背景技术
3', 5'-环化腺苷酸的分子式为C10H12N5O6P,分子量329.21 ;其它名称:cAMP、环磷腺苷、3', 5'-环磷酸腺苷、腺苷-3',5'-环磷酸;根据环磷腺苷质量标准([S]. 2015年版中国药典二部),本品性状为白色或类白色粉末;无臭,味微咸,本品在水中微溶,在乙醇或***中几乎不溶。本品按干燥品质量计算,纯度不低于99%。
cAMP 具有调节生物体内多种酶催化反应的功能,很多激素的作用也是通过cAMP进行调节的,起着激素媒介的物质的作用,即第二信使的作用。环磷腺苷本身可以作为药物,如注射用环磷腺苷,可用于心功能不全、心绞痛和心肌梗死的治疗,特别是对洋地黄类强心药中毒或不敏感的患者心功能不全、心绞痛和心肌梗死的治疗;用作治疗心律失常的辅助药物(注射用环磷腺苷[J].新医学,1998,29(8):414-412)。另外,本品还可以作为前体,生产二丁酰环磷腺苷钙(二丁酰环磷腺苷钙制剂及制备方法CN1554358),用于心绞痛、急性心肌梗死的辅助治疗,亦可用于心肌炎、心源性休克,手术后网膜下出血和银屑病,并可辅助其他抗癌药治疗白血病(注射用二丁酰环磷腺苷钙说明书)。也可用于生产环磷腺苷葡胺注射液(环磷腺苷葡胺注射液药物组合物及其质控方法和制法CN106959347A),用于心力衰竭、心肌炎、病窦综合征、冠心病及心肌病的辅助治疗。
现有关于环磷腺苷的结晶方法,主要有以下几种:
方法一:CN103319557A 公开了“一种环磷酸腺苷的结晶方法”,先将环磷腺苷制成钠盐,收集结晶后,再将上述环磷酸腺苷钠盐晶体溶于水,配成饱和溶液,搅拌条件下,用酸调节溶液PH为4.0~5.5,养晶0.5~8h,再调节其pH至1.0~2.5,结晶完全后抽滤,乙醇洗涤晶体,45℃条件下真空干燥即得环磷酸腺苷晶体;其中有机溶剂为甲醇、乙醇或丙酮中的任意一种或几种的混合物;体积为环磷腺苷钠盐水溶液体积的0.5~5.0倍;结晶温度为10~100℃;酸为盐酸或硫酸。
方法二:文献“3’,5’-环化腺苷酸的生产(中国科学院上海生化所与上海生物化学制药厂 [J].医药工业,1973,8:4-11”)和“最新生化药物制备技术(李良铸,李明晔. [M] .中国医药科技出版社,2001,245-246)”,公开了下述方法:先将5’-AMP与N,N’-二环已基码啉胍在吡啶溶剂中制成复盐,复盐在DCCI与无水吡啶的条件下,进行环合。再将环磷腺苷反应液减压浓缩,用水与***的混合溶液对内酯化物进行萃取,萃取液经真空抽除***后,再上阳柱分离;上柱液经 0.01mol HCl 溶液洗脱,收集第II吸收峰(E260nm),洗脱液再用固体NH4HCO3中和至6~7后,再经60℃减压,滤去残渣,得80ml左右浓度约为17.5%的cAMP•NH4滤液;cAMP滤液的浓度范围(15~20%),再加入等体积的95%乙醇,搅拌下,用6mol的HCl调节pH值2.0,此时有大量白色结晶析出,再置4℃以下的冰箱中过夜,得纯度可达90%以上的cAMP。
方法三:文献“环磷腺苷的合成(申红艳,等. [J].中国医药工业. 2004,35(3):132-133)”,公开了另一种方法:先将腺苷制成腺苷二氯磷酸酯。将收集的腺苷二氯磷酸酯用适量乙酸乙酯与磷酸三乙酯溶解,过滤,搅拌下,慢慢加到0.04mol/L KOH溶液-乙睛(4:6, 1500m1)混合液中,生成环磷腺苷钾盐。0℃下用2mol/L盐酸调至PH6,于-5℃以下放置过夜,溶液分层,上层乙睛回收,水层减压蒸干,向残余物中加入50%乙醇水溶液(40m1),用2mo1/L盐酸调至PH2,析出白色结晶,过滤,滤饼溶于50%乙醇水溶液(40m1),用2mo1/L盐酸调至PH2,析出白色结晶,过滤,滤饼溶于50%乙醇水溶液(30m1),用2mo1/L盐酸调PH2,并冷冻至-15℃过夜。过滤,滤饼用乙醇洗涤,30℃真空干燥后得cAMP白色固体7.1g,收率58%。
方法四:CN109206465A公开了一种合成环磷腺苷的方法,记载了向纯度为80%的环磷腺苷粗品中加入20倍水(环磷腺苷浓度约为5%)。根据环磷腺苷质量标准,本品在水中微溶,又根据我们的环磷腺苷溶解度试验,在室温条件下,环磷腺苷的溶解度约为0.4%,因此,显然,按照该方法,无法重结晶。
以上几种方法的最大不足之处在于,易使cAMP成品中残留的无机盐杂质超标,不能确保临床用药的安全性。
为了便于对微溶等概念的理解,现将“环磷腺苷质量标准”的药典凡例中,关于溶解、微溶、极微溶解、几乎不溶或不溶的定义介绍如下:易溶系指溶质lg(ml)能在溶剂1〜不到10m l中溶解;溶解系指溶质lg(ml)能在溶剂10〜不到30m l中溶解;微溶系指溶质lg(ml)能在溶剂100〜不到1000m l中溶解;极微溶解系指溶质lg(ml)能在溶剂1000〜不到10000 ml中溶解;几乎不溶或不溶系指溶质lg(ml)在溶剂10000 m l中不能完全溶解;略溶系指溶质lg(ml)能在溶剂30〜不到100ml中溶解。
由于环磷腺苷在水中微溶,在乙醇中不溶。因此,上述结晶方法的共同点是先将弱酸性的环磷腺苷与能与cAMP起中和反应的碱,制成易溶于水的钠盐、钾盐或铵盐,再用盐酸或硫酸将上述溶液的pH值调整为1.0~2.0,制成微溶的氢型cAMP。
因此,常规的结晶方法难以将cAMP中残留的少量NaCl、Na2SO4、KCl、NH4Cl等无机盐杂质去除,常常导致成品中无机盐杂质残留超标,不符合2015年版《中国药典》关于药品中无机盐杂质的限度须符合要求的相关规定;并且导致微溶的氢型cAMP的工业化生产成本大幅提高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是,克服现有技术存在的上述缺陷,提供一种可降低3',5'-环化腺苷酸中无机盐杂质,成本较低的结晶方法,使用该结晶方法对3',5'-环化腺苷酸粗产品进行提纯,在不降低成品的纯度、收率的基础上,可以有效解决克服目前的3',5'-环化腺苷酸成品中残留的无机盐杂质超标问题,确保临床用药的安全,还可以显著降低工业化生产的成本。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:一种可降低3',5'-环化腺苷酸中无机盐杂质的结晶方法,包括以下步骤:
(1)溶解:取3',5'-环化腺苷酸粗品,加水,经搅拌配制成3',5'-环化腺苷酸混悬液,然后添加可与3',5'-环化腺苷酸生成可溶性盐的无机盐,继续搅拌使大部分固体溶解,再滤除不溶物,得料液; (2)脱色:向步骤(1)所得的料液中添加活性炭,然后搅拌,得含炭脱色料液; (3)除炭和精滤除菌:将步骤(2)所得的含炭脱色料液进行除炭,然后经过微孔滤膜精滤除菌,得滤液; (4)调pH值、结晶:向步骤(3)所得的滤液中添加盐酸溶液或硝酸溶液,调整滤液的pH值,至有白色晶体析出,静置,得到含结晶晶体的混悬液; (5)固液分离:将步骤(4)所得的含结晶晶体的混悬液进行固液分离,得到3',5'-环化腺苷酸粗湿晶体,然后向所述粗湿晶体加入有机溶剂,再进行充分搅拌,之后离心或减压过滤,除去有机溶剂,即得3',5'-环化腺苷酸湿晶体; (6)干燥、粉碎、过筛和混合:将步骤(5)得到的3',5'-环化腺苷酸湿晶体置于干燥箱中干燥,粉碎成粉末,然后过筛,再倒入三维混合机混合,即得提纯的3',5'-环化腺苷酸产品。
进一步,步骤(1)中,所述无机盐为碳酸钙、碳酸氢钙、乙酸钙、丙酸钙、丁酸钙、氨水、碳酸铵或碳酸氢铵。优选碳酸钙、碳酸氢铵中的一种。
步骤(1)中,所述3',5'-环化腺苷酸粗品的纯度为97.5%以上,优选为99.0%以上,所述3',5'-环化腺苷酸混悬液的质量浓度为5%~40%,优选8~15%,更优选10%;所述水的温度为10℃~100℃,优选35~65℃,更优选40~60℃;所述无机盐的添加量为等当量至过量,优选为等当量。
进一步,步骤(2)中,所述活性炭的的加入量为所得溶液总质量的0.1%~1%,优选为0.2~0.4%,搅拌时间为10min以上,优选为30min。
进一步,步骤(3)中,所述微孔滤膜的孔径为0.22μm~0.45μm。
进一步,步骤(4)中,所述pH调节剂的浓度为0.5~8mol/L ,优选为4~7 mol/L,更优选5~6 mol/L;所述pH值为2~4,最佳为2.0;所述晶体析出温度为室温以下,优选为10℃以下。
进一步,步骤(5)中,所述有机溶剂的质量为粗湿晶体的1~10倍,优选为2~4倍。
进一步,步骤(5)中,所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丙酮等中的一种或几种的混合溶剂。除甲醇之外,其它4种均是《中国药典》收载的安全、低毒的有机溶剂。其中优选乙醇、丙酮。
进一步,步骤(6)中,所述干燥温度为30℃~130℃,优选为40℃~80℃,所述干燥时间为2~20 hr,所述过筛的筛网目数为80目~120目。
以下说明本发明原料选择的原理:
一、本发明步骤(1)中,无机盐的选择原则,应当同时满足以下条件:1).由于环磷腺苷呈酸性,故选择可与环磷腺苷生成可溶性盐的无机盐,如:cAMP•Na、cAMP•K、cAMP•Ca及环磷腺苷葡甲胺盐等,例如碳酸钙或碳酸氢铵等,但该无机盐不得含钡盐、镁盐、铜盐等重金属离子;2)由于环磷腺苷在水中微溶,因此,当用酸调节pH值,使上述可溶性的cAMP盐重新被酸化时,产生的新的盐类杂质,既应当易溶于水,同时还应当易溶于有机溶剂;比如:当无机盐中的阳离子为钙离子,酸性pH调节剂为盐酸时,可生成CaCl2,而CaCl2不但在水中易溶,且在乙醇中也易溶。具体数据见下表1、表2;3).若生成的盐仅在水中的溶解度比较大,而在醇、酮等溶剂中不溶或难溶,则不适于作为本品的酸性pH调节剂。比如:当无机盐中的阳离子为钾离子,酸性pH调节剂为盐酸时,则会生成KCl,尽管KCl在水中易溶,但在乙醇中微溶。具体数据见下述表1、表2。
二、无机盐的具体选择:1)根据本发明确定的无机盐选择原则,若选择阳离子为钾、钠的强碱弱酸盐做为无机盐,当用盐酸、硫酸、硝酸、磷酸等强酸中和时,生成的盐虽均易溶于水,但都不溶于或微溶于醇、酮等溶剂(部分钾、钠盐在甲醇、乙醇、丙酮中的溶解度参见表1);2).若选择阳离子为钙离子的强碱弱酸盐作为本发明使用的无机盐,当用HCl、HNO3作为本发明的酸性pH值调节剂时,则可生成既易溶于水又易溶于有机溶剂的盐,如:Ca(NO3)2、CaCl2(详见表1、表2),再用少量有机溶剂润洗,就可将这些盐类杂质完全除去;3).若选择阳离子为铵离子的弱酸弱碱盐作为本品的无机盐时,当采用HNO3作为本品的酸性pH值调节剂时,则可生成既易溶于水又易溶于部分有机溶剂的NH4NO3(详见表1、表2),再用少量的有机溶剂润洗,即可将这些盐类杂质,完全除去。因此,本发明使用的无机盐,只宜选择阳离子为钙离子的强碱弱酸盐(如乙酸钙、丙酸钙、丁酸钙、碳酸氢钙、碳酸钙、氧化钙、氢氧化钙,优选为碳酸钙)与阳离子为铵离子的弱酸弱碱盐(如氨水、碳酸氢铵、碳酸铵,优选为碳酸氢铵)。
三、当阳离子为钙离子的强碱盐或强碱弱酸盐时,对应的酸性pH值调节剂及有机溶剂的选择:1)对应的酸性pH值调节剂的选择:当酸性pH值调节剂选用硫酸、磷酸时,生成的钙的硫酸盐、磷酸盐,在水中与醇、酮中均不溶或微溶,故不宜选用硫酸、磷酸作为pH值酸性调节剂;当酸性pH值调节剂选用盐酸、硝酸时,生成的CaCl2既易溶于水又易溶于醇;生成的Ca(NO3)2既易溶于水又易溶于醇、酮(具体参见表1、表2),因此,酸性pH值调节剂宜选用盐酸、硝酸;从经济性方面考虑,优选盐酸;2)对应的有机溶剂的选择:当生成的盐为氯化钙时,由于氯化钙在甲醇、乙醇中易溶,在丙酮中不溶,故只能选用甲醇、乙醇作为有机溶剂;由于甲醇属二类溶剂,毒性较大,尤其对视神经的损害大,故从安全生产考虑,优选乙醇;当生成的盐为硝酸钙时,由于硝酸钙在甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丙酮均易溶,故五种溶剂均可作为有机溶剂使用;从安全生产考虑,宜选择乙醇、丙醇、异丙醇、丙酮;从经济性和来源方面考虑,优选乙醇。
四、当阳离子为铵离子的弱酸弱碱盐(如碳酸氢铵、碳酸铵)时,对应的酸性pH值调节剂及有机溶剂的选择:1)、阳离子为铵离子的弱酸弱碱盐,对应的酸性pH值调节剂的选择:当酸性pH值调节剂选用盐酸、硫酸、磷酸时,生成的铵的硫酸盐、盐酸盐、磷酸盐在醇、酮溶剂中均不溶或微溶,故不宜选用盐酸、硫酸、磷酸作为pH值酸性调节剂;.当酸性pH值调节剂选用硝酸时,生成的NH4NO3,既易溶于水又易溶于醇、酮(详见表1、表2),因此,宜选用硝酸;2)对应的有机溶剂的选择:由于硝酸铵在甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丙酮中均易溶,故5种有机溶剂均可选用;由于甲醇属二类溶剂,毒性较大,尤其对视神经的损害大,故从安全生产考虑,只宜选择乙醇、正丙醇、异丙醇、丙酮,其中优选丙酮、乙醇。
本发明的有益效果是:操作步骤简单,在不降低3',5'-环化腺苷酸产品的纯度、收率的基础上,克服了现有提纯结晶方法难以将产品中残留的少量NaCl、Na2SO4、KCl、NH4Cl等无机盐杂质去除,易使产品中无机盐杂质残留超标,不符合2015年版《中国药典》关于药品中无机盐杂质的限度须符合要求的相关规定之缺点;确保了临床用药的安全,还显著减少了润洗结晶用的溶剂用量,显著降低工业化生产的成本,具有良好的经济效益。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明:
以下所述各实施例使用的3',5'-环化腺苷酸粗品均由湖南中启制药有限公司提供。
实施例1
本实施例包括以下步骤:
(1)溶解:准确称取纯净水100kg,加热至40℃,取纯度为99%以上的3',5'-环化腺苷酸粗品10 kg(30.4mol),加入水中,搅拌,制成10%的3',5'-环化腺苷酸混悬液,备用;再称取纯度为99.0%以上的等当量的碳酸钙1.52kg(15.2mol),搅拌下,加入所述混悬液,待大部分白色固体溶解后,过滤,滤除不溶物,得料液;
(2)脱色:向步骤(1)所得料液,加入相当于料液总质量0.3%的活性炭(约300g),继续搅拌30min,得含炭脱色料液;
(3)除炭和精滤除菌:将步骤(2)所得含炭脱色料液先经除炭,再经过孔径为0.22μm的微孔滤膜精滤除菌,得滤液;
(4)pH值调节与结晶:待步骤(3)所得滤液冷却至室内温度后,用浓度为6 mol/L的盐酸溶液,调滤液的pH值至2.0,此时有大量白色晶体析出,待温度降至10℃以下后,静置20hr,得含结晶晶体的混悬液。
(5)固液分离:将含结晶晶体的混悬液先减压过滤,得粗湿晶体,再向粗湿晶体加相当于湿晶量2倍的乙醇(约30 L),充分搅拌后,减压过滤,滤除乙醇,即得提纯的3',5'-环化腺苷酸湿晶体。
(6)干燥、粉碎、过筛和混合:将步骤(5)所得提纯的3',5'-环化腺苷酸湿晶体置于40℃的减压干燥箱中,放置20 hr进行干燥;将干燥后的3',5'-环化腺苷酸晶体粉碎成粉末;将所得3',5'-环化腺苷酸粉末倒入振筛机(筛网目数为100目)过筛;将过筛后的3',5'-环化腺苷酸粉末倒入三维混合机混合20 min,得提纯的3',5'-环化腺苷酸产品8.3kg。
本实施例的3',5'-环化腺苷酸产品收率为83%,纯度为99.6%,炽灼残渣(即无机盐杂质残留量)检查项的检测结果为0.03%。
实施例2
本实施例包括以下步骤:
(1)溶解:准确称取纯净水5kg,加热至100℃,取纯度为98.0%以上的3',5'-环化腺苷酸粗品2kg(6.08mol),加入水中,搅拌,制成40%的3',5'-环化腺苷酸混悬液,备用;再称取纯度为99.0%以上的等当量的碳酸钙3.04kg(3.04mol),搅拌下,加入所述混悬液,待大部分白色固体溶解后,过滤,滤除不溶物,得料液;
(2)脱色:向步骤(1)所得料液,加入相当于料液总质量1%的活性炭(约50g),继续搅拌30min,得含炭脱色料液;
(3)除炭和精滤除菌:将步骤(2)所得含炭脱色料液先经除炭,再经过孔径为0.2μm的微孔滤膜精滤除菌,得滤液;
(4)pH值调节与结晶:待步骤(3)所得滤液冷却至室内温度后,用浓度为6 mol/L的硝酸溶液,调滤液的pH值至2.0,此时有大量白色晶体析出,置室温下,静置2 hr,得含结晶晶体的混悬液。
(5)固液分离:将含结晶晶体的混悬液先减压过滤,得粗湿晶体,再向粗湿晶体加相当于湿晶量2倍的丙酮(约6L),充分搅拌后,减压过滤,滤除丙酮,即得提纯的3',5'-环化腺苷酸湿晶体。
(6)干燥、粉碎、过筛和混合:将步骤(5)所得提纯的3',5'-环化腺苷酸湿晶体置于130℃的常压干燥箱中,放置2 hr进行干燥;将干燥后的3',5'-环化腺苷酸晶体粉碎成粉末;将所得3',5'-环化腺苷酸粉末倒入振筛机(筛网目数为100目)过筛;将过筛后的3',5'-环化腺苷酸粉末倒入三维混合机混合20 min,得提纯的3',5'-环化腺苷酸产品8.1kg。
本实施例的3',5'-环化腺苷酸产品收率为81%,纯度为99.5%,炽灼残渣(即无机盐杂质残留量)检查项的检测结果为0.03%。
实施例3
本实施例包括以下步骤:
(1)溶解:准确称取纯净水100kg,加热至60℃,取纯度为99.0%以上的3',5'-环化腺苷酸粗品(由湖南中启制药有限公司提供)10kg(30.4mol),加入水中,搅拌,制成10%的3',5'-环化腺苷酸混悬液,备用;再称取纯度为99.0%以上的等当量的碳酸氢铵2.49kg(30.4 mol),搅拌下,加入所述混悬液,待大部分白色固体溶解后,过滤,滤除不溶物,得料液;
(2)脱色:向步骤(1)所得料液,加入相当于料液总质量0.3%的活性炭(约300g),继续搅拌30min,得含炭脱色料液;
(3)除炭和精滤除菌:将步骤(2)所得含炭脱色料液先经除炭,再经过孔径为0.2μm的微孔滤膜精滤除菌,得滤液;
(4)pH值调节与结晶:待步骤(3)所得滤液冷却至室内温度后,用浓度为6 mol/L的硝酸溶液,调滤液的pH值至2.0,此时有大量白色晶体析出,等温度降至4℃室温以下后,静置17 hr,得含结晶晶体的混悬液。
(5)固液分离:将含结晶晶体的混悬液先减压过滤,得粗湿晶体,再向粗湿晶体加相当于湿晶量2倍的丙酮,充分搅拌后,减压过滤,滤除丙酮,即得提纯的3',5'-环化腺苷酸湿晶体。
(6)干燥、粉碎、过筛和混合:将步骤(5)所得提纯的3',5'-环化腺苷酸湿晶体置于40℃的减压干燥箱中,放置20 hr进行干燥;将干燥后的3',5'-环化腺苷酸晶体粉碎成粉末;将所得3',5'-环化腺苷酸粉末倒入振筛机(筛网目数为100目)过筛;将过筛后的3',5'-环化腺苷酸粉末倒入三维混合机混合20 min,得提纯的3',5'-环化腺苷酸产品8.25kg。
本实施例的3',5'-环化腺苷酸产品收率为82.5%,纯度为99.6%,炽灼残渣(即无机盐杂质残留量)检查项的检测结果为0.02%。
下面列举对比文献与本发明的实施例1进行实验数据对比说明:
1、对比文献1:CNCN103319557A 公开的环磷酸腺苷的结晶方法,记载了先将cAMP•Na配成饱和溶液,相当于是先将环磷腺苷制成易溶于水的钠盐,再用盐酸或硫酸调PH值至2.0。根据sigma公司目录,环磷腺苷钠在水中的溶解度约为10%(环磷腺苷钠的溶解度[Z].sigma-aldrich公司目录,2004~2005)。在结晶过程中,会生成的NaCl、Na2SO4,由于NaCl、Na2SO4微溶于有机溶剂(顾庆超等.化学用表[M] .江苏科学技术出版社,1979,2•70-2•71;2•88-2•89),具体见表1,故这二种盐类杂质,会包埋于cAMP结晶内,与cAMP形成共沉淀现象。尽管专利8使用了0.5倍~5倍的有机溶剂对结晶进行了洗涤,但仍然无法完全将成品中的残留的少量NaCl、Na2SO4杂质去除。
比如,欲使10 kg的环磷腺苷(约30.4mol)在100L水中完全溶解,需消耗30.4mol的NaOH,再用3.04mol的HCl,重新将溶液的PH值调至2.0,生成环磷腺苷结晶。因此,生成NaCl(FW=58.5)的量也是30.4mol,即1776.9g,相当于100L水中NaCl的浓度约为1.7%。由于环磷腺苷在水中微溶,因此,当将环磷腺苷混悬液中大量的水滤除后,环磷腺苷湿晶(简称:湿晶)的含水量约为30%~40%,即湿晶重量约为13kg~14kg。
根据前面的推算,由于水中NaCl 浓度=1.7kg/100L≈1.7%,故可推算出环磷腺苷湿晶中水中的含盐量约为71.4g~112.2g(均值91.8g;炽灼残渣=91.8g/10000g=0.0092=0.918%)。
根据环磷腺苷质量标准([S]. 2015年版中国药典二部),本品中的炽灼残渣限度应小于0.1%,相当于本品中NaCl的残留量应小于10000g*0.1%=10g。因此,上述NaCl的残留量,远远大于0.1%的限度。
由于NaCl在乙醇中的溶解度约为0.07%(g/100g),换算成氯化钠的体积溶解度约为0.07g/125ml (乙醇密度约为0.8g/ml ),折算成100ml 乙醇的相当于0.056g/100ml。若使91.8 g的氯化钠完全被乙醇溶解,需要95%的乙醇量至少为163kg ,相当于200L,相当于湿晶重量的14~15倍。
另外,在加入乙醇润洗本品的同时,NaCl也会从乙醇溶液中析出,混杂或被环磷腺苷晶体包埋,形成共沉淀现象。而该专利的结晶方法,仅用了5倍的溶剂体积,因此,显然不可能使本品的炽灼残渣限度符合药典规定。事实上,我们还采用了大量的95%的乙醇润洗湿晶(约30倍),本品的炽灼残渣限度仍然有0.3%。
对比例1
步骤一、溶解:准确称取的纯化水100kg,加热至40℃,取纯度为99%以上的环磷酸腺苷粗品10 kg(30.4mol),分次加入,搅拌均匀,制成10%的环磷腺苷混悬液,备用;再称取纯度为99.0%以上的等当量的氢氧化钠1.22kg(30.4 mol),搅拌下,分次加入上述混悬液,待大部分白色固体溶解后,过滤,滤除不溶物。
步骤二、脱色:向上述料液,加入约为料液总量为0.3%的活性炭(约300g),继续搅拌30min以上;
步骤三、脱炭和精滤:将上述溶液先经除炭,再经过孔径为0.22μm~0.45μm的微孔滤膜除菌;
步骤四、调结晶:待滤液冷至室温以下后,用浓度为6 mol/L的盐酸溶液,调滤液的PH值至2.0,此时有大量白色晶体析出,待温度降至4℃以下后,静置过夜,时间约为17 hr;
步骤五、收集结晶:上述混悬液先减压过滤后,再向上述粗湿晶体内加入湿晶量约15倍的乙醇,充分搅拌后,减压过滤,滤除乙醇。再向上述湿晶内加入湿晶量约15倍量的乙醇,充分搅拌后,减压过滤,滤除乙醇,即得3',5'-环化腺苷酸湿晶体;
步骤六、干燥、粉碎、过筛和混合:将收集的湿晶置于40℃的减压干燥箱中,放置14~17 hr;将干燥后的环磷腺苷粉成粉末;将粉碎后的环磷腺苷粉末倒入振筛机(筛网目数为100目)过筛;将过筛后的环磷腺苷粉末倒入三维混合机混合20 min,得3',5'-环化腺苷酸成品8.2kg。
本对比例1的3',5'-环化腺苷酸收率为82%,纯度为99.2%,炽灼残渣项为0.3 %。
2、对比文献2:“3’,5’-环化腺苷酸的生产(中国科学院上海生化所与上海生物化学制药厂. [J].医药工业,1973,8:4-11.)”和文献“最新生化药物制备技术(李良铸,李明晔. [M] .中国医药科技出版社,2001,245-246.)”,虽以固体NH4HCO3来调节溶液的PH值,但由于碳酸氢铵在常温放置、使用过程中易分解,产生强烈的刺激性氨臭味,不利于在洁净区的生产操作,而且生成的NH4Cl盐微溶于乙醇等有机溶剂(见表1),虽然使用了大量的有机溶剂对结晶进行润洗,但仍然不能完全将成品中的NH4Cl残留完全去除。
比如,欲使10 kg的环磷腺苷(约30.4mol)在100L水中完全溶解,需消耗30.4mol的NH4HCO3(FW=82),再用30.4mol的HCl,重新将溶液的PH值调至2.0,生成微溶于水的环磷腺苷结晶。同时,还生成30.4mol (约1626.4g)的NH4Cl(FW=53.5),相当于100L水中NH4Cl的浓度约为1.6%。
由于环磷腺苷在水中微溶,因此,当将环磷腺苷混悬液中大量的水滤除后,环磷腺苷湿晶(简称:湿晶)的含水量约为30%~40%,即环磷腺苷湿晶中水的重量为3~4kg, 故可推算出湿晶中的含盐量约为48g~64g(均值56g),因此,cAMP中的残留量相当于限度的5~7倍。
在本品精制时,加入适量的乙醇的目的,主要是考虑到用适量的乙醇润洗湿饼,一方面可使结晶更疏松,另一方面,可溶解一部分水,大大缩短减压干燥时间,而且并不会影响产品品质。
由于NH4Cl在乙醇微溶(NH4Cl在乙醇中的溶解度约为0.6%(g/100ml),故从理论上讲,48 g的氯化铵完全被乙醇溶解,需要乙醇量至少为8kg,约10L, 仅需为13kg~14kg湿晶量的0.71~0.76倍。
但由于共沉淀现象,由于氯化铵微溶于乙醇,故生成的氯化铵极易被包埋于cAMP结晶内,若乙醇的润洗体积不能足够大,则氯化铵在cAMP中残留量完全可能大于0.1%。
后我们照文献重结晶方法,将乙醇的润洗体积调整为湿晶量的10倍,润洗次数调整为二次,对制得的环磷腺苷参照食品添加剂氯化铵国家标准GB31631-2014中氯化铵含量测定方法,仅将cAMP的取样量改为该法的5倍后,对上述重结晶的cAMP成品中残留的氯化铵含量进行测定,测得cAMP中的氯化铵的测留量为0.35%,详见对比例2。
尽管本品中的氯化铵残留量超限,但照2015年版中国药典炽灼残渣检查法(通则0841),本品中炽灼残渣检查项结果却符合规定,为0.02%。究其原因,应当是由于NH4Cl在100℃时开始分解,337.8℃时可以完全分解为氨气和氯化氢气体,沸点为520℃,由于炽灼温度为700~800℃,故当将本品置于马沸炉内炽灼时,残留于本品中的NH4Cl会完全被气化,致使本品炽灼残渣检查项的结果呈假阴性所致。
对比例2
步骤一、溶解:准确称取的纯化水100kg,加热至40℃,取纯度为99%以上的环磷酸腺苷粗品10 kg(30.4mol),分次加入,搅拌均匀,制成10%的环磷腺苷混悬液,备用;再称取纯度为99.0%以上的等当量的碳酸氢铵2.49kg(30.4 mol),搅拌下,分次加入上述混悬液,待大部分白色固体溶解后,过滤,滤除不溶物。
步骤二、脱色:向上述料液,加入约为料液总量为0.3%的活性炭(约300g),继续搅拌30min以上;
步骤三、脱炭和精滤:将上述溶液先经除炭,再经过孔径为0.22μm~0.45μm的微孔滤膜除菌;
步骤四、调结晶:待滤液冷至室温以下后,用浓度为6 mol/L的盐酸溶液,调滤液的PH值至2.0,此时有大量白色晶体析出,待温度降至4℃以下后,静置过夜,时间约为17 hr。
步骤五、收集结晶:上述混悬液先减压过滤后,再向上述粗湿晶体内加入相当于湿晶量约5倍的乙醇,充分搅拌后,每次静置30min,减压过滤,滤除乙醇。再向上述湿晶内加入相当于湿晶量约5倍量的乙醇,充分搅拌后,减压过滤,滤除乙醇,即得3',5'-环化腺苷酸湿晶体。
步骤六、干燥、粉碎、过筛和混合:将收集的湿晶置于40℃的减压干燥箱中,放置14~17 hr;将干燥后的环磷腺苷粉成粉末;将粉碎后的环磷腺苷粉末倒入振筛机(筛网目数为100目)过筛;将过筛后的环磷腺苷粉末倒入三维混合机混合20 min,得3',5'-环化腺苷酸成品8.4kg。
本对比例1的3',5'-环化腺苷酸收率为84%,纯度为99.3%,炽灼残渣项为0.35 %。
3、对比文献3:“环磷腺苷的合成(申红艳,等. [J]. 中国医药工业. 2004,35(3):132-133)”,记载了在重结晶时,先将滤饼溶于50%乙醇水溶液40m1(相当于加入20 ml的水与20ml 的无水乙醇),用2mo1/L盐酸调至PH2,析出白色结晶(其中:cAMP重量约为7.1g(21.6mmol);KCl(MW=75.5)重量为1.6g(21.6mmol),浓度为8%)。
由于KCl在乙醇中微溶,又因为湿晶中cAMP的量为7.1 g。故过滤后,湿晶中的含水量一般为30%~40%,相当于2.13ml~2.84ml(均值为:2.48g),由于KCl的浓度为8%,故湿品中所含KCl的重量为0.2g。
再次将上述湿晶溶于50%乙醇水溶液30m1(相当于加入15 ml的水与15ml 的无水乙醇),此时,酸型的cAMP 浓度=7.1g/15ml=47% ,故远远大于cAMP的溶解度0.4%, cAMP无法溶解,故无法按该法进行重结晶。
另外,根据表1、表2,NH4Cl、NaCl虽在水中的溶解度比较大,但上述二种盐仅在甲醇中略溶(NH4Cl、NaCl在甲醇中溶解度分别为3.4g/100g、1.5g/100g)(见表1),为了将本品中上述二种盐类杂质充分去除,只能采用甲醇来润洗cAMP结晶。
由于甲醇属二类溶剂,毒性较大,尤其对视神经的损害,故从安全生产考虑,故我们不予考虑。
综上所述,上述对比文献记载的3',5'-环化腺苷酸结晶方法,均难以将cAMP中残留的少量NaCl、Na2SO4、KCl、NH4Cl等无机盐杂质去除。
表1:部分Na、K、Ca、铵盐在甲醇、乙醇、丙酮中的溶解度
注:-* 不溶;数据来自“化学用表”(顾庆超等. [M] .江苏科学技术出版社,1979,2•70-2•71;2•88-2•89)和“solubility of inorganic compounds in water”(HANDBOOKof CHEMISTRY and PHYSICS[M].44th EDITION 1962-1963,1694-1705)
表2. 部分Na、K、Ca、铵盐在不同温度的水中的溶解度
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明技术原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应当视为在本发明的保护范围之内。