料箔，例如泡罩包装。包装或分配器装置可以伴随有施用说明书。包装或分配器装置还可以伴随有由管理药物的制造，使用或销售的政府机构规定的形式的通知，该通知反映了该机构批准用于人或兽医的组合物的形式行政。例如，这种通知可以包括由美国食品和药物管理局批准的用于处方药的标签或批准的产品插页。还可以制备包含配制在药学上可接受的溶剂中的本发明制剂的组合物，置于合适的容器中，并标记用于治疗指定的病症，如上文进一步详述。

因为本发明的组合物在体内使用，所述组合物优选是高纯度的并且基本上没有潜在有害的污染物，例如至少国家食品(NF)级，通常至少分析级，并且优选至少药物级。就给定化合物必须在使用前合成的程度而言，此类合成或随后的纯化将优选产生基本上不含可能在合成或纯化过程中使用的任何潜在污染毒性剂的产品。

可将其它因子掺入本发明的组合物或凝胶(即上文所述的红细胞生成素和纤连蛋白)中。这些包括但不限于细胞外基质组分(例如玻连蛋白、层粘连蛋白、胶原、弹性蛋白)，生长因子(例如FGF1、FGF2、IGF1、IGF2、PDGF、EGF、KGF、HGF、VEGF、SDF-1、GM-CSF、CSF、G-CSF、TGFα、TGFβ、NGF和ECGF)、缺氧诱导因子(例如HIF-1α和β和HIF-2)、激素(例如胰岛素、GH)、CRH、瘦蛋白、催乳素和TSH)、血管生成因子(例如血管生成素和血管生成素)、凝血和抗凝血因子[例如因子I、因子XIII、组织因子、钙、vWF、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、纤连蛋白、抗凝血酶、肝素、纤溶酶原、低分子量肝素(Clixan)、高分子量激肽原(HMWK)、前激肽释放酶、纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI1)、纤溶酶原激活物抑制剂-2(PAI2)、尿激酶、血栓调节蛋白纤溶酶原激活剂(tPA)、α2-抗纤溶酶和蛋白Z相关蛋白酶抑制剂(ZPI)]、细胞因子(IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13和INF-α、INF、β和INF-、MCP-1或CCL2)、酶(例如、内切糖苷酶、外切糖苷酶、核酸内切酶、核酸外切酶、肽酶、脂肪酶、氧化酶、脱羧酶、水蛭酶、软骨素酶、软骨素酶ABC、软骨素酶AC、透明质酸酶、角质酶、肝素酶、肝素酶剪接变异、胶原酶、胰蛋白酶、过氧化氢酶)、神经递质(例如乙酰胆碱和单胺)、神经肽(例如物质P)、维生素(例如D-生物素、氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、D-泛酸、钙盐、吡哆醛、盐酸吡哆醇、盐酸核黄素、硫胺素维生素B、维生素E、维生素C、维生素D、维生素B1-6、维生素K、维生素A和维生素PP)、碳水化合物(例如包括葡萄糖、甘露糖、麦芽糖和果糖的单/二/螯合剂(例如Fe螯合剂、Ca螯合剂)、抗氧化剂(例如维生素E、Quarcetin、超氧化物清除剂、超氧化物歧化酶)、H₂O₂清除剂、自由基清除剂、Fe清除剂)、脂肪酸(例如甘油三酯、磷脂、胆固醇、游离脂肪酸和非游离脂肪酸、脂肪醇、亚油酸、油酸和硫辛酸)、抗生素(例如青霉素、头孢菌素和四环素)、镇痛药、麻醉剂、抗菌剂、抗酵母剂、抗真菌剂、、益生菌剂、抗原虫剂、抗瘙痒剂、抗皮炎剂、止吐剂、抗炎剂、抗过度角质化剂、止汗剂、抗牛皮癣剂、抗脂溢剂、抗组胺剂、氨基酸(例如、必需的和非必需的(来自AZ)、特别是谷氨酰胺和精氨酸)、盐(例如、脯氨酸盐和硫酸盐)、硫酸盐硫酸钙)、类固醇(例如雄激素、***、孕激素、糖皮质激素和盐皮质激素)、儿茶酚胺(例如肾上腺素和去甲肾上腺素)、核苷和核苷酸(例如Purins和Pyrimidines)、***素(例如***素E2)、白三烯、红细胞生成素(例如血小板生成素)、蛋白聚糖(例如硫酸乙酰肝素、硫酸角质素)、羟基磷灰石羟基磷灰石(Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂)]、触珠蛋白(Hp1-1、Hp2-2和Hp1-2)、超氧化物歧化酶(例如SOD 1/2/3)、一氧化氮、一氧化氮供体、谷胱甘肽过氧化物酶、保湿化合物(例如加压素)、细胞(例如血小板)、细胞培养基(例如M199，DMEM/F12，RPMI，Iscovs)，血清(例如人血清，胎牛血清)、缓冲液(例如HEPES、碳酸氢钠)、洗涤剂(例如Tween)、消毒剂、草药、果实提取物、蔬菜提取物(例如卷心菜、黄瓜)、花提取物、植物提取物、类黄酮例如石榴汁)、香料、叶子(例如绿茶、洋甘菊)、多酚(例如红葡萄酒)、蜂蜜、凝集素、微粒、纳米颗粒(lyposomes)、胶束、碳酸钙(CaCO₃、例如沉淀碳酸钙、研磨/碳酸盐、卤化银、PCC、GCC)、方解石、石灰石、粉碎的大理石、磨碎的石灰石、石灰、白垩(例如白垩粉、香槟白垩、法式白垩)和辅因子例如BH4(四氢生物喋呤)。

本发明的组合物还可以含有这样的成分、物质、元素和材料，其含有氢、烷基、芳基、卤素基团、羟基、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、酰基、羧基、氨基酰胺基、磺酰胺基、氨基酰基、酰胺基、胺基、硝基、有机硒化合物、烃和环烃。

本发明的组合物可以与这样的物质结合，所述物质诸如过氧化苯甲酰、血管收缩剂、血管扩张剂、水杨酸、视黄酸、壬二酸、乳酸、乙醇酸、pyreuric酸、单宁、苯并樟脑及其衍生物。

本发明的一些实施方案的组合物可以与聚乙二醇(例如PEG，SE-PEG)生物结合，聚乙二醇保持活性成分(即本发明的EPO和/或FN组合物)的稳定性(例如针对蛋白酶活性)和/或溶解性(例如，在生物流体例如血液、消化液内)，同时保持其生物活性并延长其半衰期。

除了本文公开的药学有效量的药剂外，本发明这一方面的组合物还包括皮肤病学可接受的载体。

短语“皮肤病学可接受的载体”是指适合于局部施用到皮肤即角质组织上，具有良好的美学性能，与本发明的活性剂和任何其它组分相容，并且是安全的而且对哺乳动物无毒的的载体。

为了增强活性成分(例如本发明的红细胞生成素和/或纤连蛋白)的经皮吸收，可以向组合物中加入一种或多种试剂，包括但不限于二甲基亚砜、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、表面活性剂、氮酮、醇、丙酮、丙二醇和聚乙二醇。

在本发明的组合物中使用的载体可以是各种各样的形式。这些包括乳液溶剂，包括但不限于水包油、油包水、水包油包水和硅氧烷包水包油乳剂、霜剂、软膏、水溶液、洗剂、肥皂、糊剂、乳剂、凝胶、喷雾剂或气雾剂。如本领域技术人员将理解的，取决于组分在组合物中的水溶性/分散性，给定的组分将主要分布在水或油/硅氧烷相中。

根据本发明的乳剂通常含有药学有效量的本文公开的药剂和脂质或油。脂质和油可以来自动物、植物或石油，并且可以是天然的或合成的(即人造的)。合适的乳化剂的实例描述于，例如，授予Dickert等人的美国专利3,755,560。1973年8月28日；美国专利1983年12月20日授予Dixon等人的美国专利4,421,769；和McCutcheon's Detergents andEmulsifiers，North American Edition，第317-324页(1986)，其各自通过引用整体并入本文。

乳液还可以含有消泡剂，以在施用于角质组织时使起泡最小化。消泡剂包括高分子量的硅氧烷和本领域公知的用于这种用途的其它材料。

合适的乳液可以具有宽范围的粘度，这取决于所需的产品形式。

包含水包油乳液的合适溶剂的实例描述于美国1991年12月17日授予Turner，D.J.等人的美国专利5,073,371，1991年12月17日授予Turner，D.J等人的美国专利5,073,372中，其各自通过引用全部并入本文。下文中详细描述了包含结构化试剂、亲水性表面活性剂和水的特别优选的水包油乳液。

优选的水包油乳液包含结构剂以有助于形成液晶凝胶网络结构。不受理论的限制，认为结构剂有助于为组合物提供有助于组合物稳定性的流变特性。结构化试剂也可以用作乳化剂或表面活性剂。

多种阴离子表面活性剂也可用于本文。参见，例如，1975年12月30日授予Laughlin等人的美国专利3,929,678，其全部内容通过引用全部并入本文。此外，两性和两性离子表面活性剂也可用于本文。

本发明的组合物可以配制为制药工业所使用的各种形式的任何形式，包括溶液、洗剂，喷雾剂、霜剂、软膏、油膏、凝胶、油剂、洗剂等，如下所述。

本发明的组合物可以配制成足够粘以保留在被治疗的皮肤区域上，并且不容易蒸发和/或不容易通过用水冲洗除去，但可以借助于皂，清洁剂和/或洗发水除去。

制备具有这种性质的组合物的方法是本领域技术人员公知的，并且详细描述于Remington's Pharmaceutical Sciences，1990(同上)；和Pharmaceutical Dosage Formsand Drug Delivery Systems，第6版，Williams&Wilkins(1995)。

本发明的局部组合物，包括但不限于洗剂和乳膏，可以包含皮肤病学上可接受的润肤剂。如本文所用，“润肤剂”是指可用于预防或缓解干燥以及用于保护皮肤的材料。多种合适的润肤剂是已知的并且可以在本文中使用。参见例如Sagarin，Cosmetics，Scienceand Technology，第2版，1，第3243页(1972)，其包含适合作为润肤剂的多种材料的实例，并且通过引用完全并入本文。优选的润肤剂是甘油。

根据本发明的洗剂和霜剂通常包含溶液载体***和一种或多种润肤剂。

本发明的局部施用的组合物还可以包括添加的附加组分，例如为了使组合物富含香料和皮肤营养因子。

在合理的医学判断范围内，选择这些组分适合用于人角质组织而不诱导毒性、不相容性、不稳定性、过敏反应等。此外，这些任选的组分是有用的，只要它们不会不可接受地改变本发明的活性化合物的益处。

CTFA Cosmetic Ingredient Handbook，第二版(1992)描述了通常用于皮肤护理工业中的各种各样的非限制性化妆品成分，其适用于本发明的组合物中。这些成分类的实例包括：研磨剂、吸收剂、美容组分如香料、颜料、着色剂/着色剂、精油、皮肤感觉剂、收敛剂等(例如丁香油、薄荷醇、樟脑、桉树油、丁子香酚、乳酸薄荷酯、痤疮榛子馏分)、抗痤疮剂、抗结块剂、消泡剂、抗微生物剂(例如丁基氨基甲酸碘丙酯)、抗氧化剂、粘合剂、生物添加剂、缓冲剂、填充剂、螯合剂、化学添加剂、收敛剂、化妆品杀生物剂、变性剂、药物收敛剂、外用止痛剂、成膜剂或用于帮助组合物的成膜性和亲和性的材料(例如聚合物)、遮光剂、pH调节剂、推进剂、还原剂、多价螯合剂、皮肤调理剂(例如、湿润剂、包括混合和闭塞)、皮肤舒缓和/或愈合剂(例如泛醇和衍生物(例如乙基泛醇)、芦荟、泛酸及其衍生物、尿囊素、红没药醇和甘草酸二钾)、皮肤治疗剂、增稠剂和维生素及其衍生物。

本发明的组合物可以直接施用于皮肤。或者，其可以通过本领域已知的各种透皮药物递送***通过正常皮肤施用递送，例如以时间释放方式将组合物释放到皮肤中的透皮贴剂。本领域已知的其它药物递送***包括加压气溶胶瓶，离子电渗疗法或超声波导入。离子电渗用于增加皮肤渗透性和促进透皮递送。美国专利5,667,487和5,658,247公开了适用于超声离子电渗疗法介导的治疗剂跨皮肤转运的电离子声器。或者/并且，脂质体或胶束也可用作递送溶剂。

由于伤口和缺血可涉及头皮，本发明的组合物还包括适用于头皮皮肤和头发的润肤剂，表面活性剂和/或调理剂。润肤剂包括但不限于烃油和蜡，例如矿物油、凡士林等，植物和动物油和脂肪，例如橄榄油、棕榈油、蓖麻油、玉米油、大豆油、羊毛脂及其衍生物，例如羊毛脂、羊毛脂油、羊毛脂蜡、羊毛脂醇等。其它润肤剂包括具有10至20个碳原子的脂肪酸的酯、例如包括肉豆蔻酸、硬脂酸、异硬脂酸、棕榈酸等，例如肉豆蔻酸甲酯、肉豆蔻酸丙酯、肉豆蔻酸丁酯、硬脂酸丙酯、异硬脂酸丙酯等。其它润肤剂包括具有10至20个碳原子的脂肪酸、包括硬脂酸、肉豆蔻酸、月桂酸、异硬脂酸、棕榈酸等。润肤剂还包括具有10至20个碳原子的脂肪醇、例如鲸蜡醇、肉豆蔻醇、月桂醇、异硬脂醇、硬脂醇等。

当配制本发明的组合物用于头发时，优选使用乳化剂/表面活性剂。

表面活性剂的实例包括但不限于具有可与亲水性环氧烷烃、聚环氧乙烷、环氧丙烷、环氧丁烷、聚环氧乙烷缩合的游离反应性氢的疏水烷基、烯烃或烷基芳族官能团的聚氧化烯氧化物缩合产物。特别有效的是由Rohm&Haas公司以其商标TRITON 100系列产品出售的辛基酚与约7至约13摩尔环氧乙烷的缩合产物。

在实施方案的组合物中还包括其它成分，例如香料、稳定剂、染料、抗微生物剂、抗菌剂、抗附聚物、紫外线辐射吸收剂等。

优选还使用对酸水解稳定的调节剂，例如具有至少一个季铵部分的硅氧烷化合物以及乙氧基化的单季铵盐，以稳定和任选地增稠实施方案的组合物。

可用于使本发明的组合物不透明的材料包括脂肪酯，不透明聚合物，例如苯乙烯聚合物，如来自Morton，International，Inc.的OPACIFIER 653^TM和脂肪醇。以下是脂肪醇的非限制性列表：鲸蜡醇、硬脂醇、鲸蜡硬脂醇、山嵛醇和花生醇。本发明的不透明的调理组合物还可以包括Lexamine S-13、二鲸蜡基氯化铵和鲸蜡硬脂醇聚醚-20。在一个具体的实施方案中，红细胞生成素和纤连蛋白制剂包含约10-30μg/mL红细胞生成素和约100-300μg/mL纤连蛋白、约0.20％对羟基苯甲酸甲酯、约9％月桂醇聚醚和异链烷烃和聚丙烯酰胺、约12％和添加至100％的磷酸盐缓冲液。

在另一个实施方案中，红细胞生成素和纤连蛋白制剂包含红细胞生成素(EPO)(5％w/w)、纤连蛋白(FN)(30％w/w)，甘油(5％，w/w)，苯甲醇(BA)(2％，w/w)，三乙醇胺(0.9％，w/w)，对羟基苯甲酸甲酯(0.2％w)和水(至100％，w/w)。

在其它实施方案中，红细胞生成素和纤连蛋白制剂或组合物包含浓度为0.01％至30％(w/w)之间的任何值红细胞生成素，浓度为0.01％至50％(w/w)，浓度为0.01％至30％(w/w)之间任何值的甘油，浓度为0.01％至30％(w/w)之间任何值的Carbomer 940，浓度为0.01％至30％(w/w)之间任何值的苯甲醇、浓度为0.01％至30％(w/w)之间任何值的三乙醇胺、浓度为0.01％至30％(w/w)之间任何值的对羟基苯甲酸甲酯、浓度为0.01％至30％(w/w)之间任何值的对羟基苯甲酸丙酯和在0.01％至100％(w/w)之间的任何值的水。

因此，本发明的实施方案包括用于促进血管生成和伤口愈合的局部组合物。

应当理解，本发明的组合物可以与其他目前实行的疗法组合使用，例如但不限于光/光疗法(例如，Dermanwand TM for Wound Care by National BiologicalCorp.Beachwood，Ohio)和超声治疗(参见例如美国专利6,960,173)。

预期在从本申请成熟的专利的寿命期间，将开发许多相关的红细胞生成素和纤连蛋白组合物，并且术语红细胞生成素和纤连蛋白组合物的范围旨在包括所有这些新技术。

如本文所用，术语“约”是指±10％。

红细胞生成素和纤连蛋白组合物和制剂描述于US2014/0154205A1(“Erythropoietin And Fibronectin Compositions For Therapeutic And CosmeticApplications”)和US2010/0310626A1(“Erythropoietin And Fibronectin CompositionsFor Bone Regeneration”)中，通过引用整体并入本文。

III.实施例

包括以下实施例以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解，以下实施例中公开的技术代表由发明人发现的在本发明的实践中良好地起作用的技术，因此可以被认为构成其实践的优选模式。然而，根据本公开，本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施例进行许多改变，并且仍然获得相同或相似的结果。

实施例1

四头猪，两头DM猪和两头对照猪完成了14天的试验期。两只糖尿病猪的血糖和糖化血红蛋白(HbA1c)水平显著升高，体重低于两只对照猪。用含溶剂、FN、EPO和EPO/FN的凝胶进行烧伤局部治疗没有改变(a)糖尿病猪中的红细胞、白细胞或血小板计数和升高的血糖水平，以及(b)对照组和糖尿病猪的血液血红蛋白和HbA1c水平(表1)。

表1：糖尿病对猪体重和局部伤口治疗对血液学的影响。

值表示为平均值±标准偏差。(n)猪数。统计显著性设定在5％。*p<0.05，是在第0、7天和

第14天之间组中的差异显著性；NS，不显著；RBC，红细胞；HbA1c，糖化血红蛋白。

局部EPO加速伤口闭合并以剂量依赖性方式增加糖尿病伤口的再生皮肤中的血流量，并且这种效果通过FN加强。EPO处理、FN处理和EPO/FN处理的糖尿病伤口比溶剂处理的糖尿病伤口闭合更快。在从第4天起，在溶剂处理和EPO/FN处理的糖尿病伤口之间检测到伤口闭合率最显著差异。从第4天开始，EPO/FN处理伤口的伤口闭合率显著快于FN-处理和EPO-处理的糖尿病伤口的闭合率。从第9天起，EPO处理的糖尿病伤口闭合速率比FN-处理的糖尿病伤口的闭合速率快(图1A)。

溶剂处理的糖尿病伤口的闭合率显著慢于溶剂处理的健康伤口的闭合率。EPO处理的糖尿病伤口的闭合率是剂量依赖性的。高剂量EPO处理的糖尿病伤口的闭合率显著快于低剂量EPO处理的糖尿病伤口的闭合率。此外，低剂量EPO处理的糖尿病伤口的闭合率显著快于溶剂处理的糖尿病伤口的闭合率(图1B)。

从第2天起溶剂处理的糖尿病伤口中的血流量小于溶剂处理的非糖尿病伤口中的血流量。还发现EPO处理的糖尿病伤口中的血流与EPO/FN-处理的糖尿病伤口的血流没有显著不同，并且这两种血流量显著高于溶剂处理和FN处理的糖尿病伤口(图1C；右图)。高剂量EPO处理的糖尿病伤口中的血流量显著高于从第4天开始的溶剂处理的糖尿病伤口中的血流量，以及从第7天开始的低剂量EPO处理的糖尿病伤口中的血流量。在低剂量EPO处理的糖尿病伤口中的血流量显著高于从第9天开始的溶剂处理的糖尿病伤口中的血流量(图1D；右图)。

局部FN不影响非糖尿病伤口的再生皮肤中的伤口闭合和血流。健康猪的溶剂处理和FN处理的伤口的闭合率和血流非常相似。从第4天起，EPO处理的非糖尿病性伤口的伤口闭合率和血流量显著大于溶剂处理和FN处理非糖尿病性伤口的闭合率和血流量。有趣的是，在4-11天阶段在健康猪上EPO/FN处理的伤口和溶剂处理的伤口、FN处理和EPO处理的伤口之间检测到伤口闭合率和血流的最显著差异(图2A和2B)。

局部EPO增加糖尿病伤口的再生皮肤中的微血管密度(MVD)和eNOS表达水平而且FN增强了这些作用。14天后溶剂处理的糖尿病伤口中的MVD和eNOS表达水平低于溶剂处理的非糖尿病伤口中的MVD和eNOS表达水平(图3A-E)。14天的局部FN处理对糖尿病和非糖尿病伤口中的MVD和eNOS表达水平没有影响(图3B-E)。另一方面，局部EPO处理14天显著增加糖尿病和非糖尿病伤口中的MVD和eNOS表达水平(图3B-E)。在EPO/FN处理的非糖尿病伤口中，MVD和eNOS表达水平与EPO处理的非糖尿病伤口中的那些没有显著差异(图3B和3D)。相比之下，EPO/FN处理的糖尿病伤口的MVD和eNOS表达水平显著高于EPO处理的糖尿病伤口中的MVD和eNOS表达水平(图3C和3E)。

局部EPO增加糖尿病伤口的再生皮肤中的胶原沉积和透明质酸(HA)合成而且FN增强了这种效果。在14天后溶剂处理的糖尿病伤口中羟基脯氨酸(HP)和HA的量以及两种HA合酶(HAS1和HAS2)的表达水平低于溶剂处理的非糖尿病伤口中的表达水平(图4A-G)。局部FN处理14天不改变糖尿病和非糖尿病伤口中的HP和HA量以及HAS1和HAS2表达水平(图4B-G)。另一方面，局部EPO处理14天显著增加糖尿病和非糖尿病伤口中的HP和HA量以及HAS1和HAS2表达水平(图4B-G)。在EPO/FN处理的非糖尿病和糖尿病伤口中的HP量分别显著高于EPO-处理的非糖尿病和糖尿病伤口中的量(图4A-C)。EPO/FN处理的非糖尿病伤口中的HA量和HAS1和HAS2表达水平与EPO-处理的非糖尿病伤口的HAS1和HAS2表达水平非常相似(图4D和4F)。相比之下，EPO/FN处理的糖尿病伤口中的HA量和HAS1和HAS2表达水平显著高于EPO处理的糖尿病伤口中的HAS1和HAS2表达水平(图4E和4G)。

在无创伤糖尿病皮肤中AQP3表达降低。无创伤糖尿病猪皮肤中的AQP3表达水平低于无创伤的健康猪皮肤中的AQP3表达水平(图5A-D)。创伤糖尿病猪皮肤中的AQP3蛋白表达水平显著低于无创伤健康猪皮肤中的表达水平(p<0.01)(图5E和5G)。

该结果也反映在AQP3mRNA表达水平中：无创伤的糖尿病皮肤中的AQP3mRNA表达水平显著低于无创伤的健康猪皮肤中的表达水平(p<0.01)(图5F)。

局部EPO刺激糖尿病伤口的再生皮肤中的AQP3表达而且FN增强了这种效果。14天后，溶剂处理的糖尿病伤口中的AQP3蛋白和mRNA表达水平显著低于溶剂处理的非糖尿病伤口中的AQP3蛋白和mRNA表达水平(图6A-H)。在糖尿病组和对照组猪中，(a)EPO处理的伤口中AQP3蛋白和mRNA表达显著高于溶剂处理和FN处理的伤口，(b)EPO/FN处理的伤口显著提高(c)溶剂处理和FN处理的伤口彼此没有差异(图6A-6H)。

AQP3蛋白表达与糖尿病性烧伤创面的再生皮肤中的血管生成程度和HP和HA量正相关。Pearson相关性用于研究健康和糖尿病猪的AQP3蛋白表达水平、血管生成程度和烧伤伤口中的HP和HA量之间的关系。在糖尿病和健康猪中，AQP3蛋白表达水平与血管生成(图7A和7B)、HP量(图7C和7D)和HA量(图7E和7F)的程度呈正相关。有趣的是，这些相关性在糖尿病猪的烧伤创面的再生皮肤中比在健康猪的烧伤创面的再生皮肤中显著增强。

AQP3抑制减少局部EPO对伤口闭合率、血管生成程度以及糖尿病烧伤创面中的HP和HA量的影响。当AQP3活性被HgCl₂阻断时，EPO/HgCl₂处理的糖尿病伤口的闭合率显著降低(图8A)。这种伤口愈合率的降低伴随着血流量的减少(图8B)、低eNOS表达水平(图15C)、低HAS1和HAS2表达水平(图8C)、低程度的血管生成(图8D)、低HP量(图8E)和HA量(图8F)。此外，EPO/HgCl₂处理的糖尿病伤口的闭合率、eNOS、HAS1和HAS2的表达水平以及HP和HA的量显著低于EPO处理的糖尿病伤口的这些数值。

高葡萄糖下调人皮肤角质形成细胞和成纤维细胞中的AQP3表达，并且该作用被EPO阻断。暴露于高葡萄糖(HG)水平5天的HEKC和NHFC的增殖率低于暴露于正常葡萄糖(NG)水平的细胞的增殖率(图9A和9B)。HG暴露的细胞中的AQP3表达水平显著低于NG-25暴露的细胞中的表达水平(图9C和9D)。EPO治疗恢复了在HG中孵育5天的正常AQP3表达水平和细胞的增殖速率。

方法

I型DM猪模型。该研究包括四只60kg的健康母猪(Sus domesticus)，它们购自Lahav Institute of Animal Research Institute(Kibbutz Lahav，Israel)。选择猪作为该研究的实验动物，因为猪的皮肤伤口愈合类似于人的皮肤伤口愈合(Sullivan，2001)。将猪单独放置在具有恒定温度(24±2℃)和相对湿度(55±10％)的人工12小时光/暗循环的猪栏内。在研究之前让猪适应一周，自由摄取标准实验室食物和水。猪的护理和福利符合(a)在“Guide to the Care and Use of Laboratory Animals”，第7版，NationalAcademies Press，Washington DC，USA中描述的动物福利和人道动物处理指南，和(b)技术准则，这些准则符合以色列关于动物用于实验和其他科学目的的国家法规。

DM诱导、烧伤创面建立、伤口处理、敷料变化和数据收集在全身麻醉下进行，因为在没有固定的情况下很难对轻型猪只进行伤口清理、处理和上绷带。使用静脉内施用的异丙酚(5mg/kg)进行全身麻醉，然后在气管内插管用5:1的异氟烷在2:1氧气/一氧化二氮混合物保持麻醉状态。在四只猪全身麻醉时将静脉内导管永久置于右颈静脉中，用于在研究期间进行血液取样以及在两只猪的DM诱导期间输注流体。使用无创耳朵血氧饱和度监测麻醉猪的心率和血氧饱和度，并使用数字直肠温度计监测猪的体温。在所有程序之后，让猪从手术台上的麻醉中恢复，拔管，然后放入猪栏。在实验的最后一天即第14天，将猪麻醉用于数据和样本收集，然后通过静脉内注射KCl(2mmol/kg；40ml)和过量的异氟烷(5％)人道地杀死。

根据先前描述的方案(Hara，2008)在两只猪上诱导DM。简言之，将猪禁食过夜，然后在施用链脲霉素(STZ，Alexis Biochemicals，San Diego，CA，USA)之前用0.9％NaCl(10ml/kg/h)静脉内水合1小时。将STZ(200mg/kg)溶解于0.9％NaCl中，并在静脉内通过植入的静脉内插管施用一min。在施用STZ后，使用血糖计(FreeStyle FREEDOM Lite，AbbotDiabetes Care Inc.，Alameda，CA，USA)每15min检查血糖水平一次，检查6小时。在施用STZ后的前两个小时内，连续或间歇地静脉内输注葡萄糖(50g溶于100ml水中)，以避免因急性STZ诱导的胰腺细胞损伤引起的严重低血糖。在研究期间通过血糖仪每天至少检查两次血糖水平。当在STZ施用后6小时血糖水平等于或高于300mg/dl时，DM诱导被认为是成功的，并且在14天研究期间持续存在。静脉内注射长效胰岛素(24IU Lantus；AventisPharmaceuticals，Kansas City，Mo，USA)以维持糖尿病猪的空腹血糖水平在300-400mg/dl之间。

创建部分厚度皮肤烧伤伤口。DM维持一个月，之后在麻醉下产生部分厚度的皮肤烧伤伤口。一旦麻醉，使用VEET脱毛膏(Reckitt Benckiser plc，Slough，Berkshire，UK)剃除每只猪的脊柱的每一侧的背部皮肤上的刷毛。然后用水清洁皮肤并用组织干燥，然后使用无菌技术在猪的清洁背部皮肤上产生12cm²的圆形部分厚度皮肤烧伤伤口。使用先前描述的方法(Davis，1990)创建烧伤创面。简言之，将四个圆柱形黄铜杆(每个直径约2.25cm，重量为358g)置于热水(92℃)中2min。通过将杆垂直放置在每个麻醉的猪的背部皮肤上20s，没有额外的压力，产生四组六个部分厚度烧伤伤口。在两只糖尿病猪中，产生了另外一组六个部分厚度烧伤伤口。在将加热的棒应用于皮肤之前，将棒擦干以防止蒸发的水滴在皮肤上造成蒸汽烫伤。

实验室中制备用于局部伤口治疗的6种不同的凝胶：(a)不含活性成分的凝胶(溶剂凝胶)，(b)含有2000IU/g EPO(高剂量EPO)，(c)含有500IU/g EPO(低剂量EPO)的凝胶，(d)含有300μg/g FN的凝胶，(e)含有2000IU/g EPO和300μg/g FN，和(f)含有0.1mM HgCl₂和2000IU/g EPO的凝胶。购买重组人EPO作为注射剂(EPREX 40,000IU，Janssen CilagBucks，UK)。FN按1mg/ml溶液(EMD Millipore，Billerica，Massachusetts，USA)购买。将HgCl₂(0.1mM)掺入含有2000IU/g EPO的凝胶中，以阻断伤口中皮肤AQP3活性(阴性对照)，HgCl₂购自Sigma(Sigma-Aldrich，USA)。通过ELISA测定的凝胶的稳定性测试的结果表明EPO和FN在4℃下在凝胶中稳定至少三个月。

实施例中使用的组合物的配方

制剂的制备方法。该制剂按如下制备：

1.将对羟基苯甲酸甲酯(MP)和对羟基苯甲酸丙酯(PP)称重到玻璃烧杯中并溶解于Glicerol和苯甲醇(BA)中。

2.加入1/3批量的WFI并在60℃下搅拌30min。使用加热板和上混合器。

3.将混合物在搅拌下冷却至30℃。

4.在不加热搅拌的同时，缓慢加入所需量的Carbomer 940。

5.向混合物中加入EPO并搅拌10min。

6.向混合物中加入FN并搅拌10min。

7.通加入足量的三乙醇胺将pH调节至6.5±0.3。

8.加入足量的WFI以获得所需的重量。

9.在室温下混合30min。

优选批次的局部凝胶Carbopol 940 3000IU/g(克)红细胞生成素(EPO)和300μg/g(克)纤连蛋白(FN)的制备

*根据生物活性结果(来自CoA或进入测试)

BA＝生物活性(IU/ml)

重量＝300000/X

制备方法。每种成分相对欲制备的总量所需的量。精确称量每种成分。将对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯的总量与甘油和苄醇混合。将约40克水加入到混合物中，并将混合物充分混合30min并加热至60℃。将Carbopol 940p缓慢地喷洒在快速搅拌的混合物上，并在30℃下充分混合。将所有EPO加入混合物中，然后充分混合10min。然后将FN加入混合物中，充分混合10min。将足够的三乙醇胺加入到混合物中，然后混合，直到获得所需的粘度，确认混合物中没有Carbopol 940p团块。加入足量的水至总量为100克，并将混合物充分混合。然后将凝胶分装在每瓶1gr(克)的Eppendorf小瓶中。然后在瓶上标记批号、制备日和储存条件。取30gr(克)的凝胶样品进行稳定性和微生物学测试，并分配如下：a.在4℃下20g用于Elisa测试，b.在4℃下10克用于微生物学测试。

用各种局部EPO制剂处理伤口。将每组6个部分厚度烧伤伤口随机分配用以下局部凝胶之一进行处理：含溶剂的凝胶、含高剂量EPO的凝胶、含FN的凝胶和含EPO/FN的凝胶。用含有EPO/HgCl₂的凝胶处理一只糖尿病猪上另一组烧伤，并用含有低剂量EPO的凝胶(低剂量EPO)处理第二糖尿病猪中的另一组烧伤。在14天的研究期间每两天局部施用凝胶(3g)于每个伤口。为了防止在施用后通过摩擦除去凝胶以及在处理之间保护烧伤伤口，用非粘性纱布垫覆盖处理的伤口，所述非粘性纱布垫通过Tensoplast弹性胶带包扎(Smith&Nephew，London，UK)。不使用术后镇痛药和抗生素，因为这些药物可能影响愈合过程，从而混淆了数据的解释。

研究参数。在14的天研究阶段的开始和结束时以及在研究期间，对每只猪进行称重。在每个治疗日，使用12兆像素数字照相机(Olympus，Styles Tough，Tokyo，Japan)拍摄每个伤口，并采集血液样品用于测定红细胞、白细胞和血小板计数、血浆血红蛋白和HbA1c水平。在第2、7和14天使用6mm圆形刀片从糖尿病和非糖尿病猪的溶剂处理的和处理的烧伤创面的再生皮肤的随机选择区域和未受伤皮肤上冲孔活检。将每个活检标本的样品立即用10％中性缓冲***固定用于MVD的组织学测定(稍后详述)或储存在液氮中，用于免疫组织化学分析、western印迹分析、ELISA和PCR测定蛋白质水平(细节如下)。

确定伤口闭合率。从烧伤伤口的上皮组织区域计算伤口闭合率。为了计算速率，每个烧伤创伤的面积被分为三个区域：(a)痂区域，其中烧伤皮肤在创建烧伤后变成刚性外皮，(b)红色区域，痂可以是分离，但没有上皮细胞，和(c)白斑，其中痂可以分离并且含有新的上皮细胞。当处理伤口并更换绷带时，通过测量第2、4、7、9、11和14天的白色面积计算伤口闭合率。为此，将透明纸放置在每个伤口上，并且在纸上画出白色区域的形状。然后将透明纸叠加到1-mm²方格纸上，以测量伤口中的白色面积。使用以下公式计算白色率大小的时间依赖性变化情况：

白色区域面积的所有测量由对治疗模式不知情的三个检查者进行。

确定烧伤创面的血流量。在14天的研究阶段的开始和结束时以及在研究期间，通过激光多普勒灌注成像***(PeriScan PIM 2System，Perimed，Stockholm，Sweden)非侵入地测量伤口中的血流。在以下设置下进行伤口的扫描：激光波长为670nm(可见红色)，与烧伤伤口的距离为25cm，扫描分辨率为256×64像素，扫描持续时间为180s。扫描仪的探头放置在与皮肤略微垂直的角度以防止激光束从非有效区域反射，根据设备手册中的建议。对于每个烧伤伤口，从移动的红细胞的激光束的反射计算灌注参数，与组织灌注成线性比例的激光多普勒灌注指数。在六种颜色的刻度上测量感兴趣区域(ROI)中的灌注，其中深蓝色描绘最低灌注速率，红色描绘最高灌注速率，使用用于血液灌注成像的PIMSoft软件(LiscaDevelopment AB，Linkoping，Sweden)。对于每个烧伤创伤，ROI是在初始烧伤创伤周围画出的12-cm²的圆圈，并且伤口中的血流是ROI中所有颜色的平均值。

确定烧伤组织的再生皮肤中血管生成的程度。CD31是由血管内皮细胞表达的粘附分子，并广泛用作标记物以证明组织中内皮细胞和新形成的毛细血管的存在。该标记物用于确定愈合伤口的再生皮肤中的MVD和血管生成的程度。为此，制备在第2、7和14天收集的5μm厚的***保持的伤口的穿刺活检样品切片，并安装在载玻片上用于CD31染色。简言之，将样品包埋在石蜡块中，使用二甲苯脱蜡，在双去离子水(ddH₂O)中在一系列梯度丙醇溶液(100-0％)再水化，然后将其浸入Tris-缓冲盐水(TBS.pH7.5)5min。用TBS处理后，通过将载玻片在3％过氧化氢/甲醇溶液中浸泡20min来封闭切片中的内源性过氧化物酶。然后将载玻片在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中漂洗，并在90℃下浸没在10mM柠檬酸盐缓冲溶液(pH6.0)中10min，通过微波加热来暴露抗原。首先用1:50正常山羊血清(Sigma)将载玻片封闭30min，以消除抗原的非特异性染色，在PBS中漂洗，然后在4℃下在黑暗中用1:100CD31抗体(R&D Systems，MN，USA)过夜孵育。过夜孵育后，将载玻片在PBS中漂洗并用Mayer's苏木精(Sigma)复染10s钟，然后施用1％乙酸以分化组织切片并在流动的自来水下漂洗。在NikonEclipse E800直立显微镜下检查载玻片，并捕获切片的图像，并通过图像分析软件(Nikon Instruments Inc.，Melville，NY，USA)分析。让对治疗方式不知情的三个研究者在五个随机显微镜视野(×200放大率)中计数每个伤口部位的再生皮肤中的毛细血管数目。

检测烧伤组织再生皮肤中的AQP3。在无创伤的健康和糖尿病猪的皮肤上，在DM诱导后一个月和烧伤前一天以及在14天研究期间通过免疫组织化学和免疫荧光在伤口的再生皮肤中检测到AQP3。对于AQP3免疫组织化学，制备从无创伤的非糖尿病和糖尿病猪皮肤以及在14天研究期间第2、7和14天的再生皮肤收集的5μm厚的切片，以与CD31染色所述相同的方式固定在载玻片上。切片首先用1:50山羊血清(Sigma)封闭30min，用PBS轻轻冲洗，并在4℃在黑暗中用1:200兔多克隆AQP3一抗(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，美国)孵育过夜。过夜孵育后，将载玻片在PBS中漂洗并与1:400生物素化的IgG二抗(VectorLaboratories Inc.，Burlingame，CA，USA)在室温下在黑暗中孵育30min。孵育后，用PBS轻轻洗涤切片，并在室温下在黑暗中与链霉亲和素过氧化物酶(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)孵育30min。使用S-(2-氨基乙基)-1-半胱氨酸(AEC/RED；InvitrogenCorp.Camarillo，CA，USA)作为底物促进抗原检测，直到观察到颜色信号形成。然后将载玻片立即用PBS漂洗并用Mayer's苏木精溶液(Sigma)复染十秒钟，然后在PBS中加入1％乙酸以分化组织切片。然后将切片在流动的自来水中漂洗，并在分级的乙醇系列中脱水5min，再用Immu-Mount(Thermo Scientific，Pittsburgh，USA)固定。如前所述，通过图像分析软件分析切片的图像。

为了通过免疫荧光证实在无创伤的健康和糖尿病猪皮肤和伤口的再生皮肤中存在AQP3，将另一组脱蜡石蜡切片与1:100兔多克隆AQP3抗体(Santa Cruz)在4℃孵育过夜。孵育后，用自来水轻轻洗涤载玻片，在室温下在黑暗中与1:200罗丹明偶联的IgG二抗(Jackson ImmunoResearch)孵育30min，然后用核染色剂TOPRO-3(Invitrogen公司)孵育30min。在TOPRO-3孵育结束时，在PBS中温和洗涤后，在共聚焦显微镜(Bio-Rad MRC 1024，CA，USA)下检查载玻片。如先前所述，通过图像分析软件分析切片的图像。

检测烧伤组织再生皮肤中的胶原蛋白。对为CD31和AQP3免疫染色制备的5μm厚切片中的一些的Masson三色染色(Sigma-Aldrich)后，在第2、7和14天收集的样品中测定再生皮肤中胶原的量。使用这种方法，胶原纤维染成蓝色，核染成黑色，细胞质和肌纤维染成红色。如先前所述，通过图像分析软件分析切片的图像。

确定烧伤组织的再生皮肤中胶原的量。羟脯氨酸(HP)是I型胶原的氨基酸成分，并且经常用作胶原蛋白的标记物。因此，在第2、7和14天从健康和糖尿病猪上收集的皮肤样品中的HP量被用作烧伤创面再生皮肤中胶原蛋白量的指标。为此，使用组织匀浆器(HG-300；MRC，Holon，Israel)将含有完全蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich，MO，USA)的PBS中的100mg皮肤样品均质化。首先将匀浆在4℃下以1500g离心5min。收集上清液，通过WhatmanGrade 540滤纸(Sigma-Aldrich)过滤，在HCl中水解，然后用去离子水稀释。使用先前描述的方案(Hamed，2009)，在加入对二甲基-氨基-苯甲醛之前，首先将稀释溶液的等分试样(2μl)与氯胺-T溶液混合。然后将所得溶液的等分试样(150μl)转移至微量滴定板，并在荧光微板读数器中在557nm下测量每个样品的吸光度。结果表示为健康猪(100％)的溶剂处理的烧伤伤口中HP量的三次测量的平均百分比。

确定烧伤组织的再生皮肤中HA的量。由于HA与皮肤强度和水合作用有关，使用Hyaluronan Quantikine ELISA试剂盒(R&D Systems)按照生产商的方案在第2、7和14天从非糖尿病和糖尿病猪采集的标本中确定烧伤创面组织的再生皮肤中的HA量。简言之，将为测定烧伤创面的再生皮肤中的HA量而制备的相同稀释溶液的等分试样(150μl)转移到微量滴定板中。然后在荧光微板读数器中在450nm处测量每个样品的吸光度，波长校正设定在570nm。结果表示为在健康猪(100％)的溶剂处理的烧伤伤口中HA量的三次测量的平均百分比。

通过蛋白质印迹分析确定烧伤组织的再生皮肤中的AQP3、eNOS和HAS1以及HAS2表达水平。由于AQP3在再生皮肤中的表达与皮肤水合有关，AQP3促进水进入细胞，因此研究了EPO对烧伤创面上的AQP3和细胞水合的影响。由于HA与皮肤强度和水合作用有关，HA是涉及皮肤水分的关键分子并且由HAS1和HAS2合成，因此研究了EPO对HAS1和HAS2表达的影响。由于血管生成发生在再生皮肤中，eNOS是脉管***中主要的NOS同种型且其表达水平指示血管生成的程度，因此研究了EPO对eNOS表达的影响。在第14天从健康和糖尿病猪收集的烧伤组织的再生皮肤中测定AQP3、eNOS、HAS1和HAS2的表达水平。简言之，将样品首先在含有完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche Applied Science)，然后在RIPA缓冲液中裂解。使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离裂解物的40μg蛋白质样品中的蛋白质。然后将分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，首先用1:100多克隆AQP3抗体，1:150单克隆eNOS抗体，1:100单克隆HAS1抗体和1:100单克隆HAS2抗体(全部购自Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA)在暗处，然后在室温下在黑暗中与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的IgG二抗(JacksonImmunoResearch。Europe)孵育30min。使用肌动蛋白(Santa Cruz)标准化蛋白质负载。使用Bio-Rad Immune-Star HRP化学发光检测***(Bio-Rad，USA)通过光密度测定法检测蛋白质表达水平。结果表示为健康猪(100％)的溶剂处理的烧伤伤口中重复读数的平均蛋白质水平的百分比。

用于定量AQP3mRNA水平的实时(RT)PCR。RT-PCR用于研究EPO对AQP3表达的影响是否是由于其对AQP3基因的影响。在第14天收集来自糖尿病和健康猪的烧伤创面组织的再生皮肤的样品，并在PBS中匀浆。使用MasterPure RNA纯化试剂盒(EPICENTREBiotechnologies，Madison，WI，USA)从匀浆中提取总RNA。对于每个样品，使用购自ABgene，UK的Absolute QPCR Mixes Reverse Transcription Reagents和Verso cDNA ReverseTranscriptase试剂盒将大约2μl的RNA一式三份逆转录。通过在Rotor-Gene 6000循环仪(Corbett Life Science，Sydney，Australia)中使用SYBR Green PCR Master Mix(Molecular Probes，Eugene，OR)的RT-PCR来进行再生皮肤样品中AQP3基因表达的定量。使用基于标准曲线的方法来评估PCR效率和测定内变化。热循环条件为一个循环(95℃10min)，然后是40个循环(95℃30s，60℃1min和72℃30s)，随后是1个循环(1min@95℃，30s@55℃和30s@95℃)。使用2^-ΔΔCT方法分析从非糖尿病和糖尿病伤口收集的溶剂处理的和未处理的组织样品中AQP3基因表达的相对变化。结果表示为归一化到内源参考基因(甘油醛-3-磷酸脱氢酶；GAPDH)后相对对照的百分比变化。

细胞培养。原代人表皮角质形成细胞(HEKC)和原代人成纤维细胞(NHFC)，两者都来自新生儿***(Cell Systems，Kirkland，WA，USA)，表达AQP3。将这两种细胞类型在补充有10％胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素和2μg/ml的CSC培养基(CellSystems)中的1型胶原包被的烧瓶上单独繁殖。在NG浓度(5mmol/ml D-葡萄糖)和HG浓度(30mmol/ml D-葡萄糖)和EPO(100IU/ml)下测定增殖能力，因为AQP3被认为是增殖所必需的。为此，首先收获细胞，转移到含有10％FBS的CSC培养基的1型胶原包被的24孔板(～100,000个细胞/孔)中，然后暴露于含或不含EPO(100IU/ml)的HG浓度下设定为5％CO 2和37℃的加湿培养箱中培养5天。5天后，根据制造商的方案使用MTT方法(Sigma)测量HEKC和NHFC的增殖。重复该测试三次，结果表示为对照未处理细胞(100％)的增殖速率的平均百分比±标准偏差(SD)。制备两种细胞类型的蛋白质提取物，以便使用蛋白质印迹分析确定AQP3表达水平，如前所述。使用免疫荧光测定来定位粘附的HEKC和NHFC中的AQP3。为此，首先将细胞在2％多聚甲醛中固定，然后与1:100兔多克隆AQP3抗体(Santa Cruz)在4℃孵育2h。孵育后，在PBS中温和地洗涤细胞，然后与1:200的罗丹明–共轭的IgG二抗(JacksonImmunoResearch)在室温黑暗中孵育30min。然后将细胞的细胞核用TOPRO-3(Invitrogen)复染30min。用TOPRO-3复染后，在PBS中轻轻洗涤细胞，然后在共焦显微镜(Bio-Rad MRC1024，CA，USA)下检查。如前所述，通过图像分析软件分析染色细胞的图像。

统计。使用计算机化统计程序(GraphPad Prism version 5.0，GraphPadSoftware Inc，CA，USA)进行所有统计分析，并且所有数据表示为平均值或百分比±SD。统计显著性设定为5％。使用双尾学生t检验来比较健康和糖尿病猪的研究参数，并且对于I型误差的对照使用Bonferroni校正的双因素ANOVA进行多重比较。Pearson相关系数用于确定AQP3蛋白表达与(a)由MVD表示的血管生成，(b)由HP量表示的胶原含量和(c)烧伤创面组织的再生皮肤中的HA量之间的关系。使用单向ANOVA与Tukey’s事后检验和双因素方差分析与Bonferroni's校正来比较和分析各组之间的伤口闭合率，以控制多重比较中的I型错误。使用双尾学生t检验比较来自健康和糖尿病猪的数据。

讨论。DSU的愈合由于受损的血管生成、减少的皮肤细胞活性和增加的炎症反应而延迟。因此，慢性伤口发展，在严重的情况下，可能发生肢体损伤。先前已经报道，局部EPO通过几种机制加速糖尿病小鼠和大鼠的全层皮肤伤口的愈合，这些机制包括(a)刺激血管生成，(b)增加胶原沉积，(c)抑制炎症反应，和(d)减少伤口床中的细胞凋亡(10，11)(Hamed，2010；2011)。现在已经发现了一种新的机制，其中局部EPO加速糖尿病皮肤伤口的愈合：局部施用的EPO增加健康和糖尿病猪的伤口床中的AQP3表达。

在局部EPO处理后，在糖尿病猪的烧伤创面中提高AQP3表达水平反映了EPO对血管生成和HP和HA量的净正效应，并导致加速的伤口闭合。由于本发明人发现在无创伤的糖尿病猪皮肤中AQP3表达降低，因此假定低水平的细胞AQP3至少部分地支持DSU的非愈合。此外，还发现(a)HG-处理的角质形成细胞和成纤维细胞中的AQP3表达水平低于NG-处理的角质形成细胞和成纤维细胞，(b)HG-处理的角质形成细胞和成纤维细胞增殖的能力小于的NG处理的角质形成细胞和成纤维细胞。有趣的是，用EPO处理可以阻断HG对角质形成细胞和成纤维细胞的这种负面影响。这些发现意味着HG水平削弱皮肤细胞中的AQP3表达，并且为发明人在具有DM的猪的皮肤中的实验结果提供体外证实。这些被提供作为可能的解释机制；发明人不打算受这些理论的约束。

发现AQP3表达水平与糖尿病皮肤伤口中的伤口闭合率相关。越来越多的证据表明，DSU的再生皮肤中的AQP3缺陷损害上皮细胞迁移和增殖，并导致再上皮化和伤口愈合延迟(Levin，2006；Sigomoto，2012)。已经报道角膜上皮细胞迁移、增殖和上皮形成受AQP3刺激(Levin，2006)。还已经报道，AQP的下调表达可能是急性肾衰竭中的尿浓缩能力降低的原因，并且EPO可以预防这种下调(Gong，2004)。因此，假定通过EPO刺激DSU中的局部AQP3表达可加速伤口愈合。该研究的结果提供了证据支持发明人的假设，即局部EPO处理糖尿病猪皮肤中的烧伤损伤通过刺激血管生成和ECM产生经AQP3依赖性机制加速其愈合。该研究的结果还提供了证据，EPO刺激非愈合性溃疡中的AQP3表达通过增加细胞水合和提高伤口的水分水平进一步加速愈合。增加细胞水合和提高水分水平促进各种细胞类型和ECM组分之间的相互作用。这种相互作用导致适当的细胞运动、迁移和分化，并最终恢复完整皮肤。

血管生成，ECM成分(例如胶原和HA)的合成和伤口床中适当的细胞水合对于正常伤口愈合是不可缺少的。EPO刺激内皮细胞增殖和血管生成细胞因子和生长因子例如血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子和来自内皮细胞和角质形成细胞的***-1的分泌，引起新血管发芽到创面中(Anagnostou，1990)。在该研究中，发现对伤口的局部EPO处理基本上增加了通过激光多普勒扫描测量的糖尿病性烧伤伤口的再生皮肤中的血流量。当测量糖尿病性烧伤伤口的再生皮肤中的MVD和eNOS表达水平时，证实了这种效果：EPO处理的糖尿病性烧伤伤口的再生皮肤中的MVD和eNOS表达水平高于溶剂处理的糖尿病烧伤。局部EPO处理还导致糖尿病性烧伤伤口中HP和HA的量显著增加。Vedrenne报道了ECM与调节细胞和ECM之间的附着，血管生成，皮肤伤口愈合和驻留真皮成纤维细胞周转的分子合成之间的密切关系的存在(Vedrenne，2012)。细胞水合和潮湿环境对于在伤口愈合期间促进成纤维细胞更新，血管生成和角质形成细胞的上皮化是至关重要的。因此，防止或限制局部AQP3蛋白表达和/或活化的任何因素或事件可以降低细胞水合水平并损伤伤口愈合。胶原和HA在ECM中具有许多功能，其中一个是用于维持细胞形状和分化的组织支架，支持细胞运动和迁移，并且使得真皮层中的ECM能够抵抗压缩。

HA是非常亲水的分子，并且这种特性使其能够调节组织水合，因为它吸引并结合水。发现在糖尿病猪的无创伤皮肤中AQP3表达水平降低。还发现，除了降低的血管生成和低HP和HA量之外，在糖尿病猪中溶剂处理的烧伤伤口的再生皮肤中的AQP3表达水平低于健康猪中溶剂处理的烧伤伤口的再生皮肤中的AQP3表达水平。还发现，局部EPO处理显著增加了糖尿病伤口中的血管生成和HP和HA量，并且这些增加伴随着AQP3表达水平的显著增加。还发现，在糖尿病猪的烧伤伤口中，HgCl₂抑制AQP3对抗EPO的阳性作用，并且该结果暗示EPO介导的AQP3刺激可以刺激DM中的伤口愈合。此外，还发现AQP3表达水平与健康和糖尿病猪的EPO处理的烧伤伤口中血管生成的程度和HP和HA的量相关。还发现，在EPO处理和EPO/FN处理的糖尿病猪的烧伤伤口中，这些相关性比健康猪的EPO处理和EPO/FN处理的烧伤伤口中的相关性更强。由于(a)EPO对糖尿病猪的伤口的再生皮肤中的AQP3表达具有阳性作用，和(b)局部处理前后伤口组织中AQP3表达水平与血管生成程度和HP和HA量之间的相关性是强的，可以得出结论，EPO诱导的愈合加速通过AQP3依赖性机制介导。当这(这些)机制被激活时，刺激伤口愈合过程的关键事件即血管生成、胶原和HA合成以及上皮再形成被激活并加速伤口愈合速率。

Sugimoto等，2012报道了在糖尿病大鼠的皮肤全层伤口愈合期间再生皮肤中AQP3表达减少。Hara-Chikuma和Verkman也报道角质层的水含量和弹性较低，并且伤口愈合和ECM生物合成在AQP3敲除小鼠中比在野生型小鼠中更慢(Hara-Chikuma，2008a)。有趣的是，在一些皮肤疾病中在人皮肤中AQP3的表达增强，例如特应性湿疹和皮肤癌(Hara-Chikuma，2008b)和皮肤烧伤创伤(Sebastian，2015)。这些研究结果表明AQP3在表皮生物学上是关键角色，AQP3受刺激时受伤后的皮肤恢复增强。

还发现，糖尿病伤口的慢伤口闭合率与伤口床中血管生成减少和HP和HA含量低有关。还发现HG处理的HEKC和NHBC增殖的能力降低与细胞中AQP3表达水平的降低有关。这些发现意味着减少的AQP3表达水平是由于HG浓度，并且是DM中角质形成细胞和成纤维细胞减少的增殖的基础。由于还发现EPO阻止了HG浓度对细胞增殖和AQP3表达的不利影响，证据表明EPO通过AQP3依赖性机制加速糖尿病伤口的愈合，该机制使组织免于HG浓度的某些影响。

另一个有趣的发现是EPO/FN处理的糖尿病伤口中的AQP3表达水平是EPO处理的糖尿病伤口中的AQP3表达水平的四倍。EPO/FN处理的糖尿病伤口中AQP3表达水平的这种显著增加与伤口组织中的快速伤口闭合率和升高的血流量以及MVD和HP和HA量的两倍增加相关。FN和纤维蛋白是支持巨噬细胞、成纤维细胞和血管生成的临时基质的两个关键组分(Stadelmann，1998)。适当形成临时基质和肉芽组织使得能够再表皮化和伤口闭合(Martin，1997)。在DM中，FN的缺陷和/或其由蛋白酶引起的降解导致临时基质的崩解，并且上皮形成不发生或延迟。先前已报道，糖尿病小鼠的局部EPO/FN处理的皮肤伤口的愈合比糖尿病小鼠的局部EPO处理的皮肤伤口的愈合更快(Hamed，2011)。FN在创伤愈合的增殖期期间在肉芽组织的形成中具有基本功能。因此，发明人认为外源性FN可以恢复糖尿病伤口中的正常临时基质。发现单独的FN对健康猪的烧伤伤口的伤口闭合率，血液流速，血管生成的程度和HP和HA量无影响。此外，发现外源FN不会加强EPO对健康猪的烧伤创伤愈合的加速作用，因为内源性FN以正常水平存在并且在健康猪中不降解。由于内源性FN在DSU中降解，因此将FN结合到含有EPO的凝胶中是合乎需要的，因为FN增强了含有EPO的凝胶的有益作用。

因此，发明人已经证明，局部EPO应用于糖尿病性伤口加速了上皮再生并增加了伤口闭合率，因此基于在糖尿病猪中的发现推测，局部EPO的应用可能对通过提高皮肤AQP3表达水平刺激DSU的治愈是治疗有益的。

实施例2-治疗人类中的慢性糖尿病性溃疡

测试实施例1的配方以确定对治疗人患者的慢性糖尿病溃疡的有效性。一名77岁男性患者诊断为糖尿病、高血压和高脂血症，在其背部右内侧脚上出现糖尿病性溃疡。损伤约为9.6cm²(见图13，“BEFORE”组)。

病人参数

性别：男

年龄：77岁

种族：北非

吸烟：无吸烟史

病史：糖尿病、高血压、高脂血症

身高：176厘米

重量：96公斤

BMI：30.99kg·m^-2

ABI：0.76(轻度梗阻)

血红蛋白：12.3g/dL

HCT：36.5％

RBC：4.13 10^8/μl

血小板计数：169 10^3/μl

葡萄糖：159mg/dL

伴随药物(进行中)：

氨氯地平：2015年以来

二甲双胍：2015年以来

普伐他汀：自2013年以来

Cartia：自2002年以来

Enaladex：自2012年以来

糖尿病足溃疡

位置：背侧，内侧位置

面积：9.6cm²

历史：超过2个月没有改善

瓦格纳类型：I

需氧细菌(铜绿假单胞菌)

在第1天施用组合物之前轻轻清除伤口。将实施例1的组合物以0.25g/cm²的剂量局部施用于伤口，每周5次，根据溃疡面积处理。处理持续近八周(55天)，并包括实施例1的组合物的36次局部施用，直到按照医生诊断伤口完全闭合。该处理由访问护士在患者家中提供。患者每周访问门诊部进行溃疡评估、测试和评估。图。图13(“之后”)是在8周处理后完全闭合的伤口的照片。

用实施例1的组合物在8周内的处理没有任何可见的全身效应，即没有引起血液参数或血压的显著变化。一些参数在下面的表3中给出。

表3.

不利影响

在治疗三周后观察到过度增生(hyper-granulation)。这被认为是微小的不良影响。由于它，治疗暂停了3天，而三个日常药物应用程序被跳过。间隔三天后，过度增生效应降低，继续治疗。直到治疗过程结束，没有观察到过度增生的进一步迹象。

结论

RMD-G1对患者K的治疗是安全和有效的。在治疗的8周内观察到慢性糖尿病创伤的完全闭合。

根据本公开，可以在没有过度实验的情况下制造和执行本文公开和要求保护的所有方法。虽然已经根据优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员显而易见的是，可以将变化应用于所述方法和所述方法的步骤或步骤的顺序在此不脱离本发明的概念、精神和范围。更具体地，显而易见的是，化学和生理学相关的某些试剂可以代替本文所述的试剂，同时将获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员显而易见的所有这些类似的替代和修改被认为在由所附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念内。

参考文献

以下参考文献，在其提供对本文所阐述的示例性程序或其它细节补充方面，通过引用明确地并入本文。

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Claims (76)

1.一种药物组合物，其包含：

凝胶；

红细胞生成素；和

纤连蛋白；其中所述纤连蛋白以施用于伤口时促进所述红细胞生成素的有益作用的量存在于所述组合物中。

2.一种处理伤口的方法，包括将治疗有效量的权利要求1的制剂局部施用于伤口以治疗所述伤口。

3.权利要求1的组合物，其中所述伤口是诊断或怀疑患有高血糖的受试者的伤口。

4.权利要求1的组合物，其中所述伤口是诊断或怀疑患有胰岛素耐受的受试者的伤口。

5.权利要求1的组合物，其中所述伤口是诊断或怀疑患有胰岛素产生缺陷的受试者的伤口。

6.权利要求1的组合物，其中所述伤口是诊断为或怀疑患有糖尿病的受试者的伤口。

7.权利要求1的组合物，其中所述伤口是人受试者的伤口。

8.权利要求1的组合物，其中所述红细胞生成素以5％w/w的浓度存在。

9.权利要求1的组合物，其中所述纤连蛋白浓度以30％w/w的浓度存在。

10.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含浓度为0.01％至30％(w/w)的红细胞生成素、浓度为0.01％至50％(w/w)的纤连蛋白、浓度为0.01％至30％(w/w)的甘油、浓度为0.01％至30％(w/w)的Carbomer 940、浓度为0.01％至30％(w/w)的苯甲醇、浓度为0.01％至30％(w/w)的三乙醇胺、浓度为0.01％至30％(w/w)的对羟基苯甲酸甲酯、浓度为0.01％至30％(w/w)的对羟基苯甲酸丙酯。

11.权利要求10的组合物，其中所述组合物包含5％(w/w)的甘油、1％(w/w)的Carbomer940、2％(w/w)的苯甲醇、0.9％(w/w)三乙醇胺、0.2％(w/w)的对羟基苯甲酸甲酯、0.05％(w/w)的对羟基苯甲酸丙酯。

12.权利要求11的组合物，其中所述组合物包含5％(w/w)的甘油、1％(w/w)的Carbomer940、2％(w/w)的苯甲醇、0.9％(w/w)的三乙醇胺、0.2％(w/w)的对羟基苯甲酸甲酯、0.05％(w/w)的对羟基苯甲酸丙酯和添加至100％(w/w)的水。

13.权利要求1的组合物，其中所述凝胶是纤维蛋白、胶原或透明质酸凝胶。

14.权利要求1的组合物，其中所述凝胶包含纤维蛋白、胶原或透明质酸。

15.权利要求1的组合物，其中所述凝胶是水凝胶。

16.一种包含红细胞生成素的药物组合物，其中所述组合物被制剂为凝胶。

17.权利要求16的组合物，其中所述组合物包含纤连蛋白。

18.权利要求16的组合物，其中所述红细胞生成素以5％w/w的浓度存在。

19.权利要求17的组合物，其中所述纤连蛋白以30％w/w的浓度存在。

20.权利要求17的组合物，其中所述组合物包含浓度为0.01％至30％(w/w)的红细胞生成素、浓度为0.01％至50％(w/w)的纤连蛋白、浓度为0.01％至30％(w/w)甘油、浓度为0.01％至30％(w/w)的Carbomer 940、浓度为0.01％至30％的苯甲醇、浓度为0.01％至30％(w/w)的对羟基苯甲酸甲酯、浓度为0.01％至30％(w/w)的对羟基苯甲酸丙酯。

21.权利要求20的组合物，其中所述组合物包含5％(w/w)的甘油、1％(w/w)的Carbomer940、2％(w/w)的苯甲醇、0.9％(w/w)的三乙醇胺、0.2％(w/w)的对羟基苯甲酸甲酯、0.05％(w/w)的对羟基苯甲酸丙酯。

22.权利要求21的组合物，其中所述组合物包含5％(w/w)的甘油、1％(w/w)的Carbomer940、2％(w/w)的苯甲醇、0.9％(w/w)的三乙醇胺、0.2％(w/w)的对羟基苯甲酸甲酯、0.05％(w/w)的对羟基苯甲酸丙酯和添加至100％(w/w)的水。

23.权利要求16的组合物，其中所述凝胶是纤维蛋白、胶原或透明质酸凝胶。

24.权利要求16的组合物，其中所述凝胶包含纤维蛋白、胶原或透明质酸。

25.权利要求16的组合物，其中所述凝胶是水凝胶。

26.一种治疗受试者的伤口的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的包含红细胞生成素的组合物，其中所述组合物是凝胶。

27.权利要求26的方法，其中所述组合物包含纤连蛋白。

28.权利要求26的方法，其中所述红细胞生成素以5％w/w的浓度存在。

29.权利要求27的方法，其中所述纤连蛋白以30％w/w的浓度存在。

30.权利要求27的方法，其中所述组合物包含浓度为0.01％至30％(w/w)的红细胞生成素、浓度为0.01％至50％(w/w)的纤连蛋白、0.01％至30％(w/w)之间的浓度的甘油、浓度为0.01％至30％(w/w)的Carbomer 940、浓度为0.01％至30％的苯甲醇、浓度为0.01％至30％(w/w)的三乙醇胺、浓度为0.01％至30％(w/w)的对羟基苯甲酸甲酯、浓度为0.01％至30％(w/w)的对羟基苯甲酸丙酯。

31.权利要求30的方法，其中所述组合物包含5％(w/w)的甘油、1％(w/w)的Carbomer940、2％(w/w)的苯甲醇、0.9％(w/w)的三乙醇胺、0.2％(w/w)的对羟基苯甲酸甲酯、0.05％(w/w)的对羟基苯甲酸丙酯。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述组合物包含5％(w/w)的甘油、1％(w/w)的Carbomer 940、2％(w/w)的苯甲醇、0.9％(w/w)的三乙醇胺、0.2％(w/w)的对羟基苯甲酸甲酯、0.05％(w/w)的对羟基苯甲酸丙酯和添加至100％(w/w)的水。

33.权利要求26-32中任一项的方法，其中所述凝胶是纤维蛋白、胶原或透明质酸凝胶。

34.权利要求26-32中任一项的方法，其中所述凝胶包含纤维蛋白、胶原或透明质酸。

35.权利要求33或34的方法，其中所述凝胶是水凝胶。

36.权利要求26-35中任一项的方法，其中所述受试者被诊断或怀疑患有高血糖。

37.权利要求26-35中任一项的方法，其中所述受试者被诊断或怀疑患有胰岛素耐受。

38.权利要求26-35中任一项的方法，其中所述受试者被诊断或怀疑患有胰岛素产生缺陷。

39.权利要求26-35中任一项的方法，其中所述受试者被诊断为或怀疑患有糖尿病。

40.权利要求26-35中任一项的方法，其中所述受试者是人类受试者。

41.权利要求26-40中任一项的方法，其中组合物经多次施用提供。

42.权利要求41的方法，其中所述组合物施用2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多次。

43.权利要求41的方法，其中所述组合物被提供1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、21、22、23或24周。

44.权利要求41的方法，其中所述组合物被提供1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个月。

45.权利要求41的方法，其中施用之间的时间间隔为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天。

46.权利要求41的方法，其中施用之间的时间间隔为1、2、3、4、5、6、7或8周。

47.权利要求26-46中任一项的方法，其中所述凝胶被制剂用于皮肤施用或被经皮肤施用。

48.权利要求26-47中任一项的方法，其中所述伤口是溃疡。

49.权利要求26-48中任一项的方法，其中所述伤口是糖尿病性溃疡。

50.权利要求26-49中任一项的方法，其中所述伤口是慢性糖尿病性溃疡。

51.权利要求26-50中任一项的方法，其中所述伤口是四肢的慢性糖尿病性溃疡。

52.权利要求26-51中任一项的方法，其中所述伤口是慢性糖尿病足溃疡。

53.一种治疗受试者的伤口的方法，包括向所述受试者施用诱导水通道蛋白(aquaporin)表达的治疗有效量的组合物。

54.权利要求53的方法，其中所述水通道蛋白是水通道蛋白-3。

55.权利要求53-54中任一项的方法，其中所述组合物是纤维蛋白、胶原或透明质酸凝胶。

56.权利要求55的方法，其中所述凝胶包含纤维蛋白、胶原或透明质酸。

57.权利要求55或56的方法，其中所述凝胶是水凝胶。

58.权利要求53-57中任一项的方法，其中所述受试者被诊断或怀疑患有高血糖。

59.权利要求53-57中任一项的方法，其中所述受试者被诊断或怀疑患有胰岛素耐受。

60.权利要求53-57中任一项的方法，其中所述受试者被诊断或怀疑患有胰岛素产生缺陷。

61.权利要求53-57中任一项的方法，其中所述受试者被诊断为或怀疑患有糖尿病。

62.权利要求53-57中任一项的方法，其中所述受试者是人类受试者。

63.权利要求53-62中任一项的方法，其中组合物经多次施用提供。

64.权利要求63的方法，其中所述组合物施用2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多次。

65.权利要求63的方法，其中所述组合物被提供1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24周。

66.权利要求63的方法，其中所述组合物被提供1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个月。

67.权利要求63的方法，其中施用之间的时间间隔为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天。

68.权利要求63的方法，其中施用之间的时间间隔为1、2、3、4、5、6、7或8周。

69.权利要求53-68中任一项的方法，其中所述凝胶被制剂用于皮肤施用或被经皮肤施用。

70.权利要求53-69中任一项的方法，其中所述伤口是溃疡。

71.权利要求53-70中任一项的方法，其中所述伤口是糖尿病性溃疡。

72.权利要求53-71中任一项的方法，其中所述伤口是慢性糖尿病性溃疡。

73.权利要求53-72中任一项的方法，其中所述伤口是四肢的慢性糖尿病性四肢溃疡。

74.权利要求53-73中任一项的方法，其中所述伤口是慢性糖尿病足溃疡。

75.一种通过将足够量的权利要求1的组合物施用到受伤的皮肤表面以美容治疗所述表面的方法，例如，其中所述受伤的皮肤表面是划伤、软皮肤裂纹、痤疮等导致的。

76.一种通过将足够量的权利要求1所述的组合物施用到被刮伤的皮肤表面以愈合所述受伤的皮肤表面的方法，例如，其中所述受伤的皮肤表面是刮擦、软皮肤裂纹、痤疮等导致的。