CN107383159B - 一种鹰嘴豆低聚肽及其工业化制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鹰嘴豆低聚肽及其工业化制备方法和用途。所述低聚肽粉收率不低于7%，肽含量在80wt%以上，分子量均分布在1500 Dalton以下，灰分不高于5%。所述方法操作简便，高收率低成本，适合大规模生产。所述鹰嘴豆低聚肽粉具有较好的抗氧化活性和抗疲劳功效，并具有促进肠道对PM 2.5颗粒物的分泌，增强巨噬细胞对PM 2.5颗粒物的吞噬功能，改善对PM 2.5颗粒物引起的心脏扩大的功效，可用于制备治疗或者预防PM 2.5颗粒物引起的症状的药物、食品或保健品。
Description
技术领域
本发明提供一种鹰嘴豆低聚肽及其工业化生产工艺及其用途，属于食品深加工领域。
背景技术
鹰嘴豆(Cicer arietinum L)为蝶形花科草本植物，别名桃尔豆、鸡豆、鸡心豆等，是印度和巴基斯坦的重要的蔬菜之一，在欧洲食用鹰嘴豆也十分普遍，也是维吾尔医常用药材。维吾尔族用它治疗支气管炎、黏膜炎、霍乱、便秘痢疾、消化不良、肠胃气胀、毒蛇咬伤、糖尿病、***降低、皮肤瘙痒、高脂血症、中暑等疾病。在中医上，鹰嘴豆可以调节湿度，有止泻、解毒、壮身等作用。
鹰嘴豆所含的营养成分非常丰富，无论是从种类，还是数量上，都大大超过其他豆类。它含有18以上的氨基酸(含人体必须但自身不能合成的全部8种氨基酸)，多种营养元素和微量元素，如：钙、罗、锌、镁、磷等。特别是每百克鹰嘴豆所含的钙高达350毫克，磷320毫克，高于大部分豆类，铁的含量达47毫克，比其它豆类高出90％，维生素C、B1、B2含量高达12毫克，膳食纤维含量更高于其它。据报道，鹰嘴豆含有丰富的蛋白质，高达20％，其中球蛋白和清蛋白分别占总蛋白的42.16％和39.76％。球蛋白和清蛋白是人体非常重要的营养物质，可以起到提升免疫力的作用。与鹰嘴豆蛋白相比，其水解产物鹰嘴豆低聚肽除氨基酸组成与鹰嘴豆蛋白一样具有优质蛋白的特点以外，还具有鹰嘴豆蛋白所不具备的良好的溶解性、稳定性等理化性质，而且具有易吸收和低过敏原性、降低血脂和胆固醇、降低血压、促进矿物质吸收和脂肪代谢、增强运动员体能等多种生理功能，因此开发鹰嘴豆低聚肽已经成为食品药品领域的研究热点。我们前期专利CN 105949290 A公开了鹰嘴豆蛋白及其肽的制备工艺，鹰嘴豆肽收率在6％左右，肽含量不低于80wt％，85％以上的肽分子量小于1500Dalton，灰分在10％左右。为了获得高分子量更小且灰分更低的鹰嘴豆低聚肽，并且应用于工业生产，本发明提供了一种更优的鹰嘴豆低聚肽制备工艺，制备所得的鹰嘴豆低聚肽的分子量均分布在1500Dalton以下，灰分控制在5％以下，收率也得到一定的提高。同时，生物活力实验表明，本工艺生产的鹰嘴豆低聚肽粉同样具有更好的抗氧化活性，同时体内生物活力测试表明此肽粉具有较好的抗疲劳功效，可以制备用于治疗相关疾病的药物、食品或保健品。除此之外，体内活性还表明该肽粉具有促进肠道对PM 2.5颗粒物的分泌，增强巨噬细胞对PM 2.5颗粒物的吞噬功能，改善对PM 2.5颗粒物引起的心脏扩大的功效，可用于制备治疗或者预防PM 2.5引起的症状的药物、食品或保健品。
食品中除含有大量有机物质之外，还含有较丰富的无机成分。这些无机成分维持人体的正常生理功能，构成人体组织方面有着十分重要的作用。食品经过高温灼烧后残留的无机物质称为灰分。灰分主要为食品中的矿物盐或无机盐类，测定食品中灰分是评价食品质量的指标之一。对于食品行业来说，灰分是一项体的重要的质量指标。例如，在面粉加工中，常以总灰分含量来评定面粉等级，因为小麦麸皮的灰分含量比胚乳高20倍左右，因此，面粉的加工精度越高，灰分含量越低。在生产果胶、明胶等胶质产品时，总灰分可说明这些制品的胶冻性能；水溶性灰分则在很大程度上表明果酱、果冻等水果制品中的水果含量；而酸不溶性灰分的增加则预示着污染和掺杂。这对保证食品质量是十分重要的。食品和药品中灰分的控制具有下述重要意义：
(1)食品的总灰分含量是控制食品成品或半成品质量的重要依据。比如：牛奶中的总灰分在牛奶中的含量是恒定的。一般在0.68％--0.74％，平均值非常接近0.70％，因此可以用测定牛奶中总灰分的方法测定牛奶是否掺假，若掺水，灰分降低。另外还可以判断浓缩比，如果测出牛奶灰分在1.4％左右，说明牛奶浓缩一倍。又如富强粉，麦子中麸皮灰分含量高，而胚乳中蛋白质含量高，麸皮的灰分比胚乳的含量高20倍，就是说面粉中的精度高，则灰分就低。
(2)评定食品是否卫生，有没有污染。不同的食品，因所用原料、加工方法及测定条件的不同，各种灰分的组成和含量也不相同，当这些条件确定后，某种食品的灰分常在一定范围内。如果灰分含量超过了正常范围，说明食品生产中使用了不合乎卫生标准要求的原料或食品添加剂，或食品在加工、贮运过程中受到了污染。因此，测定灰分可以判断食品受污染的程度
(3)判断食品是否掺假。
(4)评价营养的参考指标(可通过测各种元素)。
(5)可以评判食品的加工精度和食品品质。无机盐是六大营养要素之一，是人类生命活动不可缺少的物质，要正确评价某食品的营养价值，其无机盐含量是一个评价指标。譬如常以总灰分含量评定面粉等级，富强粉为0.3-0.5％；标准粉为0.6-0.9％。生产果胶、明胶之类的胶质品时，灰分是这些制品的胶冻性能的标志。
因此，为了获得更低灰分的鹰嘴豆低聚肽粉，本发明所制备的产品灰分可控制在5％以下，同时制备工艺绿色、环保，适合大规模生产。
发明内容
本发明公开了一种鹰嘴豆低聚肽及其工业化制备工艺，旨在保证肽含量的前提下，提供一种分子量更小且灰分更低的鹰嘴豆低聚肽的工业化制备工艺，工艺更为简便，绿色环保，适合大规模生产。本工艺生产的鹰嘴豆低聚肽粉具有更好的抗氧化活性，可以用于治疗或预防自由基过多引起的症状的药物、食品或保健食品；具有抗疲劳的功效，可以用于预防或者治疗疲劳症状的药物、食品或保健食品；具有并具有促进肠道对PM 2.5颗粒物的分泌，增强巨噬细胞对PM 2.5颗粒物的吞噬功能，改善对颗粒物引起的心脏扩大的功效，可用于制备治疗或者预防PM 2.5颗粒物引起的症状的药物、食品或保健品。
在鹰嘴豆低聚肽的制备过程中，由于蛋白提取以及酶解过程中，为达到生物酶反应条件，不断的加入盐酸和氢氧化钠，造成盐的含量高，从而造成灰分含量高。较高的灰分，影响了产品中肽含量。由于盐的分子量较小，前期肽的纯化方法都是较大分子量的超滤膜，最后收集的为超滤膜的透过液，因此肽、氨基酸以及盐均在透过液，不能将盐除去。
现有技术中多种食品的灰分控制在8wt％，如大豆肽粉的国家标准(GBT 22492-2008，其内容在此全部引入并作参考)。但利用本申请的制备方法，灰分可控制在5wt％以下。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种鹰嘴豆低聚肽，其特征在于：采用GB/T 22492-2008附录A与附录B的检测方法，测得肽含量在80wt％以上，分子量小于1500Dalton以下的占100％，其分子量分布如下：
数均分子量范围：45～1340
重均分子量范围：47～1380；
其中所述灰分小于5wt％；
优选地，肽含量为81.2wt％以上，分子量小于1500Dalton以下的占100％；
优选地，肽含量为85wt％以上，分子量小于1500Dalton以下的占100％；
优选地，肽含量为90wt％以上，分子量小于1500Dalton以下的占100％；
优选地，肽含量为95wt％以上，分子量小于1500Dalton以下的占100％。
本发明还提供了所述鹰嘴豆低聚肽粉的制备方法；优选地，包括(1)鹰嘴豆的预处理；(2)碱提酸沉法提取蛋白；(3)蛋白酶解；(4)分离纯化。
优选地，所述方法包括下述步骤：
(1)原料预处理：将带皮的鹰嘴豆粉碎，过24目以上筛网以获得鹰嘴豆粉，将鹰嘴豆粉与有机溶剂按质量比为1:3～1:10混合，室温搅拌20～60min，离心过滤，豆渣按以上步骤再次处理1～2次，最后离心过滤后得到处理好的豆渣。
(2)碱提酸沉法提取蛋白：将处理好的豆渣，与水按重量比为1:5～1:20混合，调节pH至8～10于室温提取2～3次，每次1～2h，合并碱提液，离心过滤，调节滤液的pH为3～5，离心弃去上清液，再使用pH为3～5纯化水清洗沉淀物1～2次，离心得到鹰嘴豆蛋白沉淀物。
(3)蛋白酶解：往鹰嘴豆蛋白沉淀物中加入体积比为1:5～1:15的纯化水混合，搅拌均匀复溶，将蛋白复溶液加热至40～55℃，加入鹰嘴豆粉质量的0.1％～1％生物酶，搅拌酶解4～6h后，调整pH为2～6，煮沸灭活10～30min，离心过滤，滤液备用；
(4)分离纯化：将步骤(3)中的滤液使用孔径为0.5μm以下的微滤膜进行过滤，透过液再经100～400Dalton纳滤膜处理后，截留液浓缩干燥后，得到鹰嘴豆低聚肽粉。
优选地，所述的有机溶剂选自醇类、脂类、醚类、烷烃类的一种或者它们的混合物，优选乙醇溶液；所述乙醇溶液配制使用的乙醇为食品级乙醇，乙醇溶液体积浓度为50％以上，优选体积浓度为90％以上的乙醇溶液。
优选地，所述的碱提酸沉法可以为连续逆流提取法或者普通提取法。
优选地，所述生物酶选自食品级的中性蛋白酶(酶活力≥30万u/g)、木瓜蛋白酶(酶活力≥40万u/g)、菠萝蛋白酶(酶活力≥30万u/g)、碱性蛋白酶(酶活力≥20万u/g)、胃蛋白酶(酶活力≥50万u/g)、胰酶(酶活力≥3000u/g)中的一种或者它们的混合物，优选地使用中性蛋白酶。
优选地，所述浓缩可以为膜浓缩、减压浓缩或常压浓缩；所述干燥可以为喷雾干燥、真空干燥、加热干燥或冷冻干燥。
所述鹰嘴豆低聚肽粉的制备方法，其特征在于：鹰嘴豆的产率在7％以上。
更优选地，所述制备方法包括在分离纯化步骤中使用100～400Dalton纳滤膜处理的步骤。
本发明还提供了一种组合物，其含有上述的鹰嘴豆低聚肽粉，和药物或食品上可接受的助剂。
所述组合物的剂型选自素片、薄膜包衣片、糖衣片、肠衣片、分散片、胶囊、颗粒剂、口服溶液或口服混悬液。
本发明所述的鹰嘴豆低聚肽粉、组合物，都用于制备治疗或预防自由基过多引起的症状的药物、食品或保健品的应用。所述的鹰嘴豆低聚肽粉是由中性蛋白酶制备的。
本发明所述的鹰嘴豆低聚肽粉、组合物，都用于制备预防或者缓解疲劳的食品、保健品或药品，更优选剧烈运动或是精神压力造成的疲劳，更优选剧烈运动造成的疲劳。所述的鹰嘴豆低聚肽粉是由中性蛋白酶制备的。
本发明所述的鹰嘴豆低聚肽粉、组合物，都用于制备具有促进肠道对PM 2.5颗粒物的分泌，增强巨噬细胞对PM 2.5颗粒物的吞噬功能，改善对PM 2.5颗粒物引起的心脏扩大的药物、食品或保健品的应用。所述的鹰嘴豆低聚肽粉是由中性蛋白酶制备的。
附图说明
图1：本发明的方法制备所得肽粉液相色谱图；
图2：鹰嘴豆低聚肽粉对斑马鱼体内纳米活性炭(PM 2.5)分泌进入肠道促进作用的表型图；
图3：鹰嘴豆低聚肽粉对斑马鱼体内吞噬纳米活性炭(PM 2.5)的巨噬细胞吞噬功能促进作用的表型图；
图4：鹰嘴豆低聚肽粉对于纳米活性炭(PM 2.5)引起斑马鱼心脏扩大改善作用的表型图。
实施例
下面通过实施例对本发明作进一步说明。应该理解的是，本发明实施例所述方法仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。如无特别说明，实施例中用到的所有原料和溶剂均为市售产品。活性实施例2和3中所用本发明产品和阳性对照药品的量，均按照试验受体的最大耐受剂量加入。
对比实施例：
专利CN 105949290 A的制备方法获得的肽粉：将鹰嘴豆粉碎，过24目以上筛网从而获得鹰嘴豆粉。将1kg鹰嘴豆粉与浓度为95％乙醇溶液按质量比为1:3混合，室温搅拌30min，完成后，离心过滤，豆渣按以上步骤再次处理一遍，离心过滤；将豆渣与其质量比为1:8的纯化水混合，调节pH至9.5，室温提取1h，提取完成后离心过滤，弃去滤渣，滤液待用；调节滤液的pH为3，离心弃去上清液，再使用pH为3纯化水清洗蛋白沉淀物一遍；在清洗后的蛋白沉淀物中加入体积比为1:5的纯化水，搅拌均匀复溶，将蛋白复溶液加热至45℃，加入鹰嘴豆粉质量的0.2％中性蛋白酶(酶活力为40万u/g)，搅拌酶解4h后，煮沸灭活10min，离心，上清液即为蛋白酶解液；将蛋白酶解液使用孔径为0.5μm的微滤膜进行过滤，透过液再经5000Dalton超滤膜处理后，截留液浓缩、干燥后，得到淡黄色鹰嘴豆低聚肽粉(T-2)，产率可达6.1％，并测得肽含量为80.7％，至少95.41％以上分布在1500Dalton分子量以下，灰分为10.8wt％。
通过本发明方法获得的肽粉：将鹰嘴豆粉碎，过24目以上筛网从而获得鹰嘴豆粉。将1kg鹰嘴豆粉与浓度为95％乙醇溶液按质量比为1:3混合，室温搅拌30min，完成后，离心过滤，豆渣按以上步骤再次处理一遍，离心过滤；将豆渣与其质量比为1:8的纯化水混合，调节pH至9.5，室温提取1h，提取完成后离心过滤，弃去滤渣，滤液待用；调节滤液的pH为3，离心弃去上清液，再使用pH为3纯化水清洗蛋白沉淀物一遍；在清洗后的蛋白沉淀物中加入体积比为1:5的纯化水，搅拌均匀复溶，将蛋白复溶液加热至45℃，加入鹰嘴豆粉质量的0.2％中性蛋白酶(酶活力为40万u/g)，搅拌酶解4h后，调整pH为3，煮沸灭活10min，离心，上清液即为蛋白酶解液；将蛋白酶解液使用孔径为0.1μm的微滤膜进行过滤，透过液再经100Dalton纳滤膜处理后，截留液浓缩、干燥后，得到淡黄色鹰嘴豆低聚肽粉(T-1)，产率可达7.3％，并测得肽含量为81.2wt％，其肽分子量均小于1500Dalton。可见在不影响肽含量的前提下，产率提高了1％，而且分子量更小，均在1500Dalton以下小于1500Dalton分子量占100％，灰分为3.8wt％。
生物活性实施例1(抗氧化活性)：
1 DPPH自由基清除实验：
1.1 DPPH乙醇溶液的配制：精密称取DPPH 4mg，置于100mL棕色容量瓶中，加入50mL乙醇，超声30s，用乙醇定容至刻度，摇匀，待用。本品须现配现用。
1.2供试品溶液的配制：精密称取适量鹰嘴豆低聚肽粉，加乙醇溶解后，定容，稀释成所需浓度，即可。
1.3操作步骤：准确吸取2mL供试品溶液和2mL DPPH溶液混合均匀；准确吸取2mL供试品溶液和2mL乙醇混合均匀；准确吸取2mL DPPH溶液和2mL乙醇混合均匀，室温放置30min，在515nm波长处测定吸光度，并根据以下计算公式计算自由基清除率：
IR％＝[1-(Ai-Aj)/A0]*100％；
其中，Ai表示待测溶液和DPPH混合后溶液的吸光度；
Aj表示待测溶液和溶剂混合后溶液的吸光度；
A0表示DPPH和溶剂混合后溶液的吸光度。
2 ABTS+自由基清除实验：
2.1 PBS缓冲液的配制：称取氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸二氢钾0.24g，十二水合磷酸氢二钠3.62g，置于1000mL烧杯中，加入800mL蒸馏水，搅怑使其溶解，用盐酸或氢氧化钠调节pH至7.4，转移至1000mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，待用。
2.2 ABTS+贮存溶液的配制：精密称取ABTS+78mg左右，置于20mL棕色容量瓶中，加入15mL蒸馏水，超声5min，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。精密称取过硫酸钾76mg左右，置于2mL棕色容量瓶中，加入1mL蒸馏水，超声使其溶解，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。精确吸取352μL过硫酸钾溶液加入至ABTS溶液中，摇匀，静置过夜。
2.3 ABTS+工作溶液的配制：精确吸取贮存溶液1mL，加入65mL左右PBS缓冲液，摇匀。
2.4供试品溶液的配制：精密称取适量鹰嘴豆低聚肽，加PBS缓冲液溶解后，定容，稀释成所需浓度，即可。
2.5操作步骤：准确吸取0.5mL供试品溶液和5mL ABTS工作溶液混合均匀；准确吸取0.5mL供试品溶液和5mL PBS缓冲液混合均匀；准确吸取5mL ABTS工作溶液和0.5mL PBS缓冲液混合均匀，立即在734nm处测定吸光度，并根据以下公式计算自由基清除率：
IR％＝[1-(Ai-Aj)/A0]*100％；
其中，Ai表示待测溶液和ABTS混合后溶液的吸光度；
Aj表示待测溶液和溶剂混合后溶液的吸光度；
A0表示ABTS和溶剂混合后溶液的吸光度。
3 SRSA超氧阴离子自由基清除实验：
3.1 NBT溶液的配制：精密称取氯化硝基四氮唑蓝(NBT)24.5mg，置于100mL棕色容量瓶中，加入50mL蒸馏水，超声30s，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，待用。
3.2 NADH溶液的配制：精密称取烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型辅酶I(NADH)33.2mg，置于100mL棕色容量瓶中，加入50mL蒸馏水，超声30s，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，待用。
3.3 PMS溶液的配制：精密称取吩嗪硫酸甲酯(PMS)4.59mg，置于250mL棕色容量瓶中，加入150mL蒸馏水，超声30s，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，待用。
3.4 Tris-HCl缓冲溶液的配制：精密称取三羟甲基氨基甲烷(Tris)3.025g，置于500mL烧杯中，加入200mL蒸馏水，搅拌使其溶解，用1M HCl调节pH至8.0，转移至250mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，待用。使用时，取16mL上述溶液置于100mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度。
3.3供试品溶液的配制：精密称取适量鹰嘴豆低聚肽，加Tris-HCl缓冲液溶解后，定容，稀释成所需浓度，即可。
3.4吸光值检测及自由基清除率的计算：准确吸取1mL NADH溶液，1mL NBT溶液和3mL供试品溶液，对照加3mLTris-HCl缓冲溶液，分别混合均匀，各加1mL PMS溶液混匀，室温放置5min，在558nm处测定吸光度，自由基清除率计算公式如下：
IR％(SRSA)＝(1-Ai/A0)*100％
其中，Ai表示待测溶液和检测试剂混合后溶液的吸光度；
A0表示空白溶液和检测试剂混合后溶液的吸光度。
分别配制对比实施例的鹰嘴豆低聚肽产品(批号为T-1及T-2)进行DPPH、SRSA以及ABTS+自由基清除实验，并测定其EC50值，结果如表1所示：
表1鹰嘴豆低聚肽粉抗氧化活性
由表1可知，两种方法所制备的鹰嘴豆低聚肽粉对DPPH和ABTS自由基具有较强的清除作用，而对超氧阴离子(SRSA)的清除率作用较弱。而通过本专利所公开方法所制备的鹰嘴豆低聚肽(T-1)对三种自由基的清除效果略好，推测原因为更小肽分子量。可见使用本专利的发明方法所制备的鹰嘴豆低聚肽粉同样可用于制备治疗或预防自由基过多引起的症状的药物、食品或保健食品。
生物活性实施例2(抗疲劳功效)：
1鹰嘴豆低聚肽对斑马鱼运动能力的改善作用
随机选取4dpf野生型AB品系斑马鱼于六孔板中，每孔(即每个供试品组)30尾，分别水溶给予鹰嘴豆低聚肽，阳性对照药中华跌打丸1.0mg/mL浓度，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3mL。供试品预处理一段时间后，除正常对照组外，其余实验组均同时水溶给予亚硫酸钠以诱发斑马鱼疲劳模型。供试品和亚硫酸钠共同处理斑马鱼一段时间后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼，利用行为分析，测定斑马鱼的运动总距离(S)，定量评价供试品对亚硫酸钠诱发的疲劳斑马鱼的运动改善作用。
2鹰嘴豆低聚肽对斑马鱼体内乳酸代谢的影响
随机选取4dpf野生型AB品系斑马鱼于六孔板中，每孔(即每个供试品组)30尾，分别水溶给予鹰嘴豆低聚肽，阳性对照药中华跌打丸1.0mg/mL浓度，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3mL；每个实验组设置3个平行。供试品预处理一段时间后，除正常对照组外，其余实验组均同时水溶给予亚硫酸钠以诱发斑马鱼疲劳模型。供试品和亚硫酸钠共同处理斑马鱼一段时间后，每个实验组将3个平行实验组中的斑马鱼汇集在一起(共90尾)，利用NanoDrop2000超微量分光光度计间接测定斑马鱼体内乳酸含量，分别定量评价鹰嘴豆低聚肽在2000μg/mL浓度下对亚硫酸钠诱发的疲劳斑马鱼体内的乳酸含量的影响。
表2鹰嘴豆低聚肽对斑马鱼运动能力的改善作用
表3鹰嘴豆低聚肽对斑马鱼体内乳酸含量的影响
由表2和表3可知，本发明制备的鹰嘴豆低聚肽粉可明显改善斑马鱼运动能力，提高体内乳酸代谢。由此可见鹰嘴豆低聚粉具有明显的抗疲劳功效，可以用于预防或缓解疲劳的食品，保健品或药品。
生物活性实施例3(抗PM 2.5功效)：
1评价鹰嘴豆低聚肽粉对斑马鱼纳米活性炭(PM 2.5)分泌进入肠道的促进作用
实验动物：黑色素等位基因突变型半透明Albino品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为受精后2天，共150尾，每实验组为30尾。
实验模型的建立：将62.5mg/mL纳米活性炭(PM 2.5)作为纳米颗粒，注射到2dpf斑马鱼卵黄囊中(相当于人肌肉注射)，每尾斑马鱼注射10nL，即以625ng/尾剂量建立斑马鱼PM 2.5分泌模型。
实验步骤：随机选取150尾受精后2天(2dpf)黑色素等位基因突变型半透明Albino品系斑马鱼于六孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼，肌肉注射给予纳米活性炭建立斑马鱼纳米活性炭分泌进入肠道功能评价模型。水溶给予鹰嘴豆低聚肽(T-1)2000μg/mL浓度，同时设置正常对照组(养鱼用水处理斑马鱼)和模型对照组，每孔(实验组)容量为3mL。供试品每天换液，处理5d后，统计体内纳米活性炭分泌进入肠道的斑马鱼数量(N)，根据纳米活性炭分泌发生率的统计学意义来评价供试品对纳米活性炭分泌进入肠道的影响。统计学处理结果用mean±SE表示，纳米活性炭分泌发生率计算公式为：分泌发生率(％)＝(N纳米活性炭分泌进入肠道/N总数)×100％。实验结果如表4所示。
表4鹰嘴豆低聚肽粉对斑马鱼肠道分泌的促进作用
由表4可知，模型对照组斑马鱼纳米活性炭分泌尾数为4/30，纳米活性炭分泌发生率为13.3％。而鹰嘴豆低聚肽在浓度为2000μg/mL时，斑马鱼纳米活性炭分泌尾数为16/30尾，纳米活性炭分泌发生率为53.3％，表明鹰嘴豆低聚肽具有明显促进斑马鱼纳米活性炭分泌进入肠道的作用。
2评价鹰嘴豆低聚肽粉对吞噬纳米活性炭(PM 2.5)的巨噬细胞吞噬功能的促进作用
实验动物：黑色素等位基因突变型半透明Albino品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为受精后2天，共180尾，每实验组为30尾。
实验模型的建立：将62.5mg/mL纳米活性炭(PM 2.5)作为纳米颗粒，注射到2dpf斑马鱼血液循环中(相当于人静脉注射)，每尾斑马鱼注射10nL，即以625ng/尾剂量建立斑马鱼PM 2.5吞噬模型。
实验步骤：随机选取180尾受精后2天(2dpf)黑色素等位基因突变型半透明Albino品系斑马鱼于六孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼，静脉注射给予纳米活性炭建立斑马鱼纳米活性炭吞噬模型。水溶给予鹰嘴豆低聚肽粉(T-1)浓度为2000μg/mL，同时设置正常对照组(养鱼用水处理斑马鱼)和模型对照组，每孔(实验组)容量为3mL。供试品每天换液，处理2d后，加入中性红溶液对斑马鱼进行活体染色16h，染色结束，在解剖显微镜下统计吞噬了纳米活性炭的巨噬细胞数量(N)，根据吞噬纳米活性炭的巨噬细胞数量的统计学意义来评价供试品对巨噬细胞吞噬作用的影响。统计学处理结果用mean±SE表示，巨噬细胞吞噬促进作用计算公式为：巨噬细胞吞噬促进作用(％)＝(N供试品-N模型对照组)/N模型对照组×100％。结果如表5所示。
表5鹰嘴豆低聚肽粉对斑马鱼巨噬细胞吞噬功能的促进作用
由表5可知，模型对照组吞噬纳米活性炭的巨噬细胞数量为11.1个，而鹰嘴豆低聚肽在2000μg/mL时，吞噬纳米活性炭的巨噬细胞数量为17.9个，巨噬细胞吞噬促进作用分别为61％，表明鹰嘴豆低聚肽对斑马鱼巨噬细胞吞噬功能具有明显的促进作用。
3评价鹰嘴豆低聚肽粉对PM 2.5引起心脏扩大的改善作用
实验动物：野生型AB品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为受精后2天，共180尾，每实验组为30尾。
实验模型的建立：用PM 2.5处理2dpf野生型AB品系斑马鱼24h，建立PM2.5诱发的心血管毒性模型。
实验步骤：随机选取180尾受精后2天(2dpf)野生型AB品系斑马鱼于六孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼，水溶给予PM 2.5诱发斑马鱼心血管毒性评价模型。分别水溶给予鹰嘴豆低聚肽粉(T-1)，浓度为100μg/mL，同时设置正常对照组(养鱼用水处理斑马鱼)和模型对照组，每孔(实验组)容量为3mL。分别与PM 2.5共同处理24h后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼在解剖显微镜下拍照并采集数据，用NIS-Elements D 3.10高级图像处理软件进行图像分析统计斑马鱼心脏面积(A)。统计学处理结果用mean±SE表示，供试品对PM 2.5引起心脏扩大的改善作用(％)＝(A模型组-A供试品组)/(A模型组-A正常对照组)×100％。，结果如表6所示。
表6鹰嘴豆低聚肽粉对PM 2.5引起心脏扩大的改善作用
由表6可知，模型对照组斑马鱼心脏面积(13105像素)与正常对照组(10590像素)比较，表明模型建立成功；鹰嘴豆低聚肽在浓度为100μg/mL浓度时，斑马鱼心脏面积分为11967像素，心脏扩大改善作用为45％，可见鹰嘴豆低聚肽对PM 2.5引起的心脏扩大有显著的改善作用。
Claims (7)
1.一种鹰嘴豆低聚肽粉用于制备促进肠道对PM 2.5颗粒物的分泌、改善对PM 2.5颗粒物引起心脏扩大的药物、食品或保健品的应用；所述鹰嘴豆低聚肽，其特征在于：采用GB/T22492-2008附录A与附录B的检测方法，测得肽含量在80wt%以上，分子量小于1500 Dalton的占100%，其分子量分布如下：
数均分子量范围：45 ~ 1340
重均分子量范围：47 ~ 1380；
其中灰分小于5wt%。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：肽含量为81.2wt%以上，分子量小于1500Dalton的占100%。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：肽含量为85wt%以上，分子量小于1500Dalton的占100%。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：肽含量为90wt%以上，分子量小于1500Dalton的占100%。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：肽含量为95wt%以上，分子量小于1500Dalton的占100%。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述鹰嘴豆低聚肽的工业化制备方法，包括下述步骤：在分离纯化步骤中使用100~400 Dalton纳滤膜处理。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述鹰嘴豆低聚肽的工业化制备方法，包括下述步骤：
(1)原料预处理：将带皮的鹰嘴豆粉碎，过24目以上筛网以获得鹰嘴豆粉，将鹰嘴豆粉与有机溶剂按质量比为1:3~1:10混合，室温搅拌20~60 min，离心过滤，豆渣按以上步骤再次处理1~2次，最后离心过滤后得到处理好的豆渣；
(2)碱提酸沉法提取蛋白：将处理好的豆渣，与水按重量比为1:5~1:20混合，调节pH至8~10于室温提取2~3次，每次1~2 h，合并碱提液，离心过滤，调节滤液的pH为3~5，离心弃去上清液，再使用pH为3~5纯化水清洗沉淀物1~2次，离心得到鹰嘴豆蛋白沉淀物；
(3)蛋白酶解：往鹰嘴豆蛋白沉淀物中加入体积比为1:5~1:15的纯化水混合，搅拌均匀复溶，将蛋白复溶液加热至40~55oC，加入鹰嘴豆粉质量的0.1%~1%的生物酶，搅拌酶解4~6h后，调整pH为2~6，煮沸灭活10~30 min，离心过滤，滤液备用；
(4)分离纯化：将步骤(3)中的滤液使用孔径为0.5 µm以下的微滤膜进行过滤，透过液再经100~400 Dalton纳滤膜处理后，截留液浓缩干燥后，得到鹰嘴豆低聚肽粉；
所述的有机溶剂选自醇类、脂类、醚类、烷烃类的一种或者它们的混合物；所述的碱提酸沉法为连续逆流提取法或者普通提取法；
所述生物酶选自食品级的中性蛋白酶-酶活力≥30万u/g、木瓜蛋白酶-酶活力≥40万u/g、菠萝蛋白酶-酶活力≥30万u/g、碱性蛋白酶-酶活力≥20万u/g、胃蛋白酶-酶活力≥50万u/g、胰酶-酶活力≥3000 u/g中的一种或者它们的混合物，所述浓缩为膜浓缩、减压浓缩或常压浓缩；所述干燥为喷雾干燥、真空干燥、加热干燥或冷冻干燥。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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