CN107261137B - 两种抗her2抗体-毛壳素偶联物及其制备方法和抗肿瘤应用 - Google Patents

两种抗her2抗体-毛壳素偶联物及其制备方法和抗肿瘤应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术和药物领域，具体是两种抗HER2抗体‑毛壳素偶联物Trastuzumab‑vc‑Chaetocin(T‑L‑C)和Pertuzumab‑vc‑Chaetocin(P‑L‑C)及其合成制备方法和应用。所述抗体偶联物由带连接基的药物分子和单克隆抗体偶联得到，结构如下所示。本发明还提供了一种带连接基药物分子的制备方法。本发明制备的抗体偶联物对HER2阳性细胞具有靶向作用，既可以增强对HER2阳性肿瘤细胞的杀伤，也可减少(+)‑Chaetocin单独给药产生的毒副作用，对HER2阳性表达的肿瘤细胞引起的癌症有巨大潜在治疗应用价值。

Description

两种抗HER2抗体-毛壳素偶联物及其制备方法和抗肿瘤应用
技术领域
本发明涉及生物技术和药物领域，具体地说，是两种抗HER2抗体-毛壳素偶联物及其制备方法和抗肿瘤方面应用。
背景技术
人表皮生长因子受体2(HER2)是具有酪氨酸激酶活性的表皮生长因子受体家族的一个成员。受体的聚合作用会导致受体酪氨酸残基的磷酸化，并启动多种信号通路导致细胞增殖和肿瘤发生，主要在乳腺癌中高度表达。HER2基因的过表达不仅与肿瘤的发生发展相关外，还是一个重要的临床治疗监测及预后指标，并且是肿瘤靶向治疗药物选择的一个重要靶点。对于该靶点的研究相对成熟，且已有针对该基因过度表达的药物赫赛汀(Herceptin)即曲妥珠单抗Trastuzumab。
曲妥珠单抗是一种重组DNA衍生的人源化单克隆抗体，可选择性地作用于人表皮生长因子受体-2(HER2)的细胞外部位，阻断信号通路，抑制肿瘤细胞的生长，赫赛汀还可以刺激自身的免疫细胞去摧毁癌细胞，仅对HER2高表达的肿瘤有效。帕妥珠单抗也是一种通过生物技术方法生产的人源化单克隆抗体，通过结合HER2，阻滞HER2与其它HER受体的杂二聚，抑制了与肿瘤生长相关的下游信号传导过程；与曲妥珠单抗所结合的表位不同，对低、中表达HER2的肿瘤也有效。
多硫代二酮哌嗪(Epipolythiodioxopiperazines，ETPs)是一类主要由海洋真菌产生的重要活性次级代谢产物，其结构特征为二酮哌嗪母核中含有硫桥。ETPs具有广泛的生物活性，例如抗增殖、细胞毒、免疫抑制、抗病毒以及抗菌等，其中多种化合物更是展示出很高抗肿瘤活性。毛壳素(+)-Chaetocin是ETP领域一个“明星分子”，最早被发现于海洋真菌Chaetronium minutum的代谢产物中，近年来科学家围绕该分子的抗肿瘤活性进行了大量研究，显示该化合物具有组蛋白赖氨酸特异性甲基转移酶(HKMTs)抑制作用，可强烈抑制肿瘤细胞的生长。(+)-Chaetocin的良好活性与其本身具有的二硫键也有较大关系，可能能够以类似烷化剂的作用方式修饰靶细胞蛋白，阻断诸多细胞通路进而导致肿瘤细胞死亡。
抗体偶联药物是由单克隆抗体(mAb)和强效毒性药物通过生物活性连接器(Linker)偶联而成，它兼具了化学药物和抗体药物各自的优点，通过高效特异的抗原抗体反应，携带抗肿瘤药物直达靶标，抗体内吞进入细胞，在溶酶体内再进一步降解并释放药物达到杀伤肿瘤细胞的目的。
细胞毒性药物用作ADCs药物的弹头，承担杀伤肿瘤细胞、发挥ADCs疗效的主要功能，是ADCs的重要组成部分。近年来临床中候选药物弹头高度集中于海兔毒素，美登素等药物，寻找出新的药物弹头对ADCs药物的发展推进有重要的意义，而海洋天然产物是抗肿瘤活性物质的重要来源，具有很高的研究和开发价值，且目前尚无关于将Trastuzumab和Pertuzumab与其他海洋毒素偶联，来治疗HER2介导的疾病的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供两种抗HER2抗体-毛壳素偶联物及其制备方法和抗肿瘤方面应用。
本发明的第一方面，提供两种抗HER2抗体-毛壳素偶联物(T-L-C或P-L-C)，其结构式如下所示：
Figure BDA0001300998720000021
其中，mAb指曲妥珠单抗Trastuzumab或帕妥珠单抗Pertuzumab，经蛋白酶敏感型缬氨酸-瓜氨酸连接基(vc)与海洋毒素毛壳素(+)-Chaetocin连接。
即，所述的抗HER2抗体-毛壳素偶联物分别为：
一种具有以下结构式的抗HER2抗体-毛壳素偶联物Trastuzumab-vc-Chaetocin，即T-L-C：
Figure BDA0001300998720000031
其中，抗HER2抗体为选择性作用于HER2胞外区的曲妥珠单抗Trastuzumab，Trastuzumab经蛋白酶敏感型缬氨酸-瓜氨酸连接基(vc)与毛壳素(+)-Chaetocin连接，式中的n代表药物抗体偶联比，所述的药物抗体偶联比n的范围为1-8。
优选的，所述的T-L-C中药物抗体偶联比n的范围为1-2，即每个Trastuzumab抗体分子偶联1-2个(+)-Chaetocin分子。
一种具有以下结构式的抗HER2抗体-毛壳素偶联物Pertuzumab-vc-Chaetocin，即P-L-C：
Figure BDA0001300998720000032
其中，抗HER2抗体为HER杂二聚化抑制剂帕妥珠单抗Pertuzumab，Pertuzumab经蛋白酶敏感型缬氨酸-瓜氨酸连接基(vc)与毛壳素(+)-Chaetocin连接，式中的n代表药物抗体偶联比，所述的药物抗体偶联比n的范围为1-8。
优选的，所述的P-L-C中药物抗体偶联比n的范围为1-2，即每个Pertuzumab抗体分子偶联1-2个(+)-Chaetocin分子。
本发明的第二方面，提供一种带连接基药物分子的制备方法，即vc-Chaetocin，包括以下步骤(合成路径见图1)：
(A)将毛壳素(+)-Chaetocin与N,N-二异丙基乙胺混合溶解在N,N-二甲基甲酰胺中，在室温氮气保护下搅拌20min；取马来酰亚胺修饰的缬氨酸-瓜氨酸二肽和N,N-二异丙基乙胺加入到反应液中，室温下搅拌过夜；
(B)反应完毕后加入三氟乙酸和乙酸淬灭反应液，油泵减压浓缩，硅胶柱层析纯化得到棕黄色固体，该固体即为所述带连接基药物分子。
所述带连接基药物分子vc-Chaetocin的部分合成反应条件参考专利文献WO/2006/060533(Conjugates of 1,8-bis-naphthalimides with an antibody)；制备方法得到的带连接基药物分子vc-Chaetocin尚无相关报道。
本发明的第三方面，提供上述的抗HER2抗体-毛壳素偶联物(T-L-C或P-L-C)的制备方法，包括以下步骤：
(a)利用Sephadex G-25脱盐柱将曲妥珠单抗或帕妥珠单抗原液置换为磷酸盐反应缓冲液，超滤管浓缩调整抗体浓度，制备曲妥珠单抗或帕妥珠单抗抗体。
由于原液pH值不是后面偶联药物的最优条件，且原液溶液中可能含有其他干扰反应的物质，通过置换溶液，并用超滤管浓缩除去体系中的小分子及其他分子量小于30kDa的杂质分子。
(b)向抗HER2抗体缓冲液中加入三(2-羧乙基)膦(TCEP)，进行还原反应。
由于抗HER2抗体表面可反应的半胱氨酸最初是以链间二硫键的形式存在，因而不存在游离的半胱氨酸和连接基药物分子vc-Chaetocin偶联，所以在与药物分子偶联前，需要将单抗链间二硫键还原打开得到游离状态的半胱氨酸巯基。
常见的二硫键还原剂为二硫苏糖醇(DTT)，因DTT中含有巯基会与马来酰亚胺修饰的缬氨酸-瓜氨酸二肽反应，这里优选三(2-羧乙基)膦(TCEP)，且TCEP在水溶液中的稳定性和溶解性都很好；所述缓冲液为pH 7.4的PBS缓冲液；TCEP与抗HER2抗体的摩尔比为12:1；所述还原反应的条件优选为：37℃水浴反应1.5h。
(c)过Sephadex G-25脱盐柱纯化被还原的单抗，加入合成得到的带连接基的毛壳素(+)-Chaetocin混合，进行偶联反应。作为优选，所述连接基为马来酰亚胺修饰的缬氨酸-瓜氨酸二肽。(其合成方法参考文献：Dubowchik,G.M.,Firestone,R.A.,Padilla,L.,etal.Cathepsin B-labile dipeptide linkers forlysosomal release of doxorubicinfrom internalizing immunoconjugates:modelstudies of enzymatic drug releaseand antigen-specific in vitro anticancer activity[J].Bioconjugate Chemistry,2002,13(4):855-869.)。带连接基的毛壳素(+)-Chaetocin与抗HER2抗体的摩尔比为10:1，所述偶联反应的温度优选为冰浴反应1.5h。
(d)反应完成后，加入半胱氨酸溶液淬灭反应，过脱盐柱纯化，超滤管浓缩得到所述抗HER2抗体-毛壳素偶联物。所述加入的半胱氨酸为20倍过量摩尔比的20mM溶液，淬灭反应优选为冰浴下45min；由于本发明抗HER2抗体-毛壳素偶联物的分子量均大于140kDa，而反应体系中存在的其他分子的分子量均小于2kDa，采用脱盐柱除去体系中的小分子，并用超滤管浓缩抗体，得到所述的抗HER2抗体-毛壳素偶联物。
本发明的第四方面，提供上述的抗HER2抗体-毛壳素偶联物(T-L-C或P-L-C)在制备肿瘤治疗药物中的应用。
优选的，所述的肿瘤为胃癌、肺癌、肝癌或乳腺癌。
优选的，所述的肿瘤为HER2阳性肿瘤。本发明的抗HER2抗体-毛壳素偶联物与未偶联药物的抗HER2抗体相比，对HER2阳性肿瘤细胞具有较高的亲和力和较明显的杀伤力。
优选的，所述HER2阳性肿瘤细胞为胃癌细胞SGC-7901，肺癌细胞NCI-H460，肝癌细胞SMMC-7721以及三种乳腺癌细胞SKBR-3，AU565及MBA-MD-231。
更优选的，所述的HER2阳性肿瘤细胞是乳腺癌细胞SKBR-3，AU565。
本发明的有益效果为：
1、本发明偶联物具有抗HER2抗体和(+)-Chaetocin两者的生物学功能，既具有Trastuzumab或Pertuzumab抗体对肿瘤细胞的杀伤能力，又具有(+)-Chaetocin对组蛋白赖氨酸特异性甲基转移酶(HKMTs)的抑制作用，以及类似烷化剂的作用方式修饰靶细胞蛋白，在二者的协同作用下，表现出明显的抗肿瘤效果；
2、本发明偶联物通过抗HER2单抗与肿瘤细胞表面的HER2受体特异结合，发生内吞作用将(+)-Chaetocin转运到肿瘤细胞内释放发挥作用。本发明制备的抗体偶联物对HER2阳性细胞具有靶向作用，既可以增强对HER2阳性肿瘤细胞的杀伤，也可减少(+)-Chaetocin单独给药对正常细胞产生的毒副作用，对HER2阳性表达的肿瘤细胞引起的癌症有巨大潜在治疗应用价值。
附图说明
图1.本发明的连接基药物分子vc-Chaetocin的合成路径；
图2.偶联物T-L-C经还原后HPLC分析图：(a)Trastuzumab；(b)T-L-C；
图3.偶联物P-L-C经还原后HPLC分析图：(a)Pertuzumab；(b)P-L-C；
图4.各浓度(+)-Chaetocin对不同肿瘤细胞的增殖抑制作用(48h)；
图5.各浓度Trastuzumab和T-L-C对不同细胞的抑制作用比较(72h)；
图6.各浓度Pertuzumab和P-L-C对不同细胞的抑制作用比较(72h)；
图7.各浓度P-L-C和T-L-C对同种乳腺癌细胞的抑制作用(72h)比较(t检验：*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001)；
图8.P-L-C和T-L-C对不同乳腺癌细胞的抑制作用(72h)比较(t检验：*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1：vc-Chaetocin带连接基药物分子的制备
制备步骤如下：
(1)将毛壳素(+)-Chaetocin 15mg(0.022mmol)与N,N-二异丙基乙胺16.5μL(0.100mmol)，2.4mL N,N-二甲基甲酰胺混合在室温氮气保护下磁力搅拌20min后，取马来酰亚胺修饰的缬氨酸-瓜氨酸二肽37mg(0.050mmol)和N,N-二异丙基乙胺17μL(0.103mmol)加入到反应液中，室温下搅拌过夜；
(2)TLC监测反应完毕，0.40mL 1.3M三氟乙酸和0.60mL乙酸淬灭反应液，油泵减压旋蒸浓缩，硅胶柱层析纯化，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝6:1，得到棕黄色固体产物6-L-C6.8mg，收率：24.4％。1H NMR(500MHz,CD3OD)δH(ppm):8.08(d,J＝6.0Hz,2H,-CH＝CH-),7.57-7.30(m,10H,ArH),6.76(d,J＝6.0Hz,2H,ArH),4.59-4.51(m,8H,-CH 2O-,-CH-,-NHCHCO-),4.23-4.16(m,2H,-CH 2-),3.52(t,J＝7.5Hz,2H,-CH 2N-),3.12(s,6H,-NCH 3),2.76-2.69(m,2H,-CH 2NHCO-),2.31-2.19(m,5H,-CH(CH3)2,-CH 2-),1.64-1.58(m,6H,-CH 2CO-,-CH 2-),1.35-1.31(m,6H,-CH 2-),0.99-0.97(m,6H,-CH(CH 3)2).ESI-MS[(M+Na)+]m/z:1317.3。
本发明带连接基药物分子vc-Chaetocin的合成路径如图1所示。
实施例2：抗HER2抗体-毛壳素偶联物(T-L-C或P-L-C)的制备
T-L-C偶联物的制备方法包括：
(1)通过Sephadex G-25脱盐柱将曲妥珠单抗原液(20mg/mL)置换为PBS反应缓冲液(pH 7.4)，并用超滤管浓缩单抗调整浓度至10mg/mL；
(2)取500μL(10mg/mL)曲妥珠单抗溶液，加入12倍过量摩尔比的20mM TCEP溶液21μL，在37℃下孵育1.5h；
(3)用含1mM DTPA的PBS过脱盐柱，纯化被还原的单抗，在冰浴条件下向单抗溶液中加入10倍过量摩尔比的5.38mM 6-L-C溶液64μL，静置反应1.5h；
(4)加入20倍过量摩尔比的20mM半胱氨酸溶液35μL，静置45min，PBS过脱盐柱，超滤管浓缩至500μL，得到抗体偶联药物T-L-C(8.3mg/mL)。
P-L-C偶联物的制备方法包括：
(1)通过Sephadex G-25脱盐柱将帕妥珠单抗原液(10mg/mL)置换为PBS反应缓冲液(pH 7.4)，并用超滤管浓缩单抗调整浓度至8mg/mL；
(2)取500μL(8mg/mL)帕妥珠单抗溶液，加入12倍过量摩尔比的20mM TCEP溶液17μL，在37℃下孵育1.5h；
(3)用含1mM DTPA的PBS过脱盐柱，纯化被还原的单抗；在冰浴条件下向单抗溶液中加入10倍过量摩尔比的5.38mM 6-L-C溶液51μL，静置反应1.5h；
(4)加入20倍过量摩尔比的20mM半胱氨酸溶液27μL，静置45min，PBS过脱盐柱，超滤管浓缩至500μL，得到抗体偶联药物P-L-C(5.2mg/mL)。
Trastuzumab和Pertuzumab单抗的半胱氨酸巯基与vc-Chaetocin的马来酰亚胺基团发生烷基化反应，变成了偶联不同个数Chaetocin的偶联物。
单克隆抗体和(+)-Chaetocin有不同的最大吸收波长，但(+)-Chaetocin的最大吸收波长在302nm左右，在此处抗体也有吸收，所以对T-L-C和P-L-C在280nm处进行HPLC分析，同时以Trastuzumab和Pertuzumab单抗为参照，观察保留时间和峰形的变化。
纯抗体经还原后，在280nm处会有轻链(图2a，3a峰1)、重链(图2a峰2，3a峰3)两个主峰；偶联(+)-Chaetocin后，如图2b和图3b，轻重链的出峰时间和峰形都发生明显的变化，由于两种单抗的结构组成不同，药物接上的位置个数不同对抗体极性、分子量等方面的影响也不同，所以轻重链出峰时间会有所差异，如曲妥珠单抗在接上药物分子后出峰时间推迟。由HPLC分析显示抗体已偶联上(+)-Chaetocin，但偶联上的药物个数较少。
本实验中偶联物的浓度测定：采用紫外分光光度法，测定在280nM处的紫外吸收值，通过朗伯比尔定律计算抗体的浓度。本实验中偶联比的测定方法：测定偶联比是指测定每个单抗分子上接有小分子药物的个数，即偶联物中药物与抗体的摩尔比。可采用紫外分光光度法和Ellman-BCA法两种方法测定。紫外分光光度法：利用紫外分光光度计测定抗体和药物分子最大吸收波长处的吸光度，绘制出280nm和302nm处的标准曲线，然后通过测定抗体偶联药物在两波长处的吸光度，根据朗伯比尔定律计算出抗体和药物分子的量，求得(+)-Chaetocin/抗体比。Ellman-BCA法：Ellman‘s试剂可用于比色法测定生物样品中的自由巯基含量，BCA法是常用的蛋白浓度定量方法，，灵敏度高，取量少，操作简单，形成的颜色复合物稳定性好；偶联物通过还原剂将二硫键打开变成游离的巯基，然后利用Ellman法计算出未反应巯基的含量，再结合BCA法确定偶联物浓度计算偶联比。通过两种方法得到的偶联比具有很好的一致性，结果如表1所示。
表1两种测定偶联比方法结果对比
样品 T-L-C P-L-C
A280(nm) 0.664 0.397
A302(nm) 0.072 0.060
DAR(UV法) 1.81 1.89
A412(nm) 0.022 0.011
A570(nm) 0.558 0.416
DAR(Ellman-BCA法) 1.79 1.86
实施例3：体外细胞增殖测定生物活性实验
在本实施例中，研究了毛壳素(+)-Chaetocin对各肿瘤细胞系增殖的作用；以HER2阳性细胞SKBR-3、AU565，HER2阴性细胞MBA-MD-231和正常细胞HaCaT为对象，测定Trastuzumab、Pertuzumab单抗和T-L-C、P-L-C偶联物的生物学活性。
本实施例采用CCK-8试剂来评价药物的抗增殖作用。试剂的主要成分是水溶性四唑盐WST-8，WST-8被细胞内脱氢酶生物还原后生成橙黄色水溶性的甲臜(formazan)，生成的甲臜量与活细胞数量成线性相关。
本实施例选择的细胞系有：胃癌细胞SGC-7901，肺癌细胞NCI-H460，肝癌细胞SMMC-7721，乳腺癌细胞SKBR-3，AU565，MBA-MD-231以及人正常永生化角质形成细胞HaCaT。
本实验首先研究了毛壳素(+)-Chaetocin对各肿瘤细胞系增殖的作用。SGC-7901、NCI-H460、AU565细胞在含10％胎牛血清的1640培养基中，SMMC-7721、MBA-MD-231细胞在含10％胎牛血清的DMEM培养基中，SKBR-3细胞在含10％胎牛血清的McCoy’s 5a培养基中，于37℃，5％CO2培养箱中培养；六种细胞分别以6×103-8×103个细胞每孔的密度接种至96孔板，100μL/孔，培养24h后，吸出96孔板中原有培养基，加入不同浓度的培养液稀释的毛壳素(+)-Chaetocin，100μL/孔，每个浓度设复孔，并设相应浓度的溶媒对照及无细胞培养基孔，37℃，5％CO2培养箱中培养48h后，每孔加10μL CCK-8，37℃，5％CO2培养箱中培养40-60min，测定450nm下的OD值，并计算毛壳素(+)-Chaetocin对各种细胞的IC50值(μM)。计算结果如表2所示，对各肿瘤细胞的增殖抑制作用如图4。
表2毛壳素(+)-Chaetocin对个细胞的IC50值(μM)
Figure BDA0001300998720000091
由表2及图4可见，毛壳素(+)-Chaetocin对各肿瘤细胞都有明显的杀伤作用，可以用作抗体偶联药物的药物弹头。
本实验使用纯单抗Trastuzumab、Pertuzumab以及得到的两种偶联物T-L-C、P-L-C对两种HER2过表达的肿瘤细胞系进行了体外细胞培养增殖作用的研究，同时也对HER2阴性肿瘤细胞及正常细胞进行了体外细胞培养增殖作用的研究。AU565细胞在含10％胎牛血清的1640培养基中，MBA-MD-231、HaCaT细胞在含10％胎牛血清的DMEM培养基中，SKBR-3细胞在含10％胎牛血清的McCoy’s 5a培养基中，于37℃，5％CO2培养箱中培养；四种细胞分别以6×103-8×103个细胞每孔的密度接种至96孔板，100μL/孔，培养24h后，吸出96孔板中原有培养基，加入不同浓度的培养液稀释的Trastuzumab、Pertuzumab、T-L-C或P-L-C(0.1μm孔径的无菌滤膜过滤除菌)，100μL/孔，每个浓度设复孔，并设相应浓度的溶媒对照及无细胞培养基孔，37℃，5％CO2培养箱中培养72h后，每孔加10μL CCK-8，37℃，5％CO2培养箱中培养1-2h，测定450nm下的OD值，对各细胞的增殖抑制作用比较如图5、6、7、8所示。
由图5和6可见，将(+)-Chaetocin偶联到抗体上后，与纯单抗进行比较，T-LC和P-L-C对HER2高表达的两种乳腺癌细胞的杀伤能力都强于未接药物的Trastuzumab和Pertuzumab单抗，而对HER2阴性细胞MBA-MD-231和正常细胞HaCaT都没有明显的抑制作用，表明偶联物只特异性杀伤HER2阳性细胞。
由图7所示，比较两种不同ADC药物对同种乳腺癌细胞的抑制作用，P-L-C的抑制作用都强于T-L-C，P-L-C和T-L-C接上药物个数相近，但活性表现有差异，可能是由于Pertuzumab和Trastuzumab结构及作用机制不同，或Pertuzumab在接上(+)-Chaetocin后的内吞能力强于Trastuzumab，具体机制有待进一步研究。
由图8所示，不管是T-L-C还是P-L-C，对这两种来源相同(同一病灶，转移性乳腺癌)的乳腺癌细胞都有明显的抑制作用，说明所得到的偶联物对这一类乳腺癌都有较好的抑制效果；T-L-C对两种乳腺癌细胞的活性表现在各浓度段都存在差异，P-L-C对两种乳腺癌的活性表现在高浓度段的差异较明显。
综上所述，本发明所述的抗HER2抗体-毛壳素偶联物T-L-C和P-L-C具有明显的抗肿瘤活性，且具有良好的靶向性，能将小分子毒性药物转运到肿瘤部位，提供了一种新型的用于治疗HER2阳性的转移性乳腺癌细胞的抗体偶联药物。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (5)

1.一种具有以下结构式的抗HER2抗体-毛壳素偶联物Trastuzumab-vc-Chaetocin，即T-L-C：
Figure FDA0002892229440000011
其中，抗HER2抗体为曲妥珠单抗Trastuzumab，Trastuzumab经蛋白酶敏感型缬氨酸-瓜氨酸连接基vc与毛壳素(+)-Chaetocin连接，式中的n代表药物抗体偶联比，n的范围为1-2。
2.一种具有以下结构式的抗HER2抗体-毛壳素偶联物Pertuzumab-vc-Chaetocin，即P-L-C：
Figure FDA0002892229440000012
其中，抗HER2抗体为帕妥珠单抗Pertuzumab，Pertuzumab经蛋白酶敏感型缬氨酸-瓜氨酸连接基vc与毛壳素(+)-Chaetocin连接，式中的n代表药物抗体偶联比，n的范围为1-2。
3.一种如权利要求1或2所述的抗HER2抗体-毛壳素偶联物的制备方法，包括以下步骤：
(a)利用Sephadex G-25脱盐柱将曲妥珠单抗或帕妥珠单抗原液置换为磷酸盐反应缓冲液，超滤管浓缩调整抗体浓度，制备曲妥珠单抗或帕妥珠单抗；
(b)向单抗缓冲液中加入TCEP，进行还原反应；所述缓冲液为pH 7.4的PBS缓冲液；TCEP与单抗的摩尔比为12:1；所述还原反应的条件为：37℃水浴反应1.5h；
(c)过Sephadex G-25脱盐柱纯化被还原的单抗，加入带连接基的毛壳素(+)-Chaetocin混合，进行偶联反应；所述连接基为马来酰亚胺修饰的缬氨酸-瓜氨酸二肽；带连接基的毛壳素(+)-Chaetocin与单抗的摩尔比为10:1，所述偶联反应的温度为冰浴反应1.5h；
(d)反应完成后，加入半胱氨酸溶液淬灭反应，过脱盐柱纯化，超滤管浓缩得到所述抗HER2抗体-毛壳素偶联物；所述加入的半胱氨酸为20倍过量摩尔比的20mM溶液，淬灭反应为冰浴下45min。
4.根据权利要求3所述的抗HER2抗体-毛壳素偶联物的制备方法，其特征在于，步骤(c)中，所述带连接基的毛壳素(+)-Chaetocin的制备包括以下步骤：
(A)将毛壳素(+)-Chaetocin与N,N-二异丙基乙胺混合溶解在N,N-二甲基甲酰胺中，在室温氮气保护下搅拌20min；取马来酰亚胺修饰的缬氨酸-瓜氨酸二肽和N,N-二异丙基乙胺加入到反应液中，室温下搅拌过夜；
(B)反应完毕后加入三氟乙酸和乙酸淬灭反应液，油泵减压浓缩，硅胶柱层析纯化得到棕黄色固体。
5.一种如权利要求1或2所述的抗HER2抗体-毛壳素偶联物在制备抗HER2阳性肿瘤药物中的应用。
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