CN107375344A - 植物乳杆菌zdy2013的新应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了植物乳杆菌ZDY2013的新应用，所述植物乳杆菌ZDY2013具有能够TNBS诱导的小鼠克莱恩病，改善炎症表观症状，调节氧化应激，调控炎症因子的表达，达到有效防治DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎。
Description
技术领域
本发明属微生物领域，具体是涉及一种植物乳杆菌ZDY2013的新应用。
背景技术
结肠炎(inflammatory bowel disease,IBD)分为溃疡性结肠炎(ulecrativecolitis,UC)和克莱恩病(Crohn’s disease,CD)两种类型。随着近年来发病率和死亡率不断上升，结肠炎已成为严重威胁人类生命健康的一类恶性疾病。被世界卫生组织列为现代难治疗病症之一。其常见临床表现为体重下降、腹泻、血便，有癌变的倾向，反复性强。研究证明，目前用于治疗结肠炎的药物主要有氨基水杨酸、糖皮质激素以及免疫调节剂等，药价高，且副作用不可控。
植物乳杆菌作为肠道革兰氏阳性益生菌，可调节肠道菌群平衡，抑制有害菌的生长，在肠道免疫作用中占有重要地位。
本发明的申请人之前分离到的植物乳杆菌ZDY2013于2014年4月28日保存于武汉市武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M2014170。并发明该植物乳杆菌ZDY2013极耐酸耐胆盐，能在胃肠液中保持较高的存活率，并能抑制食源性致病菌的增长。此外，还能因为能调节肠道菌群多样性，达到改善宿主胃肠道健康。但是，鉴于胃肠道疾病的复杂性和多样性，所述植物乳杆菌 ZDY2013在具体胃肠道疾病的治疗功能还一无所知。
发明内容
本发明的目的之一是提供植物乳杆菌ZDY2013的新应用。
为实现以上目的，本发明提供了已下技术方案：
植物乳杆菌ZDY2013在制备防治溃疡性结肠炎的药物或保健品或食品中的应用，所述植物乳杆菌ZDY2013的保藏号为CCTCC M2014170。
本发明的另一目的是提供一种治疗溃疡性结肠炎的药物或保健品或食品。
实现上述目的的技术方案如下。
一种治疗溃疡性结肠炎的药物或保健品或食品，其活性成分包括有植物乳杆菌ZDY2013，所述植物乳杆菌ZDY2013的保藏号为CCTCC M2014170。
优选的，所述食品为饮料、酸奶、果冻等多种乳杆菌可生存的食品，只要植物乳杆菌可生存的食品中都可以，具体根据实际需要。
优选的，本发明所用的治疗溃疡性结肠炎的植物乳杆菌菌剂剂量为1×1010 cfu/kg，根据具体情况计算使用，即每kg动物、人体所用菌剂中含植物乳杆菌 ZDY2013达1010cfu。
本发明公开了一种用于治疗溃疡性结肠炎的益生菌菌剂，由植物乳杆菌 ZDY2013制备而成，以一种处于稳定期的新鲜活菌菌体形式存在。
本发明采用的植物乳杆菌ZDY2013于2014年4月28日保存于武汉市中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M2014170。
本发明进一步公开了治疗结肠炎的植物乳杆菌菌剂的制备方法，包括如下步骤：
1)植物乳杆菌ZDY2013MRS液体培养基37±1℃厌氧培养24±2h，到达到稳定期的菌体，所述植物乳杆菌ZDY2013的保藏号为CCTCC M2014170；
2)离心收集步骤1)中菌体，用无菌1×PBS洗涤2-4次；
3)用无菌1×PBS调整步骤2)所得菌体浓度到1-2×109cfu/mL；
4)向上述所得菌体中加入适宜辅料制成的药物或食物或保健品。
本发明的发明人对之前所获得的植物乳杆菌ZDY2013经过大量的研究，发现所述植物乳杆菌ZDY2013具有能够TNBS诱导的小鼠克莱恩病，改善炎症表观症状，调节氧化应激，调控炎症因子的表达，达到有效防治DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎。
附图说明
图1不同组小鼠体重变化。
图2不同组小鼠结肠组织HE染色切片。
图3不同组溃疡性结肠炎小鼠炎症因子表达。
图4不同组克莱恩病小鼠炎症因子表达。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如 Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1
菌体的活化：
将保存于甘油中的植物乳杆菌ZDY2013旋涡混匀后吸取10μL涂布于MRS 固体培养基中，37℃厌氧培养24h，挑取单菌落接种于4mL液体MRS培养基中， 37℃厌氧培养24h，按1％接种量接种于10mL MRS液体培养基中，37℃厌氧培养24h，达到稳定期。
MRS培养基配制：蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母粉 5g/L，葡萄糖20g/L，无水乙酸钠5g/L，柠檬酸氢二胺2g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.25g/L，吐温-80 1ml/L，pH6.3±0.1，121℃、15分钟灭菌
实施例2
植物乳杆菌菌剂的制备：
将活化好的处于稳定期的植物乳杆菌ZDY2013离心，收集新鲜菌体，用无菌1×PBS洗涤3次，用无菌1×PBS调菌体浓度到109cfu/mL，制成实验所需菌剂，备用。
实施例3
溃疡性结肠炎小鼠模型的构建及实验设计：
配制DSS蒸馏水溶液，待BALB/c小鼠适应环境后自由饮用7天，构建溃疡性结肠炎模型，通过表观性状判断造模是否成功。待小鼠体重下降至10％时，开始灌胃植物乳杆菌ZDY2013菌剂，按10mL/Kg，每天给药1次，连续给药5 天。对结肠炎空白组小鼠灌胃PBS，治疗结束后，摘眼球取血并处死小鼠，剖取回肠末段及全结肠。生理盐水迅速冲干净。标本于10％***溶液浸泡，做 HE染色。剩余部分结肠保存至RNA保护液，-80℃保存备用。
实验结果：
(1)本发明明显改善小鼠体重
经过灌胃植物乳杆菌ZDY2013菌剂治疗5天后，治疗组小鼠较结肠炎组小鼠体重有明显的改善，如图1所示，治疗结束后，益生菌菌剂治疗组小鼠基本可恢复至初始体重。说明本发明可有效缓解结肠炎导致的体重下降情况，改善小鼠的体重。
(2)本发明显著改善小鼠病理学情况
将不同组小鼠结肠组织制成病理学切片，结肠炎组小鼠结肠组织与自然对照组进行对比，从图2可以看出，结肠炎组结肠杯状细胞严重损伤，部分丢失，炎性细胞浸润，在粘膜下层呈连续分布，固有层发生病变，本发明组(植物乳杆菌菌剂治疗组)结肠形态较为完整，炎症细胞部分浸润。说明了本发明菌剂可有效缓解结肠炎小鼠的结肠组织炎症情况，具有修复肠粘膜损伤的功效。
(3)本发明菌剂显著调节溃疡性结肠炎炎症因子的表达
将保存于-80℃的结肠组织进行RNA提取，反转录操作后，检测炎症因子 TNF-α,IL-10的表达水平。
由图3可以看出，本发明组(植物乳杆菌组)小鼠较溃疡性结肠炎组小鼠炎症因子表达水平得到显著调节，下调了促炎症因子TNF-α表达水平，并上调了抑炎症因子IL-10的表达水平。说明了本发明菌剂可通过调节细胞因子表达水平，从而达到保护机体抗炎症的目的。
实施例4
克莱恩病模型小鼠的构建及实验设计：
配制TNBS的乙醇溶液，采用的BALB/c小鼠待适应环境后禁食24h，9号直灌胃针进行灌肠，建立急性克莱恩病模型。待小鼠体重下降至10％时，开始灌胃植物乳杆菌ZDY2013菌剂，按10mL/Kg，每天给药1次，连续给药8天。治疗结束后，选取结肠段，保存至RNA保护液，-80℃冻存备用。
实验结果：本发明显著调节克莱恩病结肠炎的炎症因子表达
将保存于-80℃的结肠组织通过液氮研磨，利用RNA提取试剂盒进行RNA 提取，将RNA反转录成cDNA，通过RT-qPCR方法检测炎症因子TNF-α的表达水平。由图4可以看出，本发明组小鼠较克莱恩病结肠炎组小鼠炎症因子表达水平得到显著调节，下调了促炎症因子TNF-α表达水平。说明了本发明菌剂可通过调节细胞因子表达水平，从而达到保护机体抗炎症的目的。
以上仅为本发明的具体实施例，并不以此限定本发明的保护范围；在不违反本发明构思的基础上所作的任何替换与改进，均属本发明的保护范围。
Claims (5)
1.植物乳杆菌ZDY2013在制备防治溃疡性结肠炎的药物或保健品或食品中的应用，所述植物乳杆菌ZDY2013的保藏号为CCTCC M2014170。
2.一种治疗溃疡性结肠炎的药物或保健品或食品，其特征是，其活性成分包括有植物乳杆菌ZDY2013，所述植物乳杆菌ZDY2013的保藏号为CCTCC M2014170。
3.根据权利要求2所述的治疗溃疡性结肠炎的药物或保健品或食品，其特征是，所述食品为饮料、酸奶、果冻。
4.根据权利要求2所述的治疗溃疡性结肠炎的药物或保健品或食品，其特征是，所述植物乳杆菌菌剂剂量为1×1010cfu/kg。
5.一种治疗结肠炎的植物乳杆菌菌剂的制备方法，其特征是，包括如下步骤：
1)植物乳杆菌ZDY2013MRS液体培养基37±1℃厌氧培养24±2h，得到达到稳定期的菌体，所述植物乳杆菌ZDY2013的保藏号为CCTCC M2014170；
2)离心收集步骤1)中菌体，用无菌1×PBS洗涤2-4次；
3)用无菌1×PBS调整步骤2)所得菌体浓度到1-2×109cfu/mL；
4)向上述所得菌体中加入适宜辅料制成的药物或食物或保健品。
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