CN113046271B

CN113046271B - 一株兔f型多杀性巴氏杆菌及其在制备灭活疫苗中的应用

Info

Publication number: CN113046271B
Application number: CN202110385646.6A
Authority: CN
Inventors: 王锦祥; 谢喜平; 孙世坤; 陈岩锋; 陈冬金; 桑雷
Original assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-04-10
Filing date: 2021-04-10
Publication date: 2022-10-14
Anticipated expiration: 2041-04-10
Also published as: CN113046271A

Abstract

本发明涉及一株兔F型多杀性巴氏杆菌及其在制备灭活疫苗中的应用。其步骤为通过病原分离培养、动物回归试验、kmt1基因序列测定和F型多杀性巴氏杆菌荚膜抗原fcbD基因序列测定，确定病原为F型多杀性巴氏杆菌，命名为F型多杀性巴氏杆菌PmF07，保藏编号为CCTCC NO：M 2021203。将该菌接种到培养基扩大培养，收获培养物，将培养物灭活，加入体积终浓度为10%的法国赛比克公司的商品化MONTANIDE^TM GEL 02 PR佐剂并混合均匀得到灭活疫苗。本发明的灭活疫苗安全，无毒副作用，免疫效果好，免疫兔能获得至少6个月的保护期，能达到预防和控制F型多杀性巴氏杆菌感染兔的良好效果。

Description

一株兔F型多杀性巴氏杆菌及其在制备灭活疫苗中的应用

技术领域

本发明涉及兔用疫苗领域，具体说是一株兔F型多杀性巴氏杆菌及其在制备灭活疫苗中的应用。

背景技术

兔巴氏杆菌病是由多杀性巴氏杆菌感染兔引起的一种传染性疾病。该病常年发生，且所有日龄的兔均可发病。临床上，兔巴氏杆菌病以呼吸道症状多见，也可见中耳炎、结膜炎和皮下脓肿。兔巴氏杆菌病是兔的常发病和多发病，在世界重要的兔养殖区如中国、西班牙、葡萄牙和意大利等国家的兔群中广泛流行。F型多杀性巴氏杆菌首次分离自火鸡，主要感染禽并能引起禽霍乱，原先认为该菌一般不感染哺乳动物。然而，Jaglic等于2004年首次报道F型多杀性巴氏杆菌也能感染兔，且对兔具有强致病性。随后，张娜等于2012年在我国山东的兔群中也分离到F型多杀性巴氏杆菌且该菌对兔同样具有很强的致病性。此后的研究调查表明F型多杀性巴氏杆菌在我国多个省份的兔群中均有流行。多杀性巴氏杆菌感染兔后能通过飞沫、污染的饲料和饮水等在兔群中迅速传播，能引起所有日龄兔的感染和死亡，造成严重的经济损失。目前，我国尚无针对兔F型多杀性巴氏杆菌的疫苗。因此，研制一种安全有效的用于预防和控制F型多杀性巴氏杆菌在我国兔群中流行的疫苗对我国兔产业的发展具有重要意义。

发明内容

本发明的目的之一是提供一株兔F型多杀性巴氏杆菌，该菌对兔具有很强的致病性，利用该菌制备的灭活疫苗安全可靠，不引起免疫兔任何的局部和全身的不良反应，且具有良好的免疫保护性。

所述的兔F型多杀性巴氏杆菌是从多例呼吸道病死兔的肺脏样品中，通过细菌分离鉴定和动物回归试验，筛选出的对兔具有强致病性的F型多杀性巴氏杆菌，命名为多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida ）PmF07，该菌于2021年3月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2021203。地址为武汉大学。

本发明的目的之二在于提供一种兔F型多杀性巴氏杆菌灭活疫苗，所述兔F型多杀性巴氏杆菌灭活疫苗，由以下步骤制备得到：

1.灭活抗原液的制备；

2.灭活疫苗的配制。

灭活抗原液的制备主要由以下步骤完成：将多杀性巴氏杆菌PmF07以0.1%（V/V）接种到脑心浸液培养基中，37℃ 180rpm培养24小时，调整菌液浓度为4.0×10¹⁰-2.0×10¹¹CFU/mL，加入体积终浓度为0.2%的甲醛，37℃ 100rpm灭活24小时，制成灭活抗原液。

灭活疫苗的配制主要由以下步骤完成：将灭活抗原液和法国赛比克公司的商品化MONTANIDE^TM GEL 02 PR佐剂按体积比为9:1混合，灭活疫苗为黄色混悬液，密封保存于4-8℃，有效期6个月。

本发明的优点在在于：

本发明制备的兔F型多杀性巴氏杆菌灭活疫苗制备方法简单、疫苗保藏和运输条件要求低且疫苗无毒力返强的风险。试验兔免疫该疫苗后免疫保护效果好，免疫保护期至少可持续6个月，具有良好的应用前景。

附图说明

图1兔F型多杀性巴氏杆菌kmt1基因和fcbD基因的PCR扩增结果，其中M：DL2000DNA Marker；1:kmt1基因（260bp）; 2:fcbD基因（490bp）; 3:kmt1基因阴性对照; 4:fcbD基因阴性对照。

图2 F型多杀性巴氏杆菌PmF07以1.0×10⁶ CFU活菌数经鼻腔攻毒引起试验兔的纤维素性肺炎。

具体实施方式

实施例1

兔F型巴氏杆菌的分离、鉴定和筛选

1）无菌采集呼吸道病死兔肺脏样品，划线接种于含5%（V/V）脱纤维绵羊血的脑心浸液琼脂平板，37℃培养24小时，挑取圆形，光滑，半透明，不溶血，直径小于1.0毫米，边缘整齐的小菌落，在5%（V/V）脱纤维绵羊血的脑心浸液琼脂平板上连续纯化3次，获得纯培养物，用于细菌鉴定。

2）用接种环取上述纯培养物，均匀地涂布在载玻片上制成涂片标本，用革兰氏染色液进行染色，显微镜观察细菌形态。选取革兰氏染色为阴性的小杆菌，用于细菌的进一步鉴定。

3）取步骤1）和步骤2）鉴定的纯培养物，提取分离菌的基因组DNA，利用kmt1基因和fcbD基因引物分别扩增分离菌的kmt1基因和fcbD基因。kmt1基因上游引物为kmt1-F，引物序列为：5’-GTTTTATGCCACTTGAAATGGGAA-3’；kmt1基因下游引物为kmt1-R，引物序列为5’-TAAGAAACGTAACTCAACATGGAAATATT-3’。fcbD基因上游引物为fcbD-F，引物序列为：5’-CTAAAGATCTTGTTCTTGCTCCATTG-3’；fcbD基因下游引物为fcbD-R，引物序列为5’-TCTGCGGTAATATTATGAGTATCCAC-3’。

PCR反应体系为50 μL：包含25 μL 2×PCR Mix，基因组DNA 1 μL，上下游引物（10μM）各2 μL，灭菌双蒸水补齐至50 μL。PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃ 30秒、59℃30秒、72℃ 45秒，35个循环；72℃延伸10分钟。F型多杀性巴氏杆菌为kmt1基因和fcbD基因阳性，kmt1基因和fcbD基因PCR扩增的目的片段分别为260bp和490bp（图1）。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后切胶回收，送铂尚生物技术（上海）有限公司测序。选取kmt1基因和fcbD基因序列分别与GenBank中多杀性巴氏杆菌的相应序列同源性高于99%以上的菌株，用于进一步的动物回归试验。

4）取步骤3）鉴定的F型多杀性巴氏杆菌，以0.1%（V/V）分别接种到10 mL脑心浸液培养基，37℃ 180rpm培养24小时，10000rpm 4℃离心10分钟，弃上清，菌体沉淀用5 mL灭菌生理盐水重悬。取1 mL菌悬液，用灭菌生理盐水稀释至活菌数为1.0×10⁷ CFU/mL。取12只35日龄多杀性巴氏杆菌阴性和抗多杀性巴氏杆菌抗体阴性的试验兔，滴鼻接种100 μL菌悬液（活菌数为1.0×10⁶ CFU），左右鼻孔各50 μL，试验期30天，每天观察试验兔的临床症状，包括试验兔的精神状态，采食量是否减少，是否出现咳嗽，是否出现鼻腔分泌物等。剖检试验期内死亡的试验兔和试验结束时存活的试验兔，观察试验兔肺脏的病变，采集肺脏样品进行细菌的分离鉴定。结果显示，F型多杀性巴氏杆菌PmF07攻毒后引起的试验兔发病率和死亡率最高，分别为100%（12/12）和41.67%（5/12）。试验兔攻毒后较不活泼，采食量下降，咳嗽，鼻腔有浆液性或脓性分泌物，剖检还可见纤维素性肺炎（图2），且能从试验兔的肺脏样品中回收到该菌株。因此，本发明选取该菌制备灭活疫苗。

实施例2

1.灭活疫苗的制备

将F型多杀性巴氏杆菌PmF07划线接种于含5%（V/V）脱纤维绵羊血的脑心浸液琼脂平板上，挑取单个菌落接种于脑心浸液培养基进行扩大培养，作为种子液。将种子液按0.1%（V/V）接种到脑心浸液培养基，37℃ 180rpm培养24小时，获得抗源液；调整抗原液中活菌数为4×10¹⁰-2×10¹¹ CFU/mL，加入体积终浓度为0.2%的甲醛，37℃ 100rpm灭活24小时，获得灭活抗原液。向灭活抗原液中加入体积终浓度为10%的法国赛比克公司的商品化MONTANIDE^TM GEL 02 PR佐剂，充分混匀，获得兔F型多杀性巴氏杆菌灭活疫苗。

2. 灭活疫苗的安全性检测

1）无菌检测：取0.2 mL步骤1制备的灭活疫苗，均匀地涂布于含5%（V/V）脱纤维绵羊血的脑心浸液琼脂平板上，共涂布3块琼脂平板，37℃倒置培养48-72小时，观察有无细菌生长。结果显示为阴性，说明兔F型多杀性巴氏杆菌灭活疫苗无细菌污染。

2）动物安全性试验：

a.取5周龄健康的BALB/c小鼠24只，平均分为2组，每组12只，公母各6只。试验组：腹腔注射0.5 mL步骤1制备的灭活疫苗；对照组：腹腔注射0.5 mL灭菌脑心浸液培养基。试验期14天。试验期间，试验组和对照组小鼠均健康活泼，无死亡，采食和饮水正常。结果表明，本发明的灭活疫苗安全。

b.取35日龄健康兔36只，平均分为3组，每组12只，公母各6只。试验一组：颈背部皮下注射1 mL步骤1制备的灭活疫苗；试验二组：颈背部皮下分2点各注射1.5 mL（共3 mL）步骤1制备的灭活疫苗；对照组：颈背部皮下注射1 mL灭菌脑心浸液培养基。试验期30天。试验期间，试验一组、试验二组和对照组的试验兔均健康活泼，注射部位和全身均无不良反应，采食和饮水正常。结果表明，本发明的灭活疫苗安全。

实施例3

灭活疫苗的免疫效果评价

1.灭活疫苗免疫后的抗体消长规律

a）F型多杀性巴氏杆菌荚膜抗原的制备：将F型多杀性巴氏杆菌PmF07（CCTCC NO：M2021203）以0.1%（V/V）接种至20 mL脑心浸液培养基，37℃ 180rpm培养24小时；10000rpm 4℃离心 5min，弃上清，沉淀用5 mL 2.5%（W/V）氯化钠溶液重悬；重悬液置56℃水浴中孵育2小时，水浴时每20min摇匀一次，12000rpm 4℃离心 30min，取上清；上清转移至分子截留量为3.5 KD的透析袋中，用500 mL灭菌生理盐水于4℃透析12小时，重复3次，最后用0.45 μm无菌滤器过滤，得到12 mL兔F型多杀性巴氏杆菌的荚膜抗原。

b）动物试验：取多杀性巴氏杆菌阴性和抗多杀性巴氏杆菌抗体阴性的健康兔40只，平均分为2组，每组20只，公母各半。免疫组：35日龄时颈背部皮下注射实施例2制备的灭活疫苗1 mL（抗原含量为1.8×10¹¹ CFU/mL），50日龄再次注射实施例2制备的灭活疫苗1 mL（抗原含量为1.8×10¹¹ CFU/mL）；对照组：35日龄时颈背部皮下注射灭菌脑心浸液培养基1mL，50日龄再次注射灭菌脑心浸液培养基1 mL。于免疫后7天、14天、21天、2个月、3个月、4个月、5个月和6个月经耳缘静脉采集试验兔全血，分离血清，以F型多杀性巴氏杆菌PmF07荚膜抗原为检测抗原通过琼脂糖扩散试验测定试验兔血清中的抗体效价。

c）琼脂扩散试验：将50μL步骤a）所得的F型多杀性巴氏杆菌荚膜抗原加入梅花型孔的中间孔，将步骤b）所得的血清用灭菌生理盐水进行连续的2倍倍比稀释至1:1024，取50μL各个稀释度的血清加入梅花型孔的周边孔，同时取50μL灭菌生理盐水加入梅花型孔的周边孔作为阴性对照，37℃湿盒中反应12小时，测定试验兔血清中抗F型多杀性巴氏杆菌的抗体效价。结果显示，灭活疫苗免疫后试验兔血清中抗兔F型多杀性巴氏杆菌的抗体效价快速升高，第2次免疫后第28天至第6个月的抗体效价能维持在7.0 log₂以上的较高水平。详细结果见表1。

表1 兔F型多杀性巴氏杆菌灭活疫苗免疫后的抗体消长规律

注：“－”为阴性。

3. 灭活疫苗的免疫保护效力

取多杀性巴氏杆菌阴性和抗多杀性巴氏杆菌抗体阴性的健康兔90只，平均分为3组，每组30只，公母各15只。免疫攻毒组：35日龄时颈背部皮下注射实施例2制备的灭活疫苗1 mL（抗原含量为1.8×10¹¹ CFU/mL），50日龄再次注射实施例2制备的灭活疫苗1 mL（抗原含量为1.8×10¹¹ CFU/mL），第二次免疫后14天经鼻腔接种100 μL（每个鼻孔50 μL）多杀性巴氏杆菌PmF07菌悬液，活菌数为1.0×10⁶ CFU；攻毒对照组：35日时龄颈背部皮下注射灭菌脑心浸液培养基1 mL，50日龄再次注射灭菌脑心浸液培养基1 mL，第二次注射后14天经鼻腔接种100 μL（每个鼻孔50 μL）多杀性巴氏杆菌PmF07菌悬液，活菌数为1.0×10⁶ CFU；对照组：35日龄时颈背部皮下注射灭菌脑心浸液培养基1 mL，50日龄再次注射灭菌脑心浸液培养基1 mL，不攻毒。从攻毒开始，观察30天，观察期间同一组的每2只试验兔（1公1母）饲养在同一铁丝笼中，自由采食和饮水。计算整个观察期间试验兔由F型多杀性巴氏杆菌PmF07攻毒引起的发病率和死亡率。

结果显示，免疫攻毒组试验兔的发病率为3.33%（1/30），死亡率为0（0/30）；攻毒对照组试验兔的发病率为100%（30/30），死亡率为40%（12/30）；对照组实验兔的发病率和死亡率均为0（0/30）。详细结果见表2。根据实施例3步骤1灭活疫苗免疫后抗体消长规律的结果，试验兔两次免疫本发明的灭活疫苗后，以1.0×10⁶ CFU F型巴氏杆菌PmF07攻毒，6个月内仍能够达到理想的保护效果。

表2 兔F型多杀性巴氏杆菌灭活疫苗免疫后兔F型多杀性巴氏杆菌PmF07攻毒引起的发病率及死亡率

注：试验兔发病的判定依据为：试验兔呼吸道有病变（如气管出血、出血性肺炎、胸腔和肺脏纤维素性渗出、肺脏化脓性纤维素性病变等）且病变组织中F型多杀性巴氏杆菌PmF07阳性，同时无引起试验兔呼吸道感染的其他病原（如兔瘟、A型和D型多杀性巴氏杆菌、波氏杆菌和金黄色葡萄球菌等）；

试验兔死亡的判定依据为：试验兔呼吸道有病变（如气管出血、出血性肺炎、胸腔和肺脏纤维素性渗出、肺脏化脓性纤维素性病变等）且病变组织中F型多杀性巴氏杆菌PmF07阳性，同时无引起试验兔呼吸道疾病的其他病原（如兔瘟、A型和D型多杀性巴氏杆菌、波氏杆菌和金黄色葡萄球菌等）。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一株兔F型多杀性巴氏杆菌及其在制备灭活疫苗中的应用

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gttttatgcc acttgaaatg ggaa 24

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

taagaaacgt aactcaacat ggaaatatt 29

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctaaagatct tgttcttgct ccattg 26

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tctgcggtaa tattatgagt atccac 26

Claims

1.一株兔F型多杀性巴氏杆菌，其特征在于：所述兔F型多杀性巴氏杆菌为多杀性巴氏杆菌Pasteurella multocida PmF07，已于2021年3月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021203。

2.一株利用权利要求1所述的兔F型多杀性巴氏杆菌制备的兔F型多杀性巴氏杆菌灭活疫苗，其特征在于：灭活疫苗中含F型多杀性巴氏杆菌PmF07抗原量为3.6×10¹⁰-1.8×10¹¹CFU/mL，佐剂体积分数为10%；

所述的兔F型多杀性巴氏杆菌灭活疫苗由以下步骤制备而成：

1）灭活菌液的制备；

2）灭活疫苗的配制；

所述灭活菌液的制备具体步骤为：将所述多杀性巴氏杆菌PmF07以0.1%V/V接种到培养基，37℃180rpm培养24小时，调整菌液浓度为4.0×10¹⁰-2.0×10¹¹CFU/mL；加入体积终浓度为0.2%的甲醛，37℃100rpm灭活24小时，获得灭活菌液；

灭活疫苗的配制是将灭活菌液和佐剂按体积比为9:1混合制备而成。