CN111826433B - 一种LncRNA在糖尿病预后评估和反复流产预警中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种LncRNA在糖尿病预后评估和反复流产预警中的应用。本发明提供了用于检测LncRNA EPB41L4A‑AS1的物质在如下(A1)或(A2)中的应用：(A1)制备用于糖尿病预后评估的产品，或糖尿病预后评估；(A2)制备用于反复流产预警的产品，或反复流产预警。其中，所述LncRNA EPB41L4A‑AS1的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。本发明提示lncRNA EPB41l4A‑AS1对于糖尿病预后评估和反复流产预警具有重要意义。

Description

一种LncRNA在糖尿病预后评估和反复流产预警中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种LncRNA在糖尿病预后评估和反复流产预警中的应用。
背景技术
人类基因组存在大量的不编码蛋白的 DNA 序列，其中80%以上的非编码序列会转录出非编码蛋白的RNA转录本被称为非编码核酸（ncRNA）。 分子量大于 200 核苷酸的称为长非编码核酸 （lncRNA）。近年来的研究发现 lncRNA在调节机体的生理和病理过程中发挥重要作用。
糖尿病是一种常见的代谢性疾病，近年来随着社会经济的发展糖尿病的发病率进一步攀升。国际糖尿病联盟公布2017年全球糖尿病患者已达到4.25亿，到2045年预计可能达到6.29亿。所以糖尿病的预防，诊断和治疗，已成为急需解决的重大社会问题。
反复性流产为自然流产连续3次以上者，每次流产往往发生在同一妊娠月份。引起反复性流产的病因复杂，临床上竟有43种疾病最终可导致反复性流产的发生，有免疫性因素、遗传性因素、感染性因素、内分泌性因素、解剖因素等，而其中免疫性因素导致的流产占反复性流产的67%之多。
发明内容
本发明的目的是提供一种LncRNA在糖尿病预后评估和反复流产预警中的应用。
第一方面，本发明要求保护用于检测LncRNA EPB41L4A-AS1的物质在如下（A1）或（A2）中的应用：
（A1）制备用于糖尿病预后评估的产品，或糖尿病预后评估；
（A2）制备用于反复流产预警的产品，或反复流产预警。
第二方面，本发明要求保护用于检测LncRNA EPB41L4A-AS1的物质在如下任一中的应用：
（a1）制备用于诊断高血糖刺激的无菌性炎症是否存在的产品，或诊断高血糖刺激的无菌性炎症是否存在；
（a2）制备用于对糖尿病的加重进行预警的产品，或对糖尿病的加重进行预警；
（a3）制备用于对糖尿病的血管并发症进行预警的产品，或对糖尿病的血管并发症进行预警；
（a4）制备用于对糖尿病的血管内皮氧化损伤进行预警的产品，或对糖尿病的血管内皮氧化损伤进行预警。
糖尿病患者，长期的血管内皮损伤会引起血管内皮并发症进而加重糖尿病病情。
在前述第一方面和第二方面中，所述用于检测LncRNA EPB41L4A-AS1的物质可为引物对或试剂盒等。
其中，所述引物对可为如下任一引物对：
（b1）由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成的引物对；
（b2）由将SEQ ID No.1和SEQ ID No.2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的，且与（b1）中所述引物对功能相同的引物对。
在本发明的具体实施方式中，所述试剂盒具体为用于检测所述LncRNA EPB41L4A-AS1的实时荧光RT-PCR检测试剂盒，含有所述引物对。具体的，所述试剂盒含有荧光RT-PCR反应液A和荧光RT-PCR反应液B；所述荧光RT-PCR反应液A中含有DNA聚合酶、dNTP、镁离子及缓冲体系等；所述荧光RT-PCR反应液B中含有所述引物对和荧光探针等。
第三方面，本发明要求保护用于检测LncRNA EPB41L4A-AS1的物质在如下任一中的应用：
（c1）制备用于检测糖尿病患者（如二型糖尿病患者）外周血中炎症性因子表达水平的产品，或者检测糖尿病患者外周血中炎症性因子表达水平（如外周血单核细胞中炎症性因子表达水平）；
（c2）制备用于检测经高糖（如30mM的D-葡萄糖）或LPS诱导（如1μg/ml的LPS）处理的免疫细胞中炎症性因子表达水平的产品，或者检测经高糖处理的免疫细胞中炎症性因子表达水平。
进一步地，所述免疫细胞可为单核细胞或淋巴细胞。
在本发明的具体实施方式中，所述单核细胞为THP-1细胞；所述淋巴细胞为JURKAT细胞。
在（c1）和（c2）中，如果测得所述LncRNA EPB41L4A-AS1的表达水平低于正常对照组，则所述炎症性因子表达水平高于或候选高于正常对照组。其中，所述正常对照组可如未患有糖尿病的健康人或者未经高糖（或LPS诱导）处理的免疫细胞。
第四方面，本发明要求保护用于抑制LncRNA EPB41L4A-AS1的物质在制备具有如下表型的细胞模型中的应用：经高糖（如30mM的D-葡萄糖）或LPS诱导（如1μg/ml的LPS）处理后，胞内炎症性因子表达水平升高。
进一步地，所述细胞可为免疫细胞；更进一步地，所述免疫细胞可为单核细胞；更加具体地，所述单核细胞可为THP-1细胞。
第五方面，本发明要求保护用于抑制LncRNA EPB41L4A-AS1的物质在制备用于增强因炎症反应所致的细胞内氧化损伤的产品，或增强因炎症反应所致的细胞内氧化损伤中的应用。
其中，所述产品可为细胞模型或动物模型。可用于药物筛选等。
进一步地，所述细胞可为绒毛细胞（如HTR-8/SVneo细胞）或胰岛细胞（如Beta-TC-6细胞）或血管内皮细胞（如HUV-EC-C [HUVEC]细胞）。
第六方面，本发明要求保护LncRNA EPB41L4A-AS1表达水平降低的免疫细胞制备用于增强因炎症反应所致的细胞内氧化损伤的产品，或增强因炎症反应所致的细胞内氧化损伤中的应用。
其中，所述产品可为细胞模型或动物模型。可用于药物筛选等。
在本发明具体实施方式中，所述免疫细胞具体为THP-1细胞。相应的，所述LncRNAEPB41L4A-AS1表达水平降低的免疫细胞具体为向THP-1细胞中导入siEPB41L4A-AS1后获得的；所述siEPB41L4A-AS1由SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的两条单链退火形成。
在前文第四方面和第五方面中，所述用于抑制LncRNA EPB41L4A-AS1的物质具体可为siEPB41L4A-AS1；所述siEPB41L4A-AS1由SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的两条单链RNA退火形成。
在前文第五方面和第六方面中，所述增强因炎症反应所致的细胞内氧化损伤具体可体现为增加因炎症反应所致的细胞内ROS水平。
在本发明的具体实施方式中，所述炎症反应具体为由高糖（如30mM D-葡萄糖）或LPS诱导所致（LPS的诱导浓度可为100-200ng/ml）。
第七方面，本发明还要求保护前文所述引物对或所述试剂盒。
在前文各方面中，所述LncRNA EPB41L4A-AS1均可为如下任一：
（B1）SEQ ID No.5所示的RNA；
（B2）将SEQ ID No.5所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的RNA；
（B3）与（B1）或（B2）所限定的核苷酸序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上或者80%以上同源性且具有相同功能的RNA。
在前文各方面中，所述炎症性因子均可为如下： IL1β，IL-8、TNF-α和/或IL-16。
本发明研究发现：lncRNA EPB41l4A-AS1在糖尿病的发生发展中起重要作用。与健康对照比较，糖尿病患者外周血有核细胞LncRNA EPB41L4A-AS1的表达水平明显下降。与此相对应，患者外周血有核细胞的炎性因子的表达明显升高。提示两者间可能存在某种联系。进一步的研究发现，LncRNA EPB41L4A-AS1是外周血有核细胞，特别是单核细胞和淋巴细胞炎性因子的重要调节分子，高糖刺激可使LncRNA EPB41L4A-AS1表达下调，进而促进单核细胞和淋巴细胞炎性因子的表达。研究还发现该lncRNA在反复流产病人中异常表达，可能与反复流产病人异常的免疫状态有关。本发明提示lncRNA EPB41l4A-AS1对于糖尿病预后评估和反复流产预警具有重要意义。
附图说明
图1为糖尿病及反复流产患者全血LncRNA EPB41L4A-AS1的表达水平。A为糖尿病患者；B为反复流产伴绒毛损伤患者。
图2为LncRNA EPB41L4A-AS1的表达下调的糖尿病患者外周血单个核细胞炎性因子表达水平的生物信息学分析。A为EPB41L4A-AS1的表达。B为IL-8的表达。C为IL-6的表达。D为IL-1β的表达。
图3为高糖及LPS处理下调LncRNA EPB41L4A-AS1在单核细胞和淋巴细胞中的表达。A和B分别为30mM高糖培养；C和D分别为1μg/mL LPS处理。
图4为LncRNA EPB41L4A-AS1稳定表达的下调的THP-1细胞株sh8与LncRNAEPB41L4A-AS1表达正常的对照细胞系比较（shnc），在高糖或LPS刺激下刺激炎性因子的表达明显增加。A为转染了稳定表达siEPB41L4A-AS1 siRNA质粒的THP-1细胞（sh8）的LncRNAEPB41L4A-AS1的表达相比于对照组显著降低。B和C分别为在高糖和LPS刺激下刺激炎性因子的表达明显增加。
图5为流式细胞仪检测下调LncRNA EPB41L4A-AS1表达诱导的免疫细胞激活对绒毛/胰岛/血管内皮细胞氧化损伤的影响。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所涉及的LncRNA EPB41L4A-AS1具体为SEQ ID No.5所示的LncRNA。
实施例1、检测全血LncRNA EPB41L4A-AS1的表达
供试样本组1：健康对照，临床上确诊的糖尿病患者和糖尿病伴肿瘤患者。供试者知情且同意。
供试样本组2：人工流产组比较，反复流产伴绒毛损伤患者。供试者知情且同意。
采用TRIZOL法提取新鲜的血液样本中的总RNA。每500μl全血中加入1ml的 RNAisoplus（TAKARA），采用氯仿萃取和异丙醇沉淀的方法获得总RNA，采用Nanodrop 2000仪器（Thermo Fisher Scientific）对用总RNA进行浓度和质量分析，用 ReverTraAce qPCR RT试剂盒（TOYOBO）将总RNA逆转录成cDNA。
LncRNA EPB41L4A-AS1的表达量采用荧光定量PCR法进行检测，采用 SYBR GreenRealTime PCRMaster Mix（TOYOBO）体系，在德国耶拿的荧光定量梯度PCR仪 qTOWER 2.2上检测。使用β-actin基因作为内参，每个样品做三个重复。
用于检测β-actin的引物如下：
正向：5’-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3’ ；
反向：5’- CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3’。
用于检测LncRNA EPB41L4A-AS1的引物如下：
正向：5’-CCACCCTGAGTCTGGTGAGT-3’（SEQ ID No.1）；
反向：5’-CCTGGCATAGTCGATGATGTA-3’（SEQ ID No.2）。
结果如图1所示，与健康对照比较，糖尿病患者和糖尿病伴肿瘤患者外周血LncRNAEPB41L4A-AS1的表达水平明显下降（图1中A）。与人工流产组比较，反复流产患者伴绒毛损伤全血LncRNA EPB41L4A-AS1的表达水平明显下降（图1中B）。
实施例2、LncRNA EPB41L4A-AS1的表达下调的糖尿病患者外周血单个核细胞炎性因子表达水平的生物信息学分析
因外周血LncRNAEPB41L4A-AS1的表达主要来自白细胞，所以本发明用生物信息学的方法分析了LncRNAEPB41L4A-AS1在糖尿病人外周血的表达情况。具体如下：
通过对GEO datasets中 GDS3875芯片中正常人（24例）和二型糖尿病人（12例）外周血单个核细胞的LncRNAEPB41L4A-AS1的表达量分析，发现LncRNAEPB41L4A-AS1在二型糖尿病人外周血单个核细胞中的表达量显著下调。通过对GEO数据库中GDS3874中的数据分析，发现与健康对照（24例）比较LncRNA EPB41L4A-AS1表达降低的二型糖尿病患者（12例）外周血单个核细胞的炎性因子IL-8，IL-6和IL-1β明显升高（图2）。
实施例3、检测高糖对单核细胞和淋巴细胞LncRNA EPB41L4A-AS1表达的影响
将THP-1细胞（ATCC® TIB-202）和JURKAT细胞（ATCC® TIB-152）分别用含有30mMD-葡萄糖的无血清的1640培养基刺激0h，2h，12h，或含有1μg/mL LPS 及10%的胎牛血清（FBS）（Biowest公司）的1640培养基培养0h，2h，12h，采用实施例1中的方法提取细胞中的总RNA，qRT-PCR检测LncRNAEPB41L4A-AS1基因的表达。
结果发现：在高糖和LPS处理12h时，单核细胞来源的THP-1细胞和淋巴细胞来源的JURKAT细胞中LncRNAEPB41L4A-AS1的表达水平已经显著下调。如图3所示。
实施例4、建立敲低LncRNA EPB41L4A-AS1表达的THP-1细胞株，检测该细胞株在高糖及LPS诱导下炎性因子的表达情况
一、稳定过表达特异性的LncRNAEPB41L4A-AS1的siRNA的THP-1的细胞系的构建
THP-1 人外周血单核细胞白血病细胞系为美国ATCC公司产品（ATCC® TIB-202），培养基为含有10%的胎牛血清（FBS）（Biowest公司）的1640培养基（Thermo FisherScientific），培养条件为37℃、5%的二氧化碳的细胞培养箱。
将编码阴性对照NC和siEPB41L4A-AS1的siRNA的DNA序列退火后分别连接到慢病毒干扰载体LV-2（上海吉玛公司，C06002）中得到稳定表达NC siRNA 和 siEPBL4A-AS1siRNA的过表达质粒。
阴性对照NC siRNA正义链：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT -3’；
阴性对照NC siRNA反义链：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。
siEPB41L4A-AS1 siRNA正义链：5’- GCCUGUCCUUUCUUCCUUUTT-3’（SEQ ID No.3）；
siEPB41L4A-AS1 siRNA反义链：5’-AAAGGAAGAAAGGACAGGCTT-3’（SEQ ID No.4）。
将上述质粒用Lipofectamine3000（美国赛默飞公司，货号L3000001）转染至THP-1细胞系，转染6h后换成新鲜的新的培养基，培养48h后，加入含有1μg/ml的嘌呤霉素 1640完全培养基进行筛选，约一个月后，存活的细胞即为稳定表达NC siRNA（shNC）或稳定表达siEPB41L4A-AS1 siRNA（shEPB41L4A-AS1）的THP-1细胞。采用与实施例1中一致的方法进行基因表达检测，发现转染了稳定表达siEPB41L4A-AS1 siRNA质粒的THP-1细胞的LncRNAEPB41L4A-AS1的表达相比于对照组显著降低，结果如图4中A所示。
二、用上述LncRNA EPB41L4A-AS1低表达的THP-1细胞株，检测在高糖及LPS诱导下炎性因子的表达情况
将THP-1的shNC和shEPB41L4A-AS1细胞系分别用含30mM D-葡萄糖或1μg/mL LPS的1640培养基处理12h后，采用与实施例1中一致的荧光定量PCR法检测细胞内的IL1β，IL-8和TNF的表达水平。
其中，用于检测IL-1β基因表达的引物对为：
正向：5’- GCTACGAATCTCCGACCACCA -3’ ；
反向：5’- GGGCAGGGAACCAGCATCT-3’。
用于检测IL-8基因表达的引物对为：
正向：5’- GACATACTCCAAACCTTTCCACCC -3’ ；
反向：5’- AAAAACTTCTCCACAACCCTCTGC -3’。
用于检测TNF基因表达的引物对为
正向：5’- TGCTGCACTTTGGAGTGATC -3’ ；
反向：5’- GGTTTGCTACAACATGGGCTA -3’。
结果如图4中B和C所示，在高糖或LPS刺激下刺激炎性因子IL1β，IL-8和TNF-α的表达明显增加。
实施例5、下调LncRNA EPB41L4A-AS1表达诱导的免疫细胞激活对绒毛/胰岛/血管内皮细胞氧化损伤的影响
HTR-8（ATCC® CRL-3271™）、beta-TC-6（ATCC® CRL-11506）和HUVEC（ATCC®CRL-1730）细胞均来自美国ATCC公司。HTR-8和beta-TC-6细胞用含有10%的胎牛血清的1640培养基（Thermo Fisher Scientific），HUVEC细胞用含10%的胎牛血清的F-12K培养基（Thermo Fisher Scientific）置于37℃、5%的二氧化碳条件下培养。
一、下调LncRNA EPB41L4A-AS1表达诱导的免疫细胞激活对绒毛细胞HTR-8/SVneo（ATCC® CRL-3271™）的氧化损伤的影响
1、调整处于对数生长期的绒毛细胞HTR8细胞的浓度，使每2ml细胞悬液中含有20w细胞。取2ml细胞悬液接种于6 well细胞培养板中至细胞完全贴壁。
2、调整处于对数期的稳定低表达LncRNA EPB41L4A-AS1的THP-1细胞（shEPB41L4A-AS1）以及相对应的作为阴性对照的 THP-1细胞（shNC）的浓度，使2ml细胞悬液中含有约100w的细胞。这两种细胞为实施例4构建。
3、去除绒毛细胞HTR8的培养液，分别加入2ml的含100w的shNC或shEPB41L4A-AS1的THP-1的细胞，将细胞按如下分组：
对照组：HTR8细胞与shNC细胞混合培养，加入约400ng的LPS，使LPS得终浓度为200ng/ml；
实验组：HTR8细胞与shEPB41L4A-AS1细胞混合培养，加入约400ng的LPS，使LPS得终浓度为200ng/ml。
将细胞置于37℃的二氧化碳培养箱中培养12h。
4、去除培养液以及悬浮的THP-1的细胞，用2ml 含有5μmol的DCFH-DA的ROS探针（MCE公司产品，货号为HY-D0940）的PBS溶液染色30min，用PBS洗去未染上的DCFH-DA的染料，收集细胞，用流式检测HTR8细胞的包内的ROS的水平。
结果如图5所示。可以看出，在稳定敲低LncRNA EPB41L4A-AS1的THP-1细胞与HTR8细胞在200ng/ml的LPS诱导12h后，能够显著的增加HTR8细胞内的ROS的水平，反应HTR8细胞有氧化损伤。
二、下调LncRNA EPB41L4A-AS1表达诱导的免疫细胞激活对胰岛细胞Beta-TC-6（ATCC® CRL-11506™）的氧化损伤的影响
1、调整处于对数生长期的胰岛细胞Beta-TC-6的浓度，使每2ml细胞悬液中含有15w细胞。取2ml细胞悬液接种于6 well细胞培养板中至细胞完全贴壁。
2、调整处于对数期的稳定低表达LncRNA EPB41L4A-AS1的THP-1的细胞（shEPB41L4A-AS1）以及相对应的阴性对照的 THP-1的细胞（shNC）的浓度，使2ml细胞悬液中含有约120w的细胞。这两种细胞为实施例4构建。
3、去除胰岛细胞Beta-TC-6的培养液，分别加入2ml的含120w的shNC或shEPB41L4A-AS1的THP-1的细胞，将细胞按如下分组：
对照组：胰岛细胞Beta-TC-6与shNC细胞混合培养，加入约400ng的LPS，使LPS得终浓度为200ng/ml；
实验组：胰岛细胞Beta-TC-6与shEPB41L4A-AS1细胞混合培养，加入约400ng的LPS，使LPS得终浓度为200ng/ml。
将细胞置于37℃的二氧化碳培养箱中培养12h。
4、去除培养液以及悬浮的THP-1的细胞，用2ml 含有5μmol的DCFH-DA的ROS探针（MCE公司产品，货号为HY-D0940）的PBS溶液染色30min，用PBS洗去未染上的DCFH-DA的染料，收集细胞，用流式检测Beta-TC-6细胞内的ROS的水平。
结果如图5所示。可以看出，在稳定敲低LncRNA EPB41L4A-AS1的THP-1细胞与胰岛细胞Beta-TC-6在200ng/ml的LPS诱导12h时，能够显著的增加胰岛细胞Beta-TC-6内的ROS的水平，反应细胞有氧化损伤。
三、下调LncRNA EPB41L4A-AS1表达诱导的免疫细胞激活对血管内皮细胞HUV-EC-C [HUVEC]（ATCC® CRL-1730™）的氧化损伤的影响。
1、调整处于对数生长期的血管内皮细胞HUVEC的浓度，使每2ml细胞悬液中含有12w细胞。取2ml细胞悬液接种于6 well细胞培养板中至细胞完全贴壁。
2、调整处于对数期的稳定低表达LncRNA EPB41L4A-AS1的的THP-1的细胞（shEPB41L4A-AS1）以及相对应的阴性对照的 THP-1的细胞（shNC）的浓度，使2ml细胞悬液中含有约80w的细胞。这两种细胞为实施例4构建。
3、去除血管内皮细胞HUVEC的培养液，分别加入2ml的含100w的shNC或shEPB41L4A-AS1的THP-1的细胞，将细胞按如下分组：
对照组：血管内皮细胞HUVEC与shNC细胞混合培养，加入约200ng的LPS，使LPS得终浓度为100ng/ml。
实验组：血管内皮细胞HUVEC与shEPB41L4A-AS1细胞混合培养，加入约200ng的LPS，使LPS得终浓度为100ng/ml。
将细胞置于 37℃的二氧化碳培养箱中培养12h。
4、去除培养液以及悬浮的THP-1的细胞，用2ml 含有5μmol的DCFH-DA的ROS探针（MCE公司产品，货号为HY-D0940）的PBS溶液染色30min，用PBS洗去未染上的DCFH-DA的染料，收集细胞，用流式检测血管内皮细胞HUVEC细胞内的ROS的水平。
结果如图5所示。可以看出，在稳定敲低LncRNA EPB41L4A-AS1的THP-1细胞与血管内皮细胞HUVEC在100ng/ml的LPS诱导12h时，能够显著的增加血管内皮细胞HUVEC内的ROS的水平，提示有剧烈地血管内皮细胞HUVEC的氧化损伤。
实施例6、检测LncRNA EPB41L4A-AS1的实时荧光RT-PCR检测试剂盒
本实施例提供了一种用实时荧光RT-PCR检测LncRNA EPB41L4A-AS1的试剂盒。
【检测方法】
一、核酸提取
1. 取已处理的样品200μL，加入600μL裂解液和20μL蛋白酶K，上下颠倒混匀，55℃水浴10min。
2. 吸取全部混合液转入吸附柱中，12,000rpm离心45s，弃去收集管中液体，套回收集管。
3. 向吸附柱中加入600μL洗涤液，12,000rpm离心45s，弃去收集管中液体，套回收集管。
4. 重复步骤3。
5. 空柱12,000rpm离心2min。
6. 将吸附柱移入新的无核酸酶的1.5mL离心管中，在吸附柱膜中央加入50μL洗脱液，室温静置1min，12,000rpm离心45s，获得核酸。
二、实时荧光RT-PCR
1. 反应体系配制：每份总体积20µL，按如下表1配制，充分混匀，并作好标记。
表1 反应体系
其中，所述荧光RT-PCR反应液A包括DNA聚合酶、dNTP、镁离子及缓冲体系等；所述荧光RT-PCR反应液B 包括实施例1中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物对、探针等。
对每管轻弹混匀，置8联管离心机上瞬时离心10s，将管壁上的液体甩至管底。
2、荧光PCR反应：在荧光PCR仪上进行以下反应：42℃ 15min ，95℃ 3min ；循环95℃ 5s 、58℃ 40s ，共40次，在每次循环第二步（58℃ 40s）收集FAM荧光信号（报告基团“FAM”，淬灭基团“None”）。
【检验结果的判断】
当被检样品出现典型的扩增曲线且Ct值≤30.0时判为阳性，无Ct值判为阴性。
<110> 清华大学深圳研究生院，深圳市康百得生物科技有限公司；
<120> 一种LncRNA在糖尿病预后评估和反复流产预警中的应用
<130> GNCLN190828
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
ccaccctgag tctggtgagt 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
cctggcatag tcgatgatgt a 21
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
gccuguccuu ucuuccuuut t 21
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
aaaggaagaa aggacaggct t 21
<210> 5
<211> 1976
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
ugucgggucc caaaauacgu ggucuaaagu ccuuugggcu ccugccgcug ccagcacuga 60
ucauaugcuc uugacccugg ucgggugggg ggaugucugg auaccuccuc uguggaaaga 120
acuggccaca cauccgcaga ggugacucgg gcugagaacc caggcuccuc cucccuuugg 180
ugacacgccc cucggucccu cacuggcacu ucucccuccg gccacacggc ggcgucucgc 240
cauagcgcag cggccgaugg uacagcccgc uccccccucg cgcucucgga cagugggucc 300
uuccacuugu agaaaagcau ugugggacgg aagccugucc uuucuuccuu uuggugcgag 360
cuugcugugg uuuuugcucu ggguccucug ggauggcgcc uggcuguggc cgcguggucu 420
cucacgcagg ggcgccgggc gggggaacgc ggccacccug agucugguga gucgacugcg 480
gcggccugug uccgaagugu ccggggccgu gaacaagggc agcggccugg ccucaggccu 540
gcguucccac guuuggaaac ggggagcuuc gucgauuugu guuuacauca ucgacuaugc 600
cagggaguuc uccagauaag ccugguuuua uuuucgucag ugaaaaggcc uuaccguaua 660
acugacuuua ugcuugcccu gcccccguau aaaauaacuu aaaagcagcg ugccugguua 720
cagcuguuuc cacgugcggu gcucgucggg agugaucacc uacccuacag gugaguuuuc 780
acguucgugc aagaccaguc gccauuuaaa acgcaucgca uuucacuuuu cauuauuaag 840
ucggauuuua aaucgugaga aaauuucucu gaaauguauu guccguuuuu aggcuguaau 900
cggcauuacu gucagccagu cagcaaccuu augccauaaa gccuaccuca cgcaguguca 960
gccuuugugu ugcccauuca cuuuggaaac uagugaaugu ggugucaaaa aaggcguaaa 1020
uuaaacgcuu ugcagccuuu uccugcccuu aaauuugaua ccuuuggugu aggagcugca 1080
uaaguaacag uugcugcuuu uacguuucca cgcgugaucu ugacccugcu agccuuaagu 1140
guaugguuuc ucuuagccag uucuaauuuu uguucaggug gaagauggau gccugaagug 1200
uagacugcug cuagcugaau accaucuggg agcauaaagg ugaccugaag guagggugau 1260
augucuuaaa gcacuuugua augggaauuu uuaucaccuu uuaaauuggg guuccuucuc 1320
uagugaguuu uaaugucagu gguacauucg uaguguugcu cugucuguag cuauuaaggu 1380
gaguuaauaa augggauagc cuccacagcu uauuuuuggg aagguuuugc ugauacuucc 1440
ugagaagccc agggaaauaa auacgcauag uacuggcauu cugcaucucu uuaagauuug 1500
uuuuuaugug uaguaauuga guuuuuuaaa agcuugugaa aucgcaggca uauuaccaag 1560
uucuugauua aaauguaaua caaaaauauu ugcugucgaa uugaguacuu uauuuuuucu 1620
cuuaggaugu ccuuggugag gauuuugaaa auuugaucuu cacaagaguu gccuggauca 1680
uuugaaauuu cugggagucu gaggaguacu gacauaauua ccugcuggag ucuguaaaua 1740
cacauuuaag acagugagga ugugaauaaa uauauuaaug cacuuuggca uuuguguuuu 1800
aagugauuaa cugccagaaa cagcuauuuc uaaaaaguua uaagggagga gggguucuuu 1860
uuugaucagu auucacugcu gucaccauaa uuaauagccu uaaaauagcu uguguuuggc 1920
ccaaagagaa auguacuuuc uuccagugac ucaaaaaucg uggcuagaac uagacu 1976

Claims (3)

1. 用于定量检测全血中LncRNA EPB41L4A-AS1的物质在制备用于反复流产伴绒毛损伤预警的产品中的应用；
所述物质为引物对或试剂盒；
所述引物对为由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成的引物对；
所述试剂盒为用于检测所述LncRNA EPB41L4A-AS1的实时荧光RT-PCR检测试剂盒，含有所述引物对。
2. 用于定量检测全血中LncRNA EPB41L4A-AS1的引物对在制备用于检测糖尿病患者外周血中炎症性因子表达水平的产品中的应用；
如果测得所述LncRNA EPB41L4A-AS1的表达水平低于正常对照组，则所述炎症性因子表达水平高于或候选高于正常对照组；所述正常对照组为未患有糖尿病的健康人；所述炎症性因子为如下：IL-6、IL-8和/或IL-1β；
所述引物对为由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成的引物对。
3. 用于抑制单核细胞来源的THP-1中LncRNA EPB41L4A-AS1的物质在制备具有如下表型的细胞模型中的应用：经高糖或LPS诱导处理后，胞内炎症性因子表达水平升高；
所述炎症性因子为IL-1β，IL-8和/或TNF-α；所述用于抑制LncRNA EPB41L4A-AS1的物质为siEPB41L4A-AS1；所述siEPB41L4A-AS1由SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的两条单链RNA退火形成。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112575076A (zh) * 2020-11-02 2021-03-30 深圳恒生医院 一种用于检测和评估早期自然流产的LncRNA标记物及应用其的产品

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101695507A (zh) * 2009-10-19 2010-04-21 清华大学深圳研究生院 一种治疗糖尿病的药物
CN103285113A (zh) * 2013-05-29 2013-09-11 清华大学深圳研究生院 一种预防和/或治疗糖尿病的药物组合物
WO2014036314A2 (en) * 2012-08-31 2014-03-06 Ignyta, Inc. Diagnosis of rheumatoid arthritis (ra) using differentially methylated loci identified in peripheral blood mononuclear cells, t-cells, b-cells and monocytes
CN106119385A (zh) * 2016-08-11 2016-11-16 河南大学 一种诊断2型糖尿病的miRNA分子标志物hsa‑miR‑149‑3p及其应用
CN106399309A (zh) * 2016-08-24 2017-02-15 江苏省省级机关医院 一种长非编码rna及其在诊断/治疗t2dm中的应用
CN106668861A (zh) * 2016-10-28 2017-05-17 清华大学深圳研究生院 一种将tiga1作为靶点来增强谷氨酰胺酶抑制剂抗***活性的方法
CN107338324A (zh) * 2017-09-08 2017-11-10 南京医科大学 用于诊断不明原因复发性流产的血清lncRNA标志物、引物组及应用和试剂盒
WO2019067210A1 (en) * 2017-09-13 2019-04-04 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATMENT OF AR AND / OR LNCRNA MEDIATION DISEASES

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10889864B2 (en) * 2014-12-08 2021-01-12 The Regents Of The University Of Michigan Non-coding RNAS and uses thereof

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101695507A (zh) * 2009-10-19 2010-04-21 清华大学深圳研究生院 一种治疗糖尿病的药物
WO2014036314A2 (en) * 2012-08-31 2014-03-06 Ignyta, Inc. Diagnosis of rheumatoid arthritis (ra) using differentially methylated loci identified in peripheral blood mononuclear cells, t-cells, b-cells and monocytes
CN103285113A (zh) * 2013-05-29 2013-09-11 清华大学深圳研究生院 一种预防和/或治疗糖尿病的药物组合物
CN106119385A (zh) * 2016-08-11 2016-11-16 河南大学 一种诊断2型糖尿病的miRNA分子标志物hsa‑miR‑149‑3p及其应用
CN106399309A (zh) * 2016-08-24 2017-02-15 江苏省省级机关医院 一种长非编码rna及其在诊断/治疗t2dm中的应用
CN106668861A (zh) * 2016-10-28 2017-05-17 清华大学深圳研究生院 一种将tiga1作为靶点来增强谷氨酰胺酶抑制剂抗***活性的方法
CN107338324A (zh) * 2017-09-08 2017-11-10 南京医科大学 用于诊断不明原因复发性流产的血清lncRNA标志物、引物组及应用和试剂盒
WO2019067210A1 (en) * 2017-09-13 2019-04-04 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATMENT OF AR AND / OR LNCRNA MEDIATION DISEASES

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
糖尿病前期患者长链非编码RNA的筛选和功能研究;张盼等;《中国病原生物学杂志》;20180430(第04期);第403-407页 *

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