CN107384955A - 花生谷氨酰t‑RNA还原酶及其应用 - Google Patents

花生谷氨酰t‑RNA还原酶及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种花生谷氨酰t‑RNA还原酶，还涉及花生谷氨酰t‑RNA还原酶在调节叶绿素和钙调素表达中的应用。本发明的有益效果：通过本发明鉴定了花生中谷氨酰t‑RNA还原酶的功能，具有调节叶绿素和钙调素表达中的作用，明确了该酶与钙信号之间的作用关系，为后期的研究奠定了理论基础。

Description

花生谷氨酰t-RNA还原酶及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种花生谷氨酰t-RNA还原酶，还涉及花生谷氨酰t-RNA还原酶的应用。
背景技术
叶绿素（Chlorophyll, Chl）是一种脂溶性的色素，在高等植物中存在于叶绿体中。植物在进行光合作用时，叶绿素发挥着极其重要的作用，能够吸收和转换太阳能，并在这一过程中把水分子分解产生氧气分子和还原性氧，在细胞电子传递链中起着十分重要的作用，从而开始了能量的转化过程，所以叶绿素在植物的生长发育以及农作物的品质和产量的形成上面都发挥着有十分重要的作用。叶绿素生物合成的起始物质是L-谷氨酰-tRNA，经过GluTR的催化作用，L-谷氨酰-t RNA被还原成为L-谷氨酸酯-1-半醛；然后经过谷氨酸酯-1-半醛转氨酶的催化作用，形成-氨基酮戊酸（ALA），ALA是叶绿素生物合成的关键前体物质。GluTR是叶绿素生物合成的中心控制者，该酶由谷氨酰t-RNA还原酶(HEMA)基因编码，因此HEMA是调控叶绿素合成途径的关键酶基因。不同植物HEMA成员数目可能有一定差异。模式植物拟南芥中HEMA有3个成员，分别是HEMA1、HEMA2和HEMA3，而黄瓜中只有HEMA1和HEMA2两个基因。
但花生HEMA基因国内外尚无报道，它在植物逆境生理和衰老生理过程中的调节作用尚不清楚。
发明内容
为了解决以上现有技术中花生HEMA基因在植物逆境生理和衰老生理过程中的调节作用研究空白的问题，本申请公开了一种花生谷氨酰t-RNA还原酶。
本发明还提供了花生谷氨酰t-RNA还原酶的应用。
本发明是通过以下步骤得到的：
花生谷氨酰t-RNA还原酶在调节叶绿素和钙调素表达中的应用。
所述的应用，优选花生谷氨酰t-RNA还原酶氨基酸序列如序列表中序列4所示。
所述的应用，优选表达花生谷氨酰t-RNA还原酶的核苷酸序列如序列表中序列3所示。
所述的应用，优选花生谷氨酰t-RNA还原酶在调节钙调素表达中的应用表现为，在盐胁迫条件下，超表达花生谷氨酰t-RNA还原酶基因的株系中钙调素表达量也随之增加。
所述的应用，优选花生谷氨酰t-RNA还原酶在调节叶绿素和钙调素表达中的应用，具体表现为，正常条件下和经过盐胁迫处理后，花生谷氨酰t-RNA还原酶基因过量表达后，叶绿素的生物合成也有增加。
钙素是植物生长发育必须的营养元素之一，它参与了植物从发芽到生长分化开花结果的全过程，在植物体内钙离子的主要作用是：（1）营养物质，促进微管的形成。（2）细胞壁的结构组织和膜的流动性。（3）减轻盐胁迫的毒害作用。（4）促进花粉管的生长和伸长。花生是需钙较多的作物，对钙元素的需求数量仅次于氮，高于磷，与钾相当。花生缺钙时，种子发育受阻，果壳组织疏松，空果、秕果及烂果增加，产量明显下降。研究Ca2+对花生逆境生理的调控机制及其与叶绿素合成过程间的关系对明确花生生长发育的钙素利用规律、保证花生高产具有非常重要的意义。
本发明的有益效果：通过本发明鉴定了花生中谷氨酰t-RNA还原酶的功能，具有调节叶绿素和钙调素表达中的作用，明确了该酶与钙信号之间的作用关系，为后期的研究奠定了理论基础。
附图说明
图1为AhhemA基因克隆结果，
图2为AhhemA基因编码蛋白的疏水性分析，
图3为AhhemA基因编码蛋白跨膜特性分析，
图4 为AhhemA在不同器官中的表达；F：花;R:根；S：茎；L：叶片；Fr:果实，
图5 为盐胁迫条件下外源施钙后AhhemA基因表达量及叶绿素含量测定，
图6 盐胁迫条件下外源施ALA后下游基因表达量，
图7 为转AhhemA基因植株PCR鉴定，
图8 为叶绿素含量测定，
图9 为CaM基因表达。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：
实施例1
1. AhhemA基因的分离
从花生叶片中利用RNA试剂盒提取RNA（购于天根生化科技有限公司）并反转录。根据基因序列，设计引物，引物序列为：5’-ATGGCTGTTTCGACGAGC-3’和5’-TTAGCTGTCACTATGGTT-3’进行聚合酶链式反应（PCR），PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段与估计的片段大小符合（1626 bp）（图1）。
将所得的PCR产物与pMD18-T克隆载体连接，转化大肠杆菌。通过菌落PCR快速筛选得到阳性克隆，提取阳性克隆的质粒，利用载体内部的酶切位点切割质粒，得到与PCR产物大小相同的条带。将鉴定好的菌液寄往上海生物工程公司测序，见序列表中序列3，用Blast，DNAman或DNAclub软件将所得片段序列与已知序列比较，发现该片段为所要克隆的目的基因。
2. AhhemA基因的序列分析
序列表中序列3：
(a)序列特征
* 长度:1626碱基对
* 类型: 核酸
* 链型: 双链
* 拓扑结构: 线性
(b)分子类型: cDNA
(c)假设: 否
(d)反义: 否
(e)最初来源:花生
序列表中序列4：
（a）序列特征
* 长度：541氨基酸
* 类型：氨基酸
* 链型：单链
* 拓扑结构：线性
（b）分子类型：蛋白质
3. AhhemA基因编码蛋白的生化特性分析
3.1 AhhemA基因编码蛋白的疏水性分析
对花生谷氨酰t-RNA还原酶基因所编码蛋白的疏水性进行分析，结果表明其亲水性氨基酸和疏水性氨基酸所占的比例相差不大（图2）。其中亲水性氨基酸所占比例稍高，表明该蛋白为水溶性蛋白。
3.2 AhhemA基因表达产物跨膜特性分析
通过向互联网上的在线PRED-TMR数据库提交AhhemA的氨基酸序列，预测到该酶蛋白结构中没有跨膜信号区（图3）。
4.AhhemA基因在花生植株中的表达分析
4.1AhhemA在花生不同器官中的表达
为了解AhhemA基因在不同器官中的内源表达情况，我们以花生AhhemA基因3’端的一段cDNA为引物进行了荧光定量PCR分析。结果表明，AhhemA基因在所有器官中均有表达，属于组成型表达，在叶片中的表达明显高于其他器官，在根中的表达量最低，说明AhhemA基因在叶绿素含量高的组织表达量较高（图4）。
4.2 花生植株在正常条件下生长三周后，200mM NaCl盐处理3天，外源施钙处理，分别选0、10、20、40、80mM不同浓度钙（记为CK、C10、C20、C40、C80，Normal为不加盐对照组）处理后取样，荧光定量PCR检测AhhemA表达情况，同时测定叶绿素含量，见图5。结果表明，盐胁迫条件下，外源施钙对花生hemA起到负调控作用，该基因表达下调，然而，叶绿素含量在施钙后并不受影响，呈上升趋势，表明钙信号在叶绿素合成途径中的作用位点很可能在hemA下游。
盐胁迫条件下，外源喷施AhhemA催化合成的ALA后，镁螯合酶活性中心的催化亚基ChlH和ChlD基因表达上调，并且在10mg/l ALA处理后表达量达到峰值，见图6。
5. AhhemA基因植物表达载体的构建
5.1 扩增AhhemA基因
花生品种“花育22”由山东省农业科学院提供，通过RT-PCR扩增了AhhemA基因的编码区。
hemA-F(5'-TCTAGAATGGCTGTTTCGACGAGC-3')(XbaI)；序列表中序列5，
hemA-R(5'-GGATCCTTAGCTGTCACTATGGTT-3')(BamHI)；序列表中序列6，
上述引物序列分别与AhhemA基因第1-18碱基、第1612-1626碱基对应。
5.2 AhhemA基因与克隆载体pMD18-TSimple及植物表达载体pBI121的连接
在构建真核表达载体时，将PCR所得基因全长连接入克隆载体pMD18-TSimple(购买于TaKaRa)，连接产物转化大肠杆菌Trans5α获得了抗卡纳的菌落。将筛选到的阳性克隆进行菌液富集后提取质粒，并将质粒用XbaI和BamHI进行双酶切，将酶切后包含AhhemA全长的条带进行回收；然后将pBI121载体用相同的酶进行酶切，将所得到的载体片段进行回收。这样所得到的全长序列和载体序列上带上了互补的粘性末端，再将二者连接后，转化大肠杆菌，通过酶切鉴定筛选出重组子，构建起表达载体pBI121-AhhemA。
5.3根癌农杆菌LBA4404感受态细胞的制备与转化
感受态细胞的制备步骤如下：
（1）挑取少许农杆菌LBA4404，接种于5mLLB液体培养基（含50mg/LSTR）中，28℃、200rpm培养过夜；
（2）取2mL培养物于LB液体培养基（含50mg/LSTR）中继续培养，直至OD800为0.5左右。
（3）培养物置冰浴中30min，4℃，5000rpm，离心5min，弃去上清液；
（4）用10mL冷的0.1mol/LNaCl悬浮菌液；
（5）4℃，5000rpm，离心5min，弃去上清液；
（6）用1mL冷的CaCl2（20mmol/L）悬浮，分装成50μL/管，液氮中冷冻后至-80℃保存。
冻融法农杆菌转化步骤：
（1）冰浴中融化感受态细胞；
（2）在1.5mLEppendorf离心管中加入2μL质粒DNA，再加入50μL融化了的感受态细胞，混匀后冰浴30min，液氮中冷冻1min，接着在37℃水浴中放置5min；
（3）加入950mL无抗生素的LB液体培养基，28℃、200rpm振荡3h；
（4）8000rpm离心1min，倒掉上清液，用100μLLB回溶菌体；
（5）取50μL菌液涂到LB固体培养基上（含有50mg/LKan，100mg/LRif），28℃倒置培养2-3d。
6. 利用农杆菌介导转化烟草
6.1 农杆菌培养：
挑取单菌落于5mLLB液体培养基（含有100mg/LRif和50mg/LKan）中培养36h（28℃、200rpm），然后取1%接种至上述同样培养基，28℃、200rpm培养12h，取2mL菌液离心（4℃、4000rpm、10min），然后用20mLMS液体培养基悬浮菌体，用于转化试验。
6.2 烟草转化、再生体系的建立：
（1）烟草Nc89种子，催芽后，播种于塑料盘中，常规管理，至2-3片真叶期，备用；
（2）取烟草叶片，用70%乙醇消毒30s，再0.1%HgCl2消毒8-10min，用无菌水冲洗数次后，剪成小块（0.5*0.5cm2）；
（3）将剪好的烟草叶片置于MS分化培养基中，28℃，光照时间16h/d，光照强度2000LX，预培养2天；
（4）将预培养后的烟草叶片浸入菌液5-10min，然后用灭菌的滤纸吸干多余菌液，接入MS培养基；28℃暗培养2天；
（5）共培养后的外植体用含250mg/L头孢的灭菌水洗涤3次，然后用灭菌滤纸吸干，转入含有卡那霉素100mg/L，头孢250mg/L的分化培养基上，恒温培养（条件同预培养）；每15天更换一次培养基；
（6）待芽长至1cm左右时，切下，移入MS生根培养基（附加卡那霉素50mg/L，头孢250mg/L）中，促其生根。待根系发育好后，移入盛有无菌土的花盆中，用塑料薄膜保湿2天后，温室常规管理。
7. 转基因烟草植株的PCR检测
7.1 CTAB微量法提取基因组DNA
（1）取0.1-0.2g新鲜叶片，置液氮中研磨成粉，转移到1.5mL离心管中，加入300μL2×CTAB提取缓冲液，轻轻搅动，使粉末充分散开，于65℃水浴中保温20min；
（2）随后，4℃，10000rpm离心10min；
（3）上清液转入一新离心管中，加入200μL氯仿/异戊醇（24:1），轻轻混匀，放置5min；
（4）4℃，8000rpm离心10min；
（5）将上清液转入另一离心管中，加入500μL冷的异丙醇，混匀，4℃放置10min；
（6）4℃，8000rpm离心10min，去掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上；
（7）75%乙醇洗沉淀，置超净工作台中20min吹干；
（8）加入50μLTE溶解DNA，-20℃保存备用。
2×CTAB提取缓冲液（100mL）：取1MTris·Cl10mL；0.5MEDTA4mL；NaCl8.182g；CTAB2.0g；PVP3.0g。将上述成分用蒸馏水溶解后，定溶到100mL。灭菌后加入加β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol,β-ME）200μL，备用。
7.2转基因植株的PCR检测
提取再生植株的基因组DNA，利用上述载体序列和AhhemA基因序列设计引物进行PCR扩增。PCR反应程序为：95℃、5min；95℃、50s，55℃、50s，72℃、1min30s，30个循环；72℃、10min。转基因植株PCR鉴定见图7，阳性率达到76.4%。
8. 转AhhemA基因植株功能鉴定
8.1 叶绿素含量测定。从转基因烟草中筛选出表达量较高的株系OE2、OE5和OE8进行叶绿素含量的测定。结果表明，正常条件下，转基因植株中叶绿素含量显著高于野生型植株；经过盐胁迫处理后，叶绿素含量均有下降，但转基因株系中叶绿素含量仍低于野生型植株。表明AhhemA基因过量表达后叶绿素的生物合成在一定程度上有增加，有利于提高植物的抗逆性。见图8。
8.2 转AhhemA基因植株中钙调素基因表达量。对照野生型植株和转基因植株经过200mM NaCl盐处理3天后利用荧光定量PCR检测钙调素基因的表达。图8 结果表明，盐胁迫条件下，超表达AhhemA基因的株系中钙调素表达量也随之增加，进一步证明了钙信号在叶绿素合成途径中的作用位点在hemA下游。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
<110>山东省农业科学院生物技术研究中心
<120>花生谷氨酰t-RNA还原酶及其应用
<160>6
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成
<400>1
ATGGCTGTTT CGACGAGC 18
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成
<400>2
TTAGCTGTCA CTATGGTT 18
<210>3
<211>1626
<212>DNA
<213>落花生（Arachis hypogaea）
<400>3
atggctgttt cgacgagctt ttcgggggct aagttggagg ctttgttcct caaatgttgt 60
tcctcttcct ctgccaatgc tgcttattct ttgtgtgtgc cttccaaaac cgccgccaag 120
gccaccagaa cgacgccgtt tcggagaggc ctggttcgtt gtgacgcttc ggcttctcct 180
gatgttattc ttgacaatgc tgctgccgtc tctgctcttc agcaacttaa gacttatgcc 240
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ggagagcttt gcggcctcaa tcatattgaa gaagcagctg ttctcagcac ctgtaaccga 420
atggagatat atgttgttgc tctctctcag catcgcggtg taaaagaagt caccgagtgg 480
atgtcaagaa ctagtggaat ccctgtttca gaactttgcc agcatcgatt tttgttgtat 540
aacaaagatg ccacacagca tcttttcgaa gtctcagctg gtcttgactc tcttgtgctg 600
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ggtgaagaat cacaacaatt cgaagcttgg agggactcgc ttgaaaccgt tcctaccata 1320
aaaaaattga gggcttatgc tgaaagaatc agggctgctg agcttgagaa atgcttaggt 1380
aagatgggtg atgatatctc gaagaagaca cggcgtgccg tggatgatct tagccgtggc 1440
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<210>4
<211>541
<212>PCR
<213>落花生（Arachis hypogaea）
<400>4
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5 10 15 20
SerSerSerSerAla AsnAlaAlaTyrSer LeuCysValProSer LysThrAlaAlaLys
25 30 35 40
AlaThrArgThrThr ProPheArgArgGly LeuValArgCysAsp AlaSerAlaSerPro
45 50 55 60
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GlyGluGlyGlnIle LeuAlaGlnValLys GlnValValLysVal GlyGlnGlyValAsn
205 210 215 220
GlyPheGlyArgAsn IleSerGlyLeuPhe LysHisAlaIleThr ValGlyLysArgVal
225 230 235 240
ArgAlaGluThrAsn IleAlaAlaGlyAla ValSerValSerSer AlaAlaValGluLeu
245 250 255 260
AlaLeuMetLysLeu ProGluThrSerHis GlyAsnAlaLysMet LeuValIleGlyAla
265 270 275 280
GlyLysMetGlyLys LeuValIleLysHis LeuValAlaLysGly CysThrLysMetVal
285 290 295 300
ValValAsnArgSer GluGluArgValAla GluIleArgGluGlu LeuLysAspValGlu
305 310 315 320
IleIleTyrLysPro LeuSerGluMetLeu AlaCysValGlyGlu AlaAspValValPhe
325 330 335 340
ThrGlyThrAlaSer GluAsnProLeuPhe LeuLysAspAspVal LysAspLeuProSer
345 350 355 360
ValSerGlnAspIle GlyGlyHisArgLeu PheIleAspIleSer ValProArgAsnVal
365 370 375 380
GlySerCysValSer AspIleGluSerVal ArgValTyrAsnVal AspAspLeuLysGlu
385 390 395 400
ValValAlaAlaAsn LysGluAspArgLeu ArgLysAlaMetGlu AlaGlnAlaIleIle
405 410 415 420
GlyGluGluSerGln GlnPheGluAlaTrp ArgAspSerLeuGlu ThrValProThrIle
425 430 435 440
LysLysLeuArgAla TyrAlaGluArgIle ArgAlaAlaGluLeu GluLysCysLeuGly
445 450 455 460
LysMetGlyAspAsp IleSerLysLysThr ArgArgAlaValAsp AspLeuSerArgGly
465 470 475 480
IleValAsnLysLeu LeuHisGlyProMet GlnHisLeuArgCys AspGlySerAspSer
485 490 495 500
ArgThrLeuThrGlu ThrLeuGluAsnMet HisAlaLeuAsnArg MetPheSerLeuGlu
505 510 515 520
ThrGluIleSerVal LeuGluGlnLysIle ArgAlaLysValGlu GlnAsnHisSerAsp
525 530 535 540
Ser
541
<210>5
<211>24
<212>DNA
<213>人工合成
<400>5
TCTAGAATGG CTGTTTCGAC GAGC 24
<210>6
<211>24
<212>DNA
<213>人工合成
<400>6
GGATCCTTAG CTGTCACTAT GGTT 24

Claims (5)

1.花生谷氨酰t-RNA还原酶在调节叶绿素和钙调素表达中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于花生谷氨酰t-RNA还原酶氨基酸序列如序列表中序列4所示。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于表达花生谷氨酰t-RNA还原酶的核苷酸序列如序列表中序列3所示。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于花生谷氨酰t-RNA还原酶在调节钙调素表达中的应用表现为，在盐胁迫条件下，超表达花生谷氨酰t-RNA还原酶基因的株系中钙调素表达量也随之增加。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于花生谷氨酰t-RNA还原酶在调节叶绿素和钙调素表达中的应用，具体表现为，正常条件下和经过盐胁迫处理后，花生谷氨酰t-RNA还原酶基因过量表达后，叶绿素的生物合成也有增加。
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