CN107267608B

CN107267608B - 一种matr3‑tfe3融合基因及其检测引物和应用

Info

Publication number: CN107267608B
Application number: CN201710458099.3A
Authority: CN
Inventors: 夏秋媛; 饶秋; 叶胜兵; 李芳秋; 周晓军
Original assignee: Nanjing General Hospital of Nanjing Command PLA
Current assignee: Nanjing General Hospital of Nanjing Command PLA
Priority date: 2017-06-16
Filing date: 2017-06-16
Publication date: 2018-03-09
Anticipated expiration: 2037-06-16
Also published as: CN107267608A

Abstract

本发明公开了一种MATR3‑TFE3融合基因及其检测引物和应用。本发明所述融合基因由MATR3的15号外显子与TFE3基因4号外显子之间发生基因融合而成；其中，MATR3基因位于5号染色体，位置为139273752‑139331677，在GeneBank中的序列版本号为GRCh38.p7，共19个外显子。一种检测MATR3‑TFE3易位性肿瘤的PCR引物，为检测MATR3‑TFE3融合基因的PCR引物。该PCR引物在制备MATR3‑TFE3易位性肿瘤诊断试剂中的应用。本发明PCR引物，扩大了原引物组合的检测范围，应用于临床，可提高诊断该类肿瘤的检出率和准确率。

Description

一种MATR3-TFE3融合基因及其检测引物和应用

技术领域

本发明属于医学检验领域，涉及一种MATR3-TFE3融合基因及其检测引物和应用。

背景技术

2004年WHO对1997年肾细胞癌病理组织学分类进行了修改，新增了Xp11.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌(Xp11.2易位性肾癌)。TFE3基因位于XP11.2，是Xp11.2易位性肾癌的唯一驱动基因，其致病机理清晰明确：这类肿瘤均涉及位于Xp11.2的TFE3基因同其它染色体易位及其所致形成融合基因，通过启动子变换从而高表达TFE3融合蛋白，而TFE3作为一个转录因子，通过与特异的DNA结构相结合，转录调控体内多种基因表达最终致病。目前至少有10种不同的易位伴侣和融合基因被报道，包括ASPL-TFE3、PRCC-TFE3、SFPQ-TFE3、NONO-TFE3、CLTC-TFE3、LUC7L3-TFE3、KHSRP-TFE3、PARP14-TFE3、DVL2-TFE3和RBM10-TFE3等，每例肿瘤内仅存在单一的易位形式。除肾细胞癌外，一些软组织间叶肿瘤同样存在TFE3基因致病性的基因易位，包括腺泡状软组织肉瘤、部分上皮样血管周细胞肿瘤等，这些间叶肿瘤和Xp11.2易位性肾癌一起统称为Xp11.2易位性肿瘤。

Xp11.2易位性肿瘤是一罕见类型肿瘤，虽然其总体发病率很低，但在儿童肾癌患者中约1/3为此类肾癌，并且回顾性研究表明此类肿瘤在我国并不罕见。该疾病以发病年龄轻为突出特征，因此造成极其沉重的家庭及社会负担。且研究已证实，Xp11.2易位性肾癌预后要比非Xp11.2易位性肾癌预后差，并且不同基因类型Xp11.2易位性肾癌的预后有所区别。此外，有明确证据表明Xp11.2易位性肿瘤的患者对血管内皮生长因子受体(vascularendothelial growth factor receptor，VEGFR)或哺乳动物雷帕霉素(mammalian targetof rapamycin，mTOR)分子靶向治疗敏感。另有研究表明，MET酪氨酸激酶为ASPL-TFE3融合基因的靶基因，并有望成为Xp11.2易位性肿瘤的治疗靶点。因此，根据基因型来精确诊断此类肿瘤显得十分重要。

目前常用的诊断Xp11.2易位性肿瘤的检测方法主要包括免疫组织化学和荧光原位杂交。免疫组织化学检测细胞核TFE3融合蛋白直观、快捷、价格低，但其缺点是该方法容易受到多种因素影响，如组织固定时间、组织修复方式、抗体克隆号以及人为的判读因素等等，使得结果可能出现假阳性或假阴性。染色体荧光原位杂交(FISH)始于传统的细胞遗传学和DNA技术的结合，快速灵敏、特异性好，可以检测隐匿或微小的染色体畸变以及复杂核型；还可以使用多种荧光标记，显示DNA片段及基因之间的相对位置与方向，空间定位精确。但这两种检测方法只能提示存在TFE3蛋白的高表达或TFE3基因的易位，均不能明确肿瘤中发生的具体易位改变。精确检测Xp11.2易位性肿瘤的易位伴侣和融合基因位点，不仅是患者预后预测的依据，也是未来靶向治疗的指导，因此，明确Xp11.2易位性肿瘤的基因易位位点，具有重要的临床意义。

Xp11.2易位性肿瘤是一种每个个体间异质性较大的肿瘤类型，目前已知的融合基因形式就包括ASPL-TFE3、PRCC-TFE3、SFPQ-TFE3、NONO-TFE3、CLTC-TFE3、LUC7L3-TFE3、KHSRP-TFE3、PARP14-TFE3、DVL2-TFE3和RBM10-TFE3等十余种。

目前高通量测序是唯一可以明确未知易位位点的检测手段，然而高通量测序费用高昂，检测周期长，检测平台稀缺，对样品质量要求高，不利于普及推广，对于大多数患者来说也不是首选检测手段。依赖以往经验，针对已知的融合位点设计特异性的PCR引物组合，对肿瘤组织中提取出的RNA逆转录之后进行PCR扩增并测序，检测融合基因具体易位位点，是最准确、便捷、经济的方法。因此，发现新的致病融合位点，进而设计PCR引物将有利于Xp11.2易位性肿瘤检测准确度的进一步提高。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种MATR3-TFE3融合基因。

本发明的另一目的是提供该MATR3-TFE3融合基因的检测引物。

本发明的又一目的是提供引物的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种MATR3-TFE3融合基因，所述融合基因由MATR3的15号外显子与TFE3基因4号外显子之间发生基因融合而成；其中，MATR3基因位于5号染色体，位置为139273752-139331677，在GeneBank中的序列版本号为GRCh38.p7，共19个外显子。我们通过高通量测序方法检测未知融合对象的Xp11.2肿瘤患者的标本，发现所述的Xp11.2的新易位伴侣：MATR3-TFE3基因易位，这一位点国内外文献均未报道过，原有TFE3融合基因扩增引物也无法检测出这一融合基因，因此会导致漏诊。

所述的MATR3-TFE3融合基因优选包含SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。

本发明所述的MATR3-TFE3融合基因的检测试剂在制备MATR3-TFE3易位性肿瘤诊断试剂中的应用。

一种检测MATR3-TFE3易位性肿瘤的PCR引物，为检测本发明所述的MATR3-TFE3融合基因的PCR引物。所有能够检测本发明所述MATR3-TFE3融合基因的引物对均在本发明的保护范围内。

针对本发明找到的新的MATR3-TFE3融合基因，我们在MATR3的15号外显子和TFE3的4号外显子内分别设计引物。遵循引物设计原则，引物最好在模板cDNA的保守区内设计，引物长度在15bp-30bp之间，引物GC含量在40％～60％之间，退火温度最好接近72℃，引物自身及引物之间不应存在互补序列，扩增条带单一特异。由于工作中经常需要在石蜡固定标本中开展工作，石蜡标本RNA碎裂严重，因此扩增产物不宜过长，需要控制在300bp以下。

经过多次调试和验证，最终设计的引物序列为：MATR3-E15-F1：CAGTTCAGTGGGAGACGAGA(SEQ ID NO.1)；TFE3-E4-R1:GCGTTGGGTTCTCCAGAT(SEQ ID NO.2)，理论扩增产物长161bp，扩增产物(融合基因)的全部序列如下：CAGTTCAGTGGGAGACGAGACCGATCTTGCTAATTTAGGTGATGTGGCTTCTGATGGGAAAAAGGAACCATCAGATAAAGCTGTGAAAAAAGATGGAAGTGCTTCAGCAGCAGCAAAGAAAAAGCTTAAAAAGGTGCAGACCCATCTGGAGAACCCAACGC(SEQ ID NO.5)。为保障检测成功率，我们还设计了另一对替补引物：引物序列为：MATR3-E15-F2：GGTGATGTGGCTTCTGATG(SEQ ID NO.3)；TFE3-E4-R2:CGAGTGTGGTGGACAGGT(SEQ ID NO.4)，理论扩增产物长184bp，扩增产物(融合基因)的全部序列如下：GGTGATGTGGCTTCTGATGGGAAAAAGGAACCATCAGATAAAGCTGTGAAAAAAGATGGAAGTGCTTCAGCAGCAGCAAAGAAAAAGCTTAAAAAGGTGCAGACCCATCTGGAGAACCCAACGCGCTACCACCTGCAGCAGGCGCGCCGGCAGCAGGTGAAACAGTACCTGTCCACCACACTCG(SEQ ID NO.6)。经实验验证，两对引物均可成功扩增出目的条带，条带单一、特异。

本发明所述的PCR引物在制备MATR3-TFE3易位性肿瘤诊断试剂中的应用。

一种MATR3-TFE3易位性肿瘤诊断试剂盒，包括本发明所述的PCR引物。

有益效果：

本发明针对高通量测序发现的新融合位点设计了特异性的PCR引物，扩大了原引物组合的检测范围，应用于临床，可提高诊断该类肿瘤的检出率和准确率。为诊断分型及分子靶向治疗提供依据。根据我们的实验结果，该引物组合诊断的特异性和敏感性均达到了100％，且操作对象只需要在石蜡包埋组织切片上进行，时间仅为三个工作日。采用本发明提供的探针组合进行检测MATR3-TFE3易位性肿瘤，不但方便、快速、可靠而且检出率高，可用于制备MATR3-TFE3易位性肿瘤诊断试剂盒，为MATR3-TFE3易位性肿瘤的快速准确的诊断提供了新的工具。

附图说明

图1：在已知MATR3-TFE3融合型肿瘤中应用本发明引物组合(MATR3-E15-F1；TFE3-E4-R1)进行验证，成功检出的MATR3-TFE3融合基因测序图。

图2：在已知MATR3-TFE3融合型肿瘤中应用本发明替补引物组合(MATR3-E15-F2；TFE3-E4-R2)进行验证，成功检出的MATR3-TFE3融合基因测序图。

图3：在未知融合对象的Xp11.2肿瘤病例中应用本发明引物组合(MATR3-E15-F1；TFE3-E4-R1)，成功检出的MATR3-TFE3融合基因测序图。

图4：在未知融合对象的Xp11.2肿瘤病例中应用本发明替补引物组合(MATR3-E15-F2；TFE3-E4-R2)，成功检出的MATR3-TFE3融合基因测序图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。

实施例1针对明确诊断的病例进行验证：

对于高通量测序RNA-seq检测出MATR3 exon15-TFE3 exon4新融合位点的病例，使用我们设计的引物进行验证。

一、RNA的提取：

严格按照RNeasy FFPE Kit操作说明进行提取。①脱蜡：将收集好的玻片进行二甲苯脱蜡，再用无水乙醇漂洗，风干后用手术刀片刮下来装入1.5ml EP管中；②酶解：加入150μl消化液,再加入10μl蛋白酶K，混匀，56℃酶解15min,80℃15min，冰上冷却；③加入16μlDNDNA酶缓冲液,再加入10μl DNase I,混匀，室温静置15mimin,12000rpm离心15min，取上清；④加入320μl结合液液再加入720μl无水乙醇，混匀，分2次转移至吸附柱中，8000rpm离心1min，，弃废液；⑤洗涤：加入500μl洗涤液,8000rpm离心1min；重复洗涤一次，弃废液，将吸附柱转移到一个新的2ml收集管中，12000rpm离心5min；⑥洗脱：将吸附柱转移到1.5ml的EP管中，加入100μl的洗脱液，室温静置1min,12000rpm离心1min，将收集好的洗脱液(即DNA提取液)进行浓度和纯度测定，-80℃保存存待用。

二、逆转录PCR RT-PCR

采用试剂盒(K1622，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，MBI)对RNA进行逆转录，方法详见试剂盒说明。PCR扩增引物为本专利MATR3-TFE3融合基因引物组合。反应体系包括：0.125μl TaKaRa Ex Taq^TMHS液，2.5μl 10×Taq Buffer(Mg²⁺plus)，2μldNTP(均购自日本Takara公司)，引物浓度为20μmol/l，cDNA模版为100ng，无菌去离子水加至25μl。PCR扩增条件为94℃变性3min后，94℃30s、60℃30s、72℃1min，共35次循环，最后72℃延伸5min。PCR产物用3％琼脂糖，电压100V，电泳，溴化乙啶染色后于紫外光下观察结果，并送测序。

结果：分别用本发明两对引物(MATR3-E15-F1/TFE3-E4-R1；和MATR3-E15-F2/TFE3-E4-R2)PCR后均可见单一特异的电泳条带，对扩增产物进行测序，得到MATR3 exon15-TFE3 exon4融合基因序列(图1、图2)，证明本项目设计的引物组合可靠且敏感。

实施例2针对未知易位伴侣的Xp11.2肿瘤进行检测

我们对35例未知易位伴侣的Xp11.2肿瘤使用本发明的引物组合进行检测，RNA提取、逆转录PCR和测序方法同上。

结果：使用本发明设计引物组合检测，共1例检测出MATR3-TFE3融合基因(图3、图4)，通过免疫组织化学、荧光原位杂交等方法验证，结果真实可靠。

评价：本发明引物组合是对原有Xp11.2融合基因引物的补充，涵盖了TFF3融合基因的未报道位点，增加了RT-PCR方法诊断该肿瘤的检出率。

<110> 中国人民解放军***南京总医院

<120>一种 MATR3-TFE3 融合基因及其检测引物和应用

<160> 6

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物MATR3-E15-F1

<400> 1

cagttcagtg ggagacgaga 20

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物TFE3-E4-R1

<400> 2

gcgttgggtt ctccagat 18

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物MATR3-E15-F2

<400> 3

ggtgatgtgg cttctgatg 19

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物TFE3-E4-R2

<400> 4

cgagtgtggt ggacaggt 18

<210> 5

<211> 161

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合基因扩增产物

<400> 5

cagttcagtg ggagacgaga ccgatcttgc taatttaggt gatgtggctt ctgatgggaa 60

aaaggaacca tcagataaag ctgtgaaaaa agatggaagt gcttcagcag cagcaaagaa 120

aaagcttaaa aaggtgcaga cccatctgga gaacccaacg c 161

<210> 6

<211> 184

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合基因扩增产物

<400> 6

ggtgatgtgg cttctgatgg gaaaaaggaa ccatcagata aagctgtgaa aaaagatgga 60

agtgcttcag cagcagcaaa gaaaaagctt aaaaaggtgc agacccatct ggagaaccca 120

acgcgctacc acctgcagca ggcgcgccgg cagcaggtga aacagtacct gtccaccaca 180

ctcg 184

Claims

1.一种MATR3-TFE3融合基因，其特征在于,所述融合基因由MATR3的15号外显子与TFE3基因4号外显子之间发生基因融合而成；其中， MATR3基因位于5号染色体，位置为139273752-139331677，在GeneBank中的序列版本号为GRCh38.p7，共19个外显子；所述的MATR3-TFE3融合基因包含SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列或者SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述的MATR3-TFE3融合基因的检测试剂在制备MATR3-TFE3易位性肿瘤诊断试剂中的应用。

3.一种检测MATR3-TFE3易位性肿瘤的PCR引物，其特征在于所述PCR引物为检测权利要求1所述的MATR3-TFE3融合基因的PCR引物。

4.根据权利要求3所述的检测MATR3-TFE3易位性肿瘤的PCR引物，其特征在于选自以下任意一对引物：SEQ ID NO.1所示的MATR3-E15-F1和SEQ ID NO.2所示的TFE3-E4-R1；或者SEQ ID NO.3所示的MATR3-E15-F2和SEQ ID NO.4所示的TFE3-E4-R2。

5.权利要求3或4所述的PCR引物在制备MATR3-TFE3易位性肿瘤诊断试剂中的应用。

6.一种MATR3-TFE3易位性肿瘤诊断试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括权利要求3或4所述的PCR引物。