CN107353372A - 一种基于磁性介孔分子筛的nNOS‑PSD‑95解偶联剂表面印记聚合物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种基于磁性介孔分子筛的nNOS‑PSD‑95解偶联剂表面印记聚合物的制备方法，属于分子印记聚合物技术领域，具体步骤分为：制备核壳结构的磁性介孔分子筛；对制得的磁性介孔二氧化硅微球进行表面接枝改性；制备基于磁性介孔分子筛的nNOS‑PSD‑95解偶联剂表面印记聚合物。本发明制备的基于磁性介孔分子筛的nNOS‑PSD‑95解偶联剂表面印记聚合物单分散性好，比表面积大，介孔规则有序，具有优良的吸附和解吸附动力学特性，且聚合物稳定性、重现性好，为实现中药中nNOS‑PSD‑95解偶联剂的选择性捕获和高效筛选提供可能。

Description

一种基于磁性介孔分子筛的nNOS-PSD-95解偶联剂表面印记 聚合物的制备方法
技术领域
本发明属于分子印记聚合物技术领域，尤其涉及对ZL006具有特异性识别的磁性介孔分子筛表面印记聚合物的制备方法。
背景技术
脑梗塞(缺血性脑卒中)具有高死亡率、高致残率、高复发率等特点，严重危害人类健康。脑缺血条件下，兴奋性氨基酸(如谷氨酸)过度释放，引起N-甲基-D-天门冬氨酸受体(NMDAR)过度激活，通过NMDAR-PSD-95-nNOS的途径病理性释放一氧化氮(NO)，从而对细胞造成严重损伤。研究发现，nNOS-PSD-95解偶联剂4-(2-羟基-3,5-二氯苄胺基)-2-羟基苯甲酸(ZL006)具有明确的脑缺血保护作用(Nature Medicine 2010，16，12：1439-U123)，靶点明确，副作用小，但因其亲水性较大，脑组织分布不理想，要开发成临床治疗脑梗塞药物，还需要进一步的研究和改善。中药是人民几千年临床用药经验的结晶，从中药中筛选nNOS-PSD-95解偶联剂，具有疗效确切，毒副作用小，成药性强等优点。且以阻断nNOS与PSD-95的偶联为靶点，从中药中开发nNOS-PSD-95解偶联剂的研究，尚未见报道。由于中药成分复杂、结构多样、干扰组分多，所以其活性成分的高效筛选迫切需要一种高选择性，特异性的专一的现代分离检测方法。
近来，分子印记聚合物(molecular imprinted polymers，MIPs)的发展将最有可能为我们活性筛选工作提供功能强大的最优先和高效率的选择，MIPs为目标分子“度身制作”，对模板分子具有特异识别性，用具有目标药效的活性分子作模板合成相应的分子印记聚合物，将其用于中药提取物的研究，可以直接从构型多样的组分库中筛选到与模板分子具有相同生理活性的成分，从而避免了传统分离提取的非特异性和低效性，大大提高了药物筛选的效率。虽然nNOS-PSD-95解偶联剂分子印迹聚合物的制备方法已有报道(中国专利CN201019026093.4)，但其属于本体聚合，合成的MIPs存在“印记”容量低、位点“包埋”以及处理步骤复杂等欠缺，介孔分子筛表面印记聚合物与之相比具有独特的优势：(1)热稳定性和水热稳定性好；(2)比表面积较大，使得硅胶表面形成更多的MIPs的印记“空穴”，制备MIPs时模板分子残留大大减少，增加了有效“印记”容量并减少了传质阻力，具有良好的吸附和解析动力学特性；(3)规则有序的垂直孔道结构更有利于分子的吸附和释放；(4)孔径分布均一且大小可调；(5)表面易于接枝、化学修饰和功能化设计；(6)制备方便、粒度可控；(7)廉价和环保。
此外，本发明还引入了磁性分离(magnetic separation，MS)技术，通过磁性、介孔分子筛以及表面分子印记技术的结合，可在外磁场作用下实现对靶标物质的快速直接分离，省去了离心、过滤等繁杂的操作，加快了分离速度，有效缩短了化合物筛选的时间，为中药活性物质的选择性快速分离富集与检测提供了一种新的强有力手段。
发明内容
解决的技术问题：针对中药活性筛选的低效和繁琐以及传统分子印迹聚合物自身的缺点，本发明提供了一种基于磁性介孔分子筛的nNOS-PSD-95解偶联剂表面印记聚合物的制备方法，旨在寻找活性显著、毒副作用小的抗脑卒中候选药物，同时为中药活性成分的的特异性和高效筛选提供新思路和新方法。
技术方案：一种基于磁性介孔分子筛的nNOS-PSD-95解偶联剂表面印记聚合物的制备方法，具体步骤为：A.制备核壳结构的磁性介孔分子筛：用溶剂热法合成无机磁性纳米粒子核心，并在磁性搅拌下加入正硅酸四乙酯和表面活性剂，所得产物通过丙酮回流或者分散在体积比为1:20～1:200的盐酸-乙醇溶液体系中室温搅拌去除多余的表面活性剂，最后去离子水洗，真空干燥，得到核壳结构的磁性介孔二氧化硅微球；B.对制得的磁性介孔二氧化硅微球进行表面接枝改性：将磁性介孔二氧化硅微球超声分散于甲苯溶液中，搅拌下加入甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷，甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷与甲苯的体积比为1:10～3:10，通氮气除氧，密封，65～120℃加热搅拌回流24h，得到接枝改性后的磁性介孔分子筛，再依次用甲苯、甲醇洗涤，磁性分离，真空干燥后备用；C.制备基于磁性介孔分子筛的nNOS-PSD-95解偶联剂表面印记聚合物：将模板分子ZL006和功能单体加入致孔剂，模板分子与功能单体的摩尔比为1:4～1:6，致孔剂与模板分子体积摩尔比为100～250mL/mmol，30℃搅拌4h，得到溶液一；表面接枝改性后的磁性介孔二氧化硅微球超声分散于致孔剂，得到溶液二，将溶液一和溶液二按任意比搅拌下均匀混合，后加入交联剂和引发剂，功能单体与交联剂的摩尔比为1:3～1:6，引发剂用量为模板分子、功能单体和交联剂质量总量的3％～5％，通氮气密封，加热搅拌回流；反应结束后磁性分离除上清液，重分散于体积比为9:1的甲醇-冰醋酸混合溶液，置于振荡培养箱反复振荡洗涤，直至上清液紫外检测不到模板分子为止，再用甲醇洗至中性，真空干燥至恒重，得到基于磁性介孔分子筛的nNOS-PSD-95解偶联剂表面印记聚合物。
上述步骤A中正硅酸四乙酯的滴加速度为2～30s一滴；磁性搅拌转速为500～1100rpm/min；盐酸-乙醇的体积比为1:200。
上述步骤B中甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷与甲苯的体积比为1:5；搅拌回流的温度为115℃。
上述步骤C中所述的功能单体为丙烯酰胺、甲基丙烯酸甲酯、4-乙烯基吡啶或N，N'-亚甲基双丙烯酰胺。
上述步骤C中所述的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯或三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯。
上述步骤C中所述的致孔剂为N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、体积比9:1甲苯-乙醇体系或体积比9:1乙腈-乙醇体系。
上述步骤C中所述的引发剂为偶氮二异丁腈。
上述步骤C中模板分子与功能单体的摩尔比为1:5，功能单体与交联剂的摩尔比为1:5，致孔剂与模板分子体积摩尔比为125mL/mmol，引发剂用量为模板分子、功能单体和交联剂质量总量的5％。
上述步骤C中加热回流时的升温步骤是50℃反应6h，60℃反应24h，最后升温到85℃反应6h。
有益效果：中药体系庞大、成分复杂、结构多样、干扰组分多，其活性成分的筛选低效且繁琐，并易于丢失微量的有效成分，本发明制备的基于磁性介孔分子筛的nNOS-PSD-95解偶联剂表面印记聚合物单分散性好，比表面积大，介孔规则有序，具有优良的吸附和解吸附动力学特性，且聚合物稳定性、重现性好，为实现中药中nNOS-PSD-95解偶联剂的选择性捕获和高效筛选提供可能。同时，将磁性分离技术与分散固相萃取联用，省去了离心、过滤等繁杂的操作，加快了分离速度，有效缩短了化合物筛选的时间，操作简单，易于回收，有利于循环使用，更加环保。
附图说明
图1是制备基于磁性介孔分子筛的nNOS-PSD-95解偶联剂表面印记聚合物的技术路线图。
图2是磁性介孔分子筛的透射电镜图。
图3是基于磁性介孔分子筛的nNOS-PSD-95解偶联剂表面印记聚合物的ZL006吸附曲线图，左图为静态吸附等温线图(a：MIP，b：NIP)，右图为吸附动力学曲线图。
图4是基于磁性介孔分子筛的nNOS-PSD-95解偶联剂表面印记聚合物的解吸附动力学曲线图和再生吸附柱形图。
图5是基于磁性分离技术与分散固相萃取联用体系筛选中药中nNOS-PSD-95解偶联剂的技术路线图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
六水合三氯化铁(FeCl3·6H2O)
无水乙酸钠(NaAc)
正硅酸四乙酯(TEOS)
十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)
甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(MPS)
丙烯酰胺(AM)
甲基丙烯酸甲酯(MMA)
4-乙烯基吡啶(4-VP)
N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)
三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)
乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)
N，N-二甲基甲酰胺(DMF)
四氢呋喃(THF)
偶氮二异丁腈(AIBN)
实施例1：
(1).称取2.7gFeCl3·6H2O和7.2gNaAc，磁性搅拌溶解于100mL乙二醇至呈均匀黄色溶液，转移至四氟乙烯高压釜，200℃静置8h，室温冷却，无水乙醇洗6次，磁性分离，45℃真空干燥至恒重，得Fe3O4粉末。
(2).称取制得的Fe3O4粉末0.1g超声分散于80mL乙醇，加入20mL去离子水、1mL浓氨水，磁力搅拌下向溶液中滴加0.1gTEOS，室温搅拌6h，乙醇、去离子水洗，重分散于60mL乙醇、80mL去离子水、1g浓氨水的混合溶液中，加入0.3gCTAB，室温搅拌30min，后滴加0.4gTEOS，继续搅拌6h，转速为500rpm，TEOS滴加速度为每2s一滴，后收集产物分散在1mLHCl和100mL乙醇混合溶液中，室温搅拌两天，磁性分离，45℃真空干燥至恒重，得磁性介孔分子筛粉末。
(3).称取0.1g制得的磁性介孔分子筛粉末超声分散于50mL甲苯溶液，加入5mLMPS，通氮气大于10min，密封，转速为1000rpm，65℃下搅拌回流24h，制得改性后的磁性介孔分子筛，依次用甲苯、甲醇洗涤，除去未反应的MPS，磁性分离，45℃真空干燥至恒重，备用。
(4).取0.3mmol ZL006，1.5mmolMMA，超声分散25mL DMF中，30℃搅拌4h，转速为300rpm，得溶液一，另称取0.1g上述改性后的磁性介孔分子筛粉末分散在25mL的DMF中，超声30min，得溶液二，将溶液一、溶液二混合，搅拌均匀后加入6mmol EGDMA，43.1mg AIBN，通氮气大于10min，密封，加热搅拌回流，50℃反应6h，60℃反应24h，最后升温到85℃反应6h。
(5).反应结束后磁性分离除上清液，重分散于体积比为9:1的甲醇-冰醋酸混合溶液，置于振荡培养箱反复振荡洗涤，直至上清液紫外检测不到模板分子为止，再用甲醇洗至中性，45℃真空干燥至恒重，得到基于磁性介孔分子筛的nNOS-PSD-95解偶联剂表面印记聚合物(MIP-1)。
非印记聚合物(NIP-1)的制备过程，除在合成过程中不添加模板分子以外，其余步骤和MIP-1相同。
实施例2:
(1).称取2.7g FeCl3·6H2O和7.2gNaAc，磁性搅拌溶解于100mL乙二醇至呈均匀黄色溶液，转移至四氟乙烯高压釜，200℃静置8h，室温冷却，无水乙醇洗6次，磁性分离，45℃真空干燥至恒重，得Fe3O4粉末。
(2).称取制得的Fe3O4粉末0.1g超声分散于80mL乙醇，加入20mL去离子水、1mL浓氨水，磁力搅拌下向溶液中滴加0.1gTEOS，室温搅拌6h，乙醇、去离子水洗，重分散于60mL乙醇、80mL去离子水、1g浓氨水的混合溶液中，加入0.3gCTAB，室温搅拌30min，后滴加0.4gTEOS，继续搅拌6h，转速为600rpm，TEOS滴加速度为每10s一滴，后收集产物分散于60mL丙酮中，80℃回流两天，重复两次回流，磁性分离，45℃真空干燥至恒重，得磁性介孔分子筛粉末。
(3).称取0.1g制得的磁性介孔分子筛粉末超声分散于50mL甲苯溶液，加入6mLMPS，通氮气大于10min，密封，转速为1000rpm，75℃下搅拌回流24h，制得改性后的磁性介孔分子筛，依次用甲苯、甲醇洗涤，除去未反应的MPS，磁性分离，45℃真空干燥至恒重，备用。
(4).取0.5mmol ZL006，2mmol4-VP，超声分散25mL THF中，30℃搅拌4h，转速为300rpm，得溶液一，另称取0.1g上述改性后的磁性介孔分子筛粉末分散在25mL的THF中，超声30min，得溶液二，将溶液一、溶液二混合，搅拌均匀后加入6mmol EGDMA，62.54mg AIBN，通氮气大于10min，密封，加热搅拌回流，50℃反应6h，60℃反应24h，最后升温到85℃反应6h。
(5).反应结束后磁性分离除上清液，重分散于体积比为9:1的甲醇-冰醋酸混合溶液，置于振荡培养箱反复振荡洗涤，直至上清液紫外检测不到模板分子为止，再用甲醇洗至中性，45℃真空干燥至恒重，得到基于磁性介孔分子筛的nNOS-PSD-95解偶联剂表面印记聚合物。(MIP-2)
非印记聚合物(NIP-2)的制备过程，除在合成过程中不添加模板分子以外，其余步骤和MIP-2相同。
实施例3:
(1).称取2.7g FeCl3·6H2O和7.2gNaAc，磁性搅拌溶解于100mL乙二醇至呈均匀黄色溶液，转移至四氟乙烯高压釜，200℃静置8h，室温冷却，无水乙醇洗6次，磁性分离，45℃真空干燥至恒重，得Fe3O4粉末。
(2).称取制得的Fe3O4粉末0.1g超声分散于80mL乙醇，加入20mL去离子水、1mL浓氨水，磁力搅拌下向溶液中滴加0.1gTEOS，室温搅拌6h，乙醇、去离子水洗，重分散于60mL乙醇、80mL去离子水、1g浓氨水的混合溶液中，加入0.3gCTAB，室温搅拌30min，后滴加0.4gTEOS，继续搅拌6h，转速为700rpm，TEOS滴加速度为每15s一滴，后收集产物分散在3mLHCl和100mL乙醇混合溶液中，室温搅拌两天，磁性分离，45℃真空干燥至恒重，得磁性介孔分子筛粉末。
(3).称取0.1g制得的磁性介孔分子筛粉末超声分散于50mL甲苯溶液，加入7mLMPS，通氮气大于10min，密封，转速为1000rpm，100℃下搅拌回流24h，制得改性后的磁性介孔分子筛，依次用甲苯、甲醇洗涤，除去未反应的MPS，磁性分离，45℃真空干燥至恒重，备用。
(4).取0.2mmol ZL006，1.2mmolMBA，超声分散25mL甲苯-乙醇(9:1，v/v)中，30℃搅拌4h，转速为300rpm，得溶液一，另称取0.1g上述改性后的磁性介孔分子筛粉末分散在25mL的甲苯-乙醇(9：1，v/v)F中，超声30min，得溶液二，将溶液一、溶液二混合，搅拌均匀后加入7.2mmolTrim，134.35mg AIBN，通氮气大于10min，密封，加热搅拌回流，50℃反应6h，60℃反应24h，最后升温到85℃反应6h。
(5).反应结束后磁性分离除上清液，重分散于体积比为9:1的甲醇-冰醋酸混合溶液，置于振荡培养箱反复振荡洗涤，直至上清液紫外检测不到模板分子为止，再用甲醇洗至中性，45℃真空干燥至恒重，得到基于磁性介孔分子筛的nNOS-PSD-95解偶联剂表面印记聚合物。(MIP-3)
非印记聚合物(NIP-3)的制备过程，除在合成过程中不添加模板分子以外，其余步骤和MIP-3相同。
实施例4：
(1).称取2.7g FeCl3·6H2O和7.2gNaAc，磁性搅拌溶解于100mL乙二醇至呈均匀黄色溶液，转移至四氟乙烯高压釜，200℃静置8h，室温冷却，无水乙醇洗6次，磁性分离，45℃真空干燥至恒重，得Fe3O4粉末。
(2).称取制得的Fe3O4粉末0.1g超声分散于80mL乙醇，加入20mL去离子水、1mL浓氨水，磁力搅拌下向溶液中滴加0.1gTEOS，室温搅拌6h，乙醇、去离子水洗，重分散于60mL乙醇、80mL去离子水、1g浓氨水的混合溶液中，加入0.3gCTAB，室温搅拌30min，后滴加0.4gTEOS，继续搅拌6h，转速为1000rpm，TEOS滴加速度为每20s一滴，后收集产物分散在0.5mLHCl和100mL乙醇混合溶液中，室温搅拌两天，磁性分离，45℃真空干燥至恒重，得磁性介孔分子筛粉末。
(3).称取0.1g制得的磁性介孔分子筛粉末超声分散于50mL甲苯溶液，加入10mLMPS，通氮气大于10min，密封，转速为1000rpm，115℃下搅拌回流24h，制得改性后的磁性介孔分子筛，依次用甲苯、甲醇洗涤，除去未反应的MPS，磁性分离，45℃真空干燥至恒重，备用。
(4).取0.4mmol ZL006，2mmolAM，超声分散25mL乙腈-乙醇(9:1，v/v)中，30℃搅拌4h，转速为300rpm，得溶液一，另称取0.1g上述改性后的磁性介孔分子筛粉末分散在25mL乙腈-乙醇(9：1，v/v)中，超声30min，得溶液二，将溶液一、溶液二混合，搅拌均匀后加入10mmol EGDMA，112.77mg AIBN，通氮气大于10min，密封，加热搅拌回流，50℃反应6h，60℃反应24h，最后升温到85℃反应6h。
(5).反应结束后磁性分离除上清液，重分散于体积比为9:1的甲醇-冰醋酸混合溶液，置于振荡培养箱反复振荡洗涤，直至上清液紫外检测不到模板分子为止，再用甲醇洗至中性，45℃真空干燥至恒重，得到基于磁性介孔分子筛的nNOS-PSD-95解偶联剂表面印记聚合物。(MIP-4)
非印记聚合物(NIP-4)的制备过程，除在合成过程中不添加模板分子以外，其余步骤和MIP-4相同。
实施例5：
(1).称取2.7gFeCl3·6H2O和7.2gNaAc，磁性搅拌溶解于100mL乙二醇至呈均匀黄色溶液，转移至四氟乙烯高压釜，200℃静置8h，室温冷却，无水乙醇洗6次，磁性分离，45℃真空干燥至恒重，得Fe3O4粉末。
(2).称取制得的Fe3O4粉末0.1g超声分散于80mL乙醇，加入20mL去离子水、1mL浓氨水，磁力搅拌下向溶液中滴加0.1gTEOS，室温搅拌6h，乙醇、去离子水洗，重分散于60mL乙醇、80mL去离子水、1g浓氨水的混合溶液中，加入0.3gCTAB，室温搅拌30min，后滴加0.4gTEOS，继续搅拌6h，转速为1100rpm，TEOS滴加速度为每30s一滴，后收集产物分散在5mLHCl和100mL乙醇混合溶液中，室温搅拌两天，磁性分离，45℃真空干燥至恒重，得磁性介孔分子筛粉末。
(3).称取0.1g制得的磁性介孔分子筛粉末超声分散于50mL甲苯溶液，加入15mLMPS，通氮气大于10min，密封，转速为1000rpm，120℃下搅拌回流24h，制得改性后的磁性介孔分子筛，依次用甲苯、甲醇洗涤，除去未反应的MPS，磁性分离，45℃真空干燥至恒重，备用。
(4).取0.3mmol ZL006，1.8mmolMMA，超声分散25mL乙腈-乙醇(9:1，v/v)中，30℃搅拌4h，转速为300rpm，得溶液一，另称取0.1g上述改性后的磁性介孔分子筛粉末分散在25mL乙腈-乙醇(9：1，v/v)中，超声30min，得溶液二，将溶液一、二混合，搅拌均匀后加入7.2mmol Trim，81.45mg AIBN，通氮气大于10min，密封，加热搅拌回流，50℃反应6h，60℃反应24h，最后升温到85℃反应6h。
(5).反应结束后磁性分离除上清液，重分散于体积比为9:1的甲醇-冰醋酸混合溶液，置于振荡培养箱反复振荡洗涤，直至上清液紫外检测不到模板分子为止，再用甲醇洗至中性，45℃真空干燥至恒重，得到基于磁性介孔分子筛的nNOS-PSD-95解偶联剂表面印记聚合物。(MIP-5)
非印记聚合物(NIP-5)的制备过程，除在合成过程中不添加模板分子以外，其余步骤和MIP-5相同。
测试实施例：
测试实施例1：合成工艺优化
称取上述实施例制得的MIP与NIP(20.0mg)各1份，置于15mL三角瓶中，分别加入2.5mmol/L的ZL006溶液5mL，超声分散，室温振摇2h，取上清液，用0.22μm的尼龙膜滤过，定量稀释，紫外-可见分光光度仪于290nm处测定吸附前后ZL006溶液浓度。根据式(1)计算出平衡吸附量Q，根据式(2)计算印记因子IF，平行操作三次。
Q＝V(C0-Ce)/W (1)
式中：C0和Ce分别为模板分子的起始浓度和平衡浓度(mmol/L)；V为吸附溶液的体积(mL)；W为印记聚合物的质量(g)。
IF＝QMIP/QNIP (2)
式中：QMIP和QNIP分别为MIP和NIP对ZL006的平衡吸附量(μmol/g)。
从表1可以看出实施例4制得的MIP对ZL006表现出了较高的吸附量和较好的吸附选择性。
表1 基于磁性介孔分子筛的nNOS-PSD-95解偶联剂表面印记聚合物的合成工艺优化表
QMIPs(μmol g-1) IF
MIP-1 93.7 1.59
MIP-2 84.1 1.3
MIP-3 58.3 1.27
MIP-4 106.41 1.92
MIP-5 79.8 1.44
取上述实施例4中合成的基于磁性介孔分子筛的nNOS-PSD-95解偶联剂表面印记聚合物进行如下测试实验。
测试实施例2：透射电镜表征
图2是本发明合成的磁性介孔分子筛的透射电镜图，可见其粒径均一，单分散性好。
测试实施例3：静态吸附试验
称取MIP与NIP(20.0mg)各6份，置于15mL三角瓶中，分别加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3mmol/L的ZL006溶液5mL，超声分散，室温振摇2h，取上清液，用0.22μm的尼龙膜滤过，定量稀释，紫外-可见分光光度仪于290nm处测定吸附前后ZL006溶液浓度。根据式(1)计算出平衡吸附量Q，平行操作三次。
从图3(左)可以看出，MIP对ZL006的吸附量明显大于NIP的吸附量，表明MIP对ZL006的吸附不同于物理吸附，而是一种有特异性识别位点的选择性吸附，这种分子识别特性来自于该聚合物的结合基团与模板分子的功能基之间的氢键作用和空穴的几何选择性。
测试实施例4：吸附动力学试验
精密称取MIP(20.0mg)9份，置于15mL三角瓶中，分别加入2.5mmol/L的ZL006溶液5mL，超声分散，室温振摇，分别在2、5、10、15、20、25、30、35min时取上清液，用0.22μm的尼龙膜滤过，定量稀释，紫外-可见分光光度仪于290nm处测定吸附前后ZL006溶液浓度，根据式(1)计算出平衡吸附量Q，平行操作三次。
从图3(右)可以看出，印迹材料具有较快的吸附速率，能在30min内迅速达到吸附平衡。而传统的本体聚合制备的MIP吸附平衡时间一般为12～24h。其原因是采用表面分子印迹制备的MIP其识别位点位于材料表面薄而均匀的印迹层，可接近性强，传质速度快，可以快速达到吸附平衡。
测试实施例5：解吸附动力学试验
精密称取MIP(20.0mg)9份，置于15mL三角瓶中，分别加入2.5mmol/L的ZL006溶液5mL，超声分散，室温振摇30min，去除上清液，分别加入体积比为9:1的甲醇-冰醋酸混合溶液1mL，分别超声1、2、5、10、15、20、25、30、35min后取上清液，氮气吹干后用体积比9:1乙腈-乙醇混合溶液复溶，0.22μm尼龙膜滤过，定量稀释，紫外-可见分光光度仪于290nm处测定吸附前后ZL006溶液浓度，计算出聚合物在不同解吸附时间的平衡吸附量Q及解吸率，平行操作三次。
从图4(左)可以看出，印迹材料具有较快的解吸附速率，约20min基本解吸附完全。其原因也是由于识别位点在材料表面规则、有序地排列。
测试实施例6：稳定性和重复使用性试验
精密称取MIP(20.0mg)1份，置于15mL三角瓶中，加入2.5mmol/L的ZL006溶液5mL，超声分散，室温振摇30min，取上清液，用0.22μm的尼龙膜滤过，定量稀释，紫外-可见分光光度仪于290nm处测定吸附前后ZL006溶液浓度。计算出平衡吸附量Q及吸附率，后去除上清液，加入体积比为9:1的甲醇-冰醋酸混合溶液1mL，超声20min后磁性分离收集聚合物，真空干燥。如此重复六次。
从图4(右)可以看出，使用六次后吸附率没有明显的变化，说明所制备的印记聚合物具有较好的稳定性和重现性，可以作为分散固相萃取的吸附剂应用于中药中nNOS-PSD-95解偶联剂的选择性捕获和高效筛选。
上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种基于磁性介孔分子筛的nNOS-PSD-95解偶联剂表面印记聚合物的制备方法，其特征在于具体步骤为：
A. 制备核壳结构的磁性介孔分子筛：
用溶剂热法合成无机磁性纳米粒子核心，并在磁性搅拌下加入正硅酸四乙酯和表面活性剂，所得产物通过丙酮回流或者分散在体积比为1:20～1:200的盐酸-乙醇溶液体系中室温搅拌去除多余的表面活性剂，最后去离子水洗，真空干燥，得到核壳结构的磁性介孔二氧化硅微球；
B. 对制得的磁性介孔二氧化硅微球进行表面接枝改性：
将磁性介孔二氧化硅微球超声分散于甲苯溶液中，搅拌下加入甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷，甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷与甲苯的体积比为1:10～3:10，通氮气除氧，密封，65～120℃加热搅拌回流24h，得到接枝改性后的磁性介孔分子筛，再依次用甲苯、甲醇洗涤，磁性分离，真空干燥后备用；
C．制备基于磁性介孔分子筛的nNOS-PSD-95解偶联剂表面印记聚合物：
将模板分子ZL006和功能单体加入致孔剂，模板分子与功能单体的摩尔比为1:4～1:6，致孔剂与模板分子体积摩尔比为100～250mL/mmol，30℃搅拌4h，得到溶液一；表面接枝改性后的磁性介孔二氧化硅微球超声分散于致孔剂，得到溶液二，将溶液一和溶液二按任意比搅拌下均匀混合，后加入交联剂和引发剂，功能单体与交联剂的摩尔比为1:3～1:6，引发剂用量为模板分子、功能单体和交联剂质量总量的3%～5%，通氮气密封，加热搅拌回流；反应结束后磁性分离除上清液，重分散于体积比为9:1的甲醇-冰醋酸混合溶液，置于振荡培养箱反复振荡洗涤，直至上清液紫外检测不到模板分子为止，再用甲醇洗至中性，真空干燥至恒重，得到基于磁性介孔分子筛的nNOS-PSD-95解偶联剂表面印记聚合物。
2.根据权利要求1所述的基于磁性介孔分子筛的nNOS-PSD-95解偶联剂表面印记聚合物的制备方法，其特征在于，步骤A中正硅酸四乙酯的滴加速度为2～30s一滴；磁性搅拌转速为500～1100rpm/min；盐酸-乙醇的体积比为1:200。
3.根据权利要求1所述的基于磁性介孔分子筛的nNOS-PSD-95解偶联剂表面印记聚合物的制备方法，其特征在于，步骤B中甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷与甲苯的体积比为1:5；搅拌回流的温度为115℃。
4.根据权利要求1所述的基于磁性介孔分子筛的nNOS-PSD-95解偶联剂表面印记聚合物的制备方法，其特征在于，步骤C中所述的功能单体为丙烯酰胺、甲基丙烯酸甲酯、4-乙烯基吡啶或N，N'-亚甲基双丙烯酰胺。
5.根据权利要求1所述的基于磁性介孔分子筛的nNOS-PSD-95解偶联剂表面印记聚合物的制备方法，其特征在于，步骤C中所述的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯或三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯。
6.根据权利要求1所述的基于磁性介孔分子筛的nNOS-PSD-95解偶联剂表面印记聚合物的制备方法，其特征在于，步骤C中所述的致孔剂为N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、体积比9:1甲苯-乙醇体系或体积比9:1乙腈-乙醇体系。
7.根据权利要求1所述的基于磁性介孔分子筛的nNOS-PSD-95解偶联剂表面印记聚合物的制备方法，其特征在于，步骤C中所述的引发剂为偶氮二异丁腈。
8.根据权利要求1所述的基于磁性介孔分子筛的nNOS-PSD-95解偶联剂表面印记聚合物的制备方法，其特征在于，步骤C中模板分子与功能单体的摩尔比为1:5，功能单体与交联剂的摩尔比为1:5，致孔剂与模板分子体积摩尔比为125mL/mmol，引发剂用量为模板分子、功能单体和交联剂质量总量的5%。
9.根据权利要求1所述的基于磁性介孔分子筛的nNOS-PSD-95解偶联剂表面印记聚合物的制备方法，其特征在于，步骤C中加热回流时的升温步骤是50℃反应6h，60℃反应24h，最后升温到85℃反应6h。
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