CN107281204A - 一种非对称的1，2，4，5‑四嗪分子的应用 - Google Patents

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Abstract

一种非对称的1，2，4，5‑四嗪激活剂在基于逆电子狄尔斯‑阿尔德反应的生物正交领域进行前体药物或蛋白质快速激活的应用。本发明的优点在于相对于对称的四嗪分子，非对称的1，2，4，5‑四嗪激活剂具有极高的激活效率，而且本身和生物正交反应过程均不会对细胞产生毒性，可快速激活前体药物，尤其是能快速激活体外或体内以赖氨酸、酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸为活性残基的蛋白质，可用于生命过程研究、疾病治疗等方面，具有极为广阔的应用前景。

Description

一种非对称的1，2，4，5-四嗪分子的应用
技术领域
本发明涉及一种激活剂的应用，具体涉及一种非对称的1，2，4，5-四嗪分子的应用。
背景技术
很多前体药物或者蛋白质的关键基团是羟基或者氨基等这类活性基团，因此，这些分子的活性可通过保护和脱保护它们的关键活性基团来调控。但很多情况下，这些分子的激活需要在生命体系中进行，这就要求脱保护反应必须是生物正交，同时具有很高的反应效率。生物正交反应(Bioorthogonal reaction)是指在活体细胞或组织中,能够在不干扰生物自身生化反应条件下可以进行的化学反应,对生命科学的基础研究和临床应用都具有重要意义。同时，狄尔斯一阿尔德反应(Diels-Alder reaction)是经典的双烯加成反应,“逆电子需求的狄尔斯-阿尔德反应”同样也有着重要的理论和应用价值,近年来被应用于抗体修饰、材料合成和活体标记等多个领域。
早期的生物正交反应主要是连接反应，用于将荧光染料等功能小分子以共价键的形式高效特异地连接到活体内的生物大分子上。近年来，研究工作者逐渐开始关注和发展生物正交“剪切反应”，利用氨基酸侧链上化学键的选择性断裂，实现活体内蛋白质的特异激活。到目前为止，前体药物或蛋白质已有的激活方法存在激活速率慢，效率低的问题。因此，无法用于生命体系内功能分子的高效激活，极大限制了这些方法在实际疾病精准治疗等方面的应用前景。
发明内容
本发明的目的是通过以下技术方案实现的，一种非对称的1，2，4，5-四嗪分子在基于逆电子狄尔斯-阿尔德反应的生物正交领域进行前体药物快速激活的应用，所述前体药物的结构通式为：
其中，X＝NH或O。
进一步，所述药物为阿霉素。
进一步，所述非对称的1，2，4，5-四嗪分子为3-(4-氟)苯基-6-(2-羟基)乙基-1,2,4,5-四嗪分子，3-(2-吡啶)-6-(2-羟基)乙基-1,2,4,5-四嗪分子，3-(2-嘧啶)-6-(2-羟基)乙基-1,2,4,5-四嗪分子，
或3-(2-嘧啶)-6-甲基-1,2,4,5-四嗪分子。
进一步，所述非对称的1，2，4，5-四嗪分子的制备方法，首先将氰基底物1,氰基底物2,水合肼,三氟甲磺酸锌混合于圆底烧瓶中，并用磁力搅拌器搅拌，反应条件为真空氮气保护，反应在55～65℃进行20～24小时；随后冷却至室温，在冰水浴条件下缓慢滴加亚硝酸钠溶液至反应体系中，用盐酸水溶液调节pH为2.8～3.2，然后用二氯甲烷萃取2～3次，合并有机相，再用无水硫酸钠干燥后以旋转蒸发仪除去有机溶剂，最后以柱层析分离方法进行分离纯化得到非对称的1，2，4，5-四嗪分子。
进一步，所述氰基底物1为4-氟基苯甲腈、2-氰基吡啶或2-氰基嘧啶；所述氰基底物2为3-羟基丙腈或乙腈。
本发明进一步的目的是通过以下技术方案实现的，一种非对称的1，2，4，5-四嗪分子在基于逆电子狄尔斯-阿尔德反应的生物正交领域进行蛋白质快速激活的应用，所述蛋白质的结构通式为：
其中，X＝NH或O。
进一步，所述蛋白质为以赖氨酸、酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸为活性残基的蛋白质。
进一步，所述非对称的1，2，4，5-四嗪分子为3-(4-氟)苯基-6-(2-羟基)乙基-1,2,4,5-四嗪分子，3-(2-吡啶)-6-(2-羟基)乙基-1,2,4,5-四嗪分子，3-(2-嘧啶)-6-(2-羟基)乙基-1,2,4,5-四嗪分子，或3-(2-嘧啶)-6-甲基-1,2,4,5-四嗪分子。
进一步，所述非对称的1，2，4，5-四嗪分子的制备方法，首先将氰基底物1,氰基底物2,水合肼,三氟甲磺酸锌混合于圆底烧瓶中，并用磁力搅拌器搅拌，反应条件为真空氮气保护，反应在55～65℃进行20～24小时；随后冷却至室温，在冰水浴条件下缓慢滴加亚硝酸钠溶液至反应体系中，用盐酸水溶液调节pH为2.8～3.2，然后用二氯甲烷萃取2～3次，合并有机相，再用无水硫酸钠干燥后以旋转蒸发仪除去有机溶剂，最后以柱层析分离方法进行分离纯化得到非对称的1，2，4，5-四嗪分子。
进一步，所述氰基底物1为4-氟基苯甲腈、2-氰基吡啶或2-氰基嘧啶；所述氰基底物2为3-羟基丙腈或乙腈进一步，所述蛋白质为以赖氨酸、酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸为活性残基的蛋白质。
进一步，所述非对称四嗪激活剂为3-(4-氟)苯基-6-(2-羟基)乙基-1,2,4,5-四嗪分子，3-(2-吡啶)-6-(2-羟基)乙基-1,2,4,5-四嗪分子，3-(2-嘧啶)-6-(2-羟基)乙基-1,2,4,5-四嗪分子，或3-(2-嘧啶)-6-甲基-1,2,4,5-四嗪分子。
进一步，所述非对称的1，2，4，5-四嗪分子的制备方法，首先将氰基底物1,氰基底物2,水合肼,三氟甲磺酸锌混合于圆底烧瓶中，并用磁力搅拌器搅拌，反应条件为真空氮气保护，反应在55～65℃进行20～24小时；随后冷却至室温，在冰水浴条件下缓慢滴加亚硝酸钠溶液至反应体系中，用盐酸水溶液调节pH为2.8～3.2，然后用二氯甲烷萃取2～3次，合并有机相，再用无水硫酸钠干燥后以旋转蒸发仪除去有机溶剂，最后以柱层析分离方法进行分离纯化得到非对称的1，2，4，5-四嗪分子。
进一步，所述氰基底物1为4-氟基苯甲腈、2-氰基吡啶或2-氰基嘧啶；所述氰基底物2为3-羟基丙腈或乙腈。
本发明利用在逆电子需求的Diels-Alder剪切反应中活性最高的一类非对称1，2，4，5-四嗪分子，结构式如下：通过3位吸电子基团(EWG)促进第一步iDA加成反应生成加成中间体，同时6位相对电中性的烷基或烷氧基基团促进第二步的脱除，从而3位和6位的取代基协同作用，显著提高了非对称1，2，4，5-四嗪分子整体在活体内的剪切反应速率。
本发明的优点在于：相对于对称的四嗪分子，非对称的1，2，4，5-四嗪激活剂具有极高的激活效率，而且本身和生物正交反应过程均不会对细胞产生毒性，尤其是快速激活体外或体内以氨基或羟基为活性位点的前药药物分子以及以赖氨酸、酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸为活性残基的蛋白质，从而可用于生命过程研究、疾病精准治疗等方面，具有极为广阔的应用前景。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：
图1为液相色谱-质谱联用测试反式环辛烯保护的阿霉素前药分子激活的试验结果。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
一、前体药物的激活
以阿霉素为例的前药的激活，反应式如下：
实施例1
1、3-(2-嘧啶)-6-甲基-1,2,4,5-四嗪分子的制备
将1.0mmol氰基底物2-氰基嘧啶,10.0mmol氰基底物乙腈,25mmol水合肼,0.5mmol三氟甲磺酸锌混合于圆底烧瓶中并用磁力搅拌器搅拌，反应条件为真空氮气保护，反应在60℃进行24小时，随后冷却至室温，在冰水浴条件下缓慢滴加浓度为1M亚硝酸钠溶液至反应体系中，用浓度为1M盐酸水溶液调节pH到3，然后用20mL二氯甲烷萃取三次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥后以旋转蒸发仪除去有机溶剂，最后以柱层析分离方法进行分离纯化得到红色固体3-(2-嘧啶)-6-甲基-1,2,4,5-四嗪分子，产率40％。表征数据：1H NMR(CDCl3,400MHz)δ9.14(d,J＝4.9Hz,2H,Ar-H),7.61(t,J＝4.9Hz,1H,Ar-H),3.23(s,3H,CCH3)ppm；13C{1H}NMR(CDCl3,100MHz)δ168.80(TZ-C),163.33(TZ-C),159.60(Ar-C),158.51(x2,Ar-C),122.65(Ar-C),21.60(CH3)ppm；HRMS(iDA adduct with 4-(OH)TCO)m/z 273.171268[(M+H)+；calcd for C15H21N4O:273.170988]。
2、阿霉素前药分子的激活
在反应玻璃瓶中加入反式环辛烯保护的阿霉素前药分子(终浓度：0.2mM)和3-(2-嘧啶)-6-甲基-1,2,4,5-四嗪分子(终浓度：1mM)，总体积保持100微升。在37℃孵育30min后，采用液相色谱-质谱联用(LC-MS)分别测试同浓度条件下反式环辛烯保护的阿霉素前药分子以及加入四嗪分子激活后产物在LC-MS上的出峰时间，与标准产物阿霉素进行对比，测试结果如图1所示。
由图1可知，反式环辛烯保护的阿霉素前药能够在5min内被3-(2-嘧啶)-6-甲基-1,2,4,5-四嗪分子完全激活生成阿霉素。
二、蛋白质的激活
将目标蛋白上关键位点用反式环辛烯进行保护后，目标蛋白会失去活性，在实施例中，采用了遗传密码子扩展技术来产生失活的蛋白，但引入反式环辛烯的方法包括但不仅限于该技术；然后通过外加四嗪分子对目的蛋白质的激活，(四嗪触发的蛋白质的激活可在体外或者体内进行)，实现时间和空间上对蛋白质功能的调控，反应式如下：
实施例2：荧光素酶fLuc的体外激活
fLuc是一种萤火虫萤光素酶，能将萤光素转化为氧化萤光素，同时发出荧光。首先在fLuc的529位***反式环辛烯保护的赖氨酸(TCOK)得到蛋白fLuc-K529TCOK使fLuc失活，然后在细胞表达fLuc-K529TCOK蛋白之后，将细胞破碎并纯化得到纯的fLuc-K529TCOK蛋白质，接着在该蛋白的溶液中加入50μM的3-(2-嘧啶)-6-甲基-1,2,4,5-四嗪分子(制备方法与实施例1相同)，使fLuc-K529TCOK脱保护，激活后的fLuc催化萤光素转化为氧化萤光素，同时产生荧光，而且可在4min内将fLuc-K529TCOK蛋白激活为野生型蛋白fLuc，激活效率可达90％以上。
实施例3：荧光素酶fLuc的激活
首先在fLuc的529位***反式环辛烯保护的赖氨酸(TCOK)得到蛋白fLuc-K529TCOK能够使fLuc失活，fLuc的活性被完全抑制，加入活的HEK293T细胞中，然后加入50uM的3-(2-嘧啶)-6-甲基-1,2,4,5-四嗪分子(制备方法与实施例1相同)使fLuc-K529TCOK脱保护，激活后的fLuc催化萤光素转化为氧化萤光素，同时产生荧光，而且可在4min内完全激活fLuc-K529TCOK，激活效率可达95％以上。
实施例4
1、3-(4-氟)苯基-6-(2-羟基)乙基-1,2,4,5-四嗪分子的制备
将1.0mmol氰基底物4-氟基苯甲腈,10.0mmol氰基底物3-羟基丙腈,25mmol水合肼,0.5mmol三氟甲磺酸锌混合于圆底烧瓶中并用磁力搅拌器搅拌，反应条件为真空氮气保护，反应在60℃进行24小时，随后冷却至室温，在冰水浴条件下缓慢滴加浓度为1M亚硝酸钠溶液至反应体系中，用浓度为1M盐酸水溶液调节pH到3，然后用20mL二氯甲烷萃取三次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥后以旋转蒸发仪除去有机溶剂，最后以柱层析分离方法进行分离纯化得到红色固体3-(4-氟)苯基-6-(2-羟基)乙基-1,2,4,5-四嗪分子，产率31％。表征数据：1H NMR(CDCl3,400MHz)δ8.79-8.41(m,2H,Ar-H),7.30(d,J＝8.5Hz,2H,Ar-H),4.31(t,J＝5.6Hz,2H,CH2CH2OH),3.63(t,J＝5.6Hz,2H,CH2CH2OH),2.39(s,1H,CH2CH2OH)ppm；13C{1H}NMR(CDCl3,100MHz)δ168.39(TZ-C),167.27(TZ-C),164.33(d,J＝82.3Hz,Ar-CF),130.49(d,J＝9.1Hz,2C,Ar-C),127.95(d,J＝3.1Hz,Ar-C),116.74(d,J＝22.1Hz,2C,Ar-C),60.20(CH2CH2OH),37.62(CH2CH2OH)ppm；19F{1H}NMR(CDCl3,376MHz)δ-106.06(s)ppm；HRMS(iDA adduct with 4-(OH)TCO)m/z 319.181866[(M+H)+；calcd forC18H24FN2O2:319.181633]。
2、苏氨酸裂解酶OspF的激活
OspF是一种病原菌分泌的苏氨酸裂解酶，能通过β消除反应使胞外信号调节激酶(MAPK)去磷酸化。首先在OspF的134位***反式环辛烯保护的赖氨酸(TCOK)得到蛋白OspF-K134TCOK能够使OspF失活，加入活的HEK293T细胞中，然后加入50uM的3-(2-嘧啶)-6-甲基-1,2,4,5-四嗪分子使OspF-K134TCOK脱保护，激活后的OspF催化185位磷酸化的Erk蛋白去磷酸化，而且可在4min内完全激活OspF-K134TCOK，激活效率可达85％以上。
实施例5
1、3-(2-吡啶)-6-(2-羟基)乙基-1,2,4,5-四嗪分子的制备
将1.0mmol氰基底物2-氰基吡啶,10.0mmol氰基底物3-羟基丙腈,25mmol水合肼,0.5mmol三氟甲磺酸锌混合于圆底烧瓶中并用磁力搅拌器搅拌，反应条件为真空氮气保护，反应在60℃进行24小时，随后冷却至室温，在冰水浴条件下缓慢滴加浓度为1M亚硝酸钠溶液至反应体系中，用浓度为1M盐酸水溶液调节pH到3，然后用20mL二氯甲烷萃取三次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥后以旋转蒸发仪除去有机溶剂，最后以柱层析分离方法进行分离纯化得到红色固体3-(2-吡啶)-6-(2-羟基)乙基-1,2,4,5-四嗪分子的制备，产率48％。表征数据：1H NMR(CDCl3,400MHz)δ8.93(d,J＝4.6Hz,1H,Ar-H),8.60(t,J＝18.1Hz,1H,Ar-H),7.98(td,J＝7.8,1.2Hz,1H,Ar-H),7.56(dd,J＝7.5,4.8Hz,1H,Ar-H),4.32(t,J＝5.8Hz,2H,CH2CH2OH),3.68(t,J＝5.8Hz,2H,CH2CH2OH),2.55(s,1H,CH2CH2OH)ppm；13C{1H}NMR(CDCl3,100MHz)δ169.31(TZ-C),164.04(TZ-C),151.03(Ar-C),150.19(Ar-C),137.67(Ar-C),126.63(Ar-C),124.12(Ar-C),60.17(CH2CH2OH),37.83(CH2CH2OH)ppm；HRMS(iDA adduct with 4-(OH)TCO)m/z 302.187617[(M+H)+；calcd for C17H24N3O2:302.186303]。
2、炭疽致死因子LF的激活
LF(Lethal Factor)是一种细菌毒素，能够发挥蛋白酶活性对体内胞外信号调节激酶MEKs进行切割。首先将LF蛋白673位的赖氨酸替换为反式环辛烯保护的赖氨酸(TCOK)从而产生LF-K673TCOK蛋白，该蛋白失去活性不能对MEKs进行正常切割，加入活的HEK293T细胞中，然后加入50uM的3-(2-嘧啶)-6-甲基-1,2,4,5-四嗪分子使LF-K673TCOK脱保护，激活后的LF能够对MEKs进行正常切割，而且可在4min内激活LF-K673TCOK，产生野生型LF，从而恢复对MEKs的切割活性，激活效率可达85％以上。
实施例6
1、3-(2-嘧啶)-6-(2-羟基)乙基-1,2,4,5-四嗪分子的制备
将1.0mmol氰基底物2-氰基嘧啶,10.0mmol氰基底物3-羟基丙腈,25mmol水合肼,0.5mmol三氟甲磺酸锌混合于圆底烧瓶中并用磁力搅拌器搅拌，反应条件为真空氮气保护，反应在60℃进行24小时，随后冷却至室温，在冰水浴条件下缓慢滴加浓度为1M亚硝酸钠溶液至反应体系中，用浓度为1M盐酸水溶液调节pH到3，然后用20mL二氯甲烷萃取三次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥后以旋转蒸发仪除去有机溶剂，最后以柱层析分离方法进行分离纯化得到红色固体3-(2-嘧啶)-6-(2-羟基)乙基-1,2,4,5-四嗪分子，产率48％。表征数据：1H NMR(CDCl3,400MHz)δ9.14(d,J＝4.9Hz,2H,Ar-H),7.61(t,J＝4.9Hz,1H,Ar-H),4.36(t,J＝5.8Hz,2H,CH2CH2OH),3.76(t,J＝5.7Hz,2H,CH2CH2OH)ppm；13C{1H}NMR(CDCl3,100MHz)δ169.89(TZ-C),163.68(TZ-C),159.50(Ar-C),158.61(x2,Ar-C),122.82(Ar-C),60.11(CH2CH2OH),37.93(CH2CH2OH)ppm；HRMS(iDA adduct with 4-(OH)TCO)m/z303.181557[(M+H)+；calcd for C16H23N4O2:303.181552]。
2、激酶MEK的激活
MEK1激酶是MEK的一种，属于胞外信号调节激酶(MAPK)通路中的关键激酶，能够使下游的ERK激酶磷酸化。首先在MEK1的97位***反式环辛烯保护的赖氨酸(TCOK)产生MEK1-K97TCOK，该蛋白失去活性不能对ERK进行磷酸化，加入活的HEK293T细胞中，然后加入50uM的3-(2-嘧啶)-6-甲基-1,2,4,5-四嗪分子(制备方法与实施例1相同)可在4min内使MEK1-K97TCOK脱保护生成野生型MEK1，激活后的MEK1能够恢复活性使ERK激酶磷酸化，恢复对ERK的切割活性，激活效率可达85％以上。
实施例7：激酶FAK的激活
FAK是一种与细胞黏附伸展相关的黏着斑激酶，属于非受体蛋白酪氨酸激酶，发挥激酶活性时能够促进自磷酸化和Src激酶磷酸化。首先在FAK的454位***反式环辛烯保护的赖氨酸(TCOK)产生FAK-K454TCOK，FAK-K454TCOK没有活性而不能对Src进行激活，加入活的HEK293T细胞中，然后加入50uM的3-(2-嘧啶)-6-甲基-1,2,4,5-四嗪分子(制备方法与实施例1相同)可在4min内使FAK-K454TCOK激活产生野生型FAK，从而恢复对Src的磷酸化活性，激活效率可达85％以上。
实施例8：激酶Src的激活
Src属于非受体蛋白酪氨酸激酶，发挥激酶活性时能够实现自磷酸化和下游底物磷酸化。首先在Src的295位***反式环辛烯保护的赖氨酸(TCOK)产生失去活性的Src-K295TCOK蛋白，加入活的HEK293T细胞中，然后加入50uM的3-(2-嘧啶)-6-甲基-1,2,4,5-四嗪分子(制备方法与实施例1相同)可以在4min内使Src脱保护，激活Src-K295TCOK，产生野生型Src，恢复对Src自身以及下游底物的的磷酸化活性，激活效率可达85％以上。
实施例9：基因编辑蛋白Cas9的激活
Cas9是CRISPR/Cas9基因编辑***中的蛋白，在发挥基因编辑功能时，Cas9结合gRNA，通过gRNA上的靶点序列在目标基因组上找到靶点序列，并解开双螺旋，Cas9将剪切DNA双链，造成DNA双链断裂。首先在Cas9的866位***反式环辛烯保护的赖氨酸(TCOK)产生没有活性的Cas9-K866TCOK，加入活的HEK293T细胞中，然后加入50uM的3-(2-嘧啶)-6-甲基-1,2,4,5-四嗪分子(制备方法与实施例1相同)可在4min内激活Cas9-K866TCOK，使Cas9脱保护，产生野生型Cas9，激活后的Cas9能够恢复活性对目的基因进行编辑，激活效率可达80％以上。
对比例1
1、3-(2-吡啶)-6-甲基-1,2,4,5-四嗪分子的制备
与实施例1制备方法中区别仅在于氰基底物1为2-氰基吡啶，氰基底物2为乙腈，按照实施例1制备步骤得到红色固体3-(2-吡啶)-6-甲基-1,2,4,5-四嗪分子，产率40％。表征数据：1H NMR(CDCl3,400MHz)δ8.96(d,J＝4.5Hz,1H,Ar-H),8.65(d,J＝7.9Hz,1H,Ar-H),7.99(td,J＝7.8,1.3Hz,1H,Ar-H),7.57(dd,J＝7.4,4.9Hz,1H,Ar-H),3.17(s,3H,CCH3)ppm；13C{1H}NMR(CDCl3,100MHz)δ168.24(TZ-C),163.69(TZ-C),150.96(Ar-C),150.36(Ar-C),137.57(Ar-C),126.45(Ar-C),123.98(Ar-C),21.46(CH3)ppm；HRMS(iDA adductwith 4-(OH)TCO)m/z 272.175796[(M+H)+；calcd for C16H22N3O:272.175739]。
2、基因编辑蛋白Cas9的激活
首先在Cas9的866位***反式环辛烯保护的赖氨酸(TCOK)产生没有活性的Cas9-K866TCOK，加入活的HEK293T细胞中，然后加入50uM的3-(2-吡啶)-6-甲基-1,2,4,5-四嗪分子，在15min内激活Cas9-K866TCOK，使Cas9脱保护，产生野生型Cas9，激活后的Cas9能够恢复活性对目的基因进行编辑，激活效率仅为33％。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种非对称的1，2，4，5-四嗪分子在基于逆电子狄尔斯-阿尔德反应的生物正交领域进行前体药物快速激活的应用，其特征在于，所述前体药物结构通式为：
其中，X＝NH或O。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为阿霉素。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述非对称的1，2，4，5-四嗪分子为
3-(4-氟)苯基-6-(2-羟基)乙基-1,2,4,5-四嗪分子，
3-(2-吡啶)-6-(2-羟基)乙基-1,2,4,5-四嗪分子，
3-(2-嘧啶)-6-(2-羟基)乙基-1,2,4,5-四嗪分子，
或3-(2-嘧啶)-6-甲基-1,2,4,5-四嗪分子。
4.根据权利要求1或3所述的应用，其特征在于，所述非对称的1，2，4，5-四嗪分子的制备方法，首先将氰基底物1,氰基底物2,水合肼,三氟甲磺酸锌混合于圆底烧瓶中，并用磁力搅拌器搅拌，反应条件为真空氮气保护，反应在55～65℃进行20～24小时；随后冷却至室温，在冰水浴条件下缓慢滴加亚硝酸钠溶液至反应体系中，用盐酸水溶液调节pH为2.8～3.2，然后用二氯甲烷萃取2～3次，合并有机相，再用无水硫酸钠干燥后以旋转蒸发仪除去有机溶剂，最后以柱层析分离方法进行分离纯化得到非对称的1，2，4，5-四嗪分子。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述氰基底物1为4-氟基苯甲腈、2-氰基吡啶或2-氰基嘧啶；所述氰基底物2为3-羟基丙腈或乙腈。
6.一种非对称的1，2，4，5-四嗪分子在基于逆电子狄尔斯-阿尔德反应的生物正交领域进行蛋白质快速激活的应用，其特征在于，所述蛋白质结构通式为：
其中，X＝NH或O。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述蛋白质为以赖氨酸、酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸为活性残基的蛋白质。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述非对称的1，2，4，5-四嗪分子为
3-(4-氟)苯基-6-(2-羟基)乙基-1,2,4,5-四嗪分子，
3-(2-吡啶)-6-(2-羟基)乙基-1,2,4,5-四嗪分子，
3-(2-嘧啶)-6-(2-羟基)乙基-1,2,4,5-四嗪分子，
或3-(2-嘧啶)-6-甲基-1,2,4,5-四嗪分子。
9.根据权利要求6或8所述的应用，其特征在于，所述非对称的1，2，4，5-四嗪分子的制备方法，首先将氰基底物1,氰基底物2,水合肼,三氟甲磺酸锌混合于圆底烧瓶中，并用磁力搅拌器搅拌，反应条件为真空氮气保护，反应在55～65℃进行20～24小时；随后冷却至室温，在冰水浴条件下缓慢滴加亚硝酸钠溶液至反应体系中，用盐酸水溶液调节pH为2.8～3.2，然后用二氯甲烷萃取2～3次，合并有机相，再用无水硫酸钠干燥后以旋转蒸发仪除去有机溶剂，最后以柱层析分离方法进行分离纯化得到非对称的1，2，4，5-四嗪分子。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述氰基底物1为4-氟基苯甲腈、2-氰基吡啶或2-氰基嘧啶；所述氰基底物2为3-羟基丙腈或乙腈。
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