CN107376016A - 一种重组蛛丝蛋白小口径人造血管支架的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种重组蛛丝蛋白小口径人造血管支架的制备方法，包括以大腹园蛛基因组为模板，采用PCR技术得到梨状腺丝重复区，并与pLX载体连接，构建重组质粒，转入BL21中进行表达，使用变性纯化手段，获得重组蛛丝蛋白溶液，并进行冻干，得到干蛋白；采用静电纺手段，与PLCL共混，得到小口径人造血管支架。本发明反应条件温和，成本低廉，工艺简单，易于操作；制备出的小口径人造血管支架具有很好的力学性能及生物相容性，厚度均匀，具有产业化实施的前景。

Description

一种重组蛛丝蛋白小口径人造血管支架的制备方法
技术领域
本发明属于纳米纤维领域，特别涉及一种重组蛛丝蛋白小口径人造血管支架的制备方法。
背景技术
蜘蛛丝是蜘蛛赖以生存的命绳，数十亿年的大自然进化赋予蜘蛛丝优异的机械强度和生物学品质，综合性能远超蚕丝以及目前最好的人造纤维材，在现代科技生活中有着不可估量的潜在应用价值。
蛛丝肉食性，领地意识强，养殖成本高，而且蜘蛛具有同类相食的个性，无法像家蚕一样高密度养殖。天然蜘蛛丝主要来源于结网，产量非常低。所以要从天然蜘蛛中取得蛛丝，产量非常有限。因此，通过基因工程的手段实现蜘蛛丝蛋白的原核表达就成为可行的策略了。
小口径人造血管支架的研制与开发一直是国际上近十年来的热点，但是到目前为止都没有正式的产品诞生，原因在于小口径人造血管支架的生物相容性和抗凝血的要求远远高于普通的大口径人造血管支架。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种重组蛛丝蛋白小口径人造血管支架的制备方法，该方法反应条件温和，成本低廉，工艺简单，易于操作；制备出的小口径人造血管支架具有很好的力学性能及生物相容性，厚度均匀，具有产业化实施的前景。
本发明的一种重组蛛丝蛋白小口径人造血管支架的制备方法，包括：
(1)以大腹园蛛基因组为模板，通过PCR扩增得到梨状腺丝PySp完整重复区的基因片段PySp-Rp；将PySp-Rp和pLX质粒分别进行双酶切，纯化回收后混合，再加入T4DNA连接酶反应，得到连接产物；
(2)将上述连接产物转入DH5α感受态细胞中进行转化，37℃过夜培养后，经酶切鉴定得到重组质粒Plx-PySp-Rp；再转入BL21感受态细胞中，37℃过夜培养后，挑取重组质粒单克隆接入LB培养基中，37℃过夜培养后，再转接入LB培养基中扩大培养，然后加入IPTG诱导培养，收集菌体；将菌体重悬于裂解缓冲液中，破菌后，离心、收集沉淀、纯化、冻干，得到重组蛛丝蛋白PySp；
(3)将重组蛛丝蛋白PySp与PLCL混合溶于溶剂中得到纺丝液，进行静电纺丝，最后经交联得到重组蛛丝蛋白小口径人造血管支架；其中，支架内径在1.5～2.0mm之间，厚度在0.1～0.5mm之间。
所述步骤(1)中的PySp-Rp的序列如SEQ ID NO.1所示。基因片段PySp-Rp的基因大小为639bp，编码213个氨基酸，蛋白分子量为22.9KDa。
所述步骤(1)中的PCR扩增所用引物为：
正向引物ATGCGGATCCGCTCCAGCACCTGCACCTAGA；
反向引物ATGCCTCGAGTTACGGTGCTGCCAGTTGAGATAG。
PCR条件为：98℃预变性3min，变性5s，65℃退火15s，72℃延伸10s，循环30次。
所述步骤(1)中的pLX质粒上具有6个His标签，用于蛋白鉴定和纯化。
所述步骤(1)中的双酶切具体为加入内切酶BamHI和XhoI，37℃下反应1-2h进行酶切；连接酶反应的反应温度为室温，反应时间为12-14h。
所述步骤(2)中的连接产物和DH5α感受态细胞的体积比为1:10；重组质粒和BL21感受态细胞的体积比为1:50；BL21感受态细胞为BL21(DE3)感受态细胞。
所述步骤(2)中的LB培养基均含有浓度为100μg/ml的氨苄青霉素(即两个LB培养基均含有氨苄青霉素)。
所述步骤(2)中的IPTG的浓度为200μg/ml；诱导培养的工艺参数为：37℃下诱导培养5h。
所述步骤(2)中的裂解缓冲液为Lysis Buffer。Lysis Buffer仅含有20mM Tris缓冲液，pH8.0。
所述步骤(2)中的破菌的压强为1100bar；离心的转速为12000r/min。
所述步骤(2)中的纯化具体为：将沉淀用含有4M尿素的Lysis Buffer漂洗一次后，用含有8M尿素的Lysis Buffer重旋沉淀，12000rpm离心后收集上清液，透析于超纯水中。
所述步骤(3)中的溶剂为六氟异丙醇，纺丝溶质的总质量浓度为8％。
所述步骤(3)中的静电纺丝的工艺参数为：纺丝电压14KV，给液速率0.8ml/h，纺丝距离15cm。
所述步骤(3)中的交联采用浓度为75％的乙醇溶液。
本发明首先采用大腹园蛛基因组为模板，采用融合PCR技术进行拼接，然后构建Plx-PySp-Rp重组质粒，转入大肠杆菌进行表达，用变性纯化方法进行纯化，获得PySp重组蛛丝蛋白溶液，并冻干保存。实验证明，该重组蛛丝蛋白在大肠杆菌中可以大量表达。经过静电纺，获得的小口径人造血管支架，在特征上符合小口径人造血管支架的定义，具有小口径人造血管支架的优良性能。
本发明操作简单易行，原材料成本较低，蛛丝蛋白具有良好的生物相容性，稳定性高并对环境无污染。制备得到的重组蛛丝蛋白表现出良好的形态特征和生物相容性。得到的静电纺小口径人造血管支架具有相对较好的力学性能和生物相容性。本发明使用SnapGene软件，PCR扩增，Western Blot与SDS-PAGE，变性纯化，透析，冷冻干燥等技术构建和纯化该蛛丝蛋白，Western Blot与SDS-PAGE用来对该蛋白进行鉴定，并通过ATR-FTIR(衰减全反射-傅里叶变换红外光谱法)分析该重组蛛丝蛋白与PLCL共混的与小口径人造血管支架对应的纳米纤维膜的二级构象特征、扫描电子显微镜(SEM)观察形貌特征、亲水角测试仪测试亲疏水性以及通过细胞培养测试细胞相容性。
有益效果
(1)本发明制备工艺简单，反应条件温和，易于操作纯化，所用均为环境友好的材料；
(2)本发明制备的PySp-Rp重组蛋白表达产量可观，所制备的混合静电纺小口径人造血管支架具有较好的力学性能和生物相容性，厚度均匀，可以预见，本发明制备的小口径人造血管支架具有产业化实施的前景，是一种潜在的小口径人造血管支架材料。
附图说明
图1是本发明的电子克隆构建流程图；
图2是实施例1制备的重组蛛丝蛋白的SDS-PAGE鉴定结果图；其中，M为蛋白marker，1为诱导前大肠杆菌中蛋白组成，2为诱导后蛋白组成，S为破菌离心后的上清液，P为破菌离心后的沉淀部分；
图3是实施例1制备的重组蛛丝蛋白的Western Blot鉴定结果图；其中，M为蛋白marker，1为4M尿素漂洗后的沉淀部分，2为8M尿素溶解后的上清液，3为破菌后总蛋白的Western blot图，4为8M尿素溶解后上清液，即纯化后的蛋白；
图4是实施例1制备的重组蛛丝蛋白纳米纤维膜的SEM图；其中，A-E分别为PySp和PLCL的质量比0:100、25:75、50:50、75:25和100:0；
图5是实施例1制备的重组蛛丝蛋白与人造血管支架对应的纳米纤维膜的红外分析图；
图6是实施例1制备的重组蛛丝蛋白与人造血管支架对应的纳米纤维膜的水接触角测试图；其中，A为PySp和PLCL的质量比0:100制备的纳米纤维膜的水接触角，B1-B3为PySp和PLCL的质量比25:75制备的纳米纤维膜在水接触后2s、4s、6s后的图，C1-C3为PySp和PLCL的质量比50:50制备的纳米纤维膜在水接触后2s、4s、6s后的图，D1-D3为PySp和PLCL的质量比75:25制备的纳米纤维膜在水接触后2s、4s、6s后的图，E1-E3为PySp和PLCL的质量比100:0制备的纳米纤维膜在水接触后2s、4s、6s后的图；
图7是实施例1制备的重组蛛丝蛋白与人造血管支架对应的纳米纤维膜所培养的细胞(HUVEC(人脐静脉内皮细胞))图；其中，(A)为荧光显微镜下的细胞形态，(B)为SEM下的细胞黏附情况；
图8是实施例1制备的重组蛛丝蛋白小口径人造血管支架的实物照片(PySp和PLCL的质量比50:50)。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
取大腹园蛛基因组1μL，以PySp重复区序列设计的一对正反向引物各2.5μL，加入25μL Q5 Master MIX酶，最后加入19μL ddH2O混匀，进行PCR扩增，PCR条件为：98℃预变性3min，变性5s，65℃退火15s，72℃延伸10s，循环30次。正向引物为：ATGCGGATCCGCTCCAGCACCTGCACCTAGA，反向引物为：ATGCCTCGAGTTACGGTGCTGCCAGTTGAGATAG。使用1％的琼脂糖凝胶电泳，切取片段大小为639bp左右，该片段即为PySp-Rp。
使用胶回收试剂盒回收，用30μL ddH2O洗脱，在洗脱液中分别加入BamHI和XhoI内切酶各2μL，Buffer 5μL，最后加入11μL ddH2O混匀后37℃反应1小时，同时，吸取30μL pLX质粒分别加入BamHI和XhoI内切酶各2μL，Buffer 5μL，最后加入11μL ddH2O混匀后37℃反应1小时后，对反应液分别使用PCR产物纯化试剂盒回收，都用20μL ddH2O洗脱后，吸取片段PySp-Rp 6μL、酶切后的pLX质粒2μL、T4Ligase酶1μL和酶连Buffer 1μL混匀后于室温下连接反应12小时，得到连接产物。
取5μL连接产物加入50μL DH5α感受态细胞，进行转化，37℃过夜培养后，挑取单克隆进行双酶切检查，将酶切正确的再进行送测序，将最终测序正确的重组质粒Plx-PySp-Rp，转入50μL BL21感受态细胞中，37℃过夜培养后，挑取重组质粒单克隆接入10ml LB培养基(含有浓度为100μg/ml的氨苄青霉素)中，37℃培养后，转接入1L LB培养基中37℃培养至OD600为0.8后加入IPTG，37℃5h培养后，5000rpm离心收集菌体，同时分别对诱导前后制样。重悬于50ml Lysis Buffer(只含有20mM Tris缓冲液，Ph8.0)中1100bar高压破菌，12000rpm离心10min，收集沉淀，并对破菌后的沉淀和上清分别制样，并同时进行SDS-PAGE鉴定与Western blotting Anti-his鉴定。然后用含有4M尿素的Lysis Buffer漂洗一次，用含有8M尿素的Lysis Buffer重悬沉淀，分别制样。12000rpm离心后收上清，透析于超纯水中，使用冻干机冻干后，称重获得100mg蛋白粉末，即重组蛛丝蛋白PySp。
用HFIP(六氟异丙醇)溶解PySp和PLCL(聚乳酸:聚己内酯＝50:50)，采用8％的总质量浓度，以质量比0:100、25:75、50:50、75:25和100:0在纺丝电压14KV、给液速率0.8ml/h、纺丝距离15cm的条件下进行静电纺丝，最后放入75％的乙醇蒸汽中过夜交联，得到由静电纺丝制备得到的小口径人造血管支架。
从图2和图3中可以看出，在SDS-PAGE胶图中相比于诱导前的大肠杆菌中的蛋白分布，诱导后在35KDa和25KDa之间，明显多了一条表达量较高的蛋白条带，并经Western Blot抗His标签的蛋白且与SDS-PAGE胶图中多出的蛋白条带位置重合。说明该重组蛛丝蛋白在大肠杆菌中获得高表达。
由图4可知，本实施例的与血管支架相对应的纳米纤维膜直径分布相对集中，均匀，主要在500nm左右。
由图5可知，含有重组蛛丝蛋白的与血管支架相对应的纳米纤维膜中，吸收峰主要在1610cm-1～1640cm-1之间(酰胺Ⅰ带)，说明重组蛛丝蛋白的主要结构是β-sheet。
由图6可知，该重组蛛丝蛋白确实促进血管支架相对应的纳米纤维膜亲水性的提高。
由图7可知，该重组蛛丝蛋白有助于细胞增殖和黏附。
SEQUENCE LISTING
<110> 东华大学
<120> 一种重组蛛丝蛋白小口径人造血管支架的制备方法
<130> 1
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gctccagcac ctgcacctag accagctcct cgaccactac cagccccaat tcaagcccca 60
agaccagcac ccgcaccaca acctgcaccg gtttacgcac cagccccagt cgtttcacaa 120
gttcaggcaa cttcttcctc tcaagcctcg gctcaacaga gtgccttcgc acagtcccaa 180
caatcttcag ttgttcaatc tcaacaaagt tcaaacgctt attctgcagc atcaactgcc 240
ggttcaagtg tgtcgcaatc tcaggcgatt gtctcaagcg ctcctgttta ttttaacacg 300
caaactttaa gtagcagcct gtcttcttct ctgcaatcac tcagtgcact caattcgtta 360
gcgagtggtc aactgagctc ctggaatgcc gcttctatta tagcgagtgc ggtagcaccg 420
tcacttggag tgtcccaagc gtcggttcaa aatagtataa gccaacagtt gagaagcgta 480
gggcccggat cttccacgtc ctctgtcgct caagcaatag caaatggagt ggctaacgca 540
gttggagcat caggaacagg agttgcagga caagaacaat ctatttcaca atccatatat 600
acttcagttt ccactgctct atctcaactg gcagcaccg 639
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgcggatcc gctccagcac ctgcacctag a 31
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgcctcgag ttacggtgct gccagttgag atag 34

Claims (10)

1.一种重组蛛丝蛋白小口径人造血管支架的制备方法，包括：
(1)以大腹园蛛基因组为模板，通过PCR扩增得到梨状腺丝PySp完整重复区的基因片段PySp-Rp；将PySp-Rp和pLX质粒分别进行双酶切，纯化回收后混合，再加入T4DNA连接酶反应，得到连接产物；
(2)将上述连接产物转入DH5α感受态细胞中进行转化，37℃过夜培养后，经酶切鉴定得到重组质粒Plx-PySp-Rp；再转入BL21感受态细胞中，37℃过夜培养后，挑取重组质粒单克隆接入LB培养基中，37℃过夜培养后，再转接入LB培养基中扩大培养，然后加入IPTG诱导培养，收集菌体；将菌体重悬于裂解缓冲液中，破菌后，离心、收集沉淀、纯化、冻干，得到重组蛛丝蛋白PySp；
(3)将重组蛛丝蛋白PySp与PLCL混合溶于溶剂中得到纺丝液，最后经交联得到重组蛛丝蛋白小口径人造血管支架；其中，支架内径在1.5～2.0mm之间，厚度在0.1～0.5mm之间。
2.根据权利要求1所述的一种重组蛛丝蛋白小口径人造血管支架的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的PySp-Rp的序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的一种重组蛛丝蛋白小口径人造血管支架的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的PCR扩增所用引物为：
正向引物ATGCGGATCCGCTCCAGCACCTGCACCTAGA；
反向引物ATGCCTCGAGTTACGGTGCTGCCAGTTGAGATAG。
4.根据权利要求1所述的一种重组蛛丝蛋白小口径人造血管支架的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的双酶切具体为加入内切酶BamHI和XhoI，37℃下反应1-2h进行酶切；连接酶反应的反应温度为室温，反应时间为12-14h。
5.根据权利要求1所述的一种重组蛛丝蛋白小口径人造血管支架的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中的连接产物和DH5α感受态细胞的体积比为1:10；重组质粒和BL21感受态细胞的体积比为1:50；BL21感受态细胞为BL21(DE3)感受态细胞。
6.根据权利要求1所述的一种重组蛛丝蛋白小口径人造血管支架的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中的LB培养基均含有浓度为100μg/ml的氨苄青霉素。
7.根据权利要求1所述的一种重组蛛丝蛋白小口径人造血管支架的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中的IPTG的浓度为200μg/ml；诱导培养的工艺参数为：37℃下诱导培养5h。
8.根据权利要求1所述的一种重组蛛丝蛋白小口径人造血管支架的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中的裂解缓冲液为Lysis Buffer。
9.根据权利要求1所述的一种重组蛛丝蛋白小口径人造血管支架的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中的溶剂为六氟异丙醇，纺丝溶质的总质量浓度为8％。
10.根据权利要求1所述的一种重组蛛丝蛋白小口径人造血管支架的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中的静电纺丝的工艺参数为：纺丝电压14KV，给液速率0.8ml/h，纺丝距离15cm。
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