CN107354114A - 一株副鸡嗜血杆菌及其应用 - Google Patents

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朱文豪
焦文强
王克领
游
游一
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Abstract

本发明公开了一株副鸡嗜血杆菌及其应用，所述的副鸡嗜血杆菌为副鸡嗜血杆菌(Haemophilus paragallinarum)HNHpg1，保藏编号：CGMCC NO：13859，保藏日期：2017年5月26日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国北京。本发明中的副鸡嗜血杆菌菌株HNHpg1分离自发生典型呼吸道症状、头面部肿胀的蛋鸡的眶下窦分泌物，具有稳定的生物学特性，对雏鸡具有较强的致病力，能够引起雏鸡发病死亡，且具有良好的免疫原性。利用本发明中的副鸡嗜血杆菌菌株HNHpg1制备的疫苗安全可靠，对鸡的传染性鼻炎具有较好的保护效果。

Description

一株副鸡嗜血杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域，特别涉及一株副鸡嗜血杆菌及其应用。
背景技术
副鸡嗜血杆菌(Haemophilus paragallinarum,HPg)是巴氏杆菌科禽杆菌属(Avibacterium)的一种短小革兰氏阴性杆菌，为鸡传染性鼻炎(Infectious coryza，Ic)的病原菌，引起鸡的急性或亚急性呼吸道感染，临床表现为鼻腔、眶下窦和气管上部发炎，流泪，流鼻液，呼吸困难。病鸡打喷嚏、摇头，颜面部单侧或双侧水肿。本病广泛分布于世界各地，Beach于1920年首先报道了该病，随后De Bliekc首次分离到Hpg。我国1987年在北京首次分离到本病原，相继在河北、辽宁、山东等地分离到本菌的报道。
副鸡嗜血杆菌可造成蛋鸡产蛋量下降，肉鸡肉质下降，生长鸡群发育迟缓受阻和淘汰率增加，对养鸡业造成较大的经济损失，严重影响养鸡业的发展。副鸡嗜血杆菌具有多种血清型，按照玻片凝集试验可将该菌分为A、B、C 3个血清型。按照间接血凝抑制试验可以分为A、B、C 3个血清群9个血清型。不同血清群的疫苗之间无交叉保护作用，而同一血清群中不同血清型之间有明显的交叉保护力。本病发病率高，大鸡比小鸡易感，死亡率一般不超过20％。经济损失主要是由于淘汰率增加和产蛋量减少。在我国Ic发病率为20％～50％，死亡率5％～20％。在并发鸡毒支原体病或其他传染病时会表现出病程延长和死淘率升高。疫苗免疫是该病的重要防控措施，应根据流行的血清型选择对应的单价或多价疫苗。目前，亟需一种新的具有安全、免疫原性好的菌株制备的疫苗对该病进行防治。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的是提供一株副鸡嗜血杆菌及其应用，该菌株毒力强，制备的疫苗免疫性好。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一株副鸡嗜血杆菌，所述的副鸡嗜血杆菌为副鸡嗜血杆菌(Haemophilusparagallinarum)HNHpg1，保藏编号：CGMCC NO：13859，保藏日期：2017年5月26日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国北京。
所述的副鸡嗜血杆菌为副鸡嗜血杆菌A型。
一种副鸡嗜血杆菌在制备副鸡嗜血杆菌灭活疫苗方面的应用。
所述的副鸡嗜血杆菌灭活疫苗的制备方法为：将所述的副鸡嗜血杆菌依次经过培养、收获和灭活得到疫苗原液后，加入佐剂即得疫苗。
所述的佐剂为氢氧化铝佐剂。
所述的副鸡嗜血杆菌灭活疫苗的制备方法为：将副鸡嗜血杆菌接种到TSB液体培养基，置于37℃摇床中培养，24h后收取培养物，测定浓度，调整培养物中副鸡嗜血杆菌的菌数为2×109CFU/mL，加入培养物体积分数0.2％的甲醛，于37℃灭活12h，制得疫苗原液；再加入和疫苗原液等体积的氢氧化铝佐剂，混合制得副鸡嗜血杆菌灭活疫苗。
本发明的有益效果：
1、本发明中的副鸡嗜血杆菌菌株HNHpg1分离自发生典型呼吸道症状、头面部肿胀的蛋鸡的眶下窦分泌物，在TSA固体培养基上分离时无其它细菌生长，只有副鸡嗜血杆菌生长，在TSB液体培养基中增殖滴度高，达109CFU/mL以上。
2、本发明中的副鸡嗜血杆菌菌株HNHpg1具有稳定的生物学特性，对雏鸡具有较强的致病力，能够引起雏鸡发病死亡，且具有良好的免疫原性。
3、利用本发明中的副鸡嗜血杆菌菌株HNHpg1制备的疫苗安全可靠，对鸡的传染性鼻炎具有较好的保护效果。
附图说明
图1为菌株HNHpg1菌落形态。
图2为菌株HNHpg1菌体革兰氏染色100×显微镜下形态。
图3为菌株HNHpg1的PCR鉴定结果，图中的Marker为DL 2000bp，从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp，100bp；1为阴性对照，2为引物P1，P2对副鸡嗜血杆菌A型疫苗株C-Hpg-8株(CVCC254)的扩增结果；3为引物P1，P2对菌株HNHpg1的扩增结果。从图中可以看出，证明扩增片段为目的片段，符合预期设计大小860bp。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1、副鸡嗜血杆菌的分离和鉴定
1.1病料采集
病料来自于2017年4月在河南省卫辉市某大型蛋鸡场发生呼吸困难、头面肿胀的蛋鸡。
1.2培养基的制备
TSB液体培养基：将TSB肉汤粉(Tryptic Soy broth，胰蛋白胨大豆肉汤)30g，溶于1000mL超纯水中，115℃灭菌15min，加胎牛血清50mL、无菌质量分数1％NAD(Nicotinamideadenine dinucleotide，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，辅酶Ⅰ)1mL；
TSA固体培养基：将TSA琼脂粉(Tryptic Soy Agar，胰蛋白胨大豆琼脂)40g，溶于1000mL超纯水中，115℃灭菌15min，加胎牛血清50mL、无菌质量分数1％NAD 1mL(根据需要进行添加)，于4℃保存备用。
1.3细菌的分离培养
无菌采集病鸡的眶下窦分泌物，接种于含有TSA固体培养基上，37℃恒温培养箱中培养36h，长出一致的针尖状大小、无色透明、光滑、湿润的，直径大小为1～2mm的菌落(见图1)。纯化并接种于不含NAD的TSA固体培养基上，在不含NAD的TSA培养基上不能生长。革兰氏染色，该菌为革兰氏阴性短小杆菌，具有多种不同的形态，从球状、杆状或长丝状的菌体(见图2)，命名为菌株HNHpg1。
1.4菌株的鉴定
1.4.1设计引物
根据副鸡嗜血杆菌23S rRNA基因的序列设计一对通用引物，用于副鸡嗜血杆菌的扩增，引物序列如下：
P1：5’-GTAACTATAACGGTCCTAAG-3’(SEQ ID NO.1)
P2：5’-CCCGCTTAGATGCTTTCAGC-3’(SEQ ID NO.2)
预期扩增片段大小为860bp。
1.4.2PCR鉴定
按照DNA提取试剂盒的操作步骤提取出菌株HNHpg1的DNA，分光光度计测定浓度为100μg/mL，进行PCR鉴定。同时，设置副鸡嗜血杆菌A型疫苗株C-Hpg-8株(CVCC254)为阳性对照。
PCR扩增反应体系为25μL：10×缓冲液2.5μL，2.5mM dNTPs 0.5μL，10μM/L通用引物P1，P2各1μL，5U/μL rTaq 1μL，100μg/mL DNA模板1μL，加入ddH2O至25μL。
反应条件：95℃预变性5min，进入循环：95℃1min，57℃1min，72℃30s，共35个循环，最后72℃延伸10min，PCR产物4℃保存。
扩增产物分别进行电泳，每孔加样10μL，1％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下观察结果(见图3)。结果扩增出860bp片段，测序与副鸡嗜血杆菌A型疫苗株C-Hpg-8株(CVCC254)99.6％同源，测序结果如下，证明菌株HNHpg1为副鸡嗜血杆菌(Haemophilusparagallinarum)。
GTAACTAATAACGGTCCTAAGGTAGCGAAATTCCTTGTCGGGTAAGTTCCGACCTGCACGAATGGCATAATGATGGCCAGGCTGTCTCCACCCGAGACTCAGTGAAATTGAAATCGCCGTGAAGATGCGGTGTACCCGCGGCTAGACGGAAAGACCCCGTGAACCTTTACTATAGCTTGACACTGAACCTTGAATTTTGATGTGTAGGATAGGTGGGAGACTATGAAGCGGTAACGCCAGTTATCGTGGAGTCGTTGTTGAAATACCACCCTTTAACGTTTGATGTTCTAACGAAGCGCCTGAAACGGGTGTTCGGACAGTGTCTGGTGGGTAGTTTGACTGGGGCGGTCTCCTCCCAAAGTGTAACGGAGGAGCACGAAGGTTTGCTAATGACGGTCGGACATCGTCAGGTTAGTGCAATGGTATAAGCAAGCTTAACTGCGAGACAGACAAGTCGAGCAGGTGCGAAAGCAGGTCATAGTGATCCGGTGGTTCTGAATGGAAGGGCCATCGCTCAACGGATAAAAGGTACTCCGGGGATAACAGGCTGATACCGCCCAAGAGTTCATATCGACGGCGGTGTTTGGCACCTCGATGTCGGCTCATCACATCCTGGGGCTGAAGTAGGTCCCAAGGGTTATGGCTGTTTCGCCATTTAAAGTGGTACGCGAGCTGGGTTTAGAACGTCGTTGAGACAGTTCGGTCCCTATCTGCCGTGGGCGTTGGAGAATTGAGAGGGGGCTGCTCCTAGTACGAGAGGACCGGAGTGGACGCATCACTGGTGTACCAGTTGTCTCGCCAGAGGCACTGCTGGGGTAGCTAATTGCGGATGAGATAAGTGCTGAAAGCATCTAAGCGGG(SEQ ID NO.3)
1.4.3血清型鉴定
用玻片凝集试验方法，取纯化的HNHpg1分离株与A、B、C型副鸡嗜血杆菌的标准阳性血清进行凝集试验，分离株与A型副鸡嗜血杆菌的标准阳性血清在3～5min内出现凝集现象，与B、C型鸡副嗜血杆菌的标准阳性血清无凝集反应。证明HNHpg1为副鸡嗜血杆菌A型。
1.5毒力试验
试验动物为42日龄鸡20只。试验动物分为两组，对照组10只，试验组10头。将HNHpg1接种于TSB液体培养基，37℃摇床培养24h后，测定菌体浓度，连续10倍稀释涂布固体平板，低倍镜下活菌计数，计算培养物原液菌体浓度，调整至108CFU/mL，试验组动物通过鼻内接种0.1mL副鸡嗜血杆菌HNHpg1液体培养物，对照组动物通过鼻内接种0.1mL灭菌的TSB液体培养基。注射后连续观察2周，观察并记录其发病数和死亡数等情况。
试验组动物在接种副鸡嗜血杆菌HNHpg1 24h后表现出张口呼吸，流清鼻液，逐渐单侧或两侧面部、眼睑、眶下窦肿胀，结膜发炎，鼻部有黏脓性干酪样分泌物堆积，有恶臭味。病程长的出现角膜混浊失明，冠色苍白，精神沉郁，羽毛蓬松，缩颈垂翅。有的将头***翅下，蹲伏于一隅，食欲废绝，偶尔饮水。肉髯明显水肿，上呼吸道炎症蔓延到气管和肺脏时，呈现呼吸困难和杂音。3～5d内死亡，少数病程拖到l～2周，最后失明废食衰竭而死。3d后死亡3只，7d后死亡5只。存活2只生长发育受阻。对照组动物在试验期间体温正常且无明显的呼吸道症状。试验结束后剖杀试验组动物，同时剖杀10只对照组动物。采集病料，进行副鸡嗜血杆菌分离。试验组剖检鼻腔和鼻窦粘膜呈急性卡他性炎症，充血肿胀，表面覆有大量粘液，鼻窦内有渗出液或干酪样坏死物。卡他性结膜炎，结膜充血、肿胀，脸部皮下水肿。对照组剖检均未发生明显的病理变化，对照组的10份病料均未分离到副鸡嗜血杆菌，试验组的10份病料中均分离到副鸡嗜血杆菌，PCR鉴定结果与HNHpg1一致。
实施例2、疫苗的制备、安全性和效力试验
2.1疫苗的制备
将副鸡嗜血杆菌菌株HNHpg1接种到TSB液体培养基，置于37℃摇床中培养，24h后收取培养物，测定菌体浓度，调整培养物中副鸡嗜血杆菌的菌数为2×109CFU/mL，每1000mL培养物加2mL甲醛溶液(质量分数37％)，于37℃灭活12h，制得疫苗原液；再加入和疫苗原液等体积的氢氧化铝佐剂(Sigma公司，F5881)，混合制得副鸡嗜血杆菌灭活疫苗，疫苗中的副鸡嗜血杆菌的菌数约为1×109CFU/mL。
2.2疫苗的安全性试验：
选取42日龄健康鸡20只，分为4组，每组5只。疫苗组3组，每组分别颈部皮下注射0.5mL、1mL、2mL本疫苗；对照组1组，颈部皮下注射2mL灭菌生理盐水。观察临床表现，共观察2周。观察期间，疫苗组和对照组的鸡在整个观察期间呼吸、食欲、精神状态都正常，平均体温升高不超过1℃，未见精神不振、采食减少、流涕、呼吸困难、眼脸肿胀等不良反应。说明本发明的灭活疫苗安全。
2.3疫苗的效力试验
选取45日龄健康鸡100只，分为5组，每组20只。具体为：疫苗1-4组：每组分别注射本疫苗0.1mL、0.2mL、0.3mL和0.5mL，第5组为未免疫组，注射0.5mL灭菌生理盐水。疫苗组和未免疫组鸡120日龄二免注射同等剂量的疫苗和灭菌生理盐水。二免后30d用107CFU的HNHpg1采取鼻内注射的攻毒方式进行攻毒。攻毒后14d内，观察所有鸡的临床症状。在攻毒后14d后，对所有鸡进行剖检，确定攻毒保护率，采集眶下窦分泌物、肺脏等器官进行副鸡嗜血杆菌分离培养。
疫苗组与未免疫组鸡攻毒后有明显的差异，攻毒后，未免疫组第二天开始出现临床症状，流涕，咳嗽、喘气、张口呼吸，减食甚至绝食，攻毒2d后开始出现死亡，2周后共死亡16只，全部发病。剖检结果：鼻腔和鼻窦粘膜呈急性卡他性炎症，鼻窦内有渗出液或干酪样坏死物。而疫苗组中，0.1mL疫苗组的20只鸡中有4只出现临床症状和病例变化；0.2mL疫苗组的20只鸡中有2只出现临床症状和病例变化；0.3mL和0.5mL疫苗组的20只鸡没有发病。免疫攻毒保护情况见下表。
注：“—”表示不适用。
由上表可以看出，本疫苗的最小免疫保护剂量为0.1mL，含菌量为1×109CFU/mL。说明本发明的灭活苗具有良好的保护效果。
以上所述仅为本发明最佳的实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 一株副鸡嗜血杆菌及其应用
<160> 3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtaactataa cggtcctaag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cccgcttaga tgctttcagc 20
<210> 3
<211> 860
<212> DNA
<213> 副鸡嗜血杆菌（Haemophilus paragallinarum）
<400> 3
gtaactaata acggtcctaa ggtagcgaaa ttccttgtcg ggtaagttcc gacctgcacg 60
aatggcataa tgatggccag gctgtctcca cccgagactc agtgaaattg aaatcgccgt 120
gaagatgcgg tgtacccgcg gctagacgga aagaccccgt gaacctttac tatagcttga 180
cactgaacct tgaattttga tgtgtaggat aggtgggaga ctatgaagcg gtaacgccag 240
ttatcgtgga gtcgttgttg aaataccacc ctttaacgtt tgatgttcta acgaagcgcc 300
tgaaacgggt gttcggacag tgtctggtgg gtagtttgac tggggcggtc tcctcccaaa 360
gtgtaacgga ggagcacgaa ggtttgctaa tgacggtcgg acatcgtcag gttagtgcaa 420
tggtataagc aagcttaact gcgagacaga caagtcgagc aggtgcgaaa gcaggtcata 480
gtgatccggt ggttctgaat ggaagggcca tcgctcaacg gataaaaggt actccgggga 540
taacaggctg ataccgccca agagttcata tcgacggcgg tgtttggcac ctcgatgtcg 600
gctcatcaca tcctggggct gaagtaggtc ccaagggtta tggctgtttc gccatttaaa 660
gtggtacgcg agctgggttt agaacgtcgt tgagacagtt cggtccctat ctgccgtggg 720
cgttggagaa ttgagagggg gctgctccta gtacgagagg accggagtgg acgcatcact 780
ggtgtaccag ttgtctcgcc agaggcactg ctggggtagc taattgcgga tgagataagt 840
gctgaaagca tctaagcggg 860

Claims (6)

1.一株副鸡嗜血杆菌，其特征在于：所述的副鸡嗜血杆菌为副鸡嗜血杆菌(Haemophilus paragallinarum)HNHpg1，保藏编号：CGMCC NO：13859，保藏日期：2017年5月26日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国北京。
2.根据权利要求1所述的副鸡嗜血杆菌，其特征在于：所述的副鸡嗜血杆菌为副鸡嗜血杆菌A型。
3.一种如权利要求1或2所述的副鸡嗜血杆菌在制备副鸡嗜血杆菌灭活疫苗方面的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的副鸡嗜血杆菌灭活疫苗的制备方法为：将所述的副鸡嗜血杆菌依次经过培养、收获和灭活得到疫苗原液后，加入佐剂即得疫苗。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的佐剂为氢氧化铝佐剂。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的副鸡嗜血杆菌灭活疫苗的制备方法为：将副鸡嗜血杆菌接种到TSB液体培养基，置于37℃摇床中培养，24h后收取培养物，测定浓度，调整培养物中副鸡嗜血杆菌的菌数为2×109CFU/mL，加入培养物体积分数0.2％的甲醛溶液，于37℃灭活12h，制得疫苗原液；再加入和疫苗原液等体积的氢氧化铝佐剂，混合制得副鸡嗜血杆菌灭活疫苗。
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