CN107257850A - 用于哺乳动物细胞的高通量聚集和操作的装置 - Google Patents

用于哺乳动物细胞的高通量聚集和操作的装置 Download PDF

Info

Publication number
CN107257850A
CN107257850A CN201480084674.2A CN201480084674A CN107257850A CN 107257850 A CN107257850 A CN 107257850A CN 201480084674 A CN201480084674 A CN 201480084674A CN 107257850 A CN107257850 A CN 107257850A
Authority
CN
China
Prior art keywords
micropore
cell
group
aggregation
hydrogel
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201480084674.2A
Other languages
English (en)
Inventor
西拉克·赫内尔
纳塔莉·布兰登贝格尔
马蒂亚斯·卢图福
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ecole Polytechnique Federale de Lausanne EPFL
Original Assignee
Ecole Polytechnique Federale de Lausanne EPFL
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ecole Polytechnique Federale de Lausanne EPFL filed Critical Ecole Polytechnique Federale de Lausanne EPFL
Publication of CN107257850A publication Critical patent/CN107257850A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/508—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above
    • B01L3/5085—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above for multiple samples, e.g. microtitration plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/26—Inoculator or sampler
    • C12M1/32—Inoculator or sampler multiple field or continuous type
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/12—Well or multiwell plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/16—Microfluidic devices; Capillary tubes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/20—Material Coatings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C12M3/06—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus with filtration, ultrafiltration, inverse osmosis or dialysis means
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/02—Adapting objects or devices to another
    • B01L2200/026—Fluid interfacing between devices or objects, e.g. connectors, inlet details
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
    • B01L2200/0668—Trapping microscopic beads
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0829—Multi-well plates; Microtitration plates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0848—Specific forms of parts of containers
    • B01L2300/0851—Bottom walls
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0893—Geometry, shape and general structure having a very large number of wells, microfabricated wells
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/16—Surface properties and coatings
    • B01L2300/161—Control and use of surface tension forces, e.g. hydrophobic, hydrophilic
    • B01L2300/165—Specific details about hydrophobic, oleophobic surfaces

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

本发明涉及用于聚集细胞的装置(1)，其包含至少一个空腔(2)，其中所述空腔包含多个用于接收至少一个细胞的微孔(3)，其中每一所述孔包含垂直侧壁和弯曲底部。

Description

用于哺乳动物细胞的高通量聚集和操作的装置
技术领域
本申请涉及用于细胞的高通量聚集的装置和所述细胞的长期培养以及在所述装置内对所述细胞的操作。所述细胞聚集用于基础生物学中，特别用于发育和癌症生物学、再生医学和药物筛选中。
本发明还涉及用于制造所述装置的方法。
背景技术
组织自组织为特化细胞、相邻支持细胞、细胞外基质组分与其它连续串扰以确保并维持功能的结构和尺寸元件的复杂三维实体(李(Li)等人2005)。这种多组分微环境称为生态位(niche)，已在用作基础研究的标准化平台的经典二维细胞培养***中经最低限度的简化，所述基础研究在从研究所关注细胞类型的分化的发育生物学到例如致瘤细胞的药理性筛选范围内。然而，所述二维分析的结果关键性地缺少转换回到三维活体内环境的方面(格里菲斯(Griffith)等人2006)。因此，在过去十年间，实验设计已显著朝向更为相关的3D模型(例如细胞聚集物培养)的实施转变(阿博特(Abbott)2003、张(Zhang)2004、帕帕罗尼(Pampaloni)等人2007)。
对于球状体形成，已建立悬滴***以可靠地以良好控制方式形成细胞群集(凯勒(Keller)1995)。简单地说，将细胞悬浮于来自培养板的盖的培养基滴中以通过重力诱导细胞聚集。这种方法极为费力，耗时，并且通常不易适于可扩展培养。尽管对所生成球状体的整个表面确保营养物递送，但以这种模式交换培养基以使得能长期培养聚集物是不可能的。此外，这种***仅能覆盖一定尺寸范围的细胞群集(林(Lin)等人2008)。
已将常规圆底聚苯乙烯96孔板引入用于简化细胞聚集的标准生物细胞培养中。尽管这种培养模式允许接近天然的构造，也就是球形底部空腔(ground cavity)，用于产生宽尺寸范围的细胞群集，但缺点包括难以在不干扰所形成球状体的情况下交换培养基，并且通量仍较低。但是，96孔圆底板是使用最广泛的用于活体外器官发生分析的培养模式(永乐(Eiraku)等人2011、菅直人(Suga)等人2011、那须(Nasu)等人2012、兰凯斯特(Lancaster)等人2013)。
为了克服早期发育生物学领域(这个研究领域中通常在细胞聚集物中培养并分化胚胎干细胞)中的这个问题，最近已提出用于大规模产生胚胎干细胞群集的装置(昂格林(Ungrin)等人2008)。以AggreWellTM(干细胞技术(STEMCELL Technologies)，加拿大，PCT/CA08/00397)出售的装置广告为可再现地大规模产生一致且尺寸受控的胚胎体(EB)的容易的标准化方法。EB是通过将确定浓度的细胞悬浮液离心到尺寸为棱锥体基部直径400或800微米的棱锥形微孔的高密度阵列中以在24小时内起始细胞聚集来生成。AggrewellTM800***实际上具有微孔，所述微孔具有平坦底部平面，代表棱锥形平截头台的最终结构，其部分地(如果并非完全)使初始发明的提供其中将所有细胞收集于总重力的中心点的细胞收集装置的目的失败。此外，所述***通常展现多个限制，这使得它难以应用于细胞球状体的长期培养。在AggreWellTM板中通过高起始细胞接种密度或细胞聚集之后使球状体生长超过24h形成的较大尺寸的EB往往形成锥形结构，反映AggreWellTM微孔的架构。迫使细胞呈非天然构造对细胞的生物功能具有未知影响，并且目前提出，培养基质的形状可诱导不受控并且不确定的细胞系定型(石库(Shiku)等人2013)。另外，AggreWellTM板受限于培养期间的最佳培养基交换，因为例如移液等处理步骤会因朝向平面的大开口暴露于主体培养基而干扰将球状体约束在微孔内。
AggreWellTM板是作为在聚二甲基硅氧烷(PDMS)中铸造的微孔阵列出售，聚二甲基硅氧烷是不容许营养物扩散的硅酮弹性体，所述营养物扩散会影响在暴露于PDMS表面的侧面上的细胞的生长和存活(李(Lee)等人2004)。此外，众所周知，PDMS易于在其表面上吸附生物分子(杜普克(Toepke)等人2006)，此因素有使细胞信号传导和药物筛选实验的最终结果出现偏差的风险。
在最新技术中解决了适宜细胞培养基质的缺乏，所述技术通过应用生物相容性支架(例如天然产生或合成的水凝胶)综合生物学与材料科学(罗利(Rowley)等人1999、卢妥夫(Lutolf)等人2005、蒂比特(Tibbitt)等人2009)。最新技术已开始探索通过2D平底微孔(戈巴(Gobaa)等人2011)或通过3D支架(兰加(Ranga)等人2014)，通过生态位微阵列使用所述生物材料来递送生物活性分子。
业内需要介接(interfacing)可再现细胞聚集技术以用智能功能性生物材料生成单一或多个给定细胞类型的细胞球状体的方法。业内需要在微型空腔中生成这些细胞聚集，所述微型空腔模拟所形成球状体的几何规范并且其中几何形状完全可定制以满足给定生物***的个别需求。业内需要将所有前述需求应用于细胞球状体地大规模产生以提供临床相关数目。业内还需要容许在相同装置上对所产生细胞聚集进行实验和局部操作。
其它现有技术出版物揭示类似的微结构。例如，KR 20130013537 A涉及微结构的制造方法和使用所述微结构收集细胞的方法。
然而，在KR 20130013537中，所揭示方法具有若干限制和缺点，例如：-)孔的形状为半球形或椭球体；
-)孔开口的接触角为最少20°；
-)小孔不可能实现；
-)孔距(孔间隔)与孔直径相等；
-)所用材料限于PDMS；
-)通量由于孔间隔(孔距)而受限；
-)长期培养是不可能的。
发明内容
本发明的目标是改良已知的细胞聚集物***。
本发明的另一目标是提出一***，所述***容许针对使用者关于通量、尺寸和几何形状以及与原位操作技术的相互关系的需要更好地加以调整。
另一目标是提出一***，所述***对使用者友好，可再现并且可靠。
根据本发明提出新颖细胞聚集物***家族，其将还使得能在相同培养模式内长期培养所形成的细胞球状体。
根据本发明，3D培养***由高纵横比圆底形微孔以及U形底形微孔的阵列组成，所述微孔具有低孔距尺寸及高侧壁，所述阵列可在不限于以下的多种材料中复现：PDMS及其它聚合材料，例如塑料，但更重要的是水凝胶，例如那些基于合成亲水聚合物的水凝胶，优选地聚(乙二醇)(PEG)，或天然产生的组分，例如基质胶(Matrigel)、琼脂糖、明胶或胶原。
为制造这些阵列，本发明利用稀聚合物溶液的溶剂蒸发产生圆形以及U形结构。圆形底部形状包括在U形底部形状中。圆底微孔是指U形底形微孔，其中微孔高度等于球形底的半径。下文中将仅使用术语U形底或U形。
然后在所关注基质中模制所形成的U形底微孔结构。尤其使用基于PEG的水凝胶作为基质材料的优点在于对营养物的高通透性、最佳且定制的生物活性，同时确保其它方面的生物惰性(卢妥夫等人2005)。此外，基于PEG的基质将允许所需生物分子选择性偶联到所描绘的微孔的底部，从而还容许研究关于聚集物内的细胞特征和发育的不溶性因子。通过利用U形底微孔的架构，特别是孔深度对直径的纵横比，球状体可包埋在培养基质的表面平面的下方以使例如移动或培养基更换的处理程序的干扰最小化。孔之间在数个细胞直径范围内的最小孔距尺寸足以抑制单细胞停留在这些边界上，所述停留过程可干扰每个孔中的均匀细胞分布并且可展现不受控的信号传导。此外，紧靠微孔平面的用于局部定时递送目标分子的微流体网络的整合容许在长期培养期间选择性操作所形成聚集物。另外，这个平台可应用于通过在所形成球状体的顶部夹心式铸造第二基质层来完全囊封所形成的聚集物，这将容许平面定位并显著促进培养期间的自动化成像。
因此，本发明提供通过以下方式生成包括一或多个细胞类型的细胞聚集物的方法：
(1)对一或多个细胞类型同时进行重力沉降或离心。
(2)对一个细胞类型进行重力沉降或离心，之后接着在前一细胞类型聚集后的任一给定时间通过重力沉降添加另一细胞类型。
总而言之，本发明提出新颖的一体化(all-in-one)2D和3D细胞培养平台，其提供细胞球状体的高通量形成，同时容许其长期培养而无需改变培养模式，同时还通过局部递送用于功能性研究的所需生物活性分子而使得能操作所形成聚集物。
具体实施方式
在一个实施例中，本发明涉及用于聚集细胞的装置，所述装置包含至少一个空腔，其中所述空腔包含多个微孔用于接收至少一个细胞，其中每一所述孔包含垂直侧壁和弯曲底部。
优选地，所述装置包含多个空腔，每一所述空腔包含多个微孔。
在一个实施例中，微孔的直径(d)、高度(h)和孔间距离(孔距，p)没有关联并且可彼此独立地改变。
在一个实施例中，微孔具有1μm至3mm的开口直径。
在一个实施例中，微孔具有1μm至3mm的高度(h)。
在一个实施例中，微孔具有不同尺寸或形状的空腔。
在一个实施例中，微孔之间的间隔(孔距尺寸)极小，使得落在孔区域内的细胞会落在微孔中并参与聚集物形成。
在一个实施例中，微孔之间的间隔在1μm至100μm范围内。
在一个实施例中，装置包含具有通道的微流体网络。
在一个实施例中，通道网络在微孔平面下方。
在一个实施例中，通道网络与微孔对准。
在一个实施例中，通道网络与微孔底部之间的距离小于500μm。
在一个实施例中，所述微孔是在水凝胶层中制得。
在一个实施例中，水凝胶层是基于合成亲水聚合物或天然产生的组分或合成聚合物与天然产生的组分的杂合物。
在一个实施例中，合成亲水聚合物选自包含以下的群组：聚(乙二醇)、聚脂肪族聚氨酯、聚醚聚氨酯、聚酯聚氨酯、聚乙烯共聚物、聚酰胺、聚乙烯醇、聚(环氧乙烷)、聚环氧丙烷、聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化四亚甲、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚(丙烯酸羟乙酯)、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)或其混合物。
在一个实施例中，通过混合并使用化学反应交联至少两种前体组分来制备水凝胶，其中第一前体组分包含n个亲核基团并且第二前体组分包含m个亲电子基团，其中n和m为至少2并且n+m的和为至少5，并且其中所述交联优选地在以下两者之间进行：
-多臂PEG大分子单体，优选地四臂PEG大分子单体，其经亲核基团、优选地硫醇基团末端官能化，与
-多臂PEG大分子单体，优选地八臂PEG大分子单体，其经亲电子基团、优选地乙烯砜基团末端官能化，所述交联是在适当的浓度和条件下进行以例如容许经交联水凝胶层展现介于0.1与100kPa之间的剪切模量。
在一个实施例中，水凝胶包含过量游离官能基，优选地亲核基团，更优选地选自包含胺和硫醇的群组，以及另外或或者亲电子基团，优选地选自包含以下的群组：丙烯酸根、甲基丙烯酸根、酰基-酰胺、甲基丙烯酰胺、丙烯腈、醌、乙烯基-砜、马来酰亚胺和其衍生物。
在一个实施例中，微孔可经一或多种类型的生物分子功能化。
在一个实施例中，生物分子是蛋白质、寡肽、寡核苷酸或糖。
在一个实施例中，蛋白质或肽是ECM产生的或ECM模拟的并且使用异双官能连接体附接到基于PEG的层的亲核或亲电子基团、优选地硫醇基团，其中所述连接体的一个官能基可与附接到聚合物链末端的官能基反应，并且所述连接体的选自包含以下的群组的另一官能基能通过其胺基团非特异性地系接到目标生物分子：琥珀酰亚胺基活性酯，例如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、α-甲基丁酸琥珀酰亚胺基酯、丙酸琥珀酰亚胺基酯；醛、硫醇、硫醇选择性基团，包含丙烯酸酯、马来酰亚胺或乙烯砜；吡啶基硫酯和二硫吡啶。
在一个实施例中，将生物分子加标签以例如通过亲和力系接到水凝胶表面。
在一个实施例中，加标签的生物分子具有标签以使得能结合到选自包含以下的群组的靶：蛋白质A、蛋白质G、蛋白质A/G、抗生蛋白链菌素、中性抗生物素蛋白、NTA、抗体、RNaseA的S-片段、钙调蛋白、纤维素、壳多糖、谷胱甘肽、直链淀粉或具有可与水凝胶网络上的官能基反应的亲核或亲电子官能基的官能化寡肽及寡核苷酸。
在一个实施例中，天然产生的组分选自包含以下的群组：多糖、明胶蛋白和ECM组分，例如琼脂糖、藻酸盐、壳聚糖、葡聚糖、明胶、层粘连蛋白、胶原、透明质酸、纤维蛋白或其混合物，或选自包含以下的复杂组织产生的基质的群组：基质胶、Myogel和Cartigel。
根据本发明，描述用于细胞聚集物的可再现形成和其长期培养的由高密度微米级U形底形微孔制得的新颖培养平台。所述平台受到高度关注，因为显示这些聚集物可形成自组织结构，所述自组织结构显示与常规培养***相比增强的细胞功能并且因此显示更强的关联性。
即使过去十年间已描述其它细胞聚集平台，例如上述AggreWellsTM(昂格林等人2008)和其它平台(吉赛布莱希特(Giselbrecht)等人2006、陈(Chen)等人2008、蔡(Choi)等人2010、刘(Liu)等人2014)，但其都不能制造得到令人满意的细胞聚集的微结构。实际上，球形微米级图案制造是微技术中的主要瓶颈，因为大多数标准工艺都形成具有边缘的结构。
最新研究已显示通过使用冰光刻和随后的PDMS复制来制造准球形微孔(刘等人2014)。尽管使用一般可获得的工具简单容易地制造，但这种技术仍受限于所形成微孔的高度、直径和孔距尺寸的相互依赖性。此外，所述平台的可扩缩性不可靠，如每个阵列的低球状体数目所显示(低于25个)。
与之相比，通过利用稀聚合物溶液的溶剂蒸发(例如基于环氧树脂的负性光致抗蚀剂SU-8)，在浓缩液体于刚性表面上的界面处形成蒸发弯月面(meniscus)，从而赋予形成具有高几何再现性的致密封装的球形微结构的能力。
本发明的主要优势在于，消除微孔直径、高度和孔间距离之间的联系，从而使得阵列几何完全自由。需要对于上文所提到的已经存在的现有技术平台不可能的独立改变这三个参数的能力来研发基于生物应用的平台而不是用于寻找应用的平台。
同样，所提出的U形底形微孔阵列优选地用柔软且高度水合的基质(例如水凝胶)而不是弹性体(例如PDMS)来形成，以尽可能接近地模拟细胞的生理环境。
显示在所提出基质上的单细胞存活显著高于基于PDMS的平台(例如在上文引用的KR现有技术申请中所揭示)并且在所提出基质上催化细胞聚集物生长。
一方面，这些结果确证最近显示的水凝胶与非水合基质相比支持细胞培养的潜力。
另一方面，三维细胞培养***似乎是二维***缺少关联性的重要解答。
对于本发明基于水凝胶的微孔阵列平台显示，可将以高通量方式聚集细胞的能力与通过将这些细胞囊封在水凝胶的上层中而为这些细胞提供三维环境的潜力联系起来。另外，因为所述平台是由水凝胶制得，所以可显示将微流体网络整合到平台中的可能性。
并且，作为使用水凝胶的另一个优点，可显示将生物功能配体化学交联到微孔表面上，使得能评价所系接信号对所培养聚集物的影响的可能性。将三维培养、微流体网络和微孔图案化和生物功能化整合到同一平台中为3D微组织的高分辨率筛选打开了全新的物理化学和时空空间。
最后，显示所述平台可用于任何细胞类型，并且更具体地可用于不形成球状体的细胞类型，例如MDA-MB231，它是在2至3天后形成聚集物并保持紧密聚集至少5天的人类乳癌细胞。
本发明呈现使得能“可控地”细胞共培养的唯一机会。通过以下方式使共培养成为可能：首先同时接种多个细胞类型，或将其它细胞类型添加到进行中的球状体培养中。另外，可在培养期间的任何给定时间添加两个以上细胞类型，以容许***地研究自组织、迁移和细胞再分布。
所呈现技术是高度通用并且创新的多维筛选平台，用于在空间和时间上进行高分辨率筛选。与上文所提到的大多数平台不同，本发明方法在于基于生物应用特异性的平台研发。认为这些种类的完全整合的技术将支持基础生物学进步以及显著催化将研究转化为临床。
根据下文对图的说明将更好地理解本发明，其中
图1A至1D说明本发明的原理；
图2说明根据本发明的微孔阵列三维几何形状(倒置)；
图3说明微孔阵列俯视几何形状；
图4说明U形底微孔阵列的全景；
图5说明对U形底孔制造工艺的概念性描述；
图6A至6C说明U形底微孔的几何形状的理论和实际视图；
图7说明对水凝胶铸造的概念性描述；
图8A至8D说明不同U形微孔尺寸；
图9A至9D说明在具有不同劲度的材料中再现的U形微孔；
图10说明在如所指示的多种材料中产生的U形微孔的实例；
图11说明较小尺寸微孔的实例；
图12A-N说明标准AggreWellTM平台的限制；
图13A-G说明不同细胞密度的实例；
图14A-G说明聚集物生长、尺寸分布和多潜能性维持的实例；
图15说明如所指示的不同细胞类型的聚集潜力的实例；
图16说明如所指示的不形成球状体的细胞类型的聚集潜力的实例；
图17A-C说明三维培养模式的实例；
图18A-F和放大图18G说明具有微流体整合的U形底微孔阵列的实例；
图19说明微孔底的生物功能化的实例；
图20说明呈不同形状的微孔的实例(俯视图和剖视图)。
图1A至1D说明本发明的原理。根据这种原理，提供具有一系列孔2的板1。所述市售孔2的典型尺寸为约6.4-34.8mm直径和1.76cm深度，容纳的总液体体积为0.36-16.8mL，对应于0.1-0.2mL至1.9-2.9mL的工作容积。当然，这是个实例并且可使用具有其它尺寸的其它板1，不管是市售板或特制板。
图1B显示图1A中的板1和其孔2的侧切视图。在这个图1B中见到一组微孔3，其位于每一孔2的底部，形成本发明的一个特征。
在图1C中更详细地说明所述微孔3，图1C是取自图1B的孔2的放大视图。
因此，本发明在实施例中提出，在板1的一组较大孔2中提供一组微孔3。
图2显示具有三维几何形状(倒置)的微孔3阵列4。出于可视化目的，微孔阵列4的三维几何形状是倒置显示。这以用于铸造U形底微孔阵列的负性PDMS印模(例如)的透视图说明U形底微孔3的一般结构。
图3以俯视几何形状说明微孔阵列4的实例。这里显示这些阵列4的理论俯视图。微孔3已经组织化以将阵列4的给定区域的孔密度最大化。同样，微孔3的这种组织化使得可将孔间距离最小化，由此防止细胞在微孔3之间生长。
定义于图1C中的距离d、h和p可用本申请中描述的制造技术独立选择。作为实例，d和h的尺寸可在1μm至3000μm(3mm)范围内；p的尺寸范围可自由选择。对于装置的最佳使用，h应始终大于或等于d，并且p应该尽可能地小，远小于d(p＜＜d)并且通常在1μm-100μm范围内。如果需要，可实现大于100μm的p而不受限制。
图1D说明随孔距尺寸对孔直径的比率而变的细胞捕获面积(由微孔覆盖的面积)的百分比。在10:1比率下，微孔已覆盖总面积的74.95％。这个百分比无法通过进一步减小孔距尺寸来显著增加。
图4说明U形底微孔3阵列的全景。在12孔板1的孔2中铸造底部直径为8mm的阵列(见图1A)。显示具有72个含有Oct4::GFP ESC群集的微孔3的阵列4区域的亮视野和荧光代表图(较小***部分，左侧)。聚集物的尺寸是单分散并且多潜能性标记物Oct4在每个细胞群集中显示。这种聚集物同质性说明U形底微孔3平台的高再现性。
下表1给出每个板具有不同数目的孔2(6、12、24、48和96)的孔板1(见图1A)的实例，孔底部面积和微孔3直径取决于每个孔2中微孔3的数目。
孔板1 6孔 12孔 24孔 48孔 96孔
底部直径(mm) 34.8 22.1 15.6 11 6.4
底部面积(cm2) 9.5 3.8 1.9 0.95 0.32
微孔3直径(μm)
50 135591 54683 27247 13547 4586
100 56035 22598 11260 5598 1895
200 19067 7689 3831 1905 644
300 9500 3831 1909 949 321
400 5672 2287 1139 566 191
500 3766 1518 756 376 127
600 2681 1081 538 267 90
700 2005 808 403 200 67
800 1556 627 312 155 52
900 1242 501 249 124 42
1000 1015 409 204 101 34
1250 659 266 132 65 22
1500 463 186 93 46 15
1750 342 138 68 34 11
2000 263 106 53 26 8
表1
本发明的一个优点在于，其容许在微孔3中容易地再填充培养基。实际上，不是个别地再填充每个所述微孔3，另外这在低于给定微孔尺寸下是不可能的。对于本发明，可能在大于微孔3的孔2水平上作用并且因此更易于再填充。
图5说明根据本发明的U形底微孔3制造工艺的概念性代表图。U形底微孔3是通过稀液体材料(例如聚合物，例如基于环氧树脂的光致抗蚀剂SU-8)的确定体积沉积来形成，以容许通过溶剂蒸发形成球形底部形状。在溶剂蒸发期间，所沉积材料浓缩并润湿微孔3壁以通过表面张力在孔底部形成倒置半球形底部形状5。在所沉积材料固化后，可使用所述结构复制模制以制造微孔3阵列4。
图6A说明蒸发后微孔的最终几何形状的理论描述，如上文关于图5所讨论。显示在孔底部具有倒置SU-8帽5的单一Si孔3的透视图，包括沿中心的剖面。r描绘倒置帽的半径，其等于预蚀刻孔的半径。h1是指孔的深度，其等于在Si中预蚀刻的深度。h2是指在溶剂蒸发前所印刷SU-8的总高度，其约等于预蚀刻孔的半径(图6B)。复制模制到PEG水凝胶中的具有SU-8沉积以形成U形孔底(底部左侧)或不具有(底部右侧)的微孔3的实例给出于图6C的图像中。
图7说明根据本发明的板1的PDMS和水凝胶铸造的概念性描述的实例。在将模板硅印模硅烷化以使表面疏水后，将U形底结构复制模制到PDMS中。然后使用所形成的PDMS U形底微孔底版将任何所需材料铸造至盖玻片上或直接在组织培养板1的孔2底部铸造。盖玻片(如果采用)可以任何适宜方式固定在孔2中，例如通过生物相容性粘合剂薄膜、例如PEG水凝胶薄层来固定。
图8A-8D说明不同U形微孔尺寸的实例。使用PEG水凝胶(G'约12.5kPa)，实现各个参数(距离d、高度h和孔距p)的不同组合。代表100μm、250μm、400μm和1.25mm直径的微孔3的共焦图像(正交视图)(A-D)。这三种不同样品的确切设计如下：
图8A：微孔3具有100μm直径、200μm高度和40μm孔间距离。
图8B：微孔3具有250μm直径、400μm高度和40μm孔间距离。
图8C：微孔3具有400μm直径、400μm高度和40μm孔间距离。
图8D：微孔3具有1.25mm直径、1mm高度和40μm孔间距离。
这显示根据本发明的微孔平台的高度通用性。
图9A至9D说明不同劲度中的U形底微孔。使用具有不同聚合物含量(w/v，1.25％、2.5％、5％、10％，如图中所指示)的PEG水凝胶，显示不同绝对劲度可模制为U形底微孔阵列。本发明的U形底微孔结构易于盖印在劲度为150Pa(G')(图9A)至约30kPa(G')(图9D)的水凝胶中。这个宽覆盖范围对解决关于细胞聚集物与不同刚度基质的相互作用的生物学问题至关重要。
图10说明如图中所指示的可使用的多种材料。从PDMS负模以上述图案盖印不同材料。可将PDMS复制模制以在PDMS中产生U形底微孔阵列。优选地，将U形底微孔阵列在柔软生物相容性聚合物中再现：显示标准合成水凝胶(例如聚乙二醇(PEG))以及天然水凝胶(例如琼脂糖、藻酸盐、明胶、基质胶和胶原)可模制。当然，可使用其它等效材料。
图11说明小尺寸孔的实施例。在12.5kPa PEG水凝胶中模制尺寸包含在10μm与50μm孔之间的微孔3以产生单细胞培养平台。单细胞顺利接种于单独孔中。
图12(A)至(N)显示标准AggreWellTM平台的限制。在400μm直径U形底微孔(A-D)中以及400μm尺寸AggrewellsTM(E-H)中培养24h后所收获Oct4::GFP ESC聚集物(即500、1000、2000和3000个细胞/微孔)的亮视野代表图。观察到AggreWellTM平台的若干个限制。如已提出(石库等人2013)在棱锥形微孔中聚集的细胞采用棱锥形(顶部)。这可在多种不同细胞接种密度下见到，例如500、1000、2000和3000个细胞/微孔(箭头)。然而，在U形底微孔中形成的细胞聚集物显著更圆。实际上，发现对于大多数细胞密度，球状体偏心率(I)、形状因子(J)和紧性(K)在U形底微孔与AggrewellsTM之间显著不同。这种紧性的缺乏通过评价两个平台之间收获后的漂浮细胞数来确认(L)，并且发现，与本发明的U形底微孔相比，在收获后更多单细胞漂浮在AggrewellsTM条件的上清液中。最后，使用延时成像，观察到接种至AggreWellTM表面(PDMS表面)上的细胞聚集物(例如Oct4::GFP ESC(M)和NIH3T3成纤维细胞(N)聚集物)沿微孔壁爬行。这些观察显示需要新颖培养平台(例如本发明)，其使用更加惰性的培养基质和显示高于PDMS的生物相容性的培养基质。
图13(A)至(G)说明所测量不同细胞密度的实例。使用小鼠Oct4::GFP ESC，以三种细胞密度
(A)1个细胞/微孔，
(B)100个细胞/微孔，
(C)500个细胞/微孔，
接种至400μm直径和400μm高度U形底微孔中。在24h后评价每种密度的尺寸分布。在这个阶段期间，1个细胞/微孔、100个细胞/微孔和140个细胞/微孔的聚集物分别生长到约25μm、110μm和140μm。
(D)单细胞在5天阶段期间的生长的亮视野代表图。可观察到不同单细胞的生长潜力不同。因此，本发明微孔阵列是在单细胞水平评价干细胞群的异质性(例如其不同克隆扩增潜力)的有效工具。
(E)在本发明U形底微孔阵列(RBW PEG)中评价单一胚胎干细胞活力并与标准AggreWellTM阵列(AW PDMS)相比较。本发明阵列支持显著单细胞存活。***对应于p<0.001。
(F)在AggreWellTM中5天后评价来自单细胞的克隆扩增集落的尺寸分布，和
(G)在本发明U形底微孔阵列中5天后评价所述尺寸分布。
与AggrewellTM平台相比，在本发明U形底微孔中形成并培养的聚集物的尺寸更均匀。
图14(A)至(G)说明聚集物生长、尺寸分布和多潜能性维持。评价与AggreWellTM平台(AW PDMS)相比，在本发明U形底微孔平台中5天(RBW PEG)的小鼠Oct4::GFP ESC的聚集物生长(A)。与AggreWellsTM相比，在压实细胞后，在本发明U形底微孔中群集的生长显著改良(B、C)。在第5天评价聚集物的尺寸分布。本发明U形底微孔平台(C)显示聚集物尺寸与AggreWellsTM(B)相比的较高单分散性。
(D)在U形底微孔阵列中在5天阶段期间，500个细胞/微孔的生长的亮视野代表图。聚集物生长在阵列中几乎一致。因此，本发明微孔平台显示高通量生成单分散聚集物的高潜力。
(E)另外，评价两个平台在更换培养基时的聚集物损失。未观察到显著差异。在更换培养基时损失平均少于7％的聚集物。
(F)还评价平台的聚集物回收。未观察到显著差异。可回收近100％的聚集物。最后，每天通过FACS分析主要ESC多潜能性标记物Oct4的维持(数据未显示)。
在第5天(G)，仍有99.0％细胞表达所述标记物，其与标准维持培养物相当。
图15说明如图中所指示的不同细胞类型的聚集潜力的实例。将各种细胞类型接种到本发明的U形底微孔阵列上。显示C2C12、HEK293T、NIH3T3成纤维细胞、NMuMG/E9和人类MSC PT-2501的亮视野代表图。不同细胞类型顺利形成聚集物并且可维持5天。所述细胞类型也都顺利收获并保持群集(仅显示hMSC PT-2501的数据作为代表性实例)。这种高度通用性显示本发明微孔平台的高潜力。
图16说明如图中所指示的不形成球状体的细胞类型的聚集潜力的实例。将不形成球状体的细胞接种到本发明U形底微孔阵列上。显示MCF-7、MDA-MB231和OP9在不同培养时间的亮视野代表图以及在第5天的相应收获聚集物。不同细胞类型顺利形成聚集物并且可维持5天。同样，所有三种细胞类型都顺利收获并保持群集。
图17(A)至(C)说明三维培养模式的实例。
(A)通过基质的第二层6的夹心式铸造3D囊封的聚集物的透视图，显示本发明技术组合将聚集物定位于一个单一z平面中以使得能进行囊封三维培养的潜力。
(B)说明夹心式铸造概念的证明。制造U形底微孔3(400μm直径，400μm高度和40μm孔距)的第一层。在这个第一层的微孔中通过重力沉降捕获PEG微珠(≈200μm直径，G'10-40kPa)以模拟细胞群集。在阵列顶部上铸造PEG水凝胶的第二层以形成三维培养物，从而完全囊封PEG微珠。
(C)夹心式铸造方法的共焦代表图。这显示本发明平台制造高通量平面三维培养物的潜力。
图18(A)至(F)和18G说明本发明U形底微孔阵列，其具有通过可灌注微米级通道的微流体整合。
示意性说明本发明U形底微孔3阵列的俯视图(A)和侧切视图(B)，所述阵列整合有微流体网络，其例如包含通道15、16，所述通道连接至相应入口15'、16'和出口15"和16"，透视图见图18G。
网络5、6可位于微孔3平面下方并与其对准或不对准。
在变体中，可存在若干个彼此相邻或互联的独立网络。
图19说明微孔底的功能化的实例。U形底形微孔3(270μm直径，400μm高度，40μm孔距)的共焦代表图。微孔3的底部经模型蛋白质(此处为BSA)功能化。
图20说明不同形状的本发明微孔3的实例。具有多种几何形状的微孔3的示意性代表图。可用上文所讨论技术使用任何形状(例如三角形、正方形、环形体和完全不规则结构)产生U形底微孔。这些形状可用于多种应用；其尤其可为用于评价培养基质几何形状对细胞功能的影响的有效工具。图20说明俯视图和沿A-A和B-B的剖视图。
制造/材料和方法
U形底微孔阵列制造
使用Si Bosch工艺，在硅基质中蚀刻出所需尺寸的平底微孔(此处为圆柱形)。然后，使用喷墨印刷将准确体积的稀液体材料(例如聚合物，例如正性光致抗蚀剂SU-8)添加至这些孔中。其它沉积技术可包括自动化液体分配(例如机器人液体处理工作站)、人工分配(例如移液)或任何其它类型的沉积方法。蒸发后，材料形成蒸发弯月面，并产生球形底以形成U形结构(见图5和6)。所述材料完全固化并且用作用于PDMS复制模制的图案，然后使用其作为最终基质(例如水凝胶)的模制图案。这种复制模制工艺容许将硅基质几何形状复制到所需最终基质中(见图7)。
对于如图11和13-16中所示的单细胞培养和聚集物培养，使用上文所提到的方法和数值的在每个尺寸范围内的本发明U形底微孔3的微型制造很有希望产生极高密度的微孔阵列(见图4)。
可模制材料
任何种类的水凝胶(即合成水凝胶以及天然的或天然产生的水凝胶)，例如PEG、琼脂糖、藻酸盐、明胶、胶原、基质胶、聚合物(例如PDMS、SU-8等)、塑料(例如PMMA、PLA、PPA、PP、PE等)、陶瓷、金属、合金、矿物质、非金属矿物质和玻璃。
细胞培养
将由奥斯汀史密斯(Austin Smith)(剑桥大学(University of Cambridge))提供的Oct4::GFP小鼠胚胎干细胞(mESC)在没有饲养细胞的情况下以常规方式在补充有白血病抑制因子(LIF)、ESC筛选的胎牛血清(FBS，吉布科(Gibco))(15％)培养基、非必需氨基酸(NEAA)丙酮酸钠(10mM)和b-巯基乙醇(0.1mM)的杜尔贝科改良伊戈尔培养基(Dulbecco'sModified Eagle Medium，DMEM)(下文称作ES细胞培养基(史密斯1991))中扩增。
将人类间质干细胞(hMSC,PT-2501,龙沙(Lonza))和OP9鼠类基质细胞以常规方式维持在补充有10％FCS(海克隆(Hyclone)，批号AUA33984)和1ng/mL人类FGF-2(派普泰克(Peprotech))的α-MEM中。
将NIH3T3成纤维细胞、MCF-7人类乳癌细胞、MDA-MB231人类乳癌细胞、C2C12小鼠成肌细胞、NMuMG E9小鼠乳癌细胞和人类胚肾(HEK)293细胞以常规方式维持在补充有10％胎牛血清(FBS)、HEPES(10mM)和丙酮酸钠(1mM)的DMEM中。
聚集物形成
用胰蛋白酶使细胞脱离。在细胞类型特异性培养基中制备具有目标密度的细胞悬浮液(即3×105个细胞/mL、6×104个细胞/mL和1000个细胞/mL，分别用于实现500个细胞/微孔、100个细胞/微孔和1个细胞/微孔)。在24孔板的孔底部铸造U形底形微孔阵列并在孔中添加2mL所制备细胞溶液。通过重力沉降使细胞沉降。
将细胞培养5天并且每天更换相应培养基。
结果/应用和实例
不同基质中和不同尺寸的U形底微孔
在多种细胞培养相容性基质(包括PDMS、PEG、琼脂糖、明胶、藻酸盐和基质胶)中模制不同尺寸(图8)的U形底微孔3阵列4。为了测试在不同劲度的基质中的再现性，在聚合物含量(w/v)在2.5％至10％范围内的PEG中模制U形底微孔3阵列4(图9)。可铸造的最低PEG劲度被测定为150Pa，相当于2.5％PEG聚合物含量(如通过流变学所测定)，在低于其的劲度下不再完全保证微孔3结构的架构。通过所保留的架构显示，U形底微孔3可在上文所提到的材料中有效再现(见图10)。
单细胞扩增和活力
平铺小于的数目的低细胞密度以最大化孔3内的单细胞分布。在PEG(RBW PEG)与AggreWellTM400(AW PDMS)的400μm直径的U形底微孔之间，在5天时间范围期间每24小时对单细胞的扩增和活力进行量化(见图17D)。所培养单一Oct4::eGFP ES细胞的存活率从AWPDMS上的48.36％±31.74％显著(p<0.0001)增加到RBW PEG上的85.05％±8.51％(见图17E)。在RBW PEG上培养的其它单细胞在5天扩增后生长为与AW PDMS相比更大且更加单分散的聚集物群体(见图17F-G)。
最先进商业平台的限制
在400μm直径的U形底微孔(见图12A-D)相对于最先进AggreWellsTM400(见图12E-H)中生成的EB之间比较接种后24h的聚集物尺寸。观察到与U形底微孔相反，AggreWellTM空腔的棱锥形状导致生成变形EB，这是由于聚集物适应孔形状所致(图3.4A-C，黑色箭头)。还观察到在较高接种密度(2000和3000个细胞/EB)下，对于U形底微孔与AggreWellsTM相比(图12C-D相对于G-H)观察到更稳健的球状体形成，如上清液中漂浮细胞的较低计数所显示(图12L)。通常，在U形底微孔中形成的EB显示更佳偏心率(图12I)、形状因子和紧性(图12I-K)指数。这些结果指示，球状体形成通常在U形底微孔中得以加强。
另外观察到，在AggrewellsTM中聚集并培养的ES细胞通常在不到24h内就开始附着到PDMS表面(图12M、N)。所附着聚集物利用倾斜的棱锥形微孔的边界沿边缘爬行。这导致聚集物融合并形成更分散的球状体群体。
聚集物尺寸
使用5％(w/v)PEG水凝胶中的U形底微孔3阵列4聚集并培养Oct4::eGFP转基因小鼠ES细胞。初始聚集物尺寸可通过调整细胞接种密度来控制。以单细胞、100个细胞/EB和500个细胞/EB的密度为目标。测定并比较接种后24h的聚集物尺寸(见图13A-C)。单细胞、100个细胞、500个细胞导致EB为10-40μm、90-130μm和110-170μm直径。
聚集物生长
在PEG中具有400μm直径的U形底微孔(RBW PEG)与AggreWellTM400(AW PDMS)之间，在5天时程期间从起始密度为500个细胞的EB对聚集物生长进行量化(见图14D)。对于RBWPEG，在48h后生长速率显著增加(p<0.0001)(见图14A)。此外，与AW PDMS相比，在RBW PEG上培养500个Oct4::eGFP细胞/微孔导致更大并且更加单分散的最终聚集物群体(见图14C-D)。
培养基更换和聚集物回收
在AW PDMS和RBW PEG二者上，对于连续5天中的每天，每24h通过抽吸出全部体积的旧培养基并通过在培养板的侧壁温和移液等量交换来交换培养基。在每次更换培养基后对全部阵列表面进行成像并对聚集物损失进行量化。AW PDMS和RBW PEG二者的聚集物损失远低于10％(见图14E)。
通过在孔中心上下移液三次回收聚集物，每轮完全液体交换，并且随后将上清液转移到新的培养板。在这个程序后对全部阵列进行成像以对聚集物回收进行量化。AW PDMS和RBW PEG二者的聚集物回收接近100％(见图14F)。所回收聚集物可用于其它生物学分析。通过流式细胞术测定从在RBW PEG上培养5天的EB解离的细胞的Oct4表达。99％的所述细胞在培养后保留其Oct4表达(见图14G)。
各种细胞类型的聚集
在5％(w/v)PEG水凝胶中模制U形底微孔阵列。在这些微孔阵列內以给定的开始密度形成各种细胞类型的聚集物。C2C12、HEK293T、NIH 3T3成纤维细胞、NMuMG克隆E9和人类间质干细胞可在U形底微孔上在24小时内有效形成群集。所述群集稳定并且可在培养后有效收获，如对于人类MSC所显示(图15)。
U形底微孔3可用于分析固有地抵抗聚集的细胞，如通过不形成球状体的癌症细胞系MDA MB231所显示。在24小时内，细胞形成松散封装的群集，其在培养中在后续几天期间进一步压实，使得甚至可在120小时后从微孔3阵列4收回稳定的群集(图16顶部图)。
小鼠OP9细胞在24小时内形成稳定群集。使细胞在培养中保持这种构造，所述细胞在外生脂肪形成分化因子(***(Dexamethasone)、IBMX和胰岛素)不存在下也在3天内有效分化为脂肪细胞。可在这个时间点从微孔阵列收获脂肪细胞群集(见图16，底部图)。
平面3D囊封
U形底微孔阵列可用于细胞和球状体的平面3D囊封以改良成像质量以及耗时。作为概念的证明，形成5％(w/v)PEG-Alexa546U形底微孔阵列。在聚合后，将200μm 10％PEG-Alexa488珠分布在微孔阵列顶部上并使其沉降到空腔中。随后用5％(w/v)PEG-Alexa647的第二层密封填充所述珠的阵列，从而在3D PEG环境中的一个焦平面中完全囊封所述珠(见图17)。
聚集物微流体
为了容许在形成后在无需转移到新的培养板的情况下对细胞球状体进行局部并且短暂的生物化学操作，通过在微孔3的平面下微模制生成紧密邻近的(距离<500μm)微流体通道，以确保所需分子在24h内扩散。作为原理的证明，通过U形底微孔阵列下方的通道灌注FITC标记的高分子量(2000kDa)葡聚糖。葡聚糖无法通过水凝胶网络灌注，因此只能有效并且选择性地标记微流体通道的内侧(见图18)。
微孔功能化
U形底微孔3可根据先前所述的方法用不同蛋白质功能化(科布尔(Kobel)等人2012)。简单来说，在亲水载玻片上形成蛋白质薄膜，在其上放置PDMS印模以容许蛋白质吸附到PDMS表面上。在PEG的后续模制步骤期间，将蛋白质转移到水凝胶表面，其中通过静电相互作用或共价键的形成将其纳入水凝胶网中。作为原理的证明，使用Alexa-647标记的BSA功能化5％(w/v)PEG-Alexa488水凝胶(见图19)。
不同形状的微孔
使用所呈现的技术，可制造任何形状的U形底微孔3用于特定应用(见图20)。实际上，已显示细胞或细胞聚集物功能受到其培养基质的几何形状的显著影响。因此，所呈现的微孔3阵列4有很大可能可解答功能如何与几何形状相关联的问题。
本申请中所述的实例、实施例和工艺步骤是以实例方式给出并且不应以限制性方式来理解。
借助等效装置、材料和方法或步骤，在本发明范围内其它变化形式是可能的。也可根据情况视需要组合本文所述的实施例。
参考文献
阿博特,A.(2003).“细胞培养：生物学的新维度(Cell culture:biology's newdimension).”自然(Nature)424(6951):870-872。
陈,C.S.、J.佩甘(J.Pegan)、J.露娜(J.Luna)、B.夏(B.Xia)、K.麦克洛斯基(K.McCloskey)、W.C.金(W.C.Chin)和M.凯恩(M.Khine)(2008).“热缩悬滴：形成并培养胚状体的简单方式(Shrinky-dink hanging drops:a simple way to form and cultureembryoid bodies).”)可视化实验杂志(J Vis Exp)(13)。
蔡,Y.Y.、B.G.钟(B.G.Chung)、D.H.李、A.卡登胡希尼(A.Khademhosseini)、J.H.金(J.H.Kim)和S.H.李(2010).“在凹面微孔阵列中的尺寸受控的胚状体形成(Controlled-size embryoid body formation in concave microwell arrays).”生物材料 (Biomaterials)31(15):4296-4303。
永乐,M.、N.高田(N.Takata)、H.石桥(H.Ishibashi)、M.川田(M.Kawada)、E.坂仓(E.Sakakura)、S.奥田(S.Okuda)、K.关口(K.Sekiguchi),T.安达(T.Adachi)和Y.笹井(Y.Sasai)(2011).“三维培养中的自组织光学杯形态发生(Self-organizing optic-cupmorphogenesis in three-dimensional culture).”自然472(7341):51-56。
吉赛布莱希特,S.、T.吉策尔特(T.Gietzelt)、E.哥特瓦尔德(E.Gottwald)、C.特劳特曼(C.Trautmann)、R.德拉肯穆勒(R.Truckenmuller)、K.F.魏贝赞(K.F.Weibezahn)和A.瓦力(A.Welle)(2006).“通过预处理聚合物膜的微热成型产生的3D组织培养基质(3Dtissue culture substrates produced by microthermoforming of pre-processedpolymer films).”生物医学微型装置(Biomed Microdevices)8(3):191-199。
戈巴,S.、S.赫尼尔(S.Hoehnel)、M.拉乔(M.Roccio)、A.尼格若(A.Negro)、S.科布尔和M.P.卢妥夫(2011).“用于以高通量探测单一干细胞命运的人工生态位微阵列(Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in highthroughput).”自然方法(Nat Methods)8f(11):949-955。
格里菲斯,L.G.和M.A.斯沃茨(M.A.Swartz)(2006).“在体外捕获复杂3D组织生理学(Capturing complex 3D tissue physiology in vitro).”自然评论：分子细胞生物学 (Nat Rev Mol Cell Biol)7(3):211-224。
凯勒,G.M.(1995).“胚胎干细胞的体外分化(In-Vitro Differentiation ofEmbryonic Stem-Cells).”细胞生物学近论(Current Opinion In Cell Biology)7(6):862-869。
科布尔,S.A.和M.P.卢妥夫(2012).“用于高通量单一干细胞培养和分析的PEG水凝胶微孔阵列的制造(Fabrication of PEG hydrogel microwell arrays for high-throughput single stem cell culture and analysis).”分子生物学方法(Methods Mol Biol)811:101-112。
兰凯斯特,M.A.、M.伦纳(M.Renner)、C.A.马丁(C.A.Martin)、D.文策尔(D.Wenzel)、L.S.比克内尔(L.S.Bicknell)、M.E.谢勒(M.E.Hurles)、T.荷弗瑞(T.Homfray)、J.M.彭宁格(J.M.Penninger)、A.P.杰克逊(A.P.Jackson)和J.A.诺布里奇(J.A.Knoblich)(2013).“人类脑发育和小头畸形的大脑类器官模型(Cerebralorganoidsmodel human brain development and microcephaly).”自然501(7467):373-379。
李,J.N.、X.姜(X.Jiang)、D.莱恩(D.Ryan)和G.M.怀特赛兹(G.M.Whitesides)(2004).“聚(二甲基硅氧烷)表面上的哺乳动物细胞的相容性(Compatibility ofmammalian cells on surfaces of poly(dimethylsiloxane)).”朗缪尔(Langmuir)20(26):11684-11691.
李,L.和T.谢(T.Xie)(2005).“干细胞生态位：结构与功能(Stem cell niche:structure and function).”细胞与发育生物学年度评论(Annu Rev Cell Dey_Biol)21:605-631。
林,R.Z.和H.Y.章(H.Y.Chang)(2008).“用于生物医学研究的三维多细胞球状体培养的最新进展(Recent advances in three-dimensional multicellular spheroidculture for biomedical research).”生物技术杂志(Biotechnol J)3(9-10):1172-1184。
刘,T.、M.温特(M.Winter)和B.蒂埃里(B.Thierry)(2014).“用于多细胞球状体的长期培养和高通量分析的超疏水基质上的准球形微孔(Quasi-spherical microwells onsuperhydrophobic substrates for long term culture of multicellular spheroidsand high throughput assays).”生物材料.
卢妥夫,M.P.和J.A.哈贝尔(J.A.Hubbell)(2005).“作为用于组织工程化中的形态发生的指导性细胞***环境的合成生物材料(Synthetic biomaterials asinstructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissueengineering).”自然生物技术(Nature Biotechnology)23(1):47-55。
那须,M.、N.高田、T.墰上(T.Danjo)、H.坂口(H.Sakaguchi)、T.角岛(T.Kadoshima)、S.二木(S.Futaki)、K.关口、M.永乐和Y.笹井(2012).“在小鼠ES细胞培养中通过含有层粘连蛋白的基质稳健形成并维持连续分层皮质神经上皮(Robust formationand maintenance of continuous stratified cortical neuroepithelium by laminin-containing matrix in mouse ES cell culture).”公共科学图书馆(PLoS One)7(12):e53024。
帕帕罗尼,F.、E.G.雷诺(E.G.Reynaud)和E.H.K.施特尔策(E.H.K.Stelzer)(2007).“桥联细胞培养与活组织之间的间隔的第三维度(The third dimension bridgesthe gap between cell culture and live tissue).”自然评论：分子细胞生物学8(10):839-845。
兰加,A.、S.戈巴、Y.冈和(Y.Okawa)、K.莫西维茨(K.Mosiewicz)、A.尼格若和M.P.卢妥夫(2014).“用于在***层面分析细胞命运的3D生态位微阵列(3D niche microarraysfor systems-level analyses of cell fate).”自然通讯(Nat Commun)5:4324。
罗利,J.A.、G.麦德拉班(G.Madlambayan)和D.J.穆尼(D.J.Mooney)(1999).“作为合成细胞外基质材料的藻酸盐水凝胶(Alginate hydrogels as syntheticextracellular matrix materials).”生物材料20(1):45-53。
石库,H.、T.新井(T.Arai)、Y.周(Y.Zhou)、N.青木(N.Aoki)、T.西条(T.Nishijo)、Y.堀口(Y.Horiguchi)、K.井野(K.Ino)和T.松江(T.Matsue)(2013).“小鼠胚状体的呼吸活性和其与未分化/分化标记物的mRNA水平的关联的非侵入性测量(Noninvasivemeasurement of respiratory activity of mouse embryoid bodies and itscorrelation with mRNA levels of undifferentiation/differentiation markers).”分子生物***(Mol Biosvst)9(11):2701-2711。
史密斯,A.(1991).“胚胎干细胞的培养和分化(Culture and differentiationof embryonic stem cells).”组织培养方法学杂志(I.Tiss.Cult.Meth)(13):89-94。
菅直人,H.、T.直树(T.Kadoshima)、M.皆口(M.Minaguchi)、M.武司(M.Ohgushi)、M.早园(M.Soen)、T.中野(T.Nakano)、N.高田、T.绵谷(T.Wataya)、K.六车(K.Muguruma)、H.三好(H.Miyoshi)、S.米村(S.Yonemura)、Y.大矶(Y.Oiso)和Y.笹井(2011).“三维培养中功能性腺垂体的自形成(Self-formation of functional adenohypophysis in three-dimensional culture).”自然480(7375):57-62。
蒂比特,M.W.和K.S.安赛斯(K.S.Anseth)(2009).“作为用于3D细胞培养的细胞外基质模拟物的水凝胶(Hydrogels as Extracellular Matrix Mimics for 3D CellCulture).”生物技术与生物工程(Biotechnology and Bioengineering)103(4):655-663。
杜普克,M.W.和D.J.毕比(D.J.Beebe)(2006).“小分子的PDMS吸收和在微流体应用中的结果(PDMS absorption of small molecules and consequences inmicrofluidic applications).”芯片实验室(Lab Chip)6(12):1484-1486。
昂格林,M.D.、C.乔西(C.Joshi)、A.尼加(A.Nica)、C.博旺(C.Bauwens)和P.W.德史塔(P.W.Zandstra)(2008).“来自单细胞悬浮液来源的人类胚胎干细胞聚集物的多细胞组织的可再现的超高通量形成(Reproducible,ultra high-throughput formation ofmulticellular organization from single cell suspension-derived humanembryonic stem cell aggregates).”公共科学图书馆3(2):el565。
张,S.(2004).“培养皿以外(Beyond the Petri dish).”自然生物技术(Nat Biotechnol)22(2):151-152。

Claims (23)

1.一种用于聚集细胞的装置(1)，其包含至少一个空腔(2)，其中所述空腔包含多个用于接收至少一个细胞的微孔(3)，其中每一所述孔包含垂直侧壁和弯曲底部。
2.根据权利要求1所述的装置，其中所述装置包含多个空腔(2)，每一所述空腔(2)包含多个微孔(3)。
3.根据前述权利要求中任一权利要求所述的装置，其中所述微孔(3)的直径(d)、高度(h)和孔间距离(孔距，p)没有关联并且可彼此独立地改变。
4.根据前述权利要求中任一权利要求所述的装置，其中所述微孔(3)具有1μm至3mm的开口直径(d)。
5.根据前述权利要求中任一权利要求所述的装置，其中所述微孔(3)具有1μm至3mm的高度(h)。
6.根据前述权利要求中任一权利要求所述的装置，其中所述微孔(3)具有不同尺寸或形状的空腔。
7.根据前述权利要求中任一权利要求所述的装置，其中所述微孔(3)之间的所述间隔(孔距尺寸)极小，使得落在所述孔区域内的细胞将落在微孔(3)中并参与聚集物形成。
8.根据前述权利要求中任一权利要求所述的装置，其中所述微孔之间的所述间隔在1μm至100μm范围内。
9.根据前述权利要求中任一权利要求所述的装置，其中其包含具有通道(5、6)的微流体网络。
10.根据前述权利要求所述的装置，其中通道的所述网络在所述微孔(3)的平面下方。
11.根据权利要求9或10中任一权利要求所述的装置，其中通道(5、6)的所述网络与所述微孔(3)对准。
12.根据权利要求9至11中任一权利要求所述的装置，其中通道(5、6)的所述网络与所述微孔(3)的底部之间的距离小于500μm。
13.根据前述权利要求中任一权利要求所述的装置，其中所述微孔(3)是在水凝胶层中制得。
14.根据权利要求13所述的装置，其中所述水凝胶层是基于合成亲水聚合物、或天然产生的组分、或合成聚合物与天然产生的组分的杂合物。
15.根据前述权利要求所述的装置，其中所述合成亲水聚合物选自包含以下的群组：聚(乙二醇)、聚脂肪族聚氨酯、聚醚聚氨酯、聚酯聚氨酯、聚乙烯共聚物、聚酰胺、聚乙烯醇、聚(环氧乙烷)、聚环氧丙烷、聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化四亚甲、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚(丙烯酸羟乙酯)、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)或其混合物。
16.根据权利要求15所述的装置，其中所述水凝胶是通过混合并使用化学反应交联至少两种前体组分来制备，其中第一前体组分包含n个亲核基团并且第二前体组分包含m个亲电子基团，其中n和m为至少2并且n+m的和为至少5，并且其中所述交联优选地在以下二者之间进行：
多臂PEG大分子单体，优选地四臂PEG大分子单体，其经亲核基团、优选地硫醇基团末端官能化，与
多臂PEG大分子单体，优选地八臂PEG大分子单体，其经亲电子基团、优选地乙烯砜基团末端官能化，所述交联是在适当浓度和条件下进行，以容许经交联水凝胶层展现介于0.1与100kPa之间的剪切模量。
17.根据权利要求13至16中任一权利要求所述的装置，其中所述水凝胶包含过量的游离官能基，优选地亲核基团，更优选地选自包含胺和硫醇的群组，以及另外或或者亲电子基团，优选地选自包含以下的群组：丙烯酸根、甲基丙烯酸根、酰基-酰胺、甲基丙烯酰胺、丙烯腈、醌、乙烯基-砜、马来酰亚胺和其衍生物。
18.根据权利要求1至17中任一权利要求所述的装置，其中所述微孔经一或多种类型的生物分子功能化。
19.根据权利要求18所述的装置，其中所述生物分子是蛋白质、寡肽、寡核苷酸或糖。
20.根据权利要求19所述的装置，其中所述蛋白质或肽是ECM产生的或ECM模拟的并且使用异双官能连接体附接到基于PEG的层的所述亲核或亲电子基团、优选地所述硫醇基团，其中所述连接体的一个官能基可与附接到所述聚合物链末端的所述官能基反应，并且所述连接体的选自包含以下的群组的另一官能基能通过其胺基团非特异性地系接到所述目标生物分子：琥珀酰亚胺基活性酯，例如N-羟基琥珀酰亚胺NHS、α-甲基丁酸琥珀酰亚胺基酯、丙酸琥珀酰亚胺基酯；醛、硫醇、硫醇选择性基团，包含丙烯酸酯、马来酰亚胺或乙烯砜；吡啶基硫酯和二硫吡啶。
21.根据权利要求18至20中任一权利要求所述的装置，其中将所述生物分子加标签以例如通过亲和力系接到所述水凝胶表面。
22.根据权利要求21所述的装置，其中所述加标签的生物分子具有标签以使得能结合到选自包含以下的群组的靶：蛋白质A、蛋白质G、蛋白质A/G、抗生蛋白链菌素、中性抗生物素蛋白、NTA、抗体、RNaseA的S-片段、钙调蛋白、纤维素、壳多糖、谷胱甘肽、直链淀粉或具有可与水凝胶网络上的官能基反应的亲核或亲电子官能基的官能化寡肽及寡核苷酸。
23.根据权利要求14所述的装置，其中所述天然产生的组分选自包含以下的群组：多糖、明胶蛋白和ECM组分，例如琼脂糖、藻酸盐、壳聚糖、葡聚糖、明胶、层粘连蛋白、胶原、透明质酸、纤维蛋白或其混合物，或选自包含以下的复杂组织产生的基质的群组：基质胶、Myogel和Cartigel。
CN201480084674.2A 2014-12-22 2014-12-22 用于哺乳动物细胞的高通量聚集和操作的装置 Pending CN107257850A (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/IB2014/067242 WO2016103002A1 (en) 2014-12-22 2014-12-22 Devices for high-throughput aggregation and manipulation of mammalian cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107257850A true CN107257850A (zh) 2017-10-17

Family

ID=52424070

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480084674.2A Pending CN107257850A (zh) 2014-12-22 2014-12-22 用于哺乳动物细胞的高通量聚集和操作的装置

Country Status (9)

Country Link
US (1) US11583860B2 (zh)
EP (1) EP3237597B1 (zh)
JP (1) JP7089240B2 (zh)
CN (1) CN107257850A (zh)
CA (1) CA2972057C (zh)
DK (1) DK3237597T3 (zh)
ES (1) ES2858600T3 (zh)
PT (1) PT3237597T (zh)
WO (1) WO2016103002A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112063525A (zh) * 2019-06-10 2020-12-11 芬欧汇川集团 细胞培养板，其制备方法和检测物质的方法
CN112534038A (zh) * 2018-05-30 2021-03-19 太阳生物科学股份公司 一种用于培养生物材料的孔

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9719068B2 (en) 2010-05-06 2017-08-01 Children's Hospital Medical Center Methods and systems for converting precursor cells into intestinal tissues through directed differentiation
JP6489484B2 (ja) * 2014-02-27 2019-03-27 公立大学法人横浜市立大学 自己組織化用細胞集合体の作製方法
CA2949834A1 (en) 2014-05-28 2015-12-03 James Macormack Wells Methods and systems for converting precursor cells into gastric tissues through directed differentiation
JP6804438B2 (ja) 2014-10-17 2020-12-23 チルドレンズ ホスピタル メディカル センター 多能性幹細胞を使用するヒト小腸のｉｎ ｖｉｖｏモデル、並びにそれを作製、及び使用する方法
CA3016641A1 (en) 2016-05-05 2017-11-09 Children's Hospital Medical Center Methods for the in vitro manufacture of gastric fundus tissue and compositions related to same
EP3296018A1 (en) 2016-09-19 2018-03-21 Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL) Organoid arrays
JP6779483B2 (ja) * 2016-09-29 2020-11-04 住友ゴム工業株式会社 医療用検査装置及び細胞検査方法
JP6485783B2 (ja) * 2016-09-29 2019-03-20 住友ゴム工業株式会社 医療用検査装置及び細胞検査方法
JP6518985B2 (ja) * 2016-09-29 2019-05-29 住友ゴム工業株式会社 がん細胞捕捉方法
US10941374B2 (en) * 2016-09-29 2021-03-09 Sumitomo Rubber Industries, Ltd. Medical analysis device and cell analysis method
CN110062764A (zh) 2016-12-05 2019-07-26 儿童医院医学中心 结肠类器官及其制备和使用方法
JP2018108038A (ja) * 2016-12-28 2018-07-12 クアーズテック株式会社 細胞培養担体
CN111699244B (zh) * 2017-12-22 2023-11-24 巴斯德研究所 基于水凝胶的器官芯片微流控装置
WO2019145847A1 (en) * 2018-01-23 2019-08-01 Seng Enterprises Ltd Cell culturing device and method
JP7158671B2 (ja) 2018-02-14 2022-10-24 住友ゴム工業株式会社 特定細胞捕捉方法
JP7109719B2 (ja) 2018-02-14 2022-08-01 住友ゴム工業株式会社 特定細胞捕捉方法
FR3079524B1 (fr) * 2018-03-27 2020-12-18 Univ Claude Bernard Lyon Plaques de micropuits en hydrogel biocompatible
FR3081168B1 (fr) * 2018-05-21 2022-03-11 Univ Bordeaux Systeme de culture cellulaire en bioreacteur
JP7348586B2 (ja) * 2019-01-18 2023-09-21 東洋製罐グループホールディングス株式会社 培養容器、培養方法、及び培養装置
US11614440B2 (en) 2019-01-24 2023-03-28 Sumitomo Rubber Industries, Ltd. Specific cell fractionating and capturing methods
EP4174172A4 (en) * 2020-06-25 2024-03-27 Next & Bio Inc METHOD FOR PREPARING AN INDUCED PLURIPOTENT STEM CELL WITHOUT USING HYDROGEL
US20220243172A1 (en) * 2020-06-25 2022-08-04 Next & Bio Inc. Standard organoid production method
EP4174171A4 (en) * 2020-06-25 2024-03-27 Next & Bio Inc METHOD FOR MASS PROLIFERATION OF STEM CELLS WITHOUT USING HYDROGEL
WO2021261623A1 (ko) * 2020-06-25 2021-12-30 주식회사 넥스트앤바이오 뇌 오가노이드 제작방법
CN113930337B (zh) * 2020-06-29 2023-03-17 清华大学 用于制备细胞团簇的装置及其构建方法及应用
EP4029934A1 (en) * 2021-01-18 2022-07-20 Universite De Geneve Methods of producing cell spheroids and tool therefore
CN113215076A (zh) * 2021-04-13 2021-08-06 华南理工大学 一种用于三维细胞球培养的半球微孔阵列基底及其制备方法
CN113667603B (zh) * 2021-08-13 2023-12-22 合肥燃音生物科技有限公司 一种肝脏类器官培养芯片及其制备方法与应用
WO2023230596A1 (en) * 2022-05-27 2023-11-30 Satellite Biosciences, Inc. Devices and methods for cell aggregation

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005007796A2 (en) * 2003-07-21 2005-01-27 Molecular Cytomics Ltd. Improved multiwell plate
WO2008106771A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mark Ungrin Devices and methods for production of cell aggregates
US20100015697A1 (en) * 2008-07-16 2010-01-21 Michael Carl Junger Micro-fluidic cell manipulation and holding device
CN101827931A (zh) * 2008-08-29 2010-09-08 北京大学 用于可准确控制的细胞培养的微流体芯片
KR101282926B1 (ko) * 2011-07-28 2013-07-08 고려대학교 산학협력단 표면장력을 이용한 반구형 마이크로웰의 제조 및 이를 이용한 세포 집합체의 형성
CN103814125A (zh) * 2011-09-20 2014-05-21 株式会社可乐丽 粘附性细胞的培养方法
US20140162351A1 (en) * 2011-08-29 2014-06-12 Hitachi, Ltd. Culturing sheet, culturing equipment material and manufacturing method

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1976972B1 (en) * 2006-01-24 2014-03-12 Brown University Cell aggregation and encapsulation device and method
US9121003B2 (en) * 2007-09-12 2015-09-01 Kitakyushu Foundation For The Advancement Of Industry, Science And Technology Cell culture instrument and cell culture method using the same
US20100055733A1 (en) * 2008-09-04 2010-03-04 Lutolf Matthias P Manufacture and uses of reactive microcontact printing of biomolecules on soft hydrogels
JP6120778B2 (ja) * 2011-02-03 2017-04-26 ノースイースタン ユニヴァーシティ 生物学的材料の極めて特異的な捕獲および遊離のための方法および組成物
JP5487136B2 (ja) * 2011-02-14 2014-05-07 株式会社Ｎｔｔドコモ 非周期的チャネル状態情報通知方法、無線基地局装置、ユーザ端末
JP6113999B2 (ja) * 2012-10-18 2017-04-12 株式会社クラレ 化合物のスクリーニング方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005007796A2 (en) * 2003-07-21 2005-01-27 Molecular Cytomics Ltd. Improved multiwell plate
WO2008106771A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mark Ungrin Devices and methods for production of cell aggregates
US20100015697A1 (en) * 2008-07-16 2010-01-21 Michael Carl Junger Micro-fluidic cell manipulation and holding device
CN101827931A (zh) * 2008-08-29 2010-09-08 北京大学 用于可准确控制的细胞培养的微流体芯片
KR101282926B1 (ko) * 2011-07-28 2013-07-08 고려대학교 산학협력단 표면장력을 이용한 반구형 마이크로웰의 제조 및 이를 이용한 세포 집합체의 형성
US20140162351A1 (en) * 2011-08-29 2014-06-12 Hitachi, Ltd. Culturing sheet, culturing equipment material and manufacturing method
CN103814125A (zh) * 2011-09-20 2014-05-21 株式会社可乐丽 粘附性细胞的培养方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
STEFAN A. KOBEL 等: "Fabrication of PEG Hydrogel Microwell Arrays for High-Throughput Single Stem Cell Culture and Analysis", 《METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112534038A (zh) * 2018-05-30 2021-03-19 太阳生物科学股份公司 一种用于培养生物材料的孔
CN112063525A (zh) * 2019-06-10 2020-12-11 芬欧汇川集团 细胞培养板，其制备方法和检测物质的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CA2972057A1 (en) 2016-06-30
ES2858600T3 (es) 2021-09-30
JP2018504103A (ja) 2018-02-15
DK3237597T3 (da) 2021-03-15
EP3237597A1 (en) 2017-11-01
PT3237597T (pt) 2021-03-12
US11583860B2 (en) 2023-02-21
CA2972057C (en) 2023-06-13
WO2016103002A1 (en) 2016-06-30
JP7089240B2 (ja) 2022-06-22
US20180264465A1 (en) 2018-09-20
EP3237597B1 (en) 2020-12-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107257850A (zh) 用于哺乳动物细胞的高通量聚集和操作的装置
ES2952105T3 (es) Matrices de organoides
Akther et al. Hydrogels as artificial matrices for cell seeding in microfluidic devices
Pampaloni et al. Three-dimensional tissue models for drug discovery and toxicology
Kang et al. Alginate microencapsulation for three-dimensional in vitro cell culture
CN106459925B (zh) 培养方法和细胞团
Anada et al. Three-dimensional cell culture device utilizing thin membrane deformation by decompression
ES2706659T3 (es) Sistema multipocillo de alto rendimiento para cultivar constructos tisulares tridimensionales in vitro o in vivo, procedimiento para producir dicho sistema multipocillo y procedimientos para preparar constructos tisulares tridimensionales a partir de células usando dicho sistema multipocillo
WO2016021498A1 (ja) 繊維状タンパク質材料の作製方法、および細胞培養方法
WO2010047133A1 (ja) 細胞保存方法、及び細胞輸送方法
JP5177774B2 (ja) 細胞の３次元階層的共培養法
CN110903976A (zh) 一种用于类器官球体培养的孔板装置
Wu et al. Engineering a cell home for stem cell homing and accommodation
JP2009247334A (ja) 細胞培養担体
EP3196293B1 (en) Three-dimensional cell culture system and cell culture method using same
Guttenplan et al. Chips for biomaterials and biomaterials for chips: Recent advances at the interface between microfabrication and biomaterials research
Penfornis et al. Three dimensional tumor models for cancer studies
CA3111453A1 (en) Production of cellular spheroids
JP4332653B2 (ja) 組織体形成方法及び組織体形成キット
Ferro et al. Three-dimensional (3D) cell culture conditions, present and future improvements
JP2021045175A (ja) 高い収集能力で哺乳動物細胞を操作（マニピュレーション）する装置
Sakthivel et al. High-throughput three-dimensional cellular platforms for screening biophysical microenvironmental signals
Cho et al. Prevalent Technologies for In Vitro Tissue/Organ Modeling
Hasannejad et al. Regulation of cell fate by cell imprinting approach in vitro
CN117957303A (zh) 细胞培养装置、使用该细胞培养装置的细胞培养方法、包括该细胞培养装置的细胞培养孵箱以及该细胞培养装置的用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination