CN113171467B - 一种基于nqo1调控的嵌合体分子及其应用 - Google Patents

一种基于nqo1调控的嵌合体分子及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于NQO1调控的嵌合体分子及其应用，该嵌合体分子由目标蛋白的配体、连接基团、E3连接酶的配体以及NQO1直接或间接调控的基团连接而成的化合物。本发明通过连入NQO1直接或间接调控的基团，组成了新型的PROTAC分子，其在NQO1表达水平较低的细胞中，无法降解靶蛋白；而在NQO1过表达时恢复降解蛋白的活性。因此，该嵌合体分子可以选择性地在NQO1表达较多的肿瘤细胞中高效地降解蛋白，降低对正常细胞的毒副作用，具有潜在的临床应用前景。

Description

一种基于NQO1调控的嵌合体分子及其应用
技术领域
本发明涉及生物化学技术领域，具体涉及一种基于NQO1调控的蛋白质降解靶向嵌合体分子及其应用。
背景技术
许多疾病的发生发展与蛋白质异常表达密切相关，如癌症、神经退行性疾病等。所以实现疾病细胞中过表达蛋白的降解而不是直接抑制蛋白质活性是一种新的疾病治疗策略。近年来，由Craig M.Crew等人发展的蛋白降解靶向嵌合体(PROTAC)技术已成为一个新的蛋白质降解的技术。PROTAC是一种具有双功能的杂合小分子，通过合适柔性链将靶蛋白配体和E3泛素连接酶配体连接，促使靶蛋白与E3泛素连接酶形成三元复合物，从而使靶蛋白接近泛素化***，实现靶蛋白的泛素化，最终导致靶蛋白被蛋白酶体降解。
不同于传统的小分子药物占据活性位点的模式，PROTAC可以通过降解整个蛋白来清除激酶的酶活及非酶活功能，所以PROTAC在克服耐药性及“不可成药”靶点方面具有巨大潜力。此外，PROTAC降解蛋白具有催化性，在引发靶蛋白泛素化后，即可从复合物中解离，并进入下一轮的催化循环，因此，PROTAC可以在非常低的计量下发挥作用。这种技术已经用于多种类型的蛋白降解，包括BRD4蛋白、CDK9蛋白以及EGFR蛋白等。
但是，PROTAC的催化特性导致蛋白不受控制的降解，从而引起全身的毒性问题，限制了PROTAC在临床中的应用。为了使得PROTAC能够特异性地在病变细胞中降解蛋白进而降低毒性，近期，通过光调控PROTAC分子降解蛋白的能力的文章相继被报道，用于精准的调控蛋白的降解。但是由于光穿透组织的能力有限，无法在生物体中得到真正的应用。因此，发展更为合适的精准调控蛋白降解的方法是有必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于NQO1调控的蛋白质降解靶向嵌合体分子及其应用。该嵌合体分子能够通过不同细胞中NQO1含量的差异实现细胞选择性的靶蛋白降解，从而在肿瘤细胞中高效地降解蛋白，并且减少对正常细胞的毒副作用。
为此，本发明的第一方面提供了一种可响应NQO1的化合物，其为式I所示的化合物或其立体异构体、几何异构体、互变异构体、氮氧化物、水合物、溶剂化物、药学上可接受的盐：
X-L-Y-Z
式I：
其中，X为目标蛋白的配体，Y为E3连接酶的配体，L为连接X和Y的链，所述化合物响应NQO1的方式是以Z被取代为H的方式。
所述响应NQO1包括直接响应或间接响应；直接响应是指所述化合物与NQO1发生反应，从而使Z被取代为H；间接响应是指所述化合物与NQO1催化反应的产物(如ROS、氢醌)发生反应，从而使Z被取代为H。即，Z为当所述化合物响应NQO1时Z本身被取代为H的基团。
进一步，所述化合物中，Z的结构式为
Figure BDA0002967777060000021
或者，Z具有以下官能团：
Figure BDA0002967777060000022
进一步，所述化合物中，Y的结构式为：
Figure BDA0002967777060000031
Figure BDA0002967777060000032
其中，-NH-与L相连，Ph-与L相连，-O-与Z相连。
进一步，所述化合物的结构式为：
Figure BDA0002967777060000033
其中，X为目标蛋白的配体，L为链，所述化合物响应NQO1的方式是以Z被取代为H的方式。
进一步，所述化合物中，X为特异识别抗癌药物靶点蛋白的配体，例如BRD4蛋白、BTK蛋白、FKBP12蛋白或CDK9蛋白。在优选的实施方式中，X为特异性识别BRD4蛋白的配体，例如JQ1或JQ2；或X为特异性识别CDK9蛋白的配体，例如CDK9-IN-11或CDK9-IN-10；或X为特异性识别BTK蛋白的配体；或X为特异性识别FKBP12蛋白的配体。
进一步，所述化合物中，L为PEG类链或烷基类链。
进一步，L选自以下结构式中的一种，其中，m，n，k各自独立地选自0-10的整数：
表1
Figure BDA0002967777060000041
优选地，其中，-CO-与Y相连接。
在具体的实施方式中，所述化合物选自以下结构式中的一种：
Figure BDA0002967777060000051
在优选的实施方式中，所述化合物选自以下结构式中的一种：
Figure BDA0002967777060000052
Figure BDA0002967777060000061
本发明的第二方面提供了所述化合物的制备方法，包括式i化合物经取代反应生成式I化合物；
其中式i化合物的结构式为：
X-L-Y
式i；
式I化合物的结构式为：
X-L-Y-Z
式I；
其中，X为目标蛋白的配体，Y为E3连接酶的配体，L为连接X和Y的链，Z为当所述化合物响应NQO1时Z本身被取代为H的基团。
进一步，当所述化合物为式I-a时，所述制备方法包括式i-a化合物经取代反应生成式I-a化合物；
其中式i-a化合物的结构式为：
Figure BDA0002967777060000062
式I-a化合物的结构式为：
Figure BDA0002967777060000071
其中，X为目标蛋白的配体，L为链，Z为当所述化合物响应NQO1时Z本身被取代为H的基团。
进一步，所述制备方法为在DIPEA和DMAP条件下进行反应；优选地，所述制备方法的反应温度为0℃。
本发明第三方面，提供所述化合物用于制备以下药物的用途。
(1)靶向肿瘤细胞的药物；
(2)***疾病的药物。
进一步，所述肿瘤包括头颈部肿瘤、眼部肿瘤、皮肤癌、嘴部肿瘤、喉部肿瘤、食道癌、胸部肿瘤、骨癌、肺癌、结肠癌、乙状结肠癌、直肠癌、胃癌、***癌、乳腺癌、卵巢肿瘤、肾癌、肝癌、胰腺癌、脑癌、肠癌、心脏肿瘤、肾上腺癌、***。
本发明基于癌症细胞中NQO1表达上调的事实，提出了通过细胞内源性的NQO1酶调控PROTAC分子活性的策略，设计了由E3连接酶配体、NQO1直接或间接调控的基团和目标蛋白质配体组成的新型光控PROTAC分子。该类在PROTAC分子在NQO1表达水平较低时，PROTAC分子没有活性，无法降解蛋白；在NQO1过表达时会引起NQO1直接或间接调控的基团断裂使得PROTAC分子恢复降解蛋白的活性。该策略可以实现在NQO1表达较多的肿瘤细胞中高效地降解蛋白，而在NQO1表达较少的正常细胞中不降解蛋白或者降解蛋白的能力较低，从而降低PROTAC分子在正常细胞中的毒性，实现细胞选择性的蛋白降解。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明提供的化合物克服了PROTAC分子的不可控性(脱靶问题)，避免了PROTAC分子对正常细胞的降解、降低了其生理毒性。
(2)与现有的通过紫外光或可见光对PROTAC分子进行调控的方法相比，本发明提供的化合物选择性地对癌细胞中过表达的NQO1进行响应，从而实现靶向降解，避免了因紫外光或可见光难以有效穿透组织而无法实现深层降解的缺点。
(3)本发明提供的化合物可在NQO1表达过高的癌细胞中恢复降解蛋白的活性，在表达量低的正常细胞中无降解蛋白活性，通过在不同细胞中NQO1含量的差异实现细胞选择性的靶蛋白降解，这是基于癌细胞本身具有的代谢特征实现的，因此具有良好的靶向性，极具临床应用前景。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：
图1为本发明提供的化合物直接响应NQO1进而降解目标蛋白的原理示意图；
图2为本发明提供的化合物响应NQO1的产物ROS进而降解目标蛋白的原理示意图；
图3为室温下NQO1-PROTAC1溶解在CDCl3中的氢谱图；
图4为NQO1-PROTAC1以及NQO1-PROTAC1经NQO1催化后产物的质谱图对比图；其中，左图为NQO1-PROTAC1的质谱图，右图为NQO1-PROTAC1经NQO1催化后产物的质谱图；
图5为NQO1-PROTAC1分别孵育293T-HaloGFP和HeLa-HaloGFP细胞后的荧光强度检测结果；
图6为室温下ROS-PROTAC1溶解在CDOD3中的氢谱图；
图7为ROS-PROTAC1以及ROS-PROTAC1和ROS反应后产物的质谱图对比图；其中，左图为ROS-PROTAC1的质谱图，右图为ROS-PROTAC1和ROS反应后产物的质谱图；
图8为β-lap对ROSHaloVHL在293T-HaloGFP细胞(a)和HeLa-HaloGFP细胞(b)中的活性的影响；
图9为ROS-PROTAC2以及ROS-PROTAC2和ROS反应后产物的质谱图对比图；其中，左图为ROS-PROTAC2的质谱图，右图为ROS-PROTAC2和ROS反应后产物的质谱图；
图10为ROS-PROTAC2对靶蛋白BRD4降解情况的结果图；其中，(a)为HeLa细胞；(c)为293T细胞；(b)为在HeLa细胞中加入β-lap后ROS-PROTAC2可以降解靶蛋白BRD4；(d)为在293T细胞中加入β-lap后ROS-PROTAC2无法降解靶蛋白BRD4。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
实施例1合成NQO1-PROTAC1
Figure BDA0002967777060000091
将PROTAC1即式a化合物(1eq,74mg)溶解于无水DCM，置于冰浴中，加入DIPEA(10eq,173μL)和DMAP(5eq,61mg)搅拌5min.。当反应体系温度冷却至0℃时，将溶解有式b化合物(1.2eq,52mg)的DCM溶液缓慢滴加到反应体系中，移除冰浴，反应过夜。反应完成后，用DCM和水萃取，有机相用MgSO4干燥。旋干后，用柱层析得到产物式I-1-1化合物，将其命名为NQO1-PROTAC1，淋洗液为DCM/MeOH(20/1)。
1H-NMR(CD3OD,400MHz)δ1.05(s,9H),1.28(s,6H),1.54(m,2H),1.73(m,2H),1.94(m,6H),2.07(s,3H),2.47(s,3H),2.81(s,3H),3,12(s,2H),3.43(t,2H),1.05(s,9H),3.52(m,6H),3.68(m,9H),3.04(d,2H),4.37(m,2H),4.60(m,3H),5.22(s,2H),7.29(d,2H),7.45(m,7H),8.90(s,1H).HR-ESI-MS m/z calculated for C59H80ClN5O13S[M+Na+]1021.45,found 1021.45
实施例2 NQO1催化NQO1-PROTAC1为PROTAC1
Figure BDA0002967777060000101
将实施例1合成的NQO1-PROTAC1即式I-1-1化合物(0.2mM)置于含有NQO1(20ng/mL)和NADH(0.5mM)的缓冲溶液中。缓慢震荡4h，用3KD的超滤离心管对混合体系高速离心分离，除去分子量较大的NQO1。然后将该体系用DCM和去离子水萃取，有机相用MgSO4干燥，旋干后通过质谱检测NQO1-PROTAC1分子的分子量变化，并且与PROTAC1即式a化合物进行对比。对比结果见图4所示。
实施例3 NQO1-PROTAC1可选择性降解癌细胞中的HaloGFP
基于癌细胞中NQO1的表达水平远高于正常细胞的现象，假设NQO1-PROTAC1能够选择性的高效降解癌细胞中的HaloGFP(Buckley D L,Raina K,Darricarrere N,etal.HaloPROTACS:Use of Small Molecule PROTACs to Induce Degradation of HaloTagFusion Proteins[J].ACS Chem Biol,2015,10(8):1831-7.)，而对正常细胞中的HaloGFP降解效率较低。本实施例选择了293T-HaloGFP细胞和HeLa-HaloGFP细胞两种NQO1含量不同的细胞系对NQO1-PROTAC1的功能进行验证。具体包括以下步骤：
用1μM，5μM和7.5μM的NQO1-PROTAC1分别孵育293T-HaloGFP和HeLa-HaloGFP细胞。16h后，通过流式细胞仪检测两种类型细胞的荧光强度。实验结果如图5所示，当NQO1-PROTAC1的浓度为5μM时，293T-HaloGFP细胞中的荧光强度为70％左右，而HeLa-HaloGFP细胞中的荧光强度为45％左右，两种细胞系的荧光强度相差25％，在一定程度上实现了蛋白质降解的细胞选择性。
实施例4合成ROS-PROTAC1
Figure BDA0002967777060000111
将PROTAC1即式a化合物(1eq,74mg)溶解于无水DCM，置于冰浴中，加入DIPEA(10eq,173μL)和DMAP(5eq,61mg)搅拌5min.。当反应体系温度冷却至0℃时，将溶解有式b化合物(1.1eq,33mg)的DCM溶液缓慢滴加到反应体系中，移除冰浴，反应过夜。反应完成后，用DCM和水萃取，有机相用MgSO4干燥。旋干后，用柱层析得到产物式I-2-1化合物，将其命名为ROS-PROTAC1，淋洗液为DCM/MeOH(40/1)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ0.91(s,9H),1.34(s,12H),1.58(m,8H),1.76(m,2H),2.52(s,3H),2.80(s,3H),3.43(m,3H),3,52-3.65(m,12H),3.97(m,2H),4.23(m,2H),4.52(m,2H),5.16(dd,2H),7.35(m,7H),7.81(d,2H),8.68(s,1H).HR-ESI-MS m/z calculated forC50H72BClN4O12S[M+H]+1156.51,found 1156.50.
实施例5 ROS-PROTAC1能够在ROS存在下转换为PROTAC1
Figure BDA0002967777060000112
将ROS-PROTAC1(1mM)与H2O2(2mM)溶于甲醇中。4h后，通过质谱检测ROS-PROTAC1的分子量变化，并且与PROTAC1分子进行对比。在相同条件下通过HPLC检测ROS-PROTAC1与H2O2的反应速率。检测结果见图7所示。
实施例6 ROS-PROTAC1可选择性降解癌细胞中的HaloGFP
假设引入NQO1催化β-lap生成ROS的级联反应后，ROS经过级联扩增之后癌细胞产生的ROS远远高于正常细胞产生ROS，使得ROS-PROTAC1分子在癌细胞中实现靶蛋白的高效降解而在正常细胞中蛋白的降解效率较低。
为了验证该猜想，本实施例用不同浓度的ROS-PROTAC1分子和1μMβ-lap共同孵育293T-HaloGFP细胞和HeLa-HaloGFP细胞系，并用只孵育相同浓度ROS-PROTAC1分子的细胞做对照。24h后通过流式细胞仪检测两种细胞系的荧光变化。实验结果如图8所示，孵育β-lap的293T-HaloGFP细胞的荧光强度比不孵育β-lap的293T-HaloGFP细胞的荧光强度低10％左右，而孵育β-lap的HeLa-HaloGFP细胞的荧光强度比不孵育β-lap的HeLa-HaloGFP细胞的荧光强度低50％左右。这表明通过利用NQO1催化β-lap产生ROS的级联反应可以使得ROS-PROTAC1分子在癌细胞中高效降解靶蛋白，而在正常细胞中基本无法降解靶蛋白，从而实现细胞选择性的蛋白质降解。
实施例7合成ROS-PROTAC2
Figure BDA0002967777060000121
将PROTAC2即式c化合物(1eq,100.2mg)溶解于无水DCM中，置于冰浴中，加入DIPEA(10eq,173μL)和DMAP(5eq,61mg)搅拌5min.。当反应体系温度冷却至0℃时，将溶解有式b化合物(1.1eq,33mg)的DCM溶液缓慢滴加到反应体系中，移除冰浴，反应过夜。反应完成后，用DCM和水萃取，有机相用MgSO4干燥，旋干后用柱层析得到产物式I-2-2化合物，命名为ROS-PROTAC2，淋洗液为DCM/MeOH(20/1)。
δ0.90(s,9H),1.34(s,12H),1.64(s,3H),2.12(m,1H),2.37(s,3H),2.48-2.54(m,4H),2.64(s,3H),3.06-3.12(m,1H),3.14-3.20(m,2H),3.41-3.69(m,15H),3.94(m,2H),4.03(d,1H),4.29(dd,1H),4.46(s,1H),4.52(dd,1H),4.59(d,1H),4.61-4.65(m,1H),4.70(t,1H),4.75(t,1H),5.16(dd,2H),6.97(d,1H),7.13-7.22(m,7H),7.30-7.35(m,8H),7.66(d,1H),7.77(m,2H),7.81(m,1H),8.64(s,1H).HR-ESI-MS m/z calc.for C63H77BClN9O12S2[M+Na]+1284.48,found 1284.48.
实施例8 ROS-PROTAC2能够在ROS存在下转换为PROTAC2
Figure BDA0002967777060000131
将ROS-PROTAC2(1mM)与H2O2(2mM)溶于甲醇中。4h后，通过质谱检测ROS-PROTAC2的分子量变化，并且与PROTAC2分子进行对比。在相同条件下通过HPLC检测ROS-PROTAC2与H2O2的反应速率。检测结果见图9所示。
实施例9
本实施例用不同浓度的ROS-PROTAC2和1μMβ-Lap共同对293T和HeLa细胞进行孵育。并用孵育相同浓度的ROS-PROTAC2和PROTAC2的细胞作为对照。24h后，通过蛋白免疫印迹检测两种细胞系中BRD4蛋白的表达水平。
实验结果见图10所示，由图10可知，在***癌细胞HeLa和正常细胞293T中加入β-lap后，ROS-PROTAC2能够实现癌细胞中BRD4蛋白的降解，而不降解正常细胞的靶蛋白。这是由于引入NQO1催化β-lap生成ROS的级联反应后，ROS经过级联扩增之后癌细胞产生的ROS远远高于正常细胞产生ROS，使得ROS-PROTAC2分子在癌细胞中实现靶蛋白的高效降解而在正常细胞中蛋白的降解效率较低。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种可响应NQO1或其产物的化合物，其为式I所示的化合物或其药学上可接受的盐：
X-L-Y-Z
式I；
其中，X为目标蛋白的配体，Y为E3连接酶的配体，L为连接X和Y的链，所述化合物响应NQO1的方式是以Z被取代为H的方式；
其中，Z的结构式为
Figure FDA0003943859820000011
L为PEG类链或烷基类链；L选自以下结构式中的一种，其中，m，n，k在各结构式中分别各自独立地选自0-10的整数；R、R1、R2在各结构式中分别各自独立地选自O，NH，或CH2，
Figure FDA0003943859820000012
Figure FDA0003943859820000021
2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，Y的结构式为：
Figure FDA0003943859820000022
其中，-NH-与L相连，Ph-与L相连，-O-与Z相连。
3.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，X为特异识别抗癌药物靶点蛋白的配体。
4.如权利要求3所述的化合物，其特征在于，X为特异性识别BRD4蛋白、BTK蛋白、FKBP12蛋白或CDK9蛋白的配体。
5.如权利要求1-4任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物的结构式为：
Figure FDA0003943859820000031
6.如权利要求1-4任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物选自以下结构式中的一种：
Figure FDA0003943859820000032
7.如权利要求1-4任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物选自以下结构式中的一种：
Figure FDA0003943859820000041
8.权利要求1-7任一项所述化合物用于制备以下药物的用途：
(1)靶向肿瘤细胞的药物；
(2)***疾病的药物。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述肿瘤包括头颈部肿瘤、眼部肿瘤、皮肤癌、食道癌、胸部肿瘤、骨癌、肺癌、结肠癌、乙状结肠癌、直肠癌、胃癌、***癌、乳腺癌、卵巢肿瘤、肾癌、肝癌、胰腺癌、脑癌、肠癌、心脏肿瘤、肾上腺癌、***。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述头颈部肿瘤包括嘴部肿瘤、喉部肿瘤。
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