CN107257624B - 具有人源化分化簇274基因的非人动物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了非人动物、用于制备和使用所述非人动物的方法和组合物，其中所述非人动物包含分化簇274(CD274)基因的人源化。此类非人动物在一些实施例中可被描述为具有对内源CD274基因的遗传修饰，以使得所述非人动物表达程序性细胞死亡配体1(PD‑L1)多肽，所述多肽包含人部分和内源部分(例如，非人部分)。

Description

具有人源化分化簇274基因的非人动物
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年12月9日提交的美国临时申请No.62/089,549以及2015年1月22日提交的美国临时申请No.62/106,525的权益，这两个美国临时申请的全部内容以引用方式并入本文。
以引用方式并入的序列表
ASCII文本文件中的序列表以引用方式并入本文，该文本文件名称为31971_10133WO01_PCTSequenceListing.txt，大小为79KB，创建于2015年11月24日，并通过EFS-Web提交给美国专利及商标局。
背景技术
尽管人们在自身免疫性、癌症和传染性疾病的治疗方面取得了巨大进展，但全球医疗保健行业仍然面临重大挑战。带来这些重大挑战的部分原因是，细胞能够通过细胞表面多肽调节免疫应答。细胞和微生物通过一些细胞表面多肽来篡夺信号通路，以减弱宿主免疫***的监控机制并抑制对其作出的免疫应答，从而形成疾病表型。尚未开发体内***，以最佳地确定自身免疫性、癌症和传染性疾病的新靶向疗法(这些新靶向疗法被设计成调节对此类疾病病状作出的免疫应答)的治疗潜力，并且确定在分子方面上这些细胞如何操纵免疫应答。这些体内***提供用于评估治疗效能和用于开发在将来治疗自身免疫性、癌症和传染性疾病的候选试剂的测定来源。
发明内容
本发明涵盖这样的认识：希望对非人动物进行工程改造，以允许改进的体内***，从而鉴别并开发可以用于治疗自身免疫性、炎性疾病和癌症的新治疗剂，并且在一些实施例中鉴别并开发治疗方案。本发明还涵盖这样的认识：希望对非人动物进行工程改造，以允许改进的体内***，从而鉴别并开发可以用于治疗传染性疾病的新治疗剂，并且在一些实施例中鉴别并开发治疗方案。此外，本发明还涵盖这样的认识：具有人源化CD274基因和/或以其他方式表达、包含或产生人或人源化PD-L1多肽的非人动物对用于例如鉴别并开发上调抗肿瘤和/或抗微生物免疫的治疗剂是期望的。在一些实施例中，本发明的非人动物提供了用于鉴别和开发组合疗法的改进的体内***，这些组合疗法包括靶向PD-L1，或间接地靶向PD-L1结合配偶体(例如，PD-1、B7-1)。
在一些实施例中，本发明提供基因组包含CD274基因的非人动物，该基因包含来自两种不同物种(例如，人和非人)的遗传物质。在一些实施例中，本文所述的非人动物的CD274基因编码包含人和非人部分的PD-L1多肽，其中该人和非人部分连接在一起并形成功能性PD-L1多肽。在一些实施例中，非人部分包含内源部分。在一些实施例中，本文所述的非人动物的CD274基因编码PD-L1多肽，该多肽包含人PD-L1多肽的完整或部分的胞外结构域。
在一些实施例中，本发明提供表达PD-L1多肽的非人动物，该PD-L1多肽包含人部分和内源部分。在一些实施例中，本发明的PD-L1多肽在非人动物的细胞中翻译，且具有非人信号肽；在一些特定实施例中，具有啮齿动物信号肽。
在一些实施例中，内源部分包含内源PD-L1多肽的胞内部分。在一些实施例中，内源部分还包含内源PD-L1多肽的跨膜部分。在一些实施例中，内源部分的一氨基酸序列与图6中呈现的小鼠PD-L1多肽的对应氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性。在一些实施例中，内源部分的氨基酸序列与图6中呈现的小鼠PD-L1多肽的对应氨基酸序列基本上相同。在一些实施例中，内源部分的氨基酸序列与图6中呈现的小鼠PD-L1多肽的对应氨基酸序列相同。
在一些实施例中，人部分包含人PD-L1多肽的氨基酸19-238。在一些实施例中，人部分包含人PD-L1多肽的氨基酸19-277。在一些实施例中，人部分包含人PD-L1多肽的氨基酸19-131。在一些实施例中，人部分的一氨基酸序列与图6中呈现的人PD-L1多肽的对应氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性。在一些实施例中，人部分的一氨基酸序列与图6中呈现的人PD-L1多肽的对应氨基酸序列基本上相同。在一些实施例中，人部分的一氨基酸序列与图6中呈现的人PD-L1多肽的对应氨基酸序列相同。
在一些实施例中，本发明的PD-L1多肽由包含内源非人CD274序列和人CD274序列的CD274基因编码。在一些特定实施例中，CD274基因包含内源CD274外显子1、2、6和7。在一些特定实施例中，CD274基因还包含完整或部分的内源CD274外显子5。在一些实施例中，包含内源非人CD274序列和人CD274序列的CD274基因位于内源CD274基因座处。
在一些实施例中，本发明的CD274基因的一序列与SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:16具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性。在一些实施例中，本发明的CD274基因的一序列与SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13或SEQ ID NO:16基本上相同。在一些实施例中，本发明的CD274基因的一序列与SEQID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:16相同。
在一些实施例中，本发明的CD274基因包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:15和SEQ ID NO:16。在一些实施例中，本发明的CD274基因包含SEQ ID NO:13和SEQ IDNO:16。在一些实施例中，本发明的CD274基因包含SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13。在一些实施例中，本发明的CD274基因包含SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:17。在一些实施例中，本发明的CD274基因包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17。
在一些实施例中，本发明提供人源化CD274基因座。在一些实施例中，人源化CD274基因座是经过遗传修饰而包含人CD274序列的内源非人CD274基因座。在一些实施例中，本发明提供人源化CD274基因座，该基因座包含非人CD274基因的一个或多个外显子，这些外显子有效连接至人CD274基因的一个或多个完整或部分的外显子。在一些实施例中，人源化CD274基因座还包含5’和3’非人CD274非翻译区(UTR)，这些非翻译区侧接人CD274基因的一个或多个外显子。在一些实施例中，人源化CD274基因座处于啮齿动物启动子的控制之下；在一些特定实施例中，处于内源啮齿动物启动子的控制之下。
在一些实施例中，人源化CD274基因座包含非人CD274外显子1、2、6和7，这些外显子有效连接至人CD274外显子3和4。在一些实施例中，人源化CD274基因座包含非人CD274外显子1、2、6和7、人CD274外显子3和4，且还包含CD274外显子5，该CD274外显子5包含人部分和非人部分，并且其中所述非人外显子和人外显子有效连接。在一些实施例中，CD274外显子5的人部分包含这样的核苷酸：这些核苷酸编码作为人PD-L1多肽胞外结构域的一部分的氨基酸残基。在一些实施例中，CD274外显子5的人部分包含编码人PD-L1多肽的氨基酸残基229-238的核苷酸。在一些实施例中，CD274外显子5的人部分包含约32bp的人CD274外显子5。在一些实施例中，CD274外显子5的非人部分包含编码跨膜序列的核苷酸。在一些实施例中，CD274外显子5的非人部分包含约69bp的啮齿动物CD274外显子5。在一些特定实施例中，人源化CD274基因座包含具有SEQ ID NO:12中所示的序列的CD274外显子5。在一些特定实施例中，人源化CD274基因座包含CD274外显子5，该外显子编码与人PD-L1多肽的L229-R238相对应的氨基酸以及与啮齿动物PD-L1多肽的T238-Q263相对应的氨基酸。
在一些实施例中，本发明提供了包含CD274基因的非人动物，该基因包含内源部分和人部分，其中内源部分和人部分有效连接至非人CD274启动子。在一些实施例中，非人CD274启动子是啮齿动物CD274启动子。在一些特定实施例中，啮齿动物CD274启动子是内源啮齿动物CD274启动子。
在一些实施例中，内源部分包含内源CD274外显子1、2、6和7。在一些实施例中，内源部分还包含完整或部分的内源CD274外显子5。在一些实施例中，内源CD274基因的内源CD274外显子1、2、完整或部分外显子5、外显子6和7，与图6中呈现的小鼠CD274基因的对应外显子1、2、完整或部分外显子5、对应外显子6和7具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性。在一些实施例中，内源CD274基因的内源CD274外显子1、2、完整或部分外显子5、外显子6和7，与图6中呈现的小鼠CD274基因的对应外显子1、2、完整或部分外显子5、对应外显子6和7基本上相同。在一些实施例中，内源CD274基因的内源CD274外显子1、2、完整或部分外显子5、外显子6和7，与图6中呈现的小鼠CD274基因的对应外显子1、2、完整或部分外显子5、对应外显子6和7相同。
在一些实施例中，人部分编码人PD-L1多肽的氨基酸19-131、19-227或19-238。
在一些实施例中，人部分包含人CD274基因的外显子3和4。在一些实施例中，人部分还包含完整或部分的人CD274外显子5。在一些实施例中，人CD274外显子3、4和完整或部分外显子5，与图6中呈现的人CD274基因的对应外显子3、4和完整或部分外显子5具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性。在一些实施例中，人CD274外显子3、4和完整或部分外显子5，与图6中呈现的人CD274基因的对应外显子3、4和完整或部分外显子5基本上相同。在一些实施例中，人CD274外显子3、4和完整或部分外显子5，与图6中呈现的人CD274基因的对应外显子3、4和完整或部分外显子5相同。在一些实施例中，人部分的一序列经过密码子优化，以便在非人动物中表达；在一些实施例中，在啮齿动物中表达；在一些特定实施例中，在小鼠或大鼠中表达。
在一些实施例中，人部分的一序列与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的同一性。在一些实施例中，人部分的一序列与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12基本上相同。在一些实施例中，人部分的一序列与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12相同。在一些实施例中，人部分包含SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12。在一些实施例中，人部分的一序列与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11相同或基本上相同。在一些实施例中，人部分包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11。
在一些实施例中，本发明的非人动物具有包含CD274基因的基因组，该基因包含SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17，或它们的组合。
在一些实施例中，本发明提供了由本文所述的非人动物产生、表达或生成的PD-L1多肽。在一些特定实施例中，由本文所述的非人动物产生、表达或生成的PD-L1多肽的氨基酸序列与图6中呈现的人源化PD-L1多肽具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性。在一些特定实施例中，由本文所述的非人动物产生、表达或生成的PD-L1多肽的氨基酸序列与图6中呈现的人源化PD-L1多肽基本上相同。在一些特定实施例中，由本文所述的非人动物产生、表达或生成的PD-L1多肽的氨基酸序列与图6中呈现的人源化PD-L1多肽相同。
在一些实施例中，本发明提供了从本文所述的非人动物分离的细胞或组织。在一些实施例中，分离的细胞或组织包含本文所述的CD274基因。在一些实施例中，细胞来自淋巴谱系。在一些实施例中，细胞来自骨髓谱系。在一些实施例中，细胞选自B细胞、树突细胞、巨噬细胞、单核细胞和T细胞。在一些实施例中，组织选自脂肪组织、膀胱、脑、乳腺、骨髓、眼部、心脏、肠、肾、肝、肺、***、肌肉、胰腺、血浆、血清、皮肤、脾、胃、胸腺、睾丸、***，以及它们的组合。
在一些实施例中，本发明提供了其基因组包含本文所述的CD274基因的非人胚胎干细胞。在一些实施例中，非人胚胎干细胞是啮齿动物胚胎干细胞。在一些特定实施例中，啮齿动物胚胎干细胞是小鼠胚胎干细胞，并且来自129品系、C57BL品系，或它们的混合物。在一些特定实施例中，啮齿动物胚胎干细胞是小鼠胚胎干细胞，并且是129和C57BL品系的混合物。
在一些实施例中，本发明的非人胚胎干细胞具有包含CD274基因的基因组，该基因包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16，或它们的组合。
在一些实施例中，本发明提供了本文所述的非人胚胎干细胞用于制备非人动物的用途。在一些特定实施例中，非人胚胎干细胞是小鼠胚胎干细胞，并且用于制备包含本文所述的CD274基因的小鼠。在一些特定实施例中，非人胚胎干细胞是大鼠胚胎干细胞，并且用于制备包含本文所述的CD274基因的大鼠。
在一些实施例中，本发明提供了非人胚胎，该非人胚胎包含具有本文所述CD274基因的非人胚胎干细胞，由该非人胚胎干细胞制备，从该非人胚胎干细胞获得，或由该非人胚胎干细胞生成。在一些特定实施例中，非人胚胎是啮齿动物胚胎；在一些实施例中，为小鼠胚胎；在一些实施例中，为大鼠胚胎。
在一些实施例中，本发明提供了本文所述的非人胚胎用于产生非人动物的用途。在一些特定实施例中，非人胚胎是小鼠胚胎，并且用于产生包含本文所述的CD274基因的小鼠。在一些特定实施例中，非人胚胎是大鼠胚胎，并且用于产生包含本文所述的CD274基因的大鼠。
在一些实施例中，本发明提供本文所述的靶向载体或核酸构建体。在一些实施例中，本发明提供包含本文所述的人源化CD274基因的靶向载体或核酸构建体。在一些实施例中，本发明提供包含CD274基因的靶向载体(或核酸构建体)，该基因编码包含人胞外结构域全部或部分的PD-L1多肽；在一些特定实施例中，包含人PD-L1多肽的氨基酸19-131、19-227或19-238的PD-L1多肽。
在一些实施例中，本发明的靶向载体或核酸构建体包含非人CD274基因的一个或多个完整或部分的外显子，这些外显子有效连接至人CD274基因的一个或多个完整或部分的外显子。在一些实施例中，靶向载体或核酸构建体包含5’和3’非人CD274非翻译区(UTR)，这些非翻译区侧接人CD274基因的一个或多个外显子。在一些实施例中，靶向载体或核酸构建体包含一个或多个选择标记。在一些实施例中，靶向载体或核酸构建体包含一个或多个位点特异性重组位点。在一些实施例中，靶向载体或核酸构建体包含人CD274外显子3和4。在一些实施例中，靶向载体或核酸构建体包含人CD274外显子3和4，以及完整或部分的人CD274外显子5。
在一些实施例中，靶向载体或核酸构建体包含SEQ ID NO:7。在一些特定实施例中，靶向载体或核酸构建体的序列与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11中的任一者相同或基本上相同。
在一些实施例中，本发明提供了本文所述的靶向载体或核酸构建体用于制备经修饰的非人胚胎干细胞的用途。在一些实施例中，本发明提供了本文所述的靶向载体或核酸构建体用于制备经修饰的非人细胞的用途。在一些实施例中，本发明提供了本文所述的靶向载体或核酸构建体用于制备经修饰的非人胚胎的用途。在一些实施例中，本发明提供了本文所述的靶向载体或核酸构建体用于制备非人动物的用途。
在一些实施例中，本发明提供了制备由内源CD274基因表达PD-L1多肽的非人动物的方法，其中PD-L1多肽包含人序列，该方法包括：(a)将基因组片段***非人胚胎干细胞中的内源CD274基因中，所述基因组片段包含编码人PD-L1多肽全部或部分的核苷酸序列；(b)获得(a)中生成的非人胚胎干细胞；以及(c)使用(b)的啮齿动物胚胎干细胞形成非人动物。
在一些实施例中，人序列包含人PD-L1多肽的氨基酸19-131、19-227或19-238。
在一些实施例中，核苷酸序列包含人CD274外显子3和4。在一些实施例中，核苷酸序列还包含完整或部分的人CD274外显子5。在一些实施例中，核苷酸序列包含一个或多个选择标记。在一些实施例中，核苷酸序列包含一个或多个位点特异性重组位点。
在一些实施例中，本发明提供制备其基因组包含CD274基因的非人动物的方法，该基因编码具有人部分和内源部分的PD-L1多肽，这两部分有效连接至非人CD274启动子，该方法包括：对非人动物的基因组进行修饰，使得其包含CD274基因，该基因编码具有人部分和内源部分的PD-L1多肽，这两部分有效连接至非人CD274启动子，从而产生所述非人动物。在一些实施例中，非人CD274启动子是啮齿动物CD274启动子。在一些特定实施例中，啮齿动物CD274启动子是内源啮齿动物CD274启动子。
在一些实施例中，人部分包含人PD-L1多肽的氨基酸19-131、19-227或19-238。
在一些实施例中，CD274基因经修饰而包含人CD274外显子3和4。在一些实施例中，CD274基因经修饰而包含人CD274外显子3、4和完整或部分外显子5。
在一些实施例中，在非人胚胎干细胞中对非人动物的基因组进行修饰，然后用所述非人胚胎干细胞生成非人动物。在一些特定实施例中，非人胚胎干细胞是啮齿动物胚胎干细胞；在一些实施例中，为小鼠胚胎干细胞；在一些实施例中，为大鼠胚胎干细胞。
在一些实施例中，本发明提供了可通过本文所述方法获得、由本文所述方法生成或由本文所述方法产生的非人动物。
在一些实施例中，本发明提供了在非人动物中减少、防止或消除肿瘤生长的方法，该方法包括以下步骤：向其基因组包含CD274基因的非人动物施用靶向人PD-L1的药物，该基因编码具有人部分和内源部分的PD-L1多肽，这两部分有效连接至非人动物CD274启动子；该施用在一定条件下进行一定时间，使得足以在非人动物中减少、防止或消除肿瘤生长。
在一些实施例中，本发明提供了在非人动物中杀死肿瘤细胞的方法，该方法包括以下步骤：向其基因组包含CD274基因的非人动物施用靶向人PD-L1的药物，该基因编码具有人部分和内源部分的PD-L1多肽，这两部分有效连接至非人动物CD274启动子；该施用在一定条件下进行一定时间，使得药物足以在非人动物中介导肿瘤细胞的杀死。
在一些实施例中，本发明提供了评估靶向人PD-L1的药物的药代动力学特性的方法，该方法包括以下步骤：向其基因组包含CD274基因的非人动物施用靶向人PD-L1的药物，该基因编码具有人部分和内源部分的PD-L1多肽，这两部分有效连接至非人动物CD274启动子；以及执行测定法以确定靶向人PD-L1的药物的一个或多个药代动力学特性。
在一些实施例中，本发明提供了评估靶向人PD-L1的药物的效能的方法，该方法包括以下步骤：向其基因组包含CD274基因的非人动物施用靶向人PD-L1的药物，该基因编码具有人部分和内源部分的PD-L1多肽，这两部分有效连接至非人动物CD274启动子；以及执行测定法以确定靶向人PD-L1的药物的效能。
在各种实施例中，本文所述的非人动物是其基因组包含CD274基因的啮齿动物，该基因编码具有人部分和内源部分的PD-L1多肽，这两部分有效连接至啮齿动物CD274启动子。在各种实施例中，啮齿动物CD274启动子是内源啮齿动物CD274启动子。在各种实施例中，人部分包含人PD-L1多肽的氨基酸19-131、19-227或19-238。
在一些实施例中，靶向人PD-L1的药物是PD-L1拮抗剂。在一些实施例中，靶向人PD-L1的药物是PD-L1激动剂。在一些实施例中，靶向人PD-L1的药物是抗PD-L1抗体。在一些实施例中，以静脉内、腹膜内、肌内或皮下方式向非人动物施用靶向人PD-L1的药物。
在一些实施例中，本发明提供用于鉴别或验证药物或疫苗的方法，该方法包括以下步骤：将药物或疫苗递送到其基因组包含本文所述CD274基因的非人动物，以及监测对药物或疫苗作出的免疫应答、药物或疫苗的安全特性或者对疾病、障碍或病症的作用中的一者或多者。在一些实施例中，监测安全特性包括确定非人动物是否因递送药物或疫苗而表现出副作用或不良反应。在一些实施例中，副作用或不良反应选自发病、死亡、体重改变、一种或多种酶(例如，肝)的水平改变、一种或多种器官的重量改变、功能丧失(例如，感觉、运动、器官等)、一种或多种疾病的易感性增加、非人动物的基因组改变、摄食量增加或减少以及一种或多种疾病的并发症。在一些实施例中，疾病、障碍或病症在非人动物中诱发。在一些实施例中，非人动物中诱发的疾病、障碍或病症与需要治疗的一个或多个人类患者所患的疾病、障碍或病症相关联。在一些特定实施例中，药物是抗体。
在一些实施例中，本发明提供了本文所述的非人动物用于开发适用于医疗(诸如用作药剂)的药物或疫苗的用途。
在一些实施例中，本发明提供了本文所述的非人动物用于制造治疗癌症或瘤的药剂的用途。
在一些实施例中，本发明提供了本文所述的非人动物用于制造治疗传染性疾病的药剂的用途。
在一些实施例中，本发明提供了本文所述的非人动物用于制造治疗炎性疾病、障碍或病症的药剂的用途。
在一些实施例中，本发明提供了本文所述的非人动物用于制造治疗自身免疫疾病、障碍或病症的药剂的用途。
在各种实施例中，本发明的CD274基因包括本文所述的CD274基因。在各种实施例中，本发明的CD274基因编码具有人部分和内源部分的PD-L1多肽，这两部分有效连接至啮齿动物CD274启动子。在各种实施例中，啮齿动物启动子是内源啮齿动物启动子。在各种实施例中，人部分包含人CD274外显子3和4。在各种实施例中，人部分包含人CD274外显子3和4，以及完整或部分的人CD274外显子5。
在各种实施例中，本发明的PD-L1多肽包括本文所述的PD-L1多肽。
在各种实施例中，本发明的非人动物无法可检测地表达全长内源非人PD-L1多肽。在各种实施例中，本发明的非人动物无法可检测地表达内源PD-L1多肽的胞外部分。在各种实施例中，本发明的非人动物无法可检测地表达内源PD-L1多肽的免疫球蛋白V结构域，以及在一些实施例中，无法可检测地表达内源PD-L1多肽的免疫球蛋白C结构域。
在各种实施例中，本发明的非人动物是啮齿动物；在一些实施例中，为小鼠；在一些实施例中，为大鼠。
如本申请中所用，术语“约”和“大约”作为等效词使用。本申请中所用的带有或不带有约/大约修饰的任何数字，都意欲涵盖相关领域的技术人员所了解的任何正常波动。
本发明的其他特征、目的和优点明示于以下具体实施方式中。然而，应当理解，尽管具体实施方式指出了本发明的某些实施例，但仅以举例说明形式给出，而非限制性。本领域的技术人员根据具体实施方式将明了本发明范围内的各种变化和修改。
附图说明
由下图构成的纳入在本文中的附图仅出于说明而非限制的目的。
图1示出了非人(例如，小鼠)和人分化簇274(CD274)基因的基因组结构的示意图，该图未按比例绘制。在每个外显子下方均有外显子编号。非翻译区(UTR)由空心矩形指示。
图2示出了用于对非人分化簇274(CD274)基因进行人源化的示例性构建体的图示，该图未按比例绘制。上方的示意图表示具有新霉素盒的人源化靶向载体，而下方的示意图表示该盒已缺失的人源化靶向载体。所选择的核苷酸接合位置用每个接合区下方的线条伴随对应SEQ ID NO.来标记。示例性人源化片段在图6中示出并说明如下：人源化片段A：人4,494bp-新霉素盒-人3,950bp(SEQ ID NO:7)；人源化片段B：人4,494bp-loxP-人3,950bp(SEQ ID NO:8)；人源化片段C：人4,494bp片段(SEQ ID NO:9)；人源化片段D：人3,950bp片段(SEQ ID NO:10)。
图3示出了非人(例如，小鼠)和人分化簇274(CD274)基因的基因组结构的示意图，该图未按比例绘制，其指示了实例1中所述的测定法中使用的探针的大概位置。还示出了人CD274基因内的示例性人源化片段(人源化片段E；SEQ ID NO:11)以及小鼠Cd274基因一部分的示例性缺失。
图4示出了对于如实例1中所述内源PD-L1基因的人源化而言纯合的小鼠中在21天内的示例性MC38.ova/hPD-L1肿瘤生长曲线。对照Ab：对PD-L1没有特异性的抗体，a-hPD-L1：对人PD-L1具有特异性的抗体。箭头指示实验期间抗体处理的天数。针对每个处理组示出了第21天时的无肿瘤小鼠数。
图5示出了在用抗PD-L1或对照抗体处理之后，在对于如实例1中所述内源CD274基因而言纯合的小鼠脾细胞中CD8b、CD3和PD-L1 mRNA表达的示例性实时PCR分析。A，每组六只小鼠的平均值。B，每个处理组中的单独小鼠的表达水平。对照Ab：对PD-L1没有特异性的抗体；a-PD-L1：抗PD-L1抗体。
图6示出了示例性小鼠、人和人源化CD274和PD-L1序列，以及用于对非人CD274基因进行人源化的示例性人核酸序列。对于mRNA序列而言，粗体字指示编码序列，并且连续外显子在指示时由交替下划线文本分隔；对于人源化mRNA序列而言，人序列包含于括号内。对于蛋白质序列而言，信号肽带有下划线，胞外序列是粗体字，免疫球蛋白V(IgV)结构域序列位于括号内，并且胞内序列为斜体；对于人源化蛋白质序列而言，非人序列用常规字体指示，人序列用粗体字指示。人源化片段A：人4,494bp-新霉素盒-人3,950bp(SEQ ID NO:7)；人源化片段B：人4,494bp-loxP-人3,950bp(SEQ ID NO:8)；人源化片段C：人4,494bp片段(SEQ ID NO:9)；人源化片段D：人3,950bp片段(SEQ ID NO:10)。
定义
本发明不限于本文所述的特定方法和实验条件，因为这些方法和条件可以变化。还应当理解，本文所用的术语仅用于描述具体实施例的目的，并且不旨在进行限制，因为本发明的范围由权利要求书限定。
除非另有定义，否则本文所用的所有术语和短语包括所述术语和短语在本领域中已获得的含义，除非明确地指出相反情况，或根据其中使用所述术语或短语的情形明显看出相反情况。虽然与本文所述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料可用于本发明的实施或测试，但现在将描述具体的方法和材料。本文中所提及的所有出版物据此以引用方式并入。
如本文应用于一个或多个目标值的术语“大约”，包括与所述参考值类似的值。在某些实施方案中，除非另有所指或根据情形明显不同，否则术语“大约”或“约”是指在任一方向(大于或小于)上落在所述参考值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小内的值的范围(除这样的数字将超过可能值的100％时以外)。
如本文所用，术语“生物活性”包括在体外或体内(例如，在生物体中)在生物***中具有活性的任何试剂的特征。例如，在生物体内具有生物效应的试剂，当其存在于生物体中时，被认为具有生物活性。在特定实施例中，当蛋白质或多肽具有生物活性时，该蛋白质或多肽的共有所述蛋白质或多肽的至少一种生物活性的部分通常被称为“生物活性”部分。
如本文所用，短语“分化簇274蛋白质”、“CD274蛋白质”、“B7-H1蛋白质”或“PD-L1蛋白质”包括这样的跨膜蛋白质，其属于细胞表面蛋白质配体的B7家族，并且具有与免疫球蛋白可变和恒定结构域相关的胞外免疫球蛋白V(IgV)和免疫球蛋白恒定样(IgC)结构域，以及跨膜和细胞质(或胞内)结构域。PD-L1在淋巴谱系(例如，B细胞、T细胞、树突细胞、巨噬细胞、单核细胞等)和非淋巴谱系(心脏、肺、肝、胰腺等)中表达，并且参与膜表面蛋白诸如程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)之间的相互作用以调控免疫功能。PD-L1的表达由细胞因子(例如，干扰素-γ)调控，并且据报道在许多人类癌症中上调，这可使这些癌症逃避免疫***的监视。已证实，PD-L1参与若干细胞过程，例如，胞内感染、外周耐受、T细胞受体信号传导和T细胞增殖。已在小鼠和人之间鉴别了选择性剪接的CD274亚型。举例来说，图6中提供了鼠和人CD274基因的核苷酸和氨基酸序列。技术人员在阅读本公开内容后将认识到，基因组中的一个或多个内源CD274基因(或所有)可通过一个或多个异源CD274基因(例如，多态变体、亚型或突变体、来自另一种物种的基因、人源化形式等)进行替换、修饰、改变、缺失、破坏等。
如本文所用，“表达CD274的细胞”、“表达B7-H1的细胞”或“表达PD-L1的细胞”包括表达PD-L1跨膜多肽的细胞。在一些实施例中，表达PD-L1的细胞在其表面上表达PD-L1跨膜多肽。在一些实施例中，PD-L1多肽以足以介导细胞间相互作用(例如，通过与PD-1受体多肽的相互作用)的量表达于细胞的表面上。示例性表达PD-L1的细胞包括B细胞、树突细胞、巨噬细胞、单核细胞和T细胞。表达PD-L1的细胞调节淋巴细胞的活化或抑制，以增强或减弱免疫应答。在一些实施例中，本发明的非人动物展现出通过表达于非人动物一个或多个细胞的表面上的人源化PD-L1多肽来调控各种细胞过程(如本文所述)。
如本文所用，术语“可比较的(comparable)”包括两种或更多种试剂、实体、状况、条件组等，它们可彼此不同但充分相似以允许在它们之间进行比较，使得可基于观察到的差异或相似性合理地得出结论。本领域的技术人员在情形中将理解，在任何给定的情况下，对于两种或更多种这样的试剂、实体、状况、条件组等需要多大程度的同一性即可被认为是可比较的。
如本文用于描述保守氨基酸置换的术语“保守”包括氨基酸残基被置换为具有化学特性(例如，电荷或疏水性)相似的侧链R基团的另一个氨基酸残基。一般来讲，保守氨基酸置换不会实质性改变蛋白质的目标功能特性，例如，受体结合配体的能力。具有化学特性相似的侧链的氨基酸的组的例子包括：脂族侧链，诸如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；脂族-羟基侧链，诸如丝氨酸和苏氨酸；含酰胺侧链，诸如天冬酰胺和谷氨酰胺；芳香族侧链，诸如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；碱性侧链，诸如赖氨酸、精氨酸和组氨酸；酸性侧链，诸如天冬氨酸和谷氨酸；以及含硫侧链，诸如半胱氨酸和甲硫氨酸。保守氨基酸置换组包括，例如，缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸、苯丙氨酸/酪氨酸、赖氨酸/精氨酸、丙氨酸/缬氨酸、谷氨酸/天冬氨酸以及天冬酰胺/谷氨酰胺。在一些实施例中，保守氨基酸置换可以是丙氨酸对蛋白质中的任何天然残基的置换，如例如丙氨酸扫描诱变中所用到的。在一些实施例中，保守置换是在据此以引用方式并入的Gonnet,G.H.et al.,1992,Science 256:1443-1445(Gonnet,G.H.等人，1992年，《科学》，第256卷，第1443-1445页)中公开的PAM250对数似然矩阵中具有正值的置换。在一些实施例中，如果置换在PAM250对数似然矩阵中具有非负值，则该置换是适度保守的置换。
如本文所用，术语“对照”包括本领域所理解的“对照”的含义，即结果与其相比较的标准品。通常，对照用于增强实验的完整性，具体方式是隔离变量以便得出有关这些变量的结论。在一些实施例中，对照是一种反应或测定法，它与测试反应或测定法同时进行以提供参比。如本文所用，“对照”可指“对照动物”。“对照动物”可具有本文所述的修饰、与本文所述不同的修饰，或没有修饰(即，野生型动物)。在一个实验中，应用“测试”(即，所测试的变量)。在第二实验中，应用“对照”，即不应用所测试的变量。在一些实施例中，对照是历史性对照(即，此前执行的测试或测定法，或此前已知的量或结果)。在一些实施例中，对照是或包括打印的或以其他方式保存的记录。对照可为阳性对照或阴性对照。
如本文所用，术语“破坏”包括DNA分子的同源重组事件(例如，经由同源重组序列，诸如基因或基因座)的结果。在一些实施例中，破坏可实现或表示DNA序列的***、缺失、置换、替换、错义突变或移码，或它们的任何组合。***可包括***完整基因或基因的片段，例如外显子，它们可具有内源序列以外的起源(例如，异源序列)。在一些实施例中，破坏可增加基因或基因产物的(例如，由基因编码的蛋白质的)表达和/或活性。在一些实施例中，破坏可减少基因或基因产物的表达和/或活性。在一些实施例中，破坏可改变基因或编码的基因产物(例如，编码的蛋白质)的序列。在一些实施例中，破坏可截短或片段化基因或编码的基因产物(例如，编码的蛋白质)。在一些实施例中，破坏可延长基因或编码的基因产物；在一些这样的实施例中，破坏可实现融合蛋白质的组装。在一些实施例中，破坏可影响基因或基因产物的水平而非活性。在一些实施例中，破坏可影响基因或基因产物的活性而非水平。在一些实施例中，破坏对基因或基因产物的水平可能没有显著影响。在一些实施例中，破坏对基因或基因产物的活性可能没有显著影响。在一些实施例中，破坏对基因或基因产物的水平或活性可能都没有显著影响。
术语“确定”、“测量”、“评价”、“评估”、“测定”和“分析”在本文中可互换使用，是指任何形式的测量，并包括确定元素存在与否。这些术语包括定量和/或定性确定。测定可为相对的或绝对的。“测定…的存在”可为确定某物存在的量和/或确定其是否存在。
如本文所用，短语“内源基因座”或“内源基因”包括在如本文所述的破坏、缺失、替换、改变或修饰引入之前，在亲代或参考生物体中发现的遗传基因座。在一些实施例中，内源基因座具有天然存在的序列。在一些实施例中，内源基因座是野生型基因座。在一些实施例中，参考生物体是野生型生物体。在一些实施例中，参考生物体是工程改造的生物体在一些实施例中，参考生物体是实验室培育的生物体(无论是野生型还是工程改造的)。
短语“内源启动子”包括与内源基因天然关联(例如在野生型生物体中)的启动子。
如本文所用，术语“异源”包括来自不同来源的试剂或实体。例如，当参考存在于特定细胞或生物体中的多肽、基因或基因产物使用时，该术语澄清相关多肽、基因或基因产物：1)是通过人工进行工程改造的；2)是通过人工(例如，经由遗传工程)引入细胞或生物体(或其前体)中的；和/或3)是由相关细胞或生物体(例如，相关细胞类型或生物体类型)非天然地产生或非天然地存在于所述细胞或生物体中的。
如本文所用，术语“宿主细胞”包括已将异源(例如，外源)核酸或蛋白质引入其中的细胞。技术人员在阅读本公开内容后将理解，这样的术语不仅指特定的主题细胞(subject cell)，而且还用于指这种细胞的子代。因为某些修饰可因突变或环境影响而在后续世代中发生，所以这样的子代事实上可不同于亲本细胞，但仍包括在本文中使用的术语“宿主细胞”的范围内。在一些实施例中，宿主细胞是或包括原核或真核细胞。一般来讲，宿主细胞是适合接受和/或产生异源核酸或蛋白质的任何细胞，而不论所述细胞被指定归属哪个生命界。示例性细胞包括原核生物和真核生物(单细胞或多细胞)的细胞、细菌细胞(例如，大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌属物种(Bacillus spp.)、链霉菌属物种(Streptomyces spp.)等的菌株)、分枝杆菌细胞、真菌细胞、酵母细胞(例如，酿酒酵母(S.cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(S.pombe)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、甲醇毕赤酵母(P.methanolica)等)、植物细胞、昆虫细胞(例如，SF-9、SF-21、杆状病毒感染的昆虫细胞、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)等)、非人动物细胞、人细胞或细胞融合物例如杂交瘤或四源杂交瘤。在一些实施例中，该细胞是人、猴、猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在一些实施例中，该细胞是真核细胞并且选自以下细胞：CHO(例如，CHO K1、DXB-11CHO、Veggie-CHO)、COS(例如，COS-7)、视网膜细胞、Vero、CV1、肾(例如，HEK293、293EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK)、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo205、HB 8065、HL-60、(例如，BHK21)、Jurkat、Daudi、A431(表皮的)、CV-1、U937、3T3、L细胞、C127细胞、SP2/0、NS-0、MMT 060562、支持细胞、BRL 3A细胞、HT1080细胞、骨髓瘤细胞、肿瘤细胞和来源于前述细胞的细胞系。在一些实施例中，该细胞包含一个或多个病毒基因，例如，表达病毒基因的视网膜细胞(例如，
Figure BDA0001317080250000171
细胞)。在一些实施例中，宿主细胞是或包括分离的细胞。在一些实施例中，宿主细胞是组织的一部分。在一些实施例中，宿主细胞是生物体的一部分。
术语“人源化”在本文中根据其本领域理解的含义使用，是指这样的核酸或蛋白质：所述核酸或蛋白质的结构(即，核苷酸或氨基酸序列)包括与非人动物中天然存在的特定基因或蛋白质的结构基本上或完全对应的部分，并且还包括与相关特定非人动物基因或蛋白质中存在的结构不同，而是与对应人基因或蛋白质中存在的可比较的结构更密切对应的部分。在一些实施例中，“人源化”基因是编码具有与人多肽(例如，人蛋白质或其部分，例如其特征性部分)的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的多肽的基因。仅举一个例子，在膜受体的情况下，“人源化”基因可编码这样的多肽，该多肽具有其氨基酸序列与人胞外部分的氨基酸序列相同的胞外部分，并且其余序列与非人(例如，小鼠)多肽的序列相同。在一些实施例中，人源化基因包含人基因的DNA序列的至少一部分。在某个实施例中，人源化基因包含人基因的完整DNA序列。在一些实施例中，人源化蛋白质包含具有出现在人蛋白质中的部分的序列。在一些实施例中，人源化蛋白质包含人蛋白质的完整序列，并且由非人动物的内源基因座表达，该内源基因座对应于人基因的同源物或直系同源物。
如本文中结合序列的比较使用的，术语“同一性”包括如通过本领域中已知的可用于测量核苷酸和/或氨基酸序列同一性的许多不同算法确定的同一性。在一些实施例中，使用ClustalW v.1.83(慢)比对(采用10.0的开放空位罚分、0.1的延伸空位罚分)和使用Gonnet相似性矩阵(MACVECTORTM 10.0.2,MacVector Inc.,2008)确定本文所述的同一性。
如本文所用，“改善”、“增加”、“消除”或“减少”或其语法对等词，指示相对于以下测量值的值：基线测量值，诸如在启动本文所述处理之前相同个体(或动物)中的测量值，或在不存在本文所述处理的情况下对照个体(或动物)或多个对照个体(或动物)中的测量值。
如本文所用，术语“分离的”包括这样的物质和/或实体，所述物质和/或实体(1)已与至少一些当最初产生(无论天然地还是在实验环境中)时与其关联的组分分离，和/或(2)已通过人工设计、产生、制备和/或制造。分离的物质和/或实体可与约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过约99％的最初与其关联的其他组分分离。在一些实施例中，分离的试剂是约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过约99％纯的。如本文所用，如果物质基本上不含其他组分，则其是“纯的”。在一些实施例中，如本领域的技术人员所理解的那样，物质在与某些其他组分例如一种或多种载体或赋形剂(例如，缓冲液、溶剂、水等)组合后，仍可被认为是“分离的”或甚至“纯的”；在这样的实施例中，物质的百分比分离或纯度是在不包括这样的载体或赋形剂情况下计算的。仅举一个例子，在一些实施例中，天然存在的生物聚合物诸如多肽或多核苷酸在以下情况下被认为是“分离的”：a)因其衍生的起源或来源而不与在其天然状态下天然伴随其的一些或全部组分关联；b)其基本上不含与天然产生其的物种相同的物种的其他多肽或核酸；或c)由不是天然产生其的物种的细胞或其他表达***表达或以其他方式与来自所述细胞或其他表达***的组分关联。因此，例如，在一些实施例中，化学合成的或在与天然产生其的细胞***不同的细胞***中合成的多肽被认为是“分离的”多肽。作为另外一种选择或除此之外，在一些实施例中，已经历一种或多种纯化技术的多肽若已与以下其他组分分离，则可被认为是“分离的”多肽：a)在自然界中与其关联的其他组分；和/或b)最初产生时与其关联的其他组分。
如本文所用，短语“非人动物”是指任何不是人的脊椎动物生物体。在一些实施例中，非人动物是圆口类鱼、硬骨鱼、软骨鱼(例如，鲨鱼或鳐)、两栖动物、爬行动物、哺乳动物和鸟。在一些实施例中，非人哺乳动物是灵长类动物、山羊、绵羊、猪、狗、牛或啮齿动物。在一些实施例中，非人动物是啮齿动物，诸如大鼠或小鼠。
如本文所用，短语“核酸”在其最广义上包括被掺入或可被掺入寡核苷酸链中的任何化合物和/或物质。在一些实施例中，“核酸”是通过磷酸二酯键掺入或可通过磷酸二酯连键掺入寡核苷酸链中的化合物和/或物质。如根据上下文将清楚的，在一些实施例中，“核酸”包括单独核酸残基(例如，核苷酸和/或核苷)；在一些实施例中，“核酸”包括包含单独核酸残基的寡核苷酸链。在一些实施例中，“核酸”是或包含RNA；在一些实施例中，“核酸”是或包含DNA。在一些实施例中，“核酸”是一个或多个天然核酸残基、包含一个或多个天然核酸残基或由一个或多个天然核酸残基组成。在一些实施例中，“核酸”是一个或多个核酸类似物、包含一个或多个核酸类似物或由一个或多个核酸类似物组成。在一些实施例中，核酸类似物与“核酸”的差别在于它不利用磷酸二酯主链。例如，在一些实施例中，“核酸”是一个或多个“肽核酸”、包含一个或多个“肽核酸”或由一个或多个“肽核酸”组成，所述肽核酸在本领域中是已知的，并且在主链中具有肽键而非磷酸二酯键，其被认为在本发明的范围内。作为另外一种选择或除此之外，在一些实施例中，“核酸”具有一个或多个硫代磷酸酯和/或5’-N-亚磷酰胺连键而非磷酸二酯键。在一些实施例中，“核酸”是一种或多种天然核苷，包含一种或多种天然核苷或由一种或多种天然核苷组成(即，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷以及脱氧胞苷)。在一些实施例中，“核酸”是一种或多种核苷类似物，包含一种或多种核苷类似物或由一种或多种核苷类似物组成(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基胞苷、C-5丙炔基尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基尿苷、C5-丙炔基胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤、2-硫代胞苷、甲基化碱基、***碱基，以及它们的组合)。在一些实施例中，“核酸”包含与天然核酸中的那些糖相比的一种或多种修饰糖(例如，2’-氟代核糖、核糖、2’-脱氧核糖、***糖和己糖)。在一些实施例中，“核酸”具有编码功能性基因产物(诸如RNA或蛋白质)的核苷酸序列。在一些实施例中，“核酸”包含一个或多个内含子。在一些实施例中，“核酸”包含一个或多个外显子。在一些实施例中，“核酸”通过以下一种或多种方法制备：从天然来源分离、通过基于互补模板的聚合(体内或体外)进行的酶促合成、在重组细胞或***中的复制以及化学合成。在一些实施例中，“核酸”的长度为至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000个或更多个残基。在一些实施例中，“核酸”是单链的；在一些实施例中，“核酸”是双链的。在一些实施例中，“核酸”具有包含至少一个元件的核苷酸序列，所述至少一个元件编码多肽或者是编码多肽的序列的互补序列。在一些实施例中，“核酸”具有酶活性。
如本文所用，短语“有效连接”包括这样的并置，其中所述组分所处的关系允许它们以其预期方式发挥作用。“有效连接”至编码序列的控制序列以一定方式连接，使得在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。“有效连接的”序列包括与目标基因邻接的表达控制序列以及通过反式或远程作用来控制目标基因的表达控制序列。如本文所用，术语“表达控制序列”包括对于实现与它们连接的编码序列的表达和加工而言必需的多核苷酸序列。“表达控制序列”包括：适当的转录起始序列、终止序列、启动子和/或增强子序列；高效的RNA加工信号，诸如剪接信号和多腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即，Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及在需要时，增强蛋白质分泌的序列。这些控制序列的性质根据宿主生物体而不同。例如，在原核生物中，这些控制序列一般包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列，而在真核生物中，这些控制序列通常包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”旨在包括其存在对于表达和加工是必需的组分，并且还可包括其存在是有利的附加组分，例如，前导序列和融合配偶体序列。
如本文所用，术语“多肽”包括氨基酸的任何聚合链。在一些实施例中，多肽具有天然存在的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽具有非天然存在的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽具有包含自然界中彼此分开地存在的部分(即，来自两个或更多个不同生物体，例如，人部分和非人部分)的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽具有经工程改造的氨基酸序列，因为所述氨基酸序列通过人工活动设计和/或产生。
如本文所用，“预防”当结合疾病、障碍和/或病症的发生使用时，包括降低出现疾病、障碍和/或病症的风险和/或延迟疾病、障碍或病症的一种或多种特征或症状的发作。当已使疾病、障碍或病症的发作延迟预定时间段时，可认为预防是彻底的。
如本文所用，术语“重组的”旨在指通过重组手段设计、工程改造、制备、表达、生成或分离的多肽(例如，如本文所述的PD-L1多肽)，诸如使用被转染入宿主细胞的重组表达载体表达的多肽，从重组的、组合的人多肽库分离的多肽(Hoogenboom H.R.,1997TIBTech.15:62-70(Hoogenboom H.R.，1997年，《生物技术趋势》，第15卷，第62-70页)；Hoogenboom H.,and Chames P.,2000,Immunology Today 21:371-378(Hoogenboom H.和Chames P.，2000年，《今日免疫学》，第21卷，第371-378页)；Azzazy H.,and HighsmithW.E.,2002,Clin.Biochem.35:425-445(Azzazy H.和Highsmith W.E.，2002年，《临床生物化学》，第35卷，第425-445页)；Gavilondo J.V.,and Larrick J.W.,2002,BioTechniques29:128-145(Gavilondo J.V.和Larrick J.W.，2002年，《生物技术》，第29卷，第128-145页))，从对于人免疫球蛋白基因是转基因的动物(例如，小鼠)分离的抗体(参见，例如，Taylor,L.D.,et al.,1992,Nucl.Acids Res.20:6287-6295(Taylor,L.D.等人，1992年，《核酸研究》，第20卷，第6287-6295页)；Little M.et al.,2000,Immunology Today 21:364-370(Little M.等人，2000年，《今日免疫学》，第21卷，第364-370页)；KellermannS.A.and Green L.L.,2002,Current Opinion in Biotechnology 13:593-597(Kellermann S.A.和Green L.L.，2002年，《生物技术当前述评》，第13卷，第593-597页)；Murphy,A.J.,et al.,2014,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.111(14):5153-5158(Murphy,A.J.等人，2014年，《美国国家科学院院刊》，第111卷，第14期，第5153-5158页))，或通过涉及将所选择的序列元件彼此剪接的任何其他手段制备、表达、生成或分离的多肽。在一些实施例中，一个或多个这样的选择的序列元件是天然存在的。在一些实施例中，一个或多个这样的选择的序列元件是经计算机设计的。在一些实施例中，一个或多个这样的选择的序列元件由已知的序列元件(例如，来自天然的或合成的来源)的诱变(例如，体内或体外)产生。例如，在一些实施例中，重组多肽包含目标来源生物体(例如，人、小鼠等)的基因组中存在的序列。在一些实施例中，重组多肽包含自然界中彼此分开地存在于两个不同生物体(例如，人生物体和非人生物体)中的序列(即，来自两个或更多个不同生物体，例如，人部分和非人部分)。在一些实施例中，重组多肽具有由诱变(例如，体外或体内，例如在非人动物中)产生的氨基酸序列，以使得所述重组多肽的氨基酸序列是虽然源自多肽序列且与多肽序列相关，但可以不是在体内天然地存在于非人动物的基因组中的序列。
术语“替换”在本文中用来指这样的过程：通过该过程，将存在于宿主基因座中(例如，基因组中)的“被替换的”核酸序列(例如，基因)从该基因座移除并将不同的“替换”核酸置于该位置。在一些实施例中，被替换的核酸序列与替换核酸序列是彼此可比较的，因为，例如它们彼此同源和/或包含对应元件(例如，蛋白质编码元件、调控元件等)。在一些实施例中，被替换的核酸序列包括启动子、增强子、剪接供***点、剪接受***点、内含子、外显子、非翻译区(UTR)中的一种或多种；在一些实施例中，替换核酸序列包括一个或多个编码序列。在一些实施例中，替换核酸序列是被替换的核酸序列的同系物。在一些实施例中，替换核酸序列是被替换的序列的直系同系物。在一些实施例中，替换核酸序列是人核酸序列，或包含人核酸序列。在一些实施例中，包括其中替换核酸序列是人核酸序列或包含人核酸序列的情况，被替换的核酸序列是啮齿动物序列或包含啮齿动物序列(例如，小鼠或大鼠序列)。这样放置的核酸序列可包含其是用于获得这样放置的序列的来源核酸序列的部分的一个或多个调控序列(例如，启动子、增强子、5'-或3'-非翻译区等)。例如，在各种实施例中，替换是用异源序列对内源序列的置换，所述置换导致从这样放置的核酸序列(包含所述异源序列)产生基因产物，但不表达内源序列；替换是用编码与由内源序列编码的蛋白质具有相似功能的蛋白质的核酸序列替换内源基因组序列(例如，内源基因组序列编码PD-L1蛋白质，并且DNA片段编码一种或多种人PD-L1蛋白质)。在各种实施例中，内源基因或其片段被对应的人基因或其片段替换。对应的人基因或其片段是作为被替换的内源基因或其片段的直系同源物的人基因或片段，或在结构和/或功能上与被替换的内源基因或其片段基本上相似或相同的人基因或片段。
术语“参考”在本文中用来描述目标试剂、动物、同龄群、个体、群体、样品、序列或值与之相比较的标准或对照试剂、动物、同龄群、个体、群体、样品、序列或值。在一些实施例中，参考试剂、动物、同龄群、个体、群体、样品、序列或值的测试和/或确定基本上与目标试剂、动物、同龄群、个体、群体、样品、序列或值的测试或确定同时进行。在一些实施例中，参考试剂、动物、同龄群、个体、群体、样品、序列或值是任选地在有形介质中体现的历史参考。在一些实施例中，参考可指对照。如本文所用，“参考”可包括“参考动物”。“参考动物”可具有本文所述的修饰、与本文所述不同的修饰，或没有修饰(即，野生型动物)。通常，如本领域的技术人员将理解的，参考试剂、动物、同龄群、个体、群体、样品、序列或值在与用于确定或表征目标试剂、动物(例如，哺乳动物)、同龄群、个体、群体、样品、序列或值的那些条件相当的条件下进行确定或表征。
如本文所用，术语“基本上”包括表现出全部或接近全部范围或程度的目标特征或特性的定性条件。生物学领域的技术人员将理解，生物和化学现象很少(如果有的话)进行至完成和/或进行至完全，或实现或避免绝对的结果。因此术语“基本上”在本文中用于捕捉许多生物和化学现象中固有的潜在完全性缺乏。
如本文所用，短语“基本上同源”包括氨基酸或核酸序列之间的比较。如本领域的技术人员将理解的，如果两个序列在对应的位置中含有同源残基，则它们一般被认为是“基本上同源的”。同源残基可以是相同的残基。另选地，同源残基可以是具有适当相似的结构和/或功能特征的不相同的残基。例如，如由本领域的技术人员所熟知的，某些氨基酸通常被归类为“疏水性”或“亲水性”氨基酸，和/或归类为具有“极性”或“非极性”侧链。一种氨基酸置换为另一种相同类型的氨基酸可通常被认为是“同源”置换。典型的氨基酸类别概述于表1和2中。
表1
Figure BDA0001317080250000231
Figure BDA0001317080250000241
表2
Figure BDA0001317080250000242
如本领域中所熟知的，氨基酸或核酸序列可使用多种算法的任何一种来进行比较，所述算法包括商业计算机程序中可用的那些算法，诸如用于核苷酸序列的BLASTN以及用于氨基酸序列的BLASTP、空位BLAST和PSI-BLAST。示例性的此类程序描述于Altschul,S.F.et al.,1990,J.Mol.Biol.,215(3):403-410(Altschul,S.F.等人，1990年，《分子生物学杂志》，第215卷，第3期，第403-410页)；Altschul,S.F.et al.,1997,Methods inEnzymology(Altschul,S.F.等人，1997年，《酶学方法》)；Altschul,S.F.et al.,1997,Nucleic Acids Res.,25:3389-3402(Altschul,S.F.等人，1997年，《核酸研究》，第25卷，第3389-3402页)；Baxevanis,A.D.,and B.F.F.Ouellette(eds.)Bioinformatics:APractical Guide to the Analysis of Genes and Proteins,Wiley,1998(Baxevanis,A.D.和B.F.F.Ouellette(编辑)，《生物信息学：基因和蛋白质分析实用指南》，威立出版社，1998年)；以及Misener et al.(eds.)Bioinformatics Methods and Protocols(Methodsin Molecular Biology,Vol.132),Humana Press,1998(Misener等人(编辑)，生物信息学方法指南(《分子生物学方法》，第132卷)，胡马纳出版社，1998年)。除了鉴别同源序列以外，上面提及的程序通常还提供同源性程度的指示。在一些实施例中，如果两个序列的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的对应残基在相关的残基区段上是同源的，则这两个序列被认为是基本上同源的。在一些实施例中，相关区段是完整序列。在一些实施例中，相关区段为至少9、10、11、12、13、14、15、16、17个或更多个残基。在一些实施例中，相关区段包括沿着完整序列的邻接残基。在一些实施例中，相关区段包括沿着完整序列的不连续残基，例如，通过多肽或其一部分的折叠构象而聚集在一起的非邻接残基。在一些实施例中，相关区段为至少10、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个残基。
如本文所用，短语“基本上同一”包括氨基酸或核酸序列之间的比较。如本领域的技术人员将理解的，如果两个序列在对应的位置中含有相同残基，则它们一般被认为是“基本上同一的”。如本领域中所熟知的，氨基酸或核酸序列可使用多种算法的任何一种来进行比较，所述算法包括商业计算机程序中可用的那些算法，诸如用于核苷酸序列的BLASTN以及用于氨基酸序列的BLASTP、空位BLAST和PSI-BLAST。示例性的此类程序描述于Altschul,S.F.et al.,1990,J.Mol.Biol.,215(3):403-410(Altschul,S.F.等人，1990年，《分子生物学杂志》，第215卷，第3期，第403-410页)；Altschul,S.F.et al.,1997,Methods inEnzymology(Altschul,S.F.等人，1997年，《酶学方法》)；Altschul,S.F.et al.,1997,Nucleic Acids Res.,25:3389-3402(Altschul,S.F.等人，1997年，《核酸研究》，第25卷，第3389-3402页)；Baxevanis,A.D.,and B.F.F.Ouellette(eds.)Bioinformatics:APractical Guide to the Analysis of Genes and Proteins,Wiley,1998(Baxevanis,A.D.和B.F.F.Ouellette(编辑)，《生物信息学：基因和蛋白质分析实用指南》，威立出版社，1998年)；以及Misener et al.(eds.)Bioinformatics Methods and Protocols(Methodsin Molecular Biology,Vol.132),Humana Press,1998(Misener等人(编辑)，生物信息学方法指南(《分子生物学方法》，第132卷)，胡马纳出版社，1998年)。除了鉴别同一的序列以外，上面提及的程序通常还提供同一性程度的指示。在一些实施例中，如果两个序列的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的对应残基在相关的残基区段上是相同的，则这两个序列被认为是基本上同一的。在一些实施例中，相关区段是完整序列。在一些实施例中，相关区段为至少10、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个残基。
如本文所用，短语“靶向载体”或“靶向构建体”包括包含靶向区的多核苷酸分子。靶向区包含这样的序列，其与靶细胞、组织或动物中的序列相同或基本上相同，并且可以经由同源重组将靶向构建体整合到所述细胞、组织或动物的基因组内的位置中。还包括使用位点特异性重组酶识别位点(例如，loxP或Frt位点)进行靶向的靶向区。在一些实施例中，本发明的靶向构建体还包含特定目标核酸序列或基因、选择性标记、控制和/或调控序列以及其他核酸序列，这些核酸序列允许通过外源性添加帮助或促进涉及这些序列的重组的蛋白质来介导的重组。在一些实施例中，本发明的靶向构建体还包含完整或部分的目标基因，其中所述目标基因是编码具有与由内源序列编码的蛋白质相似的功能的完整或部分的蛋白质的异源基因。在一些实施例中，本发明的靶向构建体还包含完整或部分的目标人源化基因，其中所述目标人源化基因编码具有与由内源序列编码的蛋白质相似的功能的完整或部分的蛋白质。
如本文所用，术语“变体”包括显示出与参考实体的显著结构同一性但相较于所述参考实体在一个或多个化学部分的存在或水平方面与所述参考实体结构上不同的实体。在许多实施例中，“变体”还在功能上不同于其参考实体。一般来讲，特定实体是否被适当地认为是参考实体的“变体”是基于其与参考实体的结构同一性的程度。如本领域的技术人员将理解的，任何生物或化学参考实体具有某些特征性结构元件。按照定义，“变体”是共用一个或多个这样的特征性结构元件的不同化学实体。仅举几例，小分子可具有特征性核心结构元件(例如，大环核)和/或一个或多个特征性侧基部分，以使得小分子的变体是共用核心结构元件和特征性侧基部分，但在其他侧基部分上和/或在存在于核心内的键的类型(单键相对于双键，E相对于Z，等)上不同的分子，多肽可具有包含在线性或三维空间中相对于彼此具有指定的位置和/或促成特定生物学功能的多个氨基酸的特征性序列元件，核酸可具有包含在线性或三维空间中相对于彼此具有指定的位置的多个核苷酸残基的特征性序列元件。例如，“变体多肽”可因氨基酸序列中的一个或多个差异和/或共价附接于多肽主链的化学部分(例如，碳水化合物，脂质等)中的一个或多个差异而不同于参考多肽。在一些实施例中，“变体多肽”显示出与参考多肽具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％的总体序列同一性。另选地或另外地，在一些实施例中，“变体多肽”不与参考多肽共用至少一个特征性序列元件。在一些实施例中，参考多肽具有一种或多种生物活性。在一些实施例中，“变体多肽”共用参考多肽的一种或多种生物活性。在一些实施例中，“变体多肽”缺少参考多肽的一种或多种生物活性。在一些实施例中，“变体多肽”显示出相较于参考多肽降低水平的一种或多种生物活性。在许多实施例中，如果目标多肽具有与亲代的氨基酸序列相同但在特定位置上具有少数序列改变的氨基酸序列，则目标多肽被认为是亲代或参考多肽的“变体”。通常，变体中少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％的残基相较于亲代被置换。在一些实施例中，“变体”相较于亲代具有10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个被置换的残基。通常，“变体”具有非常少的数目(例如，少于5、4、3、2或1个)的被置换的功能残基(即，参与特定生物活性的残基)。此外，相较于亲代，“变体”通常具有不超过5、4、3、2或1个添加或缺失，并且通常不具有添加或缺失。此外，任何添加或缺失通常少于约25、约20、约19、约18、约17、约16、约15、约14、约13、约10、约9、约8、约7、约6个，且通常少于约5、约4、约3或约2个残基。在一些实施例中，亲代或参考多肽是天然存在的多肽。如本领域的技术人员将理解的，特定目标多肽的多个变体通常可以是天然存在的，特别是当目标多肽是传染性因子多肽时。
如本文所用，术语“载体”是指能够转运与其关联的另一种核酸的核酸分子。在一些实施例中，载体能够在宿主细胞诸如原核和/或真核细胞中进行染色体外复制和/或表达与它们连接的核酸。能够指导有效连接的基因的表达的载体在本文中被称为“表达载体”。
如本文所用，术语“野生型”具有其本领域中理解的含义，即包括具有如在“正常”(相对于突变、患病的、改变的等)状态或背景中天然存在的结构和/或活性的实体。本领域的技术人员将理解，野生型基因和多肽通常以多种不同的形式(例如，等位基因)存在。
具体实施方式
除了别的方面以外，本发明提供了具有编码程序性死亡配体1(PD-L1)多肽的人源化遗传物质的改良和/或工程改造的非人动物，以用于确定PD-L1调节剂(例如，抗PD-L1抗体)治疗癌症、自身免疫疾病和传染性病原体的治疗效能，以及对免疫细胞应答和功能的测定。可以设想，此类非人动物在确定PD-L1调节剂的治疗效能及其对PD-1:PD-L1(或PD-L1:B7-1)阻断的潜力方面提供了改进。因此，本发明特别适用于开发抗PD-L1，并且在一些实施例中，适用于开发抗PD-1疗法，以便治疗各种癌症、自身免疫疾病以及增强免疫应答以治疗和/或改善传染性病因。具体地讲，本发明涵盖啮齿动物CD274基因的人源化，使得在非人动物的细胞表面上表达人源化PD-L1多肽。此类人源化PD-L1非人动物能够提供人PD-L1+细胞的来源，以便确定抗PD-L1治疗剂促进抗肿瘤免疫应答的效能。此类人源化PD-L1非人动物还能够提供人PD-L1+细胞的来源，以便确定抗PD-L1治疗剂改善自身免疫疾病、障碍或病症的效能。此外，此类人源化PD-L1非人动物提供体内***，以用于筛选和开发治疗各种癌症、自身免疫疾病和传染性疾病的抗PD-L1疗法。在一些实施例中，治疗效能在本发明的非人动物中可由以下方式展现：疾病、障碍或病症的体征和/或症状减少或消失；在一些实施例中，疾病、障碍或病症的一些(而非所有)体征和症状减少或消失；在一些实施例中，疾病、障碍或病症的所有体征和症状减少或消失，但疾病、障碍或病症仍可能存在于非人动物体内。在各种实施例中，疾病、障碍或病症与癌症相关联。在各种实施例中，疾病、障碍或病症与自身免疫疾病、障碍或病症相关联。在各种实施例中，疾病、障碍或病症与传染性病原体(例如，细菌)相关联。
在一些实施例中，本发明的非人动物展现出通过表达于非人动物细胞表面上的人源化PD-L1多肽阻断PD-1:PD-L1信号传导而调节的免疫应答。在一些实施例中，人源化PD-L1多肽具有与人PD-L1多肽的完整或部分免疫球蛋白V和C结构域相对应的序列。在一些实施例中，人源化PD-L1多肽具有与人PD-L1多肽的基本上所有胞外结构域相对应的序列。在一些实施例中，人源化PD-L1多肽具有与啮齿动物PD-L1多肽的细胞质结构域相对应的序列；在一些实施例中，人源化PD-L1多肽具有与啮齿动物PD-L1多肽的跨膜和细胞质结构域相对应的序列。在一些实施例中，人源化PD-L1多肽具有与人PD-L1多肽的氨基酸残基19-238(或19-227、或19-131)相对应的序列。在一些实施例中，本发明的非人动物包含CD274基因，该基因包含来自非人动物和异源物种(例如，人)的遗传物质。在一些实施例中，本发明的非人动物包含人源化CD274基因，其中该人源化CD274基因包含人CD274基因的外显子3、外显子4和完整或部分的外显子5。在一些特定实施例中，本发明的非人动物包含人源化CD274基因，其中人源化CD274基因包含与外显子3及外显子3的3’端约4,160bp的人基因组序列相对应的、约4,494bp的人CD274基因。在一些特定实施例中，本发明的非人动物包含人源化CD274基因，其中人源化CD274基因包含与人CD274基因的外显子4的5’端约1,253bp的人基因组序列、外显子4、内含子4及外显子5最开始32bp相对应的、约3,950bp的人CD274基因。在一些特定实施例中，本发明的非人动物包含人源化CD274基因，其中人源化CD274基因包含与位点特异性重组位点(例如，loxP位点)并置的约4,494bp和约3,950bp的人CD274基因，所述4,494bp和3,950bp对应于人CD274基因的外显子3、外显子4及外显子5的最开始32bp。在一些特定实施例中，本发明的非人动物包含人源化CD274基因，其中人源化CD274基因包含与人CD274基因的外显子3、外显子4及外显子5的最开始32bp相对应的、约8,444bp的人CD274基因。在一些实施例中，本发明的非人动物(例如，啮齿动物，诸如小鼠或大鼠)包含人源化CD274基因，其中人源化CD274基因包含人CD274基因的外显子3、外显子4和一部分外显子5，它们有效连接至非人Cd274基因(例如，内源非人Cd274基因)的外显子1、2、一部分外显子5、外显子6和7；并且在具体实施例中，人源化CD274基因编码人源化PD-L1多肽，该多肽包含人PD-L1多肽的所有或基本上所有胞外结构域，以及非人PD-L1多肽的所有或基本上所有跨膜和细胞质结构域。在一些特定实施例中，本发明的非人动物包含图2中所示的人源化CD274基因。
在下面的章节中详细地描述本发明的各个方面。章节的使用并非意在限制本发明。每个章节可适用于本发明的任何方面。在本申请整篇中，除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。
分化簇274(CD274)基因
CD274编码称为程序性细胞死亡配体1(PD-L1，也称为B7-H1)的多肽，该基因是使用B7家族成员B7-1和B7-2搜索人表达序列标签(EST)时发现的(Dong,H.et al.,1999,Nature Med.5(12):1365-1369(Dong,H.等人，1999年，《自然医学》，第5卷，第12期，第1365-1369页)；Freeman,G.J.et al.,2000,J.Exp.Med.192(7):1027-1034(Freeman,G.J.等人，2000年，《实验医学杂志》，第197卷，第7期，第1027-1034页))。CD274基因由七个外显子组成，每个外显子编码PD-L1多肽的不同部分；外显子1：非编码区并含有5’UTR；外显子2：信号序列；外显子3：免疫球蛋白V(IgV)结构域；外显子4：免疫球蛋白C(IgC)结构域；外显子5：胞外结构域和跨膜结构域的C端部分；外显子6：胞内结构域；以及外显子7：胞内结构域的约6个氨基酸残基及3’UTR。PD-L1多肽与其他B7家族成员(B7-1和B7-2)具有共同的结构组织，尽管序列同一性百分比较低(约20％)。相比之下，小鼠和人的PD-L1多肽序列具有约70％序列同一性(Freeman,G.J.等人，出处同上)。PD-L1在心脏、骨骼肌、胎盘和肺中明显表达，在胸腺、脾、肾和肝中较少表达，并且在脑、结肠或小肠中不表达(Dong,H.等人，出处同上)。此外，PD-L1在小鼠体内的T细胞、B细胞、骨髓细胞(例如，树突细胞、巨噬细胞、肥大细胞等)和角化细胞上组成型表达，然而已报道了在活化后在人体内的相同细胞中的表达(例如，Keir,M.E.,et al.,2008,Annu.Rev.Immunol.26:677-704(Keir,M.E.等人，2008年，《免疫学年评》，第26卷，第677-704页)中所综述)。实际上，据报道小鼠和人基因的CD274启动子包含干扰素调节因子1(IRF-1)的结合位点，已证实这些结合位点负责人癌细胞中的PD-L1上调(Lee,S.J.et al.,2006,FEBS Lett.580(3):755-762(Lee,S.J.等人，2006年，《欧洲生化学会联合会快报》，第580卷，第3期，第755-762页))。已报道了PD-L1剪接变体(参见例如下文及He,X.H.et al.,2005,Acta Pharmacol Sin.26(4):462-468(He,X.H.等人，2005年，《中国药理学报》，第26卷，第4期，第462-468页))，但是尚未发现与任何疾病的因果关系。PD-L1专门结合PD-1，而不与结构类似于PD-1的其他蛋白质(CTLA4、CD28、ICOS；参见Dong.Dong,H.等人和Freeman,G.J.等人，出处同上)发生任何相互作用。PD-L1与PD-1接合会引起免疫细胞中的多种刺激或抑制功能，其中一些功能包括细胞增殖、细胞因子产生及T细胞受体和B细胞受体信号传导。还已证实，PD-L1(以及PD-L2)参与双向信号传导(例如，参见Dong,H.et al.,2003,J.Clin.Invest.111:363-370(Dong,H.等人，2003年，《临床研究杂志》，第111卷，第363-370页)；Kuipers,H.et al.,2006,Eur.J.Immunol.36:2472-2782(Kuipers,H.等人，2006年，《欧洲免疫学杂志》，第36卷，第2472-2782页))。有趣的是，已表明PD-L1结合B7-1(CD80)，即CD28的配体，但与CD28自身的相互作用尚无报道(Butte,M.J.et al.,2007,Immunity 27:111-122(Butte,M.J.等人，2007年，《免疫》，第27卷，第111-122页))。与B7-1的这种独特相互作用对于其参与T细胞应答和耐受性的调控特别重要。实际上，由于其共刺激和共抑制功能提供了多个功能性结果，PD-L1作为治疗自身免疫和炎性疾病以及治疗癌症的潜在靶标，已受到广泛关注。事实上，抗PD-L1疗法目前正在人临床试验中开展测试(参见，例如，Pedoeem,A.et al.,2014,Clin.Immunol.153:145-152(Pedoeem,A.等人，2014年，《临床免疫学》，第153卷，第145-152页)；以及Philips,G.K.andAtkins,M.,2014,Intern.Immunol.8pages(Philips,G.K.和Atkins,M.，2014年，《国际免疫学》，8页))。
为了开发在未来治疗癌症和自身免疫性的实用靶向疗法，需要更深入透彻地理解在表达PD-L1的多种细胞类型(例如，非淋巴细胞)之中PD-L1介导的功能以及与其他B7家族成员的独特相互作用。
CD274和PD-L1(B7-H1)序列
示例性鼠、人和人源化CD274和PD-L1序列在图6中示出。用于对非人CD274基因进行人源化的示例性人核酸序列也在图6中示出。对于mRNA序列而言，粗体字指示编码序列，并且连续外显子在指示时由交替下划线文本分隔；对于人源化mRNA序列而言，人序列包含于括号内。对于蛋白质序列而言，信号肽带有下划线，胞外序列是粗体字，免疫球蛋白V(IgV)结构域序列位于括号内，并且胞内序列为斜体；对于人源化蛋白质序列而言，非人序列用常规字体指示，人序列用粗体字指示。
CD274转录物变体是本领域已知的。一种转录物变体相较于规范序列(参见图6)缺少5’编码区中的框内外显子，并导致残基17-130(即，IgV结构域加约5个氨基酸残基)的缺失。该变体的mRNA和蛋白质序列可分别见于Genbank登记号NM_001267706.1和NP_001254635.1，这些登记号据此以引用方式并入。另一种变体编码具有K178D置换和残基179-290的缺失的可溶性蛋白质。该变体的mRNA和蛋白质序列可分别见于Genbank登记号XM_006716759.1和XP_006716822.1，这些登记号据此以引用方式并入。已描述了第三种变体(NR_052005.1)，该变体相较于规范序列缺少交替内部区段，因此被表示为非编码变体，原因在于5’最末端支持的翻译起始密码子的使用使得转录物成为无义介导的mRNA降解(NMD)的候选物。其他亚型描述于WO 2014/197369中，该申请据此以引用方式并入。
人源化CD274非人动物
提供了非人动物，这些非人动物由于编码PD-L1多肽的非人动物内源基因座(例如，CD274基因座)的遗传修饰，而在非人动物的细胞表面上表达人源化PD-L1多肽。本文所述的合适例子包括啮齿动物，在一些实施例中，包括小鼠。
人源化CD274基因在一些实施例中包含来自异源物种(例如，人)的遗传物质，其中人源化CD274基因编码PD-L1多肽，该多肽包含来自异源物种的遗传物质的编码部分。在一些实施例中，本发明的人源化CD274基因包含异源物种的基因组DNA，该DNA编码在细胞的质膜上表达的PD-L1多肽的胞外部分。还提供了用于制备包含所述人源化CD274基因的非人动物、非人胚胎和细胞的非人动物、胚胎、细胞和靶向构建体。
在一些实施例中，内源CD274基因缺失。在一些实施例中，内源CD274基因改变，其中内源CD274基因的一部分被替换为异源序列(例如，完整或部分的人CD274序列)。在一些实施例中，所有或基本上所有内源CD274基因被替换为异源基因(例如，人CD274基因)。在一些实施例中，异源CD274基因的一部分在内源CD274基因座处***到内源非人CD274基因中。在一些实施例中，异源基因是人基因。在一些实施例中，对内源CD274基因的两个拷贝之一进行修饰或人源化，从而产生对于人源化CD274基因而言为杂合的非人动物。在其他实施例中，提供对于人源化CD274基因而言为纯合的非人动物。
在各个方面，非人动物在内源非人CD274基因座处包含完整或部分的人CD274基因。在一些实施例中，非人动物在内源非人CD274基因座之外的位置包含人CD274基因。因此，此类非人动物可被描述为具有异源CD274基因。内源CD274基因座处(或内源CD274基因座之外)被替换、***、修饰或改变的CD274基因或者由这种基因表达的(或由非人动物的基因组的其他地方表达的)多肽可以使用多种方法检测，包括例如PCR、蛋白质印迹、DNA印迹、限制性片段长度多态性(RFLP)或者等位基因获得或丢失测定法。在一些实施例中，非人动物对于人源化CD274基因而言为杂合的。
在各种实施例中，根据本发明的人源化CD274基因包括具有第三外显子的CD274基因，该第三外显子的序列与图6的人CD274 mRNA序列中呈现的第三外显子具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性。
在各种实施例中，根据本发明的人源化CD274基因包括具有第三外显子的CD274基因，该第三外显子的序列与图6的人CD274 mRNA序列中呈现的第三外显子基本上相同。
在各种实施例中，根据本发明的人源化CD274基因包括具有第三外显子的CD274基因，该第三外显子的序列与图6的人CD274 mRNA序列中呈现的第三外显子相同。
在各种实施例中，根据本发明的人源化CD274基因包括具有第四外显子的CD274基因，该第四外显子的序列与图6的人CD274 mRNA序列中呈现的第四外显子具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性。
在各种实施例中，根据本发明的人源化CD274基因包括具有第四外显子的CD274基因，该第四外显子的序列与图6的人CD274 mRNA序列中呈现的第四外显子基本上相同。
在各种实施例中，根据本发明的人源化CD274基因包括具有第四外显子的CD274基因，该第四外显子的序列与图6的人CD274 mRNA序列中呈现的第四外显子相同。
在各种实施例中，根据本发明的人源化CD274基因包括具有第五外显子的CD274基因，该第五外显子的序列与图6的人源化CD274 mRNA序列中呈现的第五外显子具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性。
在各种实施例中，根据本发明的人源化CD274基因包括具有第五外显子的CD274基因，该第五外显子的序列与图6的人源化CD274 mRNA序列中呈现的第五外显子基本上相同。
在各种实施例中，根据本发明的人源化CD274基因包括具有第五外显子的CD274基因，该第五外显子的序列与图6的人源化CD274 mRNA序列中呈现的第五外显子相同。
在各种实施例中，根据本发明的人源化CD274基因包括具有第三、第四和第五外显子的CD274基因，每个外显子的序列与图6的人源化CD274 mRNA序列中呈现的第三、第四和第五外显子具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性。
在各种实施例中，根据本发明的人源化CD274基因包括具有第三、第四和第五外显子的CD274基因，每个外显子的序列与图6的人源化CD274 mRNA序列中呈现的第三、第四和第五外显子基本上相同。
在各种实施例中，根据本发明的人源化CD274基因包括具有第三、第四和第五外显子的CD274基因，每个外显子的序列与图6的人源化CD274 mRNA序列中呈现的第三、第四和第五外显子相同。
在各种实施例中，根据本发明的人源化CD274基因包括具有第一、第二、第六和第七外显子的CD274基因，每个外显子的序列与图6的小鼠Cd274 mRNA序列中呈现的第一、第二、第六和第七外显子具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性。
在各种实施例中，根据本发明的人源化CD274基因包括具有第一、第二、第六和第七外显子的CD274基因，每个外显子的序列与图6的小鼠Cd274 mRNA序列中呈现的第一、第二、第六和第七外显子基本上相同。
在各种实施例中，根据本发明的人源化CD274基因包括具有第一、第二、第六和第七外显子的CD274基因，每个外显子的序列与图6的小鼠Cd274 mRNA序列中呈现的第一、第二、第六和第七外显子相同。
在各种实施例中，根据本发明的人源化CD274基因包括包含与SEQ ID NO:12具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性的序列的CD274基因。
在各种实施例中，根据本发明的人源化CD274基因包括包含与SEQ ID NO:12基本上相同的序列的CD274基因。
在各种实施例中，根据本发明的人源化CD274基因包括包含与SEQ ID NO:12相同的序列的CD274基因。
在各种实施例中，根据本发明的人源化CD274基因包括包含与SEQ ID NO:13或SEQID NO:16具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性的序列的CD274基因。
在各种实施例中，根据本发明的人源化CD274基因包括包含与SEQ ID NO:13或SEQID NO:16基本上相同的序列的CD274基因。
在各种实施例中，根据本发明的人源化CD274基因包括包含与SEQ ID NO:13或SEQID NO:16相同的序列的CD274基因。
在各种实施例中，根据本发明的人源化CD274基因包括包含与SEQ ID NO:13具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性的第一序列以及与SEQ ID NO:16具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性的第二序列的CD274基因。
在各种实施例中，根据本发明的人源化CD274基因包括包含与SEQ ID NO:13基本上相同的第一序列以及与SEQ ID NO:16基本上相同的第二序列的CD274基因。
在各种实施例中，根据本发明的人源化CD274基因包括包含与SEQ ID NO:13相同的第一序列以及与SEQ ID NO:16相同的第二序列的CD274基因。
在各种实施例中，根据本发明的人源化CD274基因包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16和位点特异性重组酶识别位点，其中所述位点特异性重组酶识别位点位于所述人源化CD274基因的内含子内。
在各种实施例中，根据本发明的人源化CD274基因包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16和loxP位点，其中所述loxP位点位于所述人源化CD274基因的内含子内。
在各种实施例中，根据本发明的人源化CD274基因包括在CD274外显子3与CD274外显子4之间包含内含子的CD274基因，其中所述内含子包含与SEQ ID NO:17基本上相同的序列。
在各种实施例中，根据本发明的人源化CD274基因包括在CD274外显子3与CD274外显子4之间包含内含子的CD274基因，其中所述内含子包含与SEQ ID NO:17相同的序列。
在各种实施例中，根据本发明的人源化CD274基因包括包含SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17的CD274基因。
在各种实施例中，根据本发明的人源化CD274基因包括包含SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的CD274基因。
在各种实施例中，根据本发明的人源化CD274基因包括这样的CD274基因，其核苷酸编码序列(例如，cDNA序列)与图6的人源化CD274核苷酸编码序列中呈现的核苷酸编码序列具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性。
在各种实施例中，根据本发明的人源化CD274基因包括这样的CD274基因，其核苷酸编码序列(例如，cDNA序列)与图6的人源化CD274核苷酸编码序列中呈现的核苷酸编码序列基本上相同。
在各种实施例中，根据本发明的人源化CD274基因包括这样的CD274基因，其核苷酸编码序列(例如，cDNA序列)与图6的人源化CD274核苷酸编码序列中呈现的核苷酸编码序列相同。
在各种实施例中，根据本发明的人源化CD274 mRNA序列包含与图6的人源化CD274mRNA序列具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性的序列。
在各种实施例中，根据本发明的人源化CD274 mRNA序列包含与图6的人源化CD274mRNA序列基本上相同的序列。
在各种实施例中，根据本发明的人源化CD274 mRNA序列包含与图6的人源化CD274mRNA序列相同的序列。
在各种实施例中，根据本发明的人源化CD274基因编码这样的PD-L1多肽，其氨基酸序列与图6的PD-L1多肽序列具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性。
在各种实施例中，根据本发明的人源化CD274基因编码这样的PD-L1多肽，其氨基酸序列与图6的PD-L1多肽序列基本上相同。
在各种实施例中，根据本发明的人源化CD274基因编码这样的PD-L1多肽，其氨基酸序列与图6的PD-L1多肽序列相同。
在各种实施例中，由本发明的非人动物产生的PD-L1多肽具有这样的胞外部分，其氨基酸序列与图6中呈现的人PD-L1多肽的胞外部分具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性。
在各种实施例中，由本发明的非人动物产生的PD-L1多肽具有这样的胞外部分，其氨基酸序列与图6中呈现的人PD-L1多肽的胞外部分基本上相同。
在各种实施例中，由本发明的非人动物产生的PD-L1多肽具有这样的胞外部分，其氨基酸序列与图6中呈现的人PD-L1多肽的胞外部分相同。
在各种实施例中，由本发明的非人动物产生的PD-L1多肽包含与图6的人或人源化PD-L1多肽中呈现的氨基酸残基19-131具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性的氨基酸序列。
在各种实施例中，由本发明的非人动物产生的PD-L1多肽包含与图6的人或人源化PD-L1多肽中呈现的氨基酸残基19-131基本上相同的氨基酸序列。
在各种实施例中，由本发明的非人动物产生的PD-L1多肽包含与图6的人或人源化PD-L1多肽中呈现的氨基酸残基19-131相同的氨基酸序列。
在各种实施例中，由本发明的非人动物产生的PD-L1多肽包含与图6的人或人源化PD-L1多肽中呈现的氨基酸残基19-227具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性的氨基酸序列。
在各种实施例中，由本发明的非人动物产生的PD-L1多肽包含与图6的人或人源化PD-L1多肽中呈现的氨基酸残基19-227基本上相同的氨基酸序列。
在各种实施例中，由本发明的非人动物产生的PD-L1多肽包含与图6的人或人源化PD-L1多肽中呈现的氨基酸残基19-227相同的氨基酸序列。
在各种实施例中，由本发明的非人动物产生的PD-L1多肽包含与图6的人或人源化PD-L1多肽中呈现的氨基酸残基19-238具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性的氨基酸序列。
在各种实施例中，由本发明的非人动物产生的PD-L1多肽包含与图6的人或人源化PD-L1多肽中呈现的氨基酸残基19-238基本上相同的氨基酸序列。
在各种实施例中，由本发明的非人动物产生的PD-L1多肽包含与图6的人或人源化PD-L1多肽中呈现的氨基酸残基19-238相同的氨基酸序列。
在各种实施例中，由本发明的非人动物产生的PD-L1多肽具有这样的免疫球蛋白V(IgV)结构域，其氨基酸序列与图6中呈现的人PD-L1多肽的IgV结构域具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性。
在各种实施例中，由本发明的非人动物产生的PD-L1多肽具有这样的免疫球蛋白V(IgV)结构域，其氨基酸序列与图6中呈现的人PD-L1多肽的IgV结构域基本上相同。
在各种实施例中，由本发明的非人动物产生的PD-L1多肽具有这样的免疫球蛋白V(IgV)结构域，其氨基酸序列与图6中呈现的人PD-L1多肽的IgV结构域相同。
在各种实施例中，由本发明的非人动物产生的PD-L1多肽具有免疫球蛋白V(IgV)结构域和免疫球蛋白C(IgC)结构域，每种结构域的氨基酸序列与图6中呈现的人PD-L1多肽的IgV结构域和IgC结构域具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性。
在各种实施例中，由本发明的非人动物产生的PD-L1多肽具有免疫球蛋白V(IgV)结构域和免疫球蛋白C(IgC)结构域，每种结构域的氨基酸序列与图6中呈现的人PD-L1多肽的IgV结构域和IgC结构域基本上相同。
在各种实施例中，由本发明的非人动物产生的PD-L1多肽具有免疫球蛋白V(IgV)结构域和免疫球蛋白C(IgC)结构域，每种结构域的氨基酸序列与图6中呈现的人PD-L1多肽的IgV结构域和IgC结构域相同。
在各种实施例中，由本发明的非人动物产生的PD-L1多肽具有跨膜结构域和胞内结构域，每种结构域的氨基酸序列与图6中呈现的小鼠PD-L1多肽的跨膜结构域和胞内结构域具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性。
在各种实施例中，由本发明的非人动物产生的PD-L1多肽具有跨膜结构域和胞内结构域，每种结构域的氨基酸序列与图6中呈现的小鼠PD-L1多肽的跨膜结构域和胞内结构域基本上相同。
在各种实施例中，由本发明的非人动物产生的PD-L1多肽具有跨膜结构域和胞内结构域，每种结构域的氨基酸序列与图6中呈现的小鼠PD-L1多肽的跨膜结构域和胞内结构域相同。
在各种实施例中，由本发明的非人动物产生的PD-L1多肽包含与图6中呈现的人源化PD-L1多肽的氨基酸序列具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性的氨基酸序列。
在各种实施例中，由本发明的非人动物产生的PD-L1多肽具有与图6中呈现的人源化PD-L1多肽的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列。
在各种实施例中，由本发明的非人动物产生的PD-L1多肽具有与图6中呈现的人源化PD-L1多肽的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
提供了用于制备表达人源化PD-L1多肽(包括特定多态形式、等位变体(例如，单氨基酸差异)或选择性剪接的亚型)的非人动物的组合物和方法，包括用于制备由人启动子和一个或多个人调控序列表达此类多肽的非人动物的组合物和方法。在一些实施例中，还提供了用于制备由内源启动子和一个或多个内源调控序列(在一些实施例中，由内源啮齿动物启动子和一个或多个内源啮齿动物调控序列)表达此类多肽的非人动物的组合物和方法。该方法包括将编码完整或部分人PD-L1多肽的遗传物质(例如，人CD274DNA序列)***在与内源CD274基因相对应的非人动物基因组中的精确位置处，从而形成表达完全或部分为人源的PD-L1多肽的人源化CD274基因。另选地，编码完整或部分人PD-L1多肽的遗传物质的***，可在非人动物基因组中的随机位置处(即在内源CD274基因之外)进行。在一些实施例中，所述方法包括将与人CD274基因的外显子3-5(或外显子3、4和一部分外显子5)相对应的基因组DNA***到非人动物的内源CD274基因中，从而形成编码PD-L1多肽的人源化基因，该多肽包含具有由所***的外显子编码的氨基酸的人部分。在一些实施例中，所述方法包括将与全长(或cDNA)人CD274基因相对应的基因组DNA随机***到非人动物的基因组中，从而形成编码全长人PD-L1多肽的人CD274转基因。
在适当情况下，编码完整或部分人PD-L1多肽的遗传物质或一个或多个多核苷酸序列的编码区可经修饰而包含针对非人动物中的表达进行优化的密码子(例如，参见美国专利No.5,670,356和5,874,304)。密码子所优化的序列是合成序列，并且其优选地编码由非密码子优化的亲代多核苷酸编码的相同多肽(或具有与全长多肽基本上相同活性的全长多肽的生物活性片段)。在一些实施例中，编码完整或部分人PD-L1多肽的遗传物质的编码区可包括改变的序列，以针对特定细胞类型(例如，啮齿动物细胞)优化密码子使用。例如，与要***到非人动物(例如，啮齿动物)的内源CD274基因中的、人CD274基因的外显子3-5(或外显子3、4和一部分外显子5)相对应的基因组DNA的密码子，可针对非人动物的细胞中的表达进行优化。这种序列可被描述为密码子优化的序列。
人源化CD274基因方法采用内源基因的相对最少修饰，并引起非人动物中天然CD274介导的(即，PD-L1介导的)信号转导，原因在于例如CD274基因的基因组序列在单个片段中被修饰，因此通过包含必需调控序列和一些实施例中的内含子序列而保留正常功能性。因此，在此类实施例中，CD274基因修饰不会影响其他周围基因或其他与CD274相互作用的内源基因(例如，Pdcd1等)。此外，在各种实施例中，该修饰不会影响功能性PD-L1跨膜多肽在质膜上的组装，并且通过结合及随后穿过多肽细胞质部分(未受该修饰的影响)的信号转导而保持正常效应子功能。
啮齿动物(例如，小鼠)Cd274基因和人CD274基因的基因组结构的示意图(未按比例绘制)在图1中示出。使用包含人CD274基因的外显子3、4和一部分外显子5的基因组片段对内源啮齿动物(例如，小鼠)CD274基因进行人源化的示例性构建体在图2中示出。如图所示，由靶向构建体将包含人CD274基因的外显子3、4和一部分外显子5的基因组DNA***到内源啮齿动物(例如，小鼠)CD274基因座中。该基因组DNA包含编码人PD-L1多肽胞外部分(例如，氨基酸残基19-238)的基因部分。如果期望如此，可由靶向构建体将包含人CD274基因的外显子3和4的基因组DNA***到内源啮齿动物(例如，小鼠)Cd274基因座中，以便包含编码人PD-L1多肽的免疫球蛋白V和C结构域(例如，氨基酸残基19-227)的基因部分。另选地，可由靶向构建体将仅包含人CD274基因的外显子3的基因组DNA***到内源啮齿动物(例如，小鼠)Cd274基因座中，以便仅包含编码人PD-L1多肽的免疫球蛋白V结构域(例如，氨基酸残基19-131)的基因部分。技术人员在阅读本公开内容后将理解，可按照本文所述的方法，根据需要的所编码的PD-L1多肽，将人CD274基因的各种量的遗传物质***到非人动物的基因组中。
可通过本领域已知的任何方法制备在内源CD274基因座处具有人源化CD274基因的非人动物(例如，小鼠)。例如，可制备将完整或部分的人CD274基因与选择性标记基因一起引入的靶向载体。图2示出了小鼠基因组的内源Cd274基因座，其包含人CD274基因的外显子3、4和一部分外显子5(约32bp)的***。如图所示，靶向构建体包含：含有内源鼠Cd274基因外显子3上游的序列的5’同源臂(约92.9Kb)，之后是含有人CD274基因外显子3的基因组DNA片段(约4494bp)，相对于内源鼠Cd274基因处于相反转录方向的药物选择盒(例如，两侧侧接loxP序列的新霉素抗性基因；约5Kb)，含有人CD274基因的外显子4和一部分外显子5的基因组DNA片段(约3950bp)，以及含有内源鼠Cd274基因的一部分外显子5及下游基因组序列(包括外显子6和7)的3’同源臂(约67.6Kb)。靶向构建体包含自删除药物选择盒(例如，侧接loxP序列的新霉素抗性基因；参见美国专利No.8,697,851、8,518,392和8,354,389，所有这些专利据此以引用方式并入)。在同源重组后，内源鼠Cd274基因的外显子3、4和一部分外显子5被替换为靶向载体中含有的序列(即，人CD274基因的外显子3、4和一部分外显子5)，导致缺失约8,964bp。形成了人源化CD274基因，从而得到表达人源化PD-L1多肽的细胞或非人动物，该多肽包含由人CD274基因的所***的基因组DNA编码的氨基酸。该药物选择盒将以发育依赖性方式被去除，即，从其种系细胞含有上述人源化CD274基因的小鼠衍生的子代将在发育过程中从分化的细胞脱落选择性标记。
虽然本文广泛讨论了在小鼠中采用人源化CD274基因(即，具有编码包含人部分和小鼠部分的PD-L1多肽的CD274基因的小鼠)的实施例，但还提供了包含人源化CD274基因的其他非人动物。在一些实施例中，这些非人动物包含有效连接至内源CD274启动子的人源化CD274基因。在一些特定实施例中，内源CD274启动子是内源啮齿动物启动子。在一些实施例中，这些非人动物由内源基因座表达人源化PD-L1多肽，其中人源化PD-L1多肽包含人PD-L1多肽的氨基酸残基19-238(或19-227或19-131)。这些非人动物包括可经遗传修饰而表达如本文所公开的PD-L1多肽的那些动物中的任何一种，包括例如哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、猪、牛科动物(例如，奶牛、公牛、水牛)、鹿、绵羊、山羊、鸡、猫、狗、雪貂、灵长类动物(例如，绒猴、猕猴)等。非人CD274直系同源物的示例性序列包括例如鸡PD-L1(XM_424811.3和XP_424811.3)、黑猩猩(XM_001140705.2和XP 001140705.1)、奶牛PD-L1(NM_001163412.1和NP_001 156884.1)和狗PD-L1(XM.541302.3和XP_541302.3)、猴(NM_001083889.1和NP001077358.1)以及大鼠(NM_001191954.1和NP_001178883.1)，这些序列据此以引用方式并入。例如，对于适当的可遗传修饰的ES细胞不易获得的那些非人动物而言，采用其他方法产生包含遗传修饰的非人动物。此类方法包括例如对非ES细胞基因组(例如，成纤维细胞或诱导多能细胞)进行修饰并采用体细胞核移植(SCNT)将经遗传修饰的基因组转移到合适的细胞，例如去核***，并且在合适的条件下在非人动物中孕育经修饰的细胞(例如，经修饰的***)而形成胚胎(参见例如Wilmut,I.et al.,1997,Nature 385:810-813(Wilmut,I.等人，1997年，《自然》，第385卷，第810-813页)；国际专利申请公布No.WO 97/07668和WO 97/07669)。
用于修饰非人动物基因组(例如，猪、奶牛、啮齿动物、鸡等基因组)的方法包括，例如采用锌指核酸酶(ZFN)或转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)来修饰基因组以包含人源化CD274基因。
也可通过将CD274核酸序列随机引入到非人动物的基因组中作为转基因来形成携带如本文所述的人源化CD274基因的非人动物。根据上下文，可采用cDNA或基因组人CD274序列。例如，内含子序列和多腺苷酸化信号可包含在转基因中，以提高转基因表达的效率和水平。一个或多个组织特异性调控序列可有效连接至CD274转基因，以指导PD-L1多肽表达于特定细胞类型。组成型启动子可有效连接至CD274核酸序列，以使得所编码的PD-L1多肽过表达(即，以更高水平表达和/或在野生型非人动物中未观察到的组织中表达)。
可基于其基因组中CD274转基因的存在和/或在非人动物组织或细胞中PD-L1mRNA的表达，来鉴别转基因首建者非人动物。然后可使用转基因首建者非人动物培育携带CD274转基因的另外的非人动物。此外，携带编码完整或部分人PD-L1多肽的转基因的转基因非人动物可进一步嫁接到携带其他转基因(例如，Pdcd1或CD80转基因)的其他转基因非人动物。
还可产生转基因非人动物，使之包含允许转基因的经调控或经指导的表达的所选***。示例性***包括噬菌体P1的Cre/loxP重组酶***(参见例如Lakso,M.et al.,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6232-6236(Lakso,M.等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第6232-6236页))和酿酒酵母(S.cerevisiae)的FLP/Frt重组酶***(O’Gorman,S.et al,1991,Science 251:1351-1355(O’Gorman,S.等人，1991年，《科学》，第251卷，第1351-1355页))。这些动物可通过构建“双重”转基因动物来提供，例如使两种转基因动物交配，一种转基因动物包含编码所选多肽的转基因(例如，CD274转基因)，而另一种转基因动物包含编码重组酶(例如，Cre重组酶)的转基因。
本发明的非人动物可如上所述那样制备或使用本领域已知的方法制备，以包含附加人或人源化基因，具体包含哪种基因这通常取决于非人动物的预期用途。可通过以下方式引入这些附加人或人源化基因的遗传物质：进一步改变具有上述遗传修饰的细胞(例如，胚胎干细胞)的基因组，或根据需要，采用与其他经遗传修饰的品系进行的、本领域已知的培育技术。在一些实施例中，制备本发明的非人动物，使之进一步包含一种或多种人或人源化基因，这些基因选自配体的B7家族和/或受体的CD28家族(例如，Pdcd1(PD-1)等)。在一些实施例中，可通过将本文所述的靶向载体引入到来自经修饰的品系的细胞中，来制备本发明的非人动物。在一些实施例中，制备本发明的非人动物，使之进一步包含人或人源化程序性细胞死亡蛋白1(Pdcd1)基因。在一些实施例中，本发明的非人动物包含本文所述的人源化CD274基因以及来自异源物种(例如，人)的遗传物质，其中该遗传物质编码完整或部分的一种或多种异源多肽，这些多肽选自配体的B-7家族或受体的CD28家族。在一些特定实施例中，本发明的非人动物包含本文所述的人源化CD274基因以及来自异源物种(例如，人)的遗传物质，其中该遗传物质编码完整或部分的异源(例如，人)PD-1多肽。在一些特定实施例中，本发明的非人动物还包含具有内源部分和人部分的Pdcd1基因，其中人部分编码人PD-1多肽的胞外结构域，并且内源部分编码内源PD-1多肽的胞内结构域；在一些实施例中，人部分和内源部分有效连接至内源Pdcd1启动子；在一些实施例中，连接至内源啮齿动物Pdcd1启动子。
例如，如本文所述，包含人源化CD274基因的非人动物可进一步包含(例如，通过杂交或多种基因靶向策略)一种或多种修饰，如2015年6月19日提交的美国专利申请No.14/744,592中所述，该专利申请据此以引用方式并入。在某些实施例中，使下述两种啮齿动物杂交：包含人源化CD274基因(即，人CD274基因的外显子3、4及外显子5的5’部分，它们有效连接至内源啮齿动物Cd274基因的外显子1、2、外显子5的3’部分、6和7，以使得人源化CD274基因编码具有来自人PD-L1多肽的胞外部分和来自啮齿动物PD-L1多肽的胞内部分的PD-L1多肽)的啮齿动物，与包含人源化Pdcd1基因(例如，人PDCD1基因的外显子2及外显子3的5’部分，它们有效连接至内源啮齿动物Pdcd1基因的外显子1、外显子3的3’部分、4和5，以使得人源化Pdcd1基因编码具有来自人PD-1多肽的胞外部分和来自啮齿动物PD-1多肽的胞内部分的PD-1多肽；参见例如2015年6月19日提交的美国专利申请No.14/744,592，该专利申请据此以引用方式并入)的啮齿动物。在一些实施例中，人源化Pdcd1基因包含非人(例如，啮齿动物)Pdcd1外显子1、4和5、人Pdcd1外显子2和Pdcd1外显子3，该Pdcd1外显子3包含人部分和非人部分，并且其中所述非人外显子和人外显子有效连接。在一些实施例中，Pdcd1外显子3的人部分包含编码PD-1茎区序列的核苷酸。在一些实施例中，Pdcd1外显子3的人部分包含约71bp的人Pdcd1外显子3。在一些实施例中，Pdcd1外显子3的非人部分包含编码跨膜序列的核苷酸。在一些实施例中，Pdcd1外显子3的非人部分包含约91bp的啮齿动物Pdcd1外显子3。在具体实施例中，人源化Pdcd1基因编码人源化PD-1多肽，该多肽包含来自人PD-1多肽的胞外部分(例如，基本上整个胞外结构域)，以及来自啮齿动物PD-1多肽的跨膜部分(例如，基本上整个跨膜结构域)和胞内部分(例如，基本上整个胞内结构域)。
在一些实施例中，本发明的非人动物是哺乳动物。在一些实施例中，本发明的非人动物是例如跳鼠总科(Dipodoidea)或鼠总科(Muroidea)的小型哺乳动物。在一些实施例中，本发明的经遗传修饰的动物是啮齿动物。在一些实施例中，本发明的啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一些实施例中，本发明的啮齿动物选自鼠总科。在一些实施例中，本发明的经遗传修饰的动物来自选自下列的科：丽仓鼠科(Calomyscidae)(例如，丽仓鼠)、仓鼠科(Cricetidae)(例如，仓鼠、新世界鼠、田鼠)、鼠科(Muridae)(真小鼠和大鼠(true miceand rats)、沙鼠、非洲刺毛鼠、冠鼠)、马岛鼠科(Nesomyidae)(攀鼠、岩鼠、白尾鼠、马岛鼠(Malagasy rats and mice))、刺睡鼠科(Platacanthomyidae)(例如，刺睡鼠)以及鼹形鼠科(Spalacidae)(例如，鼹形鼠、竹鼠和鼢鼠)。在一些特定实施例中，本发明的经遗传修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠科)、沙鼠、非洲刺毛鼠和冠鼠。在一些特定实施例中，本发明的经遗传修饰的小鼠来自鼠科的成员。在一些实施例中，本发明的非人动物是啮齿动物。在一些特定实施例中，本发明的啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一些实施例中，本发明的非人动物是小鼠。
在一些实施例中，本发明的非人动物是啮齿动物，该啮齿动物是选自C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL品系的小鼠。在一些特定实施例中，本发明的小鼠是129品系，该129品系选自是以下的品系：129P1、129P2、129P3、129X1、129S1(例如，129S1/SV、129S1/SvIm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129/SvJae、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2(参见例如Festing et al.,1999,Mammalian Genome10:836(Festing等人，1999年，《哺乳动物基因组》，第10卷，第836页)；Auerbach,W.et al.,2000,Biotechniques 29(5):1024-1028,1030,1032(Auerbach,W.等人，2000年，《生物技术》，第29卷，第5期，第1024-1028、1030、1032页))。在一些特定实施例中，本发明的经遗传修饰的小鼠是上述129品系与上述C57BL/6品系的混合型。在一些特定实施例中，本发明的小鼠是上述129品系的混合型或上述BL/6品系的混合型。在一些特定实施例中，本文所述的混合型的129品系是129S6(129/SvEvTac)品系。在一些实施例中，本发明的小鼠是BALB品系，例如BALB/c品系。在一些实施例中，本发明的小鼠是BALB品系与另一种上述品系的混合型。
在一些实施例中，本发明的非人动物是大鼠。在一些特定实施例中，本发明的大鼠选自Wistar大鼠、LEA品系、Sprague Dawley品系、Fischer品系、F344、F6以及Dark Agouti。在一些特定实施例中，本文所述的大鼠品系是选自Wistar、LEA、Sprague Dawley、Fischer、F344、F6以及Dark Agouti中的两种或更多种品系的混合型。
采用具有人源化CD274基因的非人动物的方法
已报道了CD274突变型和转基因非人动物(例如，小鼠)和细胞(Iwai,Y.et al.,2002,Proc.Nat.Acad.Sci.99(19):12293-12297(Iwai,Y.等人，2002年，《美国国家科学院院刊》，第99卷，第19期，第12293-12297页)；Latchman,Y.E.et al.,2004,Proc.Nat.Acad.Sci.101(29):10691-10696(Latchman,Y.E.等人，2004年，《美国国家科学院院刊》，第101卷，第29期，第10691-10696页)；Subudhi,S.K.et al.,2004,J.Clin.Invest.113(5):694-700(Subudhi,S.K.等人，2004年，《临床研究杂志》，第113卷，第5期，第694-700页)；Guleria,I.et al.,2005,J.Exp.Med.202(2):231-237(Guleria,I.等人，2005年，《实验医学杂志》，第202卷，第2期，第231-237页)；Keir,M.E.et al.,2006,J.Exp.Med.203(4):883-895(Keir,M.E.等人，2006年，《实验医学杂志》，第203卷，第4期，第883-895页)；Tanaka,K.et al.,2007,J.Immunol.179:5204-5210(Tanaka,K.等人，2007年，《免疫学杂志》，第179卷，第5204-5210页)；Wang,C.et al.,2008,Diabetes 57:1861-1869(Wang,C.等人，2008年，《糖尿病》，第57卷，第1861-1869页)；Wen,X.et al.,2008,Transplant.86(11):1596-1602(Wen,X.等人，2008年，《移植》，第86卷，第11期，第1596-1602页)；Plege,A.et al.,2009,Transpl.87(7):975-982(Plege,A.等人，2009年，《移植》，第87卷，第7期，第975-982页)；Cao,Y.et al.,2010,Cancer Res.71(4):1235-1243(Cao,Y.等人，2010年，《癌症研究》，第71卷，第4期，第1235-1243页)；Plege,A.et al.,2010,Eur.Soc.Organ Transplant.23:1293-1300(Plege,A.等人，2010年，《欧洲器官移植学会》，第23卷，第1293-1300页)；Ritprajak,P.et al.,2010,J.Immunol.184:4918-4925(Ritprajak,P.等人，2010年，《免疫学杂志》，第184卷，第4918-4925页)；Yantha,J.et al.,2010,Diabetes 59:2588-2596(Yantha,J.等人，2010年，《糖尿病》，第59卷，第2588-2596页)；Ding,Q.et al.,2011,J.Leukocyte Biol.90:77-86(Ding,Q.等人，2011年，《白血球生物学杂志》，第90卷，第77-86页)；Tang,L.et al.,2011,Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi XueZa Zhi 27(4):357-359(Tang,L.等人，2011年，《细胞与分子免疫学杂志》，第27卷，第4期，第357-359页)；Ghazizadeh,S.et al.,2012,20(1):196-203(Ghazizadeh,S.等人，2012年，第20卷，第1期，第196-203页))。这些突变型和转基因动物可用于确定PD-L1表达和功能的分子方面，及PD-1:PD-L1通路对于调控免疫应答(具体地讲，T细胞应答)的作用。然而，它们存在局限性，这部分归咎于所得结果所展示的可变性。许多转基因PD-L1动物采用的是使用被设计成过表达内源PD-L1的转基因(参见例如Ghazizadeh等人，出处同上)，而其他人则专注于将转基因PD-L1表达与组织特异性启动子联系起来(参见例如Ritprajak等人，出处同上)。这些动物中的一些动物已显示出不与野生型转录谱相关联的转基因PD-L1的表达模式(参见例如Wang等人和Yantha等人，出处同上)。此外，由于使用相同来源遗传物质(例如，小鼠中的小鼠PD-L1转基因)，PD-L1过表达可能对应于内源PD-L1而不是转基因PD-L1，原因在于转基因的可能位置效应。在一些情况下，此类动物展现出疾病加速发展的现象，因此让人担忧的是，转基因可能已形成或修饰了一种或多种表型，从而使PD-L1功能的分析复杂化。这些结果可合理地归因于构建体设计。在人PD-L1的情形中，经工程改造而稳定表达CMV驱动的人PD-L1的猪肠内皮细胞已在微型猪皮肤移植模型中采用，并且提供了同种异体移植模型中异位人PD-L1表达的重要见解(Ding等人，出处同上)。已证实现有PD-L1转基因非人动物可用于阐明PD-L1和PD-1:PD-L1通路的一些生物学功能，但是如上面所展现的，目前利用PD-L1介导的生物学的体内***是不完备的。PD-1:PD-L1通路的分子方面及其在癌症和自身免疫性背景下对于免疫应答调控的作用尚未在转基因动物(例如，小鼠)中得到其最大限度地利用。
本发明的非人动物提供了可用于多种测定法的表达人(或人源化)PD-L1的生物材料(例如，细胞)的改良体内***和来源。在各种实施例中，本发明的非人动物用于开发靶向PD-L1和/或调节PD-1:PD-L1信号传导(例如，干扰与PD-1的相互作用)和/或调节PD-L1与其他结合配偶体(例如，B7-1)的相互作用的治疗剂。此类动物特别有用，因为与用于体内研究的许多其他动物模型相比，它们具有完全免疫活性；因此，疗法的疗效分析不会因受损的免疫状态而变得复杂。在各种实施例中，本发明的非人动物用于鉴别、筛选和/或开发结合人PD-L1的候选治疗剂(例如，抗体)。在各种实施例中，本发明的非人动物用于筛选和开发阻断人PD-L1与人PD-1和/或人B7-1的相互作用的候选治疗剂(例如，抗体)。在各种实施例中，本发明的非人动物用于确定人源化PD-L1多肽的拮抗剂和/或激动剂在本文所述的非人动物的细胞表面上的结合特性；在一些实施例中，本发明的非人动物用于确定结合人PD-L1的一种或多种候选治疗剂抗体的一个或多个表位。
在各种实施例中，本发明的非人动物用于确定抗PD-L1抗体的药代动力学特性。在各种实施例中，使本发明的一个或多个非人动物和一个或多个对照或参考非人动物各自暴露于各种剂量(例如，0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/mg、7.5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、或50mg/kg或更大)的一种或多种候选治疗剂抗PD-L1抗体。可通过任何所需的施用途径(包括肠胃外的和非肠胃外的施用途径)给予候选治疗剂抗体。肠胃外途径包括例如静脉内、动脉内、门静脉内、肌内、皮下、腹膜内、脊柱内、鞘内、脑室内、颅内、胸膜内或其他注射途径。非肠胃外途径包括例如口服、鼻腔、经皮、肺、直肠、口颊、***、眼。施用还可采取持续输注、局部施用、从植入物(凝胶、膜等)缓释和/或静脉内注射。在各个时间点(例如，0小时、6小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、或最多30天或更多天)从非人动物(人源化和对照)分离血液。可使用得自本文所述非人动物的样品执行各种测定法，以确定所施用的候选治疗剂抗体的药代动力学特性，包括但不限于总IgG、抗治疗性抗体应答、凝集等。
在各种实施例中，本发明的非人动物用于测量阻断或调节PD-L1信号传导(或PD-1:PD-L1信号传导、或PD-L1:B7-1介导的相互作用)的疗效以及因细胞变化而引起的对基因表达的影响。在各种实施例中，使本发明的非人动物或从其分离的细胞暴露于候选治疗剂，该候选治疗剂结合非人动物细胞表面上的人源化PD-L1多肽(或PD-L1多肽的人部分)，在此后一段时间之后，分析对PD-L1依赖性过程(例如相互作用)的影响，例如粘附、细胞凋亡、细胞因子产生、炎症、增殖、自身耐受性和病毒性感染(或应答)。
本发明的非人动物表达人源化PD-L1多肽，因此可生成细胞、细胞系和细胞培养物，以便作为用于结合和功能测定法的人源化PD-L1的来源，例如以便测定PD-L1拮抗剂或激动剂的结合或功能，特别是在拮抗剂或激动剂对人PD-L1序列或表位具有特异性，或者，对与PD-1和/或B7-1相关联的人PD-L1序列或表位具有特异性的情况下。在各种实施例中，可使用从本发明的非人动物分离的细胞确定候选治疗剂抗体所结合的PD-L1表位。
在各种实施例中，由本文所述的非人动物表达的人源化PD-L1多肽可包含变体氨基酸序列。示例性人PD-L1多肽变体包括列于NCBI的SNP GeneView网页中的那些变体，并汇总于表3中。在各种实施例中，本发明的非人动物表达人源化PD-L1多肽变体。在各种实施例中，该变体在与配体结合相关联的氨基酸位置处呈多态性。在各种实施例中，本发明的非人动物用于确定通过与人PD-L1的多态性多肽变体相互作用而对配体结合的影响。在一些特定实施例中，本发明的非人动物表达表3中呈现的人PD-L1多肽变体。
表3
Figure BDA0001317080250000501
Figure BDA0001317080250000511
来自本发明的非人动物的细胞可根据需要进行分离和使用，或可在培养物中维持许多代。在各种实施例中，使来自本发明的非人动物的细胞永生化(例如，通过使用病毒)，并在培养物(例如，在连续培养物中)中无限期地维持。
在各种实施例中，本发明的细胞和/或非人动物用于各种免疫方案，以确定在对抗原的免疫应答(例如，T细胞应答)中PD-L1介导的功能。在一些实施例中，在本发明的非人动物中表征了结合人(或人源化)PD-L1或阻断人(或人源化)PD-L1的一种或多种功能的候选治疗剂。合适的测量法包括各种细胞测定法、增殖测定法、血清免疫球蛋白分析(例如，抗体滴度)、细胞毒性测定法、配体-受体相互作用的表征(例如，免疫沉淀测定法)以及配体-配体相互作用的表征。在一些实施例中，本发明的非人动物用于表征调控对抗原的免疫应答的PD-L1介导的功能。在一些实施例中，抗原与自身免疫疾病、障碍或病症相关联。在一些实施例中，抗原与炎性疾病、障碍或病症相关联。在一些实施例中，该抗原与瘤相关联。在一些实施例中，抗原与传染性因子(例如，细菌)相关联。在一些实施例中，抗原是测试抗原(例如，卵清蛋白或OVA)。在一些实施例中，抗原是与需要治疗的一个或多个人患者所患的疾病或病症相关联的靶标。
在各种实施例中，本发明的非人动物用于确定自身抗体产生的滴度的血清测定法，以便测试靶向人PD-L1的候选治疗剂的药物毒理学方面。在一些实施例中，本发明的非人动物中的自身抗体产生由非人动物中诱导的一种或多种自身免疫疾病、障碍或病症引起。
在各种实施例中，本发明的非人动物用于利用一种或多种抗原进行攻击以确定化合物或生物试剂调节免疫应答(包括但不限于对给定抗原的特异性T细胞依赖性和B细胞依赖性应答)的PD-L1依赖性调控的治疗潜力。
在各种实施例中，本发明的细胞和/或非人动物用于存活和/或增殖测定法(例如，采用B或T细胞)以筛选和开发调节人PD-L1信号传导的候选治疗剂。PD-L1的活化或抑制在T细胞应答的调控中起到重要作用，并且PD-L1对自身耐受性的调控可由PD-L1的胞外结构域的特定表位的活化引起，因此，可使用本发明的非人动物的细胞和/或本文所述的非人动物来鉴别、表征和开发候选PD-L1调节剂(例如，拮抗剂或激动剂)。在一些实施例中，本发明的细胞和/或非人动物用于一种或多种存活或死亡测定法，以确定在PD-L1存在和不存在的情况下对一个或多个特定细胞(例如，癌细胞)的增殖或细胞凋亡的影响。
在各种实施例中，本发明的细胞和/或非人动物用于异源(例如，人)细胞或组织的异种移植，以确定在对移植的人细胞或组织的生理(例如，免疫)应答中PD-L1介导的功能。在一些实施例中，在本发明的非人动物中表征了结合人PD-L1或阻断人PD-L1的一种或多种功能的候选治疗剂。合适的测量法包括各种细胞测定法、增殖测定法、血清免疫球蛋白分析(例如，抗体滴度)、细胞毒性测定法以及配体-受体相互作用的表征(免疫沉淀测定法)。在一些实施例中，本发明的非人动物用于表征调控对抗原的免疫应答的PD-L1介导的功能。在一些实施例中，抗原与瘤相关联。在一些实施例中，抗原与自身免疫疾病、障碍或病症相关联。在一些实施例中，抗原与炎性疾病、障碍或病症相关联。在一些实施例中，抗原是与需要治疗的一个或多个人患者所患的疾病或病症相关联的靶标。
在各种实施例中，本发明的非人动物用于移植或过继转移实验，以确定化合物或生物试剂调节异种淋巴细胞及其免疫功能的PD-L1依赖性调控的治疗潜力。在各种实施例中，向本发明的非人动物中移植人T细胞；在一些实施例中，初始T细胞；在一些实施例中，活化T细胞。
在各种实施例中，本发明的非人动物的细胞用于T细胞测定法，以确定化合物或生物试剂调节T细胞依赖性应答和功能的PD-L1依赖性调控的治疗潜力。示例性T细胞测定法包括但不限于，ELISpot、胞内细胞因子染色、主要组织相容性复合物(MHC)限制性、病毒抑制测定法、细胞毒性测定法、增殖测定法和调节性T细胞抑制测定法。
在各种实施例中，本发明的非人动物的细胞用于细胞迁移测定法，以筛选和开发调节人PD-L1的候选治疗剂。细胞迁移涉及细胞跨越内皮的迁移，并且迁移测定法允许测量与白细胞或肿瘤细胞的相互作用，以及白细胞或肿瘤细胞从内皮的迁移。
在各种实施例中，本发明的非人动物的细胞用于肿瘤细胞生长(或增殖)测定法，以确定化合物或生物试剂调节肿瘤细胞的PD-L1依赖性调控和/或细胞凋亡的治疗潜力。
在各种实施例中，本发明的非人动物的细胞用于细胞因子产生测定法，以确定化合物或生物试剂调节从T细胞释放细胞因子(例如，干扰素-γ、白介素-10)的PD-L1依赖性调控的治疗潜力。在一些实施例中，本发明的非人动物的细胞用于检测(和/或测量)因人源化PD-L1与靶向人PD-L1的药物或PD-L1结合配偶体(例如，PD-1、B7-1或其可溶形式)的相互作用而引起的胞内细胞因子释放。
在各种实施例中，在本发明的一个或多个非人动物中诱发自身免疫疾病、障碍或病症，以提供用于确定化合物或生物试剂调节自身免疫疾病、障碍或病症的一个或多个功能(或方面)的PD-L1依赖性调控的治疗潜力的体内***。可在本发明的一个或多个非人动物中诱发的示例性自身免疫疾病、障碍或病症包括糖尿病、实验性自身免疫性脑脊髓炎(例如，多发性硬化症的模型)、类风湿性关节炎和全身性红斑狼疮。
本发明的非人动物提供了用于药物或疫苗的分析和测试的体内***。在各种实施例中，可将候选药物或疫苗递送至本发明的一个或多个非人动物，随后监测非人动物以确定以下一者或多者：对药物或疫苗的免疫应答、药物或疫苗的安全特性、或对疾病或病症和/或疾病或病症的一种或多种症状的作用。在一些实施例中，疫苗的靶标是病毒，例如，人类免疫缺陷病毒或肝炎病毒(例如，HCV)。用于确定安全特性的示例性方法包括测量毒性、最佳剂量浓度、药物或疫苗的效能和可能的风险因素。可在此类非人动物中改良和/或开发此类药物或疫苗。
本发明的非人动物提供了用于通过过继转移阐明人细胞间相互作用的机制的改良的体内***。在各种实施例中，可用肿瘤异种移植物植入本发明的非人动物，随后进行肿瘤浸润淋巴细胞(可通过过继转移在非人动物中植入)的第二植入，以确定消除实体瘤或其他恶性肿瘤的有效性。由于人PD-L1的唯一性存在(不存在与非人动物的内源PD-L1竞争)，可利用人细胞进行这样的实验。此外，可在此类非人动物中改良和/或开发用于异种移植的疗法和药物。
本发明的非人动物提供了用于评估靶向人PD-L1的药物的药代动力学特性的体内***。在各种实施例中，可将靶向人PD-L1的药物递送或施用到本发明的一个或多个非人动物，然后监测非人动物(或从其分离的细胞)或执行对非人动物(或从其分离的细胞)的一种或多种测定法，以确定药物对非人动物的作用。药代动力学特性包括但不限于，动物如何将药物处理成各种代谢物(或检测一种或多种药物代谢物(包括但不限于毒性代谢物)的存在或不存在)、药物半衰期、施用之后药物的循环水平(例如，药物的血清浓度)、抗药物应答(例如，抗药物抗体)、药物吸收和分布、施用途径、***途径和/或药物清除率。在一些实施例中，在本发明的非人动物中或通过使用本发明的非人动物监测药物(例如，PD-L1调节剂)的药代动力学和药效动力学特性。
本发明的非人动物提供了用于评估靶向人PD-L1的药物的在靶毒性(on-targettoxicity)的体内***。在各种实施例中，可将靶向人PD-L1的药物递送或施用到本发明的一个或多个非人动物，然后监测非人动物(或从其分离的细胞)或执行对非人动物(或从其分离的细胞)的一种或多种测定法，以确定药物对非人动物的在靶毒性效应。通常，药物旨在调节其靶标的一种或多种功能。仅举一个例子，PD-L1调节剂旨在通过以下方式调节PD-L1介导的功能(例如，PD-L1信号传导和/或PD-L1相互作用)：以某种方式与一个或多个细胞的表面上的PD-L1分子相互作用，并且在一些实施例中，阻断与一个或多个PD-L1结合配偶体的相互作用。在一些实施例中，这种调节剂可具有不利效应，即夸大调节剂的一种或多种所需药理作用。此类效应称为在靶效应。示例性在靶效应包括剂量过高、慢性活化/失活以及不正确组织中的正确作用。在一些实施例中，在本发明的非人动物中或通过使用本发明的非人动物鉴别的靶向PD-L1的药物的在靶效应，用于确定PD-L1的此前未知的一种或多种功能。
本发明的非人动物提供了用于评估靶向人PD-L1的药物的脱靶毒性的体内***。在各种实施例中，可将靶向人PD-L1的药物递送或施用到本发明的一个或多个非人动物，然后监测非人动物(或从其分离的细胞)或执行对非人动物(或从其分离的细胞)的一种或多种测定法，以确定药物对非人动物的脱靶毒性效应。当药物与非预期靶标相互作用(例如，与共同表位的交叉反应性)时，可发生脱靶效应。此类相互作用可在预期或非预期组织中发生。仅举一个例子，药物的镜像异构体(对映异构体)可引起脱靶毒性效应。此外，药物可不适当地与不同受体亚型相互作用并意外地活化不同受体亚型。示例性脱靶效应包括不正确靶标的不正确活化/抑制，而不论存在不正确靶标的是何种组织。在一些实施例中，通过将药物施用到本发明的非人动物的效应与一个或多个参考非人动物进行比较，确定靶向人PD-L1的药物的脱靶效应。
在一些实施例中，执行测定法包括确定对施用了药物的非人动物的表型和/或基因型的效应。在一些实施例中，执行测定法包括对PD-L1调节剂(例如，拮抗剂或激动剂)或靶向PD-L1的药物的批次间可变性。在一些实施例中，执行测定法包括确定向本发明的非人动物和参考非人动物施用的、靶向PD-L1的药物的效应之间的差异。在各种实施例中，参考非人动物可具有本文所述的修饰、与本文所述不同的修饰(例如，具有改变、破坏、缺失、***、修饰等的或其他方面非功能性的CD274基因的修饰)或没有修饰(即，野生型非人动物)。
为了评估靶向人PD-L1的药物的药代动力学特性、在靶毒性和/或脱靶毒性而可在非人动物中(或在从其分离的细胞中和/或使用从其分离的细胞)测量的示例性参数包括但不限于，凝集、自噬、细胞***、细胞死亡、补体介导的溶血、DNA完整性、药物特异性抗体滴度、药物代谢、基因表达阵列、代谢活性、线粒体活性、氧化应激、吞噬作用、蛋白质生物合成、蛋白质降解、蛋白质分泌、应激反应、靶组织药物浓度、非靶组织药物浓度、转录活性等。在各种实施例中，本发明的非人动物用于确定PD-L1调节剂(例如，靶向PD-L1的药物)的药学有效剂量。
本发明的非人动物提供了开发和表征用于癌症的候选治疗剂的改良体内***。在各种实施例中，可用肿瘤(或肿瘤细胞)植入本发明的非人动物，随后施用一种或多种候选治疗剂。在一些实施例中，候选治疗剂可包括多特异性抗体(例如，双特异性抗体)或抗体混合物；在一些实施例中，候选治疗剂包括组合疗法，例如，以依次或同时给予的方式施用两种或更多种单特异性抗体。可在施用一种或多种候选治疗剂之前预留足够的时间，让肿瘤在非人动物内的一个或多个位置中建立。可在施用一种或多种候选治疗剂之前和之后测量肿瘤细胞增殖、生长、存活情况等。还可根据需要，在非人动物中测量候选治疗剂的细胞毒性。
本发明的非人动物提供了开发和表征用于传染性疾病的候选治疗剂的改良体内***。在各种实施例中，可通过注射使本发明的非人动物感染病毒(例如，MHV、HIV、HCV等)或病原体(例如，细菌)，随后施用一种或多种候选治疗剂。在一些实施例中，候选治疗剂可包括多特异性抗体(例如，双特异性抗体)或抗体混合物；在一些实施例中，候选治疗剂包括组合疗法，例如，以依次或同时给予的方式施用两种或更多种单特异性抗体；在一些实施例中，候选治疗剂可包括疫苗。可预留足够的时间，让病毒或病原体在非人动物内的一个或多个位置或细胞中建立，以使得在非人动物中形成与病毒或病原体的感染相关联的一种或多种症状。可在施用一种或多种候选治疗剂之前和之后测量T细胞增殖和生长情况。此外，可在受病毒或病原体感染的非人动物中测量存活率、血清和/或胞内细胞因子分析、肝和/或脾组织病理学。在一些实施例中，本发明的非人动物用于确定与病毒性感染相关联的器官损伤程度。在一些实施例中，本发明的非人动物用于在受特定病毒感染的非人动物的各种器官中确定细胞因子表达谱和/或基因表达谱。
本发明的非人动物可用于评估靶向人细胞的治疗药物的效能。在各种实施例中，向本发明的一个或多个非人动物中移植人细胞，然后向这种非人动物施用靶向此类人细胞的药物候选物。然后通过监测药物施用之后非人动物中的人细胞，确定药物的治疗效能。可在非人动物中测试的药物包括小分子化合物，即分子量小于1500kD、1200kD、1000kD或800道尔顿的化合物，以及大分子化合物(诸如蛋白质，例如抗体)，它们通过靶向人细胞(例如，与之结合和/或对其作用)，而具有治疗人疾病和病症的预期疗效。
在一些实施例中，药物是抗癌药物，并且人细胞是癌细胞，这些癌细胞可以是原发性癌症的细胞，或由原发性癌症建立的细胞系的细胞。在一些实施例中，向本发明的非人动物中移植人癌细胞，并将抗癌药物给予非人动物。可通过以下方式确定药物效能：评估非人动物中的人癌细胞的生长或转移是否因药物的施用而受到抑制。
在具体实施例中，抗癌药物是抗体分子，其结合人癌细胞上的抗原。在特定实施例中，抗癌药物是双特异性抗体，其结合于人癌细胞上的抗原，并结合于其他人细胞(例如人免疫***的细胞(或“人免疫细胞”)，诸如B细胞和T细胞)上的抗原。
实例
提供以下实例，以向本领域的技术人员描述如何制备和使用本发明的方法和组合物，并且不旨在限制本发明人视作其发明的对象的范围。除非另外指明，否则温度以摄氏度表示，压力为大气压或接近大气压。
实例1.内源分化簇274(CD274)基因的人源化
本实例举例说明在非人动物诸如啮齿动物(例如，小鼠)中对编码程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的内源CD274基因进行人源化的示例性方法。可采用本实例中所述的方法，使用任何人序列或根据需要使用序列(或序列片段)的组合，对非人动物的内源CD274基因进行人源化。在本实例中，采用Genbank登记号NM_014143.3(SEQ ID NO:11)中呈现的、含有人CD274基因外显子3、4和5(部分)的约8,444bp人DNA片段，对小鼠的内源Cd274基因进行人源化。使用
Figure BDA0001317080250000571
技术构建靶向载体，该靶向载体用于人源化编码内源Cd274基因的胞外结构域的遗传物质，该胞外结构域包括N端IgV结构域和IgC2型结构域(参见例如美国专利No.6,586,251以及Valenzuela et al.,2003,Nature Biotech.21(6):652-659(Valenzuela等人，2003年，《自然生物技术》，第21卷，第6期，第652-659页)；这些文献以引用方式并入本文)。
简而言之，对小鼠细菌人工染色体(BAC)克隆RP23-467A9(英杰公司(Invitrogen))进行修饰，使内源小鼠Cd274基因的外显子3、4和5(部分)的编码序列(约8942bp)缺失，然后使用编码人PD-L1多肽的氨基酸19-238的约8444bp人DNA片段***人CD274基因的外显子3、4和5(部分)。保留含有外显子1、外显子2、外显子6和外显子7以及非翻译区(UTR)的内源DNA。约8,444bp人DNA片段的序列分析确认了所有人CD274外显子(即，外显子3、4和5(部分))和剪接信号。序列分析揭示，该序列匹配人CD274转录物NM014143.3。首先，分两个部分扩增约8,444bp人DNA片段(图2，顶部)。使用含有NheI限制性位点的3’引物和含有促进细菌同源重组的小鼠同源盒的5’引物，通过PCR扩增含有人CD274外显子2和部分内含子3的5’部分(约4,494bp)。使用含有XhoI限制性位点的5’引物和含有促进细菌同源重组的小鼠同源盒的3’引物，通过PCR扩增含有部分内含子3、外显子4、内含子4和部分外显子5(约32bp)的3’部分(约3,950bp)。对PCR产物进行凝胶纯化，并分别用对应的限制性核酸内切酶进行消化。采用NheI-XhoI限制性位点，按照与含有人CD274编码序列的DNA片段相反的取向，将约4,494bp和约3,950bp DNA片段连接到约4,996bp自删除新霉素盒(loxP-hUb1-em7-Neo-pA-mPrm1-Crei-loxP；参见美国专利No.8,697,851、8,518,392和8,354,389，所有这些专利据此以引用方式并入)的5’端和3’端。后续的选择采用新霉素。按照设计，人CD274外显子5的一部分(即，初始32bp)和内源Cd274外显子5之间的接合区保留外显子5中的开放阅读框(图2)并形成独特的CD274外显子5(AACTACCTCTGGCACATCCTCCAAATGAAAGGACTCACTG GGTGCTTCTG GGATCCATCC TGTTGTTCCT CATTGTAGTG TCCACGGTCC TCCTCTTCTTGAGAAAACAA G；SEQ ID NO:12)。所得的靶向载体从5’到3’包含：含有来自BAC克隆RP23-467A9的约92.9kb小鼠基因组DNA的5’同源臂，含有人CD274基因外显子3和部分内含子3的约4,494bp人DNA片段，侧接loxP位点的自删除新霉素盒，含有人CD274基因的部分内含子3、外显子4、内含子4和外显子5最开始32bp的约3950bp人DNA片段，以及来自BAC克隆RP23-467A9的约67.6kb小鼠基因组DNA。
上述经修饰的RP23-467A9克隆用于对小鼠胚胎干(ES)细胞进行电穿孔以形成经修饰的ES细胞，这些细胞包含从外显子3到部分外显子5发生人源化的内源CD274基因(即，缺失约8,964的内源Cd274基因并***约8,444bp的人CD274序列)。通过测定法(Valenzuela等人，出处同上)鉴别被阳性靶向的含有人源化CD274基因的ES细胞，该测定法检测到人CD274序列(例如，外显子3、4和部分外显子5)的存在，并确认小鼠Cd274序列(例如，外显子3、4和部分外显子5和/或外显子1、2、6和7)的缺失和/或保留。表4列出了如上所述用于确认内源小鼠Cd274基因的人源化的引物和探针的示例性序列(图3中示出)。
跨越各个接合区的核苷酸序列在图2的示意图中示出。跨越上游***点的核苷酸序列包括以下序列，其表示与***点下游的人CD274序列邻接的内源小鼠Cd274序列(包含在以下括号内)：
Figure BDA0001317080250000591
Figure BDA0001317080250000592
跨越自删除新霉素盒5’端的核苷酸序列包括以下序列，其表示与***点下游的盒序列(包含在以下括号内，其中NheI限制性位点以斜体表示，并且loxP序列以粗体字表示)邻接的人CD274序列：
Figure BDA0001317080250000593
Figure BDA0001317080250000594
跨越自删除新霉素盒3’端的核苷酸序列包括以下序列，其表示与***点下游的人CD274序列邻接的盒序列(包含在以下括号内，其中loxP序列以粗体字表示，并且XhoI限制性位点以斜体表示)：
Figure BDA0001317080250000595
Figure BDA0001317080250000596
跨越人CD274序列3’端的核苷酸序列包括以下序列，其表示与小鼠Cd274序列(包含在以下括号内)邻接的人CD274序列：
Figure BDA0001317080250000601
Figure BDA0001317080250000602
在新霉素盒缺失之后跨越***点的核苷酸序列包括以下序列，其表示与其余盒序列loxP序列(包含在以下括号内，其中NheI和XhoI限制性位点以斜体表示，并且loxP序列以粗体字表示)并置的人基因组序列：
Figure BDA0001317080250000603
然后使用
Figure BDA0001317080250000604
方法将阳性ES细胞克隆植入雌性小鼠(参见例如美国专利No.7,294,754以及Poueymirou et al.,2007,Nature Biotech.25(1):91-99(Poueymirou等人，2007年，《自然生物技术》，第25卷，第1期，第91-99页))，从而生成在内源小鼠Cd274基因中***有人CD274外显子3、4和部分人CD274外显子5的一窝幼仔。使用检测人CD274基因序列的存在的测定法(Valenzuela等人，出处同上)，通过对分离自断尾的DNA进行基因分型，再次确认并鉴别携带内源Cd274基因的外显子3、4和部分外显子5的人源化(即，约8,444bp人DNA片段)的小鼠。对幼仔进行基因分型，并且选择对于人源化Pdcd1基因构建体而言杂合的动物的同龄群进行表征。还让小鼠繁育达到纯合性。
表4
Figure BDA0001317080250000605
Figure BDA0001317080250000611
实例2.人源化PD-L1在活化T细胞上的表达
本实例展示了根据实例1修饰而包含人源化CD274基因的非人动物(例如，啮齿动物)，在活化淋巴细胞的表面上表达人源化PD-L1多肽的情况。在本实例中，取自野生型小鼠以及其基因组含有如实例1中所述的人源化CD274基因的小鼠的活化T细胞用商业抗PD-L1抗体染色，以确定PD-L1在受刺激和未受刺激的T细胞中的表达。
简而言之，从野生型小鼠以及对于如实例1中所述的内源CD274基因而言纯合的小鼠收获脾，并通过机械解离将其加工成单细胞悬液。在介质(补充有10％FBS的RPMI)中洗涤细胞，以1×106/mL重悬，然后将200μL(200000个细胞)接种于96孔板中。用抗CD3和抗CD28抗体(均为1μg/mL)刺激所选孔中的细胞72小时。使用识别CD3、CD4、CD8和人(克隆MIH1，BD生物科学事业部(BD Biosciences))或小鼠(克隆10F.9G2，eBioscience)PD-L1的抗体，根据制造商技术规范对细胞进行染色以用于FACS。在LSRII流式细胞仪上运行经染色的细胞，并使用FLOWJOTM软件分析数据。对CD8+T(CD3+CD8+)和CD4+T(CD3+CD4+)细胞设门，并分析这些细胞的人和小鼠PD-L1的表达。示例性平均荧光强度值列于表5中。
如表5中所示，携带如实例1中所述的人源化CD274基因的小鼠在活化T细胞上表达包含人部分和内源部分的PD-L1多肽。人部分可检测地表达(通过对全人PD-L1多肽具有反应性的抗体进行识别)，该抗体不会识别野生型小鼠中的小鼠PD-L1多肽。相比之下，抗小鼠PD-L1抗体克隆10F.9G2展现出在抗CD3/抗CD28刺激之后对野生型小鼠中的小鼠PD-L1的高染色水平，以及人源化PD-L1小鼠中的边际染色水平。这最可能归因于与人PD-L1的部分交叉反应性。
表5
Figure BDA0001317080250000621
α-hPD-L1：抗人PD-L1
α-mPD-L1：抗小鼠PD-L1
实例3.PD-L1调节剂的体内效能
本实例展示了根据实例1修饰而包含人源化CD274基因的非人动物(例如，啮齿动物)可用于体内测定法，以筛选PD-L1调节剂(例如，抗PD-L1抗体)并确定各种特征，例如，降低肿瘤生长和/或杀死肿瘤细胞。在本实例中，在对于内源CD274基因的人源化(如实例1中所述)而言纯合的、皮下注射了MC38.ova肿瘤细胞的小鼠中筛选了若干抗PD-L1抗体，以确定促进肿瘤消退的最佳抗体剂量和抗PD-L1抗体介导杀死肿瘤细胞的程度。
简而言之，将小鼠根据体重均分为研究1的五个处理或对照组(n＝5至8只小鼠/组)或随机分配到研究2的七个处理组中(n＝5至6只小鼠)。通过异氟烷吸入麻醉研究1动物，然后向右侧腹部皮下注射100μL DMEM悬液中的1×106个MC38.ova细胞(第0天)。MC38.Ova(小鼠结肠癌)细胞经工程改造而表达鸡卵清蛋白，以便增强肿瘤免疫原性并允许监测对明确限定的抗原卵清蛋白肽的T细胞免疫应答。还使用在SFFV病毒启动子的控制之下表达全长人PD-L1的慢病毒载体转导MC38.ova细胞，并且使用对人PD-L1具有特异性的抗体(克隆MIH1，BD生物科学事业部)，通过流式细胞术针对人PD-L1(MC38.ova/hPD-L1)的阳性表达分选这些细胞。MC38.ova细胞还表达低水平的内源小鼠PD-L1。在第3、7、10、14和17天，向研究1处理组腹膜内注射500μg的三种抗PD-L1抗体之一或对PD-L1没有特异性的两种同型对照抗体之一。单组动物不做处理。还向研究2动物皮下植入1×106个MC38.Ova/hPD-L1细胞(第0天)，但是向研究2处理组腹膜内施用10mg/kg或5mg/kg剂量的抗PD-L1抗体(AbA、Ab B或Ab C)或对照抗体(即，对PD-L1没有特异性)。在第3、7、10、14和17天，向处理组施用抗体。每项研究的实验剂量和处理方案列于表6中。
表6
Figure BDA0001317080250000631
对于每项研究而言，通过在实验持续时间(研究1持续17天，研究2持续21天)内每周用卡尺测量来监测肿瘤体积，并在每项研究结束时记录存活百分比。还在每项研究结束时记下无肿瘤小鼠的数量。示例性结果(表示为平均肿瘤体积(mm3±SD))、存活百分比和无肿瘤小鼠的数量列于表7和8中。图4中提供了示例性肿瘤生长曲线。
表7
Figure BDA0001317080250000632
表8
Figure BDA0001317080250000641
对于研究1而言，所有三种抗PD-L1抗体在500μg/小鼠下都能有效促进肿瘤消退，其中所有来自接受Ab B和Ab C的处理组的小鼠在第17天时没有肿瘤(表7)。在Ab A处理组中，五只小鼠中有四只(80％)到第17天时没有肿瘤，而对照组中所有动物都有肿瘤。单因素方差分析及Dunnett多重比较事后检验揭示了用抗PD-L1抗体处理和用对照抗体处理之间肿瘤体积的显著差异，其中p值<0.05。对照2是无关的匹配同型对照抗体，而对照1是无关的不匹配同型对照抗体。
对于研究2而言，所选择的抗PD-L1抗体的施用使得肿瘤生长受到抑制，从而促进肿瘤消退(表8)。所测试的所有抗PD-L1抗体在10mg/kg和5mg/kg下均有效，并且在整个实验过程中以剂量依赖性方式促进经处理的小鼠中的肿瘤消退。用对照抗体处理的所有动物都有肿瘤(表8)。单因素方差分析及Tukey多重比较事后检验揭示了用抗PD-L1抗体处理和用对照抗体处理之间肿瘤体积的显著差异，其中p值<0.05或更低。对照1是无关的匹配同型对照。
如图4及表7和8中所示，在具有如实例1中所述的人源化CD274基因的小鼠中，抗PD-L1抗体显著抑制了预防性MC38.ova/hPD-L1肿瘤生长模型中的肿瘤生长。在整个实验过程中，10mg/kg和5mg/kg的抗PD-L1抗体疗法促进了所有小鼠中的肿瘤消退，使得到第21天时，在10mg/kg组中六只小鼠中有三只仍然没有肿瘤，并且在5mg/kg处理组中五只小鼠中有两只仍然没有肿瘤，而对照组中所有动物都有肿瘤(0/6)(图4)。单因素方差分析及Dunnett多重比较事后检验揭示了第21天时抗PD-L1与对照抗体处理之间肿瘤体积的显著差异，其中p值<0.01(5mg/kg处理组)及p值<0.0001(10mg/kg处理组)。
在类似的实验中，通过在用抗PD-L1抗体处理的荷瘤小鼠的脾细胞中测量CD8+和CD3+T细胞应答，调查了含有如实例1中所述的人源化CD274基因的小鼠中的完整功能性PD-L1信号传导。
简而言之，在第21天(上述)实验结束时从用抗PD-L1或对照抗体处理的、含有如实例1中所述的人源化CD274基因的小鼠分离脾细胞。分离总RNA，并且使用对小鼠CD8b、小鼠CD3ζ(Mm00446171_m1，应用生物***公司(Applied Biosystems))、人PD-L1和小鼠PD-L1具有特异性的寡核苷酸和TAQMANTM探针混合物(表9)，对逆转录的cDNA进行实时PCR。样品相对于小鼠亲环素B的表达进行归一化。图5中提供了示例性结果。
表9
Figure BDA0001317080250000651
如图5中所示，抗hPD-L1抗体的施用在含有人源化CD274基因(如实例1中所述)且荷MC38.ova/hPD-L1肿瘤的小鼠的脾细胞中引起了CD8+和CD3+T细胞的数量的增加。这确认了含有人源化CD274基因(如实例1中所述)的小鼠通过细胞表面上的人源化PD-L1展现出正确的表达和信号传导，因为MC38.ova细胞的PD-L1表达无法抑制抗肿瘤CD8+T细胞的增殖。总的来说，与经对照处理的小鼠相比，在两个处理组中都观察到所展现的T细胞的增加，但是使用单因素方差分析及Dunnett多重比较事后检验得出的CD8b(p值<0.01)和CD3(p<0.001)水平的统计差异仅在10mg/kg抗PD-L1抗体和对照处理组之间达到。
使用为人PD-L1多肽的胞外部分设计的人特异性探针(表9)测量人PD-L1 mRNA表达，并且确认了人源化PD-L1蛋白质在细胞表面上的正确表达(图5)。另外，使用被设计成检测小鼠PD-L1的胞外部分的引物(表9)来测量小鼠PD-L1 mRNA表达，结果未能产生产物。这些数据确认了表5中给出的流式细胞术结果，即，人源化PD-L1小鼠的确表达了完整的且在细胞表面上发挥功能的人源化PD-L1。
综上所述，本实例展现出本发明的非人动物可用于评估靶向PD-L1的药物(例如，抗体)的体内效能，并且此类动物可用于判别抗PD-L1抗体的疗效。此外，本文所述的非人动物可用于评估靶向PD-L1的药物促进肿瘤消退和/或介导杀死肿瘤细胞的程度。本发明的非人动物(例如，小鼠)展现出功能性人源化PD-L1多肽在细胞表面上的表达，以及通过抑制肿瘤模型中的CD8+T细胞的PD-L1依赖性抑制而实现的免疫应答的正确PD-L1调控。
等同方案
在如此地描述了本发明的至少一个实施例的若干方面后，本领域的技术人员将理解，其将容易想到各种改变、修改和改良。此类改变、修改和改良旨在是本公开内容的一部分，且旨在处于本发明的精神和范围之内。因此，前述描述和附图仅仅作为示例的方式，并且本发明通过随后的的权利要求书进行详细描述。
在权利要求中使用序数术语如“第一”、“第二”、“第三”等来修饰权利要求要素，其本身并不意味着一个权利要求要素相对于另一个要素的任何优先性、优先级或顺序或者其中执行方法行为的时间顺序，而是仅用作区分具有某一名称的一个权利要求要素与具有同一名称(但使用序数术语)的另一个要素的标记，以区分这些权利要求要素。
除非明确地指出相反，否则在本文说明书和权利要求书中使用的冠词“一个”和“一种”应被理解为包括其复数指代物。除非指出相反情况或根据情形明显不同，否则如果组成员的一个、多于一个或全部存在于、应用于或以其他方式相关于给定的产物或过程，则在该组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或描述被认为是满足的。本发明包括其中组的正好一个成员存在于、应用于或以其他方式相关于给定的产物或过程的实施例。本发明还包括其中多于一个或全部组成员存在于、应用于或以其他方式相关于给定的产物或过程的实施例。此外，应当理解，除非以其他方式指出或除非对于本领域的技术人员而言很明显地会产生矛盾或不一致，否则本发明涵盖其中将来自一个或多个所列的权利要求的一个或多个限制、要素、条款、说明性术语等引入另一项依赖于相同基础权利要求(或，如果相关，任何其他权利要求)的权利要求的所有变化、组合和置换。当要素被表示为列表(例如，以马库什组或类似格式)时，应当理解，要素的每个亚组也被公开，并且可从组中移除任何要素。应当理解，一般来讲，当本发明或本发明的方面被称为包含特定要素、特征等时，本发明的某些实施例或本发明的方面由或基本上由此类要素、特征等组成。为简单起见，那些实施例并没有在每一种情况下都以如此多的语句具体地阐述。还应当理解，本发明的任何实施例或方面可从权利要求书中明确地排除在外，而不管该特定排除是否于说明书中列明。
本领域的技术人员将理解可归属于本文所述的测定法或其他方法中获得的值的典型标准偏差或误差。本文中提及的描述本发明的背景和提供关于其实施的额外细节的出版物、网站和其他参考资料据此以引用方式并入。
序列表
<110> 雷杰纳荣制药公司(REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.)
<120> 具有人源化分化簇274基因的非人动物
<130> 31971 (10133WO01)
<150> 62/106,525
<151> 2015-01-22
<150> 62/089,549
<151> 2014-12-09
<160> 38
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 3653
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 1
gaaatcgtgg tccccaagcc tcatgccagg ctgcacttgc acgtcgcggg ccagtctcct 60
cgcctgcaga tagttcccaa aacatgagga tatttgctgg cattatattc acagcctgct 120
gtcacttgct acgggcgttt actatcacgg ctccaaagga cttgtacgtg gtggagtatg 180
gcagcaacgt cacgatggag tgcagattcc ctgtagaacg ggagctggac ctgcttgcgt 240
tagtggtgta ctgggaaaag gaagatgagc aagtgattca gtttgtggca ggagaggagg 300
accttaagcc tcagcacagc aacttcaggg ggagagcctc gctgccaaag gaccagcttt 360
tgaagggaaa tgctgccctt cagatcacag acgtcaagct gcaggacgca ggcgtttact 420
gctgcataat cagctacggt ggtgcggact acaagcgaat cacgctgaaa gtcaatgccc 480
cataccgcaa aatcaaccag agaatttccg tggatccagc cacttctgag catgaactaa 540
tatgtcaggc cgagggttat ccagaagctg aggtaatctg gacaaacagt gaccaccaac 600
ccgtgagtgg gaagagaagt gtcaccactt cccggacaga ggggatgctt ctcaatgtga 660
ccagcagtct gagggtcaac gccacagcga atgatgtttt ctactgtacg ttttggagat 720
cacagccagg gcaaaaccac acagcggagc tgatcatccc agaactgcct gcaacacatc 780
ctccacagaa caggactcac tgggtgcttc tgggatccat cctgttgttc ctcattgtag 840
tgtccacggt cctcctcttc ttgagaaaac aagtgagaat gctagatgtg gagaaatgtg 900
gcgttgaaga tacaagctca aaaaaccgaa atgatacaca attcgaggag acgtaagcag 960
tgttgaaccc tctgatcgtc gattggcagc ttgtggtctg tgaaagaaag ggcccatggg 1020
acatgagtcc aaagactcaa gatggaacct gagggagaga accaagaaag tgttgggaga 1080
ggagcctgga acaacggaca ttttttccag ggagacactg ctaagcaagt tgcccatcag 1140
tcgtcttggg aaatggattg agggttcctg gcttagcagc tggtccttgc acagtgacct 1200
tttcctctgc tcagtgccgg gatgagagat ggagtcatga gtgttgaaga ataagtgcct 1260
tctatttatt ttgagtctgt gtgttctcac tttgggcatg taattatgac tggtgaattc 1320
tgacgacatg atagatctta agatgtagtc accaaactca actgctgctt agcatcctcc 1380
gtaactactg atacaagcag ggaacacaga ggtcacctgc ttggtttgac aggctcttgc 1440
tgtctgactc aaataatctt tatttttcag tcctcaaggc tcttcgatag cagttgttct 1500
gtatcagcct tataggtgtc aggtatagca ctcaacatct catctcatta caatagcaac 1560
cctcatcacc atagcaacag ctaacctctg ttatcctcac ttcatagcca ggaagctgag 1620
cgactaagtc acttgcccac agagtatcag ctctcagatt tctgttcttc agccactgtc 1680
ctttcaggat agaatttgtc gttaagaaat taatttaaaa actgattatt gagtagcatt 1740
gtatatcaat cacaacatgc cttgtgcact gtgctggcct ctgagcataa agatgtacgc 1800
cggagtaccg gtcggacatg tttatgtgtg ttaaatactc agagaaatgt tcattaacaa 1860
ggagcttgca ttttagagac actggaaagt aactccagtt cattgtctag cattacattt 1920
acctcatttg ctatccttgc catacagtct cttgttctcc atgaagtgtc atgaatcttg 1980
ttgaatagtt cttttatttt ttaaatgttt ctatttaaat gatattgaca tctgaggcga 2040
tagctcagtt ggtaaaaccc tttcctcaca agtgtgaaac cctgagtctt atccctagaa 2100
cccacataaa aaacagttgc gtatgtttgt gcatgctttt gatcccagca ctagggaggc 2160
agaggcaggc agatcctgag ctctcattga ccacccagcc tagcctacat ggttagctcc 2220
aggcctacag gagctggcag agcctgaaaa acgatgccta gacacacaca cacacacaca 2280
cacacacaca cacacacaca cacaccatgt actcatagac ctaagtgcac cctcctacac 2340
atgcacacac atacaattca aacacaaatc aacagggaat tgtctcagaa tggtccccaa 2400
gacaaagaag aagaaaaaca ccaaaccagc tctattccct cagcctatcc tctctactcc 2460
ttcctagaag caactactat tgtttttgta tataaattta cccaacgaca gttaatatgt 2520
agaatatata ttaaagtgtc tgtcaatata tattatctct ttctttcttt cttcctttct 2580
ttctttcttt ctttctttct ttctttcttt ctttctttct ttcttccttc cttccttcct 2640
tccttccttc cttccttcct ttctttcttt ctttcttttt ttctgtctat ctgtacctaa 2700
atggttgctc actatgcatt ttctgtgctc ttcgcccttt ttatttaatg tatggatatt 2760
tatgctgctt ccagaatgga tctaaagctc tttgtttcta ggttttctcc cccatccttc 2820
taggcatctc tcacactgtc taggccagac accatgtctg ctgcctgaat ctgtagacac 2880
catttataaa gcacgtactc accgagtttg tatttggctt gttctgtgtc tgattaaagg 2940
gagaccatga gtccccaggg tacactgagt taccccagta ccaaggggga gccttgtttg 3000
tgtctccatg gcagaagcag gcctggagcc attttggttt cttccttgac ttctctcaaa 3060
cacagacgcc tcacttgctc attacaggtt ctcctttggg aatgtcagca ttgctccttg 3120
actgctggct gccctggaag gagcccatta gctctgtgtg agcccttgac agctactgcc 3180
tctccttacc acaggggcct ctaagatact gttacctaga ggtcttgagg atctgtgttc 3240
tctgggggga ggaaaggagg aggaacccag aactttctta cagttttcct tgttctgtca 3300
catgtcaaga ctgaaggaac aggctgggct acgtagtgag atcctgtctc aaaggaaaga 3360
cgagcatagc cgaacccccg gtggaacccc ctctgttacc tgttcacaca agcttattga 3420
tgagtctcat gttaatgtct tgtttgtatg aagtttaaga aaatatcggg ttgggcaaca 3480
cattctattt attcatttta tttgaaatct taatgccatc tcatggtgtt ggattggtgt 3540
ggcactttat tcttttgtgt tgtgtataac cataaatttt attttgcatc agattgtcaa 3600
tgtattgcat taatttaata aatattttta tttattaaaa aaaaaaaaaa aaa 3653
<210> 2
<211> 290
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 2
Met Arg Ile Phe Ala Gly Ile Ile Phe Thr Ala Cys Cys His Leu Leu
1 5 10 15
Arg Ala Phe Thr Ile Thr Ala Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr
20 25 30
Gly Ser Asn Val Thr Met Glu Cys Arg Phe Pro Val Glu Arg Glu Leu
35 40 45
Asp Leu Leu Ala Leu Val Val Tyr Trp Glu Lys Glu Asp Glu Gln Val
50 55 60
Ile Gln Phe Val Ala Gly Glu Glu Asp Leu Lys Pro Gln His Ser Asn
65 70 75 80
Phe Arg Gly Arg Ala Ser Leu Pro Lys Asp Gln Leu Leu Lys Gly Asn
85 90 95
Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr
100 105 110
Cys Cys Ile Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Leu
115 120 125
Lys Val Asn Ala Pro Tyr Arg Lys Ile Asn Gln Arg Ile Ser Val Asp
130 135 140
Pro Ala Thr Ser Glu His Glu Leu Ile Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro
145 150 155 160
Glu Ala Glu Val Ile Trp Thr Asn Ser Asp His Gln Pro Val Ser Gly
165 170 175
Lys Arg Ser Val Thr Thr Ser Arg Thr Glu Gly Met Leu Leu Asn Val
180 185 190
Thr Ser Ser Leu Arg Val Asn Ala Thr Ala Asn Asp Val Phe Tyr Cys
195 200 205
Thr Phe Trp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asn His Thr Ala Glu Leu Ile
210 215 220
Ile Pro Glu Leu Pro Ala Thr His Pro Pro Gln Asn Arg Thr His Trp
225 230 235 240
Val Leu Leu Gly Ser Ile Leu Leu Phe Leu Ile Val Val Ser Thr Val
245 250 255
Leu Leu Phe Leu Arg Lys Gln Val Arg Met Leu Asp Val Glu Lys Cys
260 265 270
Gly Val Glu Asp Thr Ser Ser Lys Asn Arg Asn Asp Thr Gln Phe Glu
275 280 285
Glu Thr
290
<210> 3
<211> 3691
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
ggcgcaacgc tgagcagctg gcgcgtcccg cgcggcccca gttctgcgca gcttcccgag 60
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gctgtcttta tattcatgac ctactggcat ttgctgaacg catttactgt cacggttccc 180
aaggacctat atgtggtaga gtatggtagc aatatgacaa ttgaatgcaa attcccagta 240
gaaaaacaat tagacctggc tgcactaatt gtctattggg aaatggagga taagaacatt 300
attcaatttg tgcatggaga ggaagacctg aaggttcagc atagtagcta cagacagagg 360
gcccggctgt tgaaggacca gctctccctg ggaaatgctg cacttcagat cacagatgtg 420
aaattgcagg atgcaggggt gtaccgctgc atgatcagct atggtggtgc cgactacaag 480
cgaattactg tgaaagtcaa tgccccatac aacaaaatca accaaagaat tttggttgtg 540
gatccagtca cctctgaaca tgaactgaca tgtcaggctg agggctaccc caaggccgaa 600
gtcatctgga caagcagtga ccatcaagtc ctgagtggta agaccaccac caccaattcc 660
aagagagagg agaagctttt caatgtgacc agcacactga gaatcaacac aacaactaat 720
gagattttct actgcacttt taggagatta gatcctgagg aaaaccatac agctgaattg 780
gtcatcccag aactacctct ggcacatcct ccaaatgaaa ggactcactt ggtaattctg 840
ggagccatct tattatgcct tggtgtagca ctgacattca tcttccgttt aagaaaaggg 900
agaatgatgg atgtgaaaaa atgtggcatc caagatacaa actcaaagaa gcaaagtgat 960
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aacctgtggt ttaggggttc atcggggctg agcgtgacaa gaggaaggaa tgggcccgtg 1080
ggatgcaggc aatgtgggac ttaaaaggcc caagcactga aaatggaacc tggcgaaagc 1140
agaggaggag aatgaagaaa gatggagtca aacagggagc ctggagggag accttgatac 1200
tttcaaatgc ctgaggggct catcgacgcc tgtgacaggg agaaaggata cttctgaaca 1260
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tttgagggtc agttcctgca gaagtgccct ttgcctccac tcaatgcctc aatttgtttt 1380
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tttattttga gtctgtgagg tcttcttgtc atgtgagtgt ggttgtgaat gatttctttt 1500
gaagatatat tgtagtagat gttacaattt tgtcgccaaa ctaaacttgc tgcttaatga 1560
tttgctcaca tctagtaaaa catggagtat ttgtaaggtg cttggtctcc tctataacta 1620
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taacccatta atactctggt tgacctaatc ttattctcag acctcaagtg tctgtgcagt 1740
atctgttcca tttaaatatc agctttacaa ttatgtggta gcctacacac ataatctcat 1800
ttcatcgctg taaccaccct gttgtgataa ccactattat tttacccatc gtacagctga 1860
ggaagcaaac agattaagta acttgcccaa accagtaaat agcagacctc agactgccac 1920
ccactgtcct tttataatac aatttacagc tatattttac tttaagcaat tcttttattc 1980
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gatgtgagca agacaaagta cctgtcctca aggagctcat agtataatga ggagattaac 2100
aagaaaatgt attattacaa tttagtccag tgtcatagca taaggatgat gcgaggggaa 2160
aacccgagca gtgttgccaa gaggaggaaa taggccaatg tggtctggga cggttggata 2220
tacttaaaca tcttaataat cagagtaatt ttcatttaca aagagaggtc ggtacttaaa 2280
ataaccctga aaaataacac tggaattcct tttctagcat tatatttatt cctgatttgc 2340
ctttgccata taatctaatg cttgtttata tagtgtctgg tattgtttaa cagttctgtc 2400
ttttctattt aaatgccact aaattttaaa ttcatacctt tccatgattc aaaattcaaa 2460
agatcccatg ggagatggtt ggaaaatctc cacttcatcc tccaagccat tcaagtttcc 2520
tttccagaag caactgctac tgcctttcat tcatatgttc ttctaaagat agtctacatt 2580
tggaaatgta tgttaaaagc acgtattttt aaaatttttt tcctaaatag taacacattg 2640
tatgtctgct gtgtactttg ctatttttat ttattttagt gtttcttata tagcagatgg 2700
aatgaatttg aagttcccag ggctgaggat ccatgccttc tttgtttcta agttatcttt 2760
cccatagctt ttcattatct ttcatatgat ccagtatatg ttaaatatgt cctacatata 2820
catttagaca accaccattt gttaagtatt tgctctagga cagagtttgg atttgtttat 2880
gtttgctcaa aaggagaccc atgggctctc cagggtgcac tgagtcaatc tagtcctaaa 2940
aagcaatctt attattaact ctgtatgaca gaatcatgtc tggaactttt gttttctgct 3000
ttctgtcaag tataaacttc actttgatgc tgtacttgca aaatcacatt ttctttctgg 3060
aaattccggc agtgtacctt gactgctagc taccctgtgc cagaaaagcc tcattcgttg 3120
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tggaggtttc gagattcaga tgccctggga gatcccagag tttcctttcc ctcttggcca 3240
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tgcatttgat tgtcactttt tgtacctgca ttaatttaat aaaatattct tatttatttt 3600
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<211> 290
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu
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Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr
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Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile
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Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser
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Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn
85 90 95
Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr
100 105 110
Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val
115 120 125
Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val
130 135 140
Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr
145 150 155 160
Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser
165 170 175
Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn
180 185 190
Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr
195 200 205
Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu
210 215 220
Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His
225 230 235 240
Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr
245 250 255
Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys
260 265 270
Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu
275 280 285
Glu Thr
290
<210> 5
<211> 3656
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 多核苷酸（人源化CD274 mRNA）
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gctgcatgat cagctatggt ggtgccgact acaagcgaat tactgtgaaa gtcaatgccc 480
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gtcctttcag gatagaattt gtcgttaaga aattaattta aaaactgatt attgagtagc 1740
attgtatatc aatcacaaca tgccttgtgc actgtgctgg cctctgagca taaagatgta 1800
cgccggagta ccggtcggac atgtttatgt gtgttaaata ctcagagaaa tgttcattaa 1860
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gcctctcctt accacagggg cctctaagat actgttacct agaggtcttg aggatctgtg 3240
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acacattcta tttattcatt ttatttgaaa tcttaatgcc atctcatggt gttggattgg 3540
tgtggcactt tattcttttg tgttgtgtat aaccataaat tttattttgc atcagattgt 3600
caatgtattg cattaattta ataaatattt ttatttatta aaaaaaaaaa aaaaaa 3656
<210> 6
<211> 291
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 多肽（人源化CD274氨基酸）
<400> 6
Met Arg Ile Phe Ala Gly Ile Ile Phe Thr Ala Cys Cys His Leu Leu
1 5 10 15
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Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu
35 40 45
Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile
50 55 60
Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser
65 70 75 80
Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn
85 90 95
Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr
100 105 110
Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val
115 120 125
Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val
130 135 140
Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr
145 150 155 160
Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser
165 170 175
Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn
180 185 190
Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr
195 200 205
Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu
210 215 220
Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His
225 230 235 240
Trp Val Leu Leu Gly Ser Ile Leu Leu Phe Leu Ile Val Val Ser Thr
245 250 255
Val Leu Leu Phe Leu Arg Lys Gln Val Arg Met Leu Asp Val Glu Lys
260 265 270
Cys Gly Val Glu Asp Thr Ser Ser Lys Asn Arg Asn Asp Thr Gln Phe
275 280 285
Glu Glu Thr
290
<210> 7
<211> 13440
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 多核苷酸（人源化片段A）
<400> 7
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tttttattac aaatggaata cgtatacttg caaataattc agatactgtg gaagagatca 660
aatgaattgc aaaagtgtcc ctcctccctt caccactatc tcccatggca tgcagagaga 720
gtaaccatta tttgtgtgtc cctccagaaa tttttttatt caactactat ttttttattt 780
tattaggtcc gtcagttttc cttttttgag cctctctata tcaaatgcaa ataaatatat 840
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gaactaggag tgttagttcc tcggtattga cccacagtta tgttatcagg tcacttgagt 1080
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ctgatcactg atcaattatt aatcaatgat cactgataac tataaactca aaaacaaaat 1560
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atattttacc atatgcttct ccattcatga catctcttga gatgttgtgg tttatacttt 1740
cagtttttct ccagtccatc cgcaaatatc aggcatctac tgtgttccaa gatattaaag 1800
aaatcatcat gacttagcct catcaacagc attgctagat ctgggatgga aaggaagagt 1860
ataatcctgg cagtcaggaa gaaggcagca taaagtataa gtttctgctt ccaaaaaagg 1920
tctctcatca gcctgtaggg agtgtgtagg gaagggacag ctgtccttgt agtagggaag 1980
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gcaaccacca agcttcactt gcactgaggc cgtgtctcca atggaaatga ggcagctggc 2340
ttgcaggagc ttcccaactc agggaagtag aactcctgag tcacctccat atgcaaatga 2400
tttcacagta atgctgttga acttcacttc ccatcacagc aaatgtgtgg taacatagct 2460
tccccacagg agtttactca ccatggtatt ttaaaggtga aacatttcaa aactgaaatt 2520
tgaaagaatt tagttttgga ttcactcaat tatcactatc acttcgggtg ttattgcacc 2580
tttcttgttt gtgagtttaa atgccagact ctcaggccac taactttcaa ttaaaagtgt 2640
ttttctttaa tcgctgaacc taacagcagg gaaaacgaaa tgttcattca gactttcaga 2700
accttcaatg agattaggca gctgaaagat caaagtgttg catagttgtc ccgataaagc 2760
tatttggatc atatggacca aatcgactgc tgtcattccc caccaacccc atctctcccc 2820
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tagcatatca tatcatactt ttctgttttg tttattgtct ctctcctcct agaatataaa 2940
ctccacaagc acaaagattt gggcctgttt tataatattg ttgcatcccc agggcctgat 3000
atacagcaga gtggtggtac gaaaagagca cacaaaaaaa tatttgttga gtcaatgaat 3060
gaatgatttc ctcaaatagg attagcctaa aattttggaa acatgaacag atttggatat 3120
gtgaaaattt atttccagac tgttcatcag gaactgttag cagcttctaa agggtacact 3180
ggagcagcag tagtaaaagg aggaagagga gcagctctgc tactgctact atcgagtact 3240
actacaatta gcacttgctt attctgtgtg ttaggccctg tactgaacac tctgtctaaa 3300
ttagttcatt tcctcctgga aatgactcta gggggtaagt gcttcatcat gtaagatgag 3360
tatttttcac attttgttgt gtctgaaatc tgagtgtgtc tttcaatgat ggaatctttg 3420
attccatgat aagtggtatt attcccattt taaggatgag gaaactgagg tccaaagaaa 3480
ttaagtaatt tgcccaaatt cacccagcct agaaaatgat aaagctagtt ctaaacccaa 3540
gcagattagc tctgaagtct gggcccttaa taaccacttt ttattgccta tatttgtacc 3600
tctggtgtac gtatcaagtt atatgttgac ttcaaaacta tcatgacctt ttcttggttt 3660
tgattgtcca acattagtat agtgttctgg gtctgcaaaa attttgatta ctcatctcat 3720
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tttactttct gttaatatat aagttgtatc ataagaaact gccgtttttg aagagcaaaa 3840
aaaggttgaa tgttaccagt tacatctggt tcaacctaat agacatttgt acaaaaacag 3900
acattttaag aggttgaaat aaaaatttaa taaacaatat tttcagtttt tactaattgt 3960
gatgcttcac tatcattagc taatatgtca aggcataata taccttaggg tgaactttat 4020
cattaacaaa ggtggatggt gtcaataatc ttgaggtttg tgttttttta tataacactg 4080
cgaggtctaa ttaagtactt actgtttacc acctcataca gtggccgata aaaagtgtca 4140
cttctgctgt ttcctctggg ttgtgcttga attattagta ttatcttcag tcctcagttt 4200
ctttgtggga aactttttaa ttagttgttt aattttgtaa gatggttagt ttagtcaaaa 4260
ttagataaga gaatttgaaa atccgtagct accccaaagc aacctacaca taagaactat 4320
tatttttgtg ttttgaaatc ataattttat tgatttccag tgtttccact ggtagtggtt 4380
tcattgatat aggagtatca aaacatcact cattatttat ttcagtttca tttgatccta 4440
gccgttttgt attaactctc tgtgaagaaa ttacctcaca aatctattgc tgtcgctagc 4500
tcgctacctt aggaccgtta tagttactag cataacttcg tatagcatac attatacgaa 4560
gttattccag acatgataag atacattgat gagtttggac aaaccacaac tagaatgcag 4620
tgaaaaaaat gctttatttg tgaaatttgt gatgctattg ctttatttgt aaccattata 4680
agctgcaata aacaagttaa caacaacaat tgcattcatt ttatgtttca ggttcagggg 4740
gaggtgtggg aggtttttta aagcaagtaa aacctctaca gatgtgatat ggctgattat 4800
gatcattact tatctagagc ttagatcccc cctgcccggt tattattatt tttgacacca 4860
gaccaactgg taatggtgcg gaggcacgct cagctggaat tggccgcaac tagggcaggt 4920
ttaacaacaa caattgcatt cattttatgt ttcaggttca gggggaggtg tgggaggttt 4980
tttaaagcaa gtaaaacctc tacagatgtg atatggctga ttatgatcat tacttatcta 5040
gatcaatcgc catcttccag caggcgcacc attgcccctg tttcactatc caggttacgg 5100
atatagttca tgacaatatt tacattggtc cagccaccag cttgcatgat ctccggtatt 5160
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gccaggtatc tctgaccaga gtcatcctaa aatacacaaa caattagaat cagtagttta 5280
acacattata cacttaaaaa ttttatattt accttagcgc cgtaaatcaa tcgatgagtt 5340
gcttcaaaaa tcccttccag ggcgcgagtt gatagctggc tggtggcaga tggcgcggca 5400
acaccatttt ttctgacccg gcaaaacagg tagttattcg gatcatcagc tacaccagag 5460
acggaaatcc atcgctcgac cagtttagtt acccccaggc taagtgcctt ctctacacct 5520
gcggtgctaa ccagcgtttt cgttctgcca atatggatta acattctccc accgtcagta 5580
cgtgagatat ctttaaccct gatcctggca atttcggcta tacgtaacag ggtgttataa 5640
gcaatcccca gaaatgccag attacgtata tcctggcagc gatcactatt ttccatgagt 5700
gaacgaacct ggtcgaaatc agtgcgttcg aacgctagag cctgttttgc acgttcaccg 5760
gcatcaacgt tttcttttcg gatccgccgc ataaccagtg aaacagcatt gctgtcactt 5820
ggtcgtggca gcccggaccg acgatgaagc atgtttagct ggcccaaatg ttgctggata 5880
gtttttactg ccagaccgcg cgcctgaaga tatagaagat aatcgcgaac atcttcaggt 5940
tctgcgggaa accatttccg gttattcaac ttgcaccatg ccgcccacga ccggcaaacg 6000
gacagaagca ttttccaggt atgctcagaa aacgcctggc gatccctgaa catgtccatc 6060
aggttcttgc gaacctcatc actcgttgca tcgaccggta atgcaggcaa attttggtgt 6120
acggtcagta aattggaatt taaatcggta cgcaccttcc tcttcttctt gggggtaccc 6180
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ccaacctgtg agcaggtgga attttgtggg ctgtggcctg ggagccagca ccctcttcct 6300
cttatagata ctagtggccc ctaggaatta tgaagtcaaa gaggaccagg acctcacaga 6360
ccatggccag tgaggacctg taccatgtcc aaatatgggc atgagagggg tgggcagggc 6420
tttggcatca ggagttgctt gtgtcacagt caagaagtga caaagatggc atccacttga 6480
gtgttcagtt agtcactcag cttaggtgtt aagtgccaca cacctgcttc taggctaggt 6540
cctgatagat aacccaaggc caggcaggtg ggtgaaacag ccacatggat ttgaactgtg 6600
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aattatccaa cgccccagtg aggcactgac agacaaatcc agagggtctc agagttgcag 6720
gggggtgggc tctagtaaaa cattgaggcc ccatcaagtg cttcaggtat aaatgggagc 6780
cacatggatg cagagcagtg tttggactga gggaggtgtt ggacattact agacagaagg 6840
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ggaatcaaga gaaaaacaat gatcccacga gagatctata gatctataga tcatgagtgg 7080
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caccccaccc ccacccccgt agctccaatc cttccattca aaatgtaggt actctgttct 7260
cacccttctt aacaaagtat gacaggaaaa acttccattt tagtggacat ctttattgtt 7320
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gtttcgcttg gtggtcgaat gggcaggtag ccggatcaag cgtatgcagc cgccgcattg 7800
catcagccat gatggatact ttctcggcag gagcaaggtg agatgacagg agatcctgcc 7860
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cattcagggc accggacagg tcggtcttga caaaaagaac cgggcgcccc tgcgctgaca 8040
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ccatggttta gttcctcacc ttgtcgtatt atactatgcc gatatactat gccgatgatt 8220
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aacttcacaa aacacactcg ccaaccccga gcgcatagtt caaaaccgga gcttcagcta 8400
cttaagaaga taggtacata aaaccgacca aagaaactga cgcctcactt atccctcccc 8460
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aataagagct ttcccgcatt agcgaaggcc tcaagacctt gggttcttgc cgcccaccat 8820
gccccccacc ttgtttcaac gacctcacag cccgcctcac aagcgtcttc cattcaagac 8880
tcgggaacag ccgccatttt gctgcgctcc ccccaacccc cagttcaggg caaccttgct 8940
cgcggaccca gactacagcc cttggcggtc tctccacacg cttccgtccc accgagcggc 9000
ccggcggcca cgaaagcccc ggccagccca gcagcccgct actcaccaag tgacgatcac 9060
agcgatccac aaacaagaac cgcgacccaa atcccggctg cgacggaact agctgtgcca 9120
cacccggcgc gtccttatat aatcatcggc gttcaccgcc ccacggagat ccctccgcag 9180
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ccctagagtc acccaagtcc cgtcctaaaa tgtccttctg ctgatactgg ggttctaagg 9300
ccgagtctta tgagcagcgg gccgctgtcc tgagcgtccg ggcggaagga tcaggacgct 9360
cgctgcgccc ttcgtctgac gtggcagcgc tcgccgtgag gaggggggcg cccgcgggag 9420
gcgccaaaac ccggcgcgga ggccatgcat ataacttcgt atagcataca ttatacgaag 9480
ttatctcgag cttggtaaag gaatggagaa ttaaggctct agatcattag tggttacact 9540
atagtattag aagtaaaaaa aagattatac caacaaaata agaacatgtt aatgtacttg 9600
taatgaataa acatgaataa agctcttatg ctatataggt gcactaaaca atctactaga 9660
attgtcagca aactacgtat cttaatcctg aaagggtccc aaaccaatga tctaaaattg 9720
aatcaaactt tcttccttga gcataattac ttaaatgatt tattaaaata gccagcattt 9780
aaaagcttaa aatgtaaata tcataatgtg gtatcctaga tagcatccca gaacagaaaa 9840
aggatattag ggaaaaactg gaggaatgga ataaattatg cagtttagtt attaataatg 9900
tactaacgtc cttagttatg acgattgtac catggtaatg taagatacta acaatagagg 9960
aaaccgggta aggagtatac agtaactcta tactatcttt gcaacttttt tgtaaattta 10020
aaacttctaa aataaagaac aaatttaaac attaaaaagt atcaccagga acatatatca 10080
ctgtttacag atgaaatact atgtattttc atatctaatt tctgatcatt gacttcaaat 10140
cagaaaagtg aatgacacct caaaatcagg ttttctgttt actgaagtct aagaaaagaa 10200
agcataccag ctggagagat tcatgtttat aaagacagat ttataacaac aaaaataaaa 10260
tatccaagaa taaatttaag aagaagcact ttactgagaa acatatgaaa acctgaacaa 10320
atggagaggg atattttgta tttgaataga aagacttctg gtttaaagat aattctcttt 10380
aaattatttt ttgtagaaat ttaaggggta caagagcagt gttgtcacat ggatatatta 10440
catagtggtg aagtctgggg ttttagtgta aattaatctt tacattttgt ttgagcccaa 10500
taaatgtacc aacatgattt ttatagaaag atagtcattc ctattaatcc aaacttgtcc 10560
caactttgaa ttgaattgag gcagagctag caggtgttcc ccacggctga ggcatctgaa 10620
cattaagcat atccctctga gaaccagcct gcattgatac tctttctaat gtggacagca 10680
tcaagctatg tacgtagttc tgtgctcagc aaaagccctg acttcttttt gtttatgtcc 10740
tagccccata caacaaaatc aaccaaagaa ttttggttgt ggatccagtc acctctgaac 10800
atgaactgac atgtcaggct gagggctacc ccaaggccga agtcatctgg acaagcagtg 10860
accatcaagt cctgagtggt aagaccacca ccaccaattc caagagagag gagaagcttt 10920
tcaatgtgac cagcacactg agaatcaaca caacaactaa tgagattttc tactgcactt 10980
ttaggagatt agatcctgag gaaaaccata cagctgaatt ggtcatccca ggtaatattc 11040
tgaatgtgtc cattaaaata tgtctaacac tgtcccctag cacctagcat gatgtctgcc 11100
tatcatagtc attcagtgat tgttgaataa atgaatgaat gaataacact atgtttacaa 11160
aatatatcct aattcctcac ctccattcat ccaaaccata ttgttactta ataaacattc 11220
agcagatatt tatggaatat accttttgtt ccatgcattg tagtactcat tggatacaca 11280
tagaataata agactcagtt cacactcttc aggaaacaga taaaaaacta agaaacaaac 11340
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ccaaacatga gggacccttt ctccccggtg cctctcccaa ggtagtctac aatatttcaa 11580
ctctagcagt ctgcttagtg catagaacat gaggctgtgt gtccctgggc aaattactag 11640
acttctgtgt gcttcacttt ccctgtagga ttataatcta ctgagcaagc ttattgtaag 11700
ggtcagatta gcaacagtgt atgaaaatga tttgagacca ttgcctgcac aaattcaact 11760
attttttttt atctcactac tctacagaag taggtagggt gggagacaga gtctgatgag 11820
aggctcagaa tgtgaaagaa agtgaggcga gtgagcatga tatttaatat aaacacaaag 11880
atattctgag aagagctgct cactgccccc tcccccaata catgttgata ggaaaatgcc 11940
acgtacttca gcaaaaacaa ctgaaaaatt agatagaaaa gtcaatcaat aggaaaagat 12000
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gctcttactg gggtacgagt cctcaggtat tgaactggct ttcagtaaaa gctagattag 12120
tgggttcctg ccatttacaa gctgttttat gacaacttac ttgttgggtg gcctacagta 12180
actcacctaa ctgcactgag tctgtttcct catctgtaaa ttggggattt ttttttaaat 12240
acctggcatg cctaactcat aaagttgttc tgaaactgaa ataaaacata cgtgaacagg 12300
cattgtaaac tgtaagttac ggaaaaagct ggctgttgtt gtgtctttaa agtttcacct 12360
gggtagtcaa agatggatca tgggtctcag tggagagctg agccaggcag gagctgacta 12420
agggtgagag gtgggagtta gcagcctctg aacatctgtg taccatggga ccccctttcc 12480
tcctgcatgg taccccagac aaggagccta gtaagagata ctaatggctt gttgtccaga 12540
gatgttcaaa ctgcagagaa agataagaca acaagcattg gcctccaatc atgatgacag 12600
ataggaggag gtgggagctc cttagcagtg ctggttggcc ttccatgttc tactgtgggc 12660
catctctgcc atgtactgta ggctactagc ttctatatta aagaatgcaa gaggggccag 12720
gagcggaggc tcatgcctgt aatctcagca ctttgggagg ccaaggtggg cagatcactt 12780
gaggtcagga gtttgtgacc agcctggcca acatggtgaa actctgcctt tactaaaaat 12840
ataaaaatta gctgggtgtg gtggtgtgca cctgtaatcc cagctactcg ggagactgag 12900
gcacaagaat tgcttgaacc tgggaggcgg aagttgcagt gagcccagat tgcgccactg 12960
cactccaccc tgggcaacag agaaagactc tgcctcaaaa aaaaaaaaaa aaagcaagag 13020
gaagtgaaat aatcaaggcc gccatttaat agtgagcagc cactccatgt ggtactgtgc 13080
aagcacatta taaatattag cctcacaaga aatgtattag catttgtatt ttgtacactg 13140
gttaagtatc ttgcccaaga cctcaaaact ggttaagggc agcagaattt agccccagca 13200
ccaccttttc aaagcctggg cttctcacac ttctccatgc tgttcccatt ttaacacagg 13260
tatctcgcca ttccagccac tcaaactttg gcatttaaga aaattatcct aaagctaaac 13320
taaacttcaa ggatgaccat tctcctgacc ccttcccatc aaaattttat ctttagtcag 13380
tttgttttcg ttttgttttg tttttcagaa ctacctctgg cacatcctcc aaatgaaagg 13440
<210> 8
<211> 8521
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 多核苷酸（人源化片段B）
<400> 8
gtcacggttc ccaaggacct atatgtggta gagtatggta gcaatatgac aattgaatgc 60
aaattcccag tagaaaaaca attagacctg gctgcactaa ttgtctattg ggaaatggag 120
gataagaaca ttattcaatt tgtgcatgga gaggaagacc tgaaggttca gcatagtagc 180
tacagacaga gggcccggct gttgaaggac cagctctccc tgggaaatgc tgcacttcag 240
atcacagatg tgaaattgca ggatgcaggg gtgtaccgct gcatgatcag ctatggtggt 300
gccgactaca agcgaattac tgtgaaagtc aatggtaaga attattatag atgagaggcc 360
tgatctttat tgaaaacata ttccaagtgt tgaagacttt tcattcttgt aagtccatac 420
ttattttcaa acagaacagc atagtctgtt cattcattca ttcaattcat gaattcattc 480
acataattat ccaatttctt gagcacctat ttgatagtca ctggaaatcc agagacaaac 540
aacacagagc catgttctac agtatgtaca gttttccaaa aagaatttct agtctttact 600
tttttattac aaatggaata cgtatacttg caaataattc agatactgtg gaagagatca 660
aatgaattgc aaaagtgtcc ctcctccctt caccactatc tcccatggca tgcagagaga 720
gtaaccatta tttgtgtgtc cctccagaaa tttttttatt caactactat ttttttattt 780
tattaggtcc gtcagttttc cttttttgag cctctctata tcaaatgcaa ataaatatat 840
tcagaacaaa ccccactgta aggttcacat taaaaaagac ttgaagtcac cctatgaaga 900
caaaaaataa tcacattaag tgtgaaagaa cctattcttc cagtacagga taagccatac 960
ttactgggca tatattcatc ttgaaaatct atactgatgt tgtcttgggg aattgaaaag 1020
gaactaggag tgttagttcc tcggtattga cccacagtta tgttatcagg tcacttgagt 1080
tcaaagtttt gtgttggcac tagctaagta aaggaaaaca cctctgcttt cattgttgag 1140
tttcacagaa ttgagagctg aaaggatccc aggcaggagc agctaatcca aactcccaca 1200
aagaacaaaa atcccccaga ggatcttctg ttcttatatt tcctgcaatg gcgtccctgt 1260
catatcccac aatggcctcc ctgccatttg gatatccctt ccatatcctg ttgaaattac 1320
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atgatgacct tttaatattt gactagaatt aaatcatctc cccttggtct ttccattcct 1440
gggctaacta ccatcaatct gagggctaac aatacaagta gaaaaagtat acatttgtca 1500
ctgatcactg atcaattatt aatcaatgat cactgataac tataaactca aaaacaaaat 1560
catgtgggga ttaagagaaa tgtatcagtt ttatgttgta tttctggtcc ctgatactgg 1620
ctcaggtaat gccactattg tcaagaagat accacttgta aagtagattt aattttcatt 1680
atattttacc atatgcttct ccattcatga catctcttga gatgttgtgg tttatacttt 1740
cagtttttct ccagtccatc cgcaaatatc aggcatctac tgtgttccaa gatattaaag 1800
aaatcatcat gacttagcct catcaacagc attgctagat ctgggatgga aaggaagagt 1860
ataatcctgg cagtcaggaa gaaggcagca taaagtataa gtttctgctt ccaaaaaagg 1920
tctctcatca gcctgtaggg agtgtgtagg gaagggacag ctgtccttgt agtagggaag 1980
ggttttattc aggtcgtctg ggctccataa tatcccttgt gtatctgcag tctcctttgc 2040
catggatcaa cacaatagga aatcttccgg cactgatggt ttttccaagg gggagttctt 2100
cctggagcaa agcaaatgac caaccaggtt tgaggacctg atttgtttga caattccatt 2160
ttgtattgta aattacttaa ttggcattct actcccaatc catcttgtca tttgcataca 2220
gtggttttgg gattgagttc agctatacca aaagtctgaa ccttctgcac ttagaacaag 2280
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ttgcaggagc ttcccaactc agggaagtag aactcctgag tcacctccat atgcaaatga 2400
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attccatgat aagtggtatt attcccattt taaggatgag gaaactgagg tccaaagaaa 3480
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gcagattagc tctgaagtct gggcccttaa taaccacttt ttattgccta tatttgtacc 3600
tctggtgtac gtatcaagtt atatgttgac ttcaaaacta tcatgacctt ttcttggttt 3660
tgattgtcca acattagtat agtgttctgg gtctgcaaaa attttgatta ctcatctcat 3720
ctgtaaaaca ttttgaactc gtgtgtttgt gcatgcacat ttgtgtgtaa ttataaaaat 3780
tttactttct gttaatatat aagttgtatc ataagaaact gccgtttttg aagagcaaaa 3840
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gatgcttcac tatcattagc taatatgtca aggcataata taccttaggg tgaactttat 4020
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cgaggtctaa ttaagtactt actgtttacc acctcataca gtggccgata aaaagtgtca 4140
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catggatcaa cacaatagga aatcttccgg cactgatggt ttttccaagg gggagttctt 2100
cctggagcaa agcaaatgac caaccaggtt tgaggacctg atttgtttga caattccatt 2160
ttgtattgta aattacttaa ttggcattct actcccaatc catcttgtca tttgcataca 2220
gtggttttgg gattgagttc agctatacca aaagtctgaa ccttctgcac ttagaacaag 2280
gcaaccacca agcttcactt gcactgaggc cgtgtctcca atggaaatga ggcagctggc 2340
ttgcaggagc ttcccaactc agggaagtag aactcctgag tcacctccat atgcaaatga 2400
tttcacagta atgctgttga acttcacttc ccatcacagc aaatgtgtgg taacatagct 2460
tccccacagg agtttactca ccatggtatt ttaaaggtga aacatttcaa aactgaaatt 2520
tgaaagaatt tagttttgga ttcactcaat tatcactatc acttcgggtg ttattgcacc 2580
tttcttgttt gtgagtttaa atgccagact ctcaggccac taactttcaa ttaaaagtgt 2640
ttttctttaa tcgctgaacc taacagcagg gaaaacgaaa tgttcattca gactttcaga 2700
accttcaatg agattaggca gctgaaagat caaagtgttg catagttgtc ccgataaagc 2760
tatttggatc atatggacca aatcgactgc tgtcattccc caccaacccc atctctcccc 2820
aaaattccca gccctgttta agtgttctct gtagcattta tctctatcta gtatattgtg 2880
tagcatatca tatcatactt ttctgttttg tttattgtct ctctcctcct agaatataaa 2940
ctccacaagc acaaagattt gggcctgttt tataatattg ttgcatcccc agggcctgat 3000
atacagcaga gtggtggtac gaaaagagca cacaaaaaaa tatttgttga gtcaatgaat 3060
gaatgatttc ctcaaatagg attagcctaa aattttggaa acatgaacag atttggatat 3120
gtgaaaattt atttccagac tgttcatcag gaactgttag cagcttctaa agggtacact 3180
ggagcagcag tagtaaaagg aggaagagga gcagctctgc tactgctact atcgagtact 3240
actacaatta gcacttgctt attctgtgtg ttaggccctg tactgaacac tctgtctaaa 3300
ttagttcatt tcctcctgga aatgactcta gggggtaagt gcttcatcat gtaagatgag 3360
tatttttcac attttgttgt gtctgaaatc tgagtgtgtc tttcaatgat ggaatctttg 3420
attccatgat aagtggtatt attcccattt taaggatgag gaaactgagg tccaaagaaa 3480
ttaagtaatt tgcccaaatt cacccagcct agaaaatgat aaagctagtt ctaaacccaa 3540
gcagattagc tctgaagtct gggcccttaa taaccacttt ttattgccta tatttgtacc 3600
tctggtgtac gtatcaagtt atatgttgac ttcaaaacta tcatgacctt ttcttggttt 3660
tgattgtcca acattagtat agtgttctgg gtctgcaaaa attttgatta ctcatctcat 3720
ctgtaaaaca ttttgaactc gtgtgtttgt gcatgcacat ttgtgtgtaa ttataaaaat 3780
tttactttct gttaatatat aagttgtatc ataagaaact gccgtttttg aagagcaaaa 3840
aaaggttgaa tgttaccagt tacatctggt tcaacctaat agacatttgt acaaaaacag 3900
acattttaag aggttgaaat aaaaatttaa taaacaatat tttcagtttt tactaattgt 3960
gatgcttcac tatcattagc taatatgtca aggcataata taccttaggg tgaactttat 4020
cattaacaaa ggtggatggt gtcaataatc ttgaggtttg tgttttttta tataacactg 4080
cgaggtctaa ttaagtactt actgtttacc acctcataca gtggccgata aaaagtgtca 4140
cttctgctgt ttcctctggg ttgtgcttga attattagta ttatcttcag tcctcagttt 4200
ctttgtggga aactttttaa ttagttgttt aattttgtaa gatggttagt ttagtcaaaa 4260
ttagataaga gaatttgaaa atccgtagct accccaaagc aacctacaca taagaactat 4320
tatttttgtg ttttgaaatc ataattttat tgatttccag tgtttccact ggtagtggtt 4380
tcattgatat aggagtatca aaacatcact cattatttat ttcagtttca tttgatccta 4440
gccgttttgt attaactctc tgtgaagaaa ttacctcaca aatctattgc tgtccttggt 4500
aaaggaatgg agaattaagg ctctagatca ttagtggtta cactatagta ttagaagtaa 4560
aaaaaagatt ataccaacaa aataagaaca tgttaatgta cttgtaatga ataaacatga 4620
ataaagctct tatgctatat aggtgcacta aacaatctac tagaattgtc agcaaactac 4680
gtatcttaat cctgaaaggg tcccaaacca atgatctaaa attgaatcaa actttcttcc 4740
ttgagcataa ttacttaaat gatttattaa aatagccagc atttaaaagc ttaaaatgta 4800
aatatcataa tgtggtatcc tagatagcat cccagaacag aaaaaggata ttagggaaaa 4860
actggaggaa tggaataaat tatgcagttt agttattaat aatgtactaa cgtccttagt 4920
tatgacgatt gtaccatggt aatgtaagat actaacaata gaggaaaccg ggtaaggagt 4980
atacagtaac tctatactat ctttgcaact tttttgtaaa tttaaaactt ctaaaataaa 5040
gaacaaattt aaacattaaa aagtatcacc aggaacatat atcactgttt acagatgaaa 5100
tactatgtat tttcatatct aatttctgat cattgacttc aaatcagaaa agtgaatgac 5160
acctcaaaat caggttttct gtttactgaa gtctaagaaa agaaagcata ccagctggag 5220
agattcatgt ttataaagac agatttataa caacaaaaat aaaatatcca agaataaatt 5280
taagaagaag cactttactg agaaacatat gaaaacctga acaaatggag agggatattt 5340
tgtatttgaa tagaaagact tctggtttaa agataattct ctttaaatta ttttttgtag 5400
aaatttaagg ggtacaagag cagtgttgtc acatggatat attacatagt ggtgaagtct 5460
ggggttttag tgtaaattaa tctttacatt ttgtttgagc ccaataaatg taccaacatg 5520
atttttatag aaagatagtc attcctatta atccaaactt gtcccaactt tgaattgaat 5580
tgaggcagag ctagcaggtg ttccccacgg ctgaggcatc tgaacattaa gcatatccct 5640
ctgagaacca gcctgcattg atactctttc taatgtggac agcatcaagc tatgtacgta 5700
gttctgtgct cagcaaaagc cctgacttct ttttgtttat gtcctagccc catacaacaa 5760
aatcaaccaa agaattttgg ttgtggatcc agtcacctct gaacatgaac tgacatgtca 5820
ggctgagggc taccccaagg ccgaagtcat ctggacaagc agtgaccatc aagtcctgag 5880
tggtaagacc accaccacca attccaagag agaggagaag cttttcaatg tgaccagcac 5940
actgagaatc aacacaacaa ctaatgagat tttctactgc acttttagga gattagatcc 6000
tgaggaaaac catacagctg aattggtcat cccaggtaat attctgaatg tgtccattaa 6060
aatatgtcta acactgtccc ctagcaccta gcatgatgtc tgcctatcat agtcattcag 6120
tgattgttga ataaatgaat gaatgaataa cactatgttt acaaaatata tcctaattcc 6180
tcacctccat tcatccaaac catattgtta cttaataaac attcagcaga tatttatgga 6240
atataccttt tgttccatgc attgtagtac tcattggata cacatagaat aataagactc 6300
agttcacact cttcaggaaa cagataaaaa actaagaaac aaacaaaaaa caggcaatcc 6360
aacaccatgt gggaaatgct ttcatagccg ggaaacctgg ggaatacctg agaggaatac 6420
tcaattcagg ccttgtttca ggaatccaaa tcctggcaca tcagagctgc ttccctcttt 6480
ccagggtggc aggaaataaa tggaacatat ttttctatct tatgccaaac atgagggacc 6540
ctttctcccc ggtgcctctc ccaaggtagt ctacaatatt tcaactctag cagtctgctt 6600
agtgcataga acatgaggct gtgtgtccct gggcaaatta ctagacttct gtgtgcttca 6660
ctttccctgt aggattataa tctactgagc aagcttattg taagggtcag attagcaaca 6720
gtgtatgaaa atgatttgag accattgcct gcacaaattc aactattttt ttttatctca 6780
ctactctaca gaagtaggta gggtgggaga cagagtctga tgagaggctc agaatgtgaa 6840
agaaagtgag gcgagtgagc atgatattta atataaacac aaagatattc tgagaagagc 6900
tgctcactgc cccctccccc aatacatgtt gataggaaaa tgccacgtac ttcagcaaaa 6960
acaactgaaa aattagatag aaaagtcaat caataggaaa agataatcca ggacggtgtt 7020
gtgaacagaa agagggggaa aaaactttag aaaatgatgg ggatgctctt actggggtac 7080
gagtcctcag gtattgaact ggctttcagt aaaagctaga ttagtgggtt cctgccattt 7140
acaagctgtt ttatgacaac ttacttgttg ggtggcctac agtaactcac ctaactgcac 7200
tgagtctgtt tcctcatctg taaattgggg attttttttt aaatacctgg catgcctaac 7260
tcataaagtt gttctgaaac tgaaataaaa catacgtgaa caggcattgt aaactgtaag 7320
ttacggaaaa agctggctgt tgttgtgtct ttaaagtttc acctgggtag tcaaagatgg 7380
atcatgggtc tcagtggaga gctgagccag gcaggagctg actaagggtg agaggtggga 7440
gttagcagcc tctgaacatc tgtgtaccat gggaccccct ttcctcctgc atggtacccc 7500
agacaaggag cctagtaaga gatactaatg gcttgttgtc cagagatgtt caaactgcag 7560
agaaagataa gacaacaagc attggcctcc aatcatgatg acagatagga ggaggtggga 7620
gctccttagc agtgctggtt ggccttccat gttctactgt gggccatctc tgccatgtac 7680
tgtaggctac tagcttctat attaaagaat gcaagagggg ccaggagcgg aggctcatgc 7740
ctgtaatctc agcactttgg gaggccaagg tgggcagatc acttgaggtc aggagtttgt 7800
gaccagcctg gccaacatgg tgaaactctg cctttactaa aaatataaaa attagctggg 7860
tgtggtggtg tgcacctgta atcccagcta ctcgggagac tgaggcacaa gaattgcttg 7920
aacctgggag gcggaagttg cagtgagccc agattgcgcc actgcactcc accctgggca 7980
acagagaaag actctgcctc aaaaaaaaaa aaaaaaagca agaggaagtg aaataatcaa 8040
ggccgccatt taatagtgag cagccactcc atgtggtact gtgcaagcac attataaata 8100
ttagcctcac aagaaatgta ttagcatttg tattttgtac actggttaag tatcttgccc 8160
aagacctcaa aactggttaa gggcagcaga atttagcccc agcaccacct tttcaaagcc 8220
tgggcttctc acacttctcc atgctgttcc cattttaaca caggtatctc gccattccag 8280
ccactcaaac tttggcattt aagaaaatta tcctaaagct aaactaaact tcaaggatga 8340
ccattctcct gaccccttcc catcaaaatt ttatctttag tcagtttgtt ttcgttttgt 8400
tttgtttttc agaactacct ctggcacatc ctccaaatga aagg 8444
<210> 12
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 12
aactacctct ggcacatcct ccaaatgaaa ggactcactg ggtgcttctg ggatccatcc 60
tgttgttcct cattgtagtg tccacggtcc tcctcttctt gagaaaacaa g 111
<210> 13
<211> 159
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 13
taacctttta cccaggtttt cagatgtgtt tggaggagtt ttctgtcttc tgagggctgg 60
tcctctttcc ttttcagcgt ttactgtcag gttcccaagg acctatatgt ggtagagtat 120
ggtagcaata tgacaattga atgcaaattc ccagtagaa 159
<210> 14
<211> 240
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 14
tttgtattaa ctctctgtga agaaattacc tcacaaatct attgctgtcg ctagctcgct 60
accttaggac cgttatagtt actagcataa cttcgtatag catacattat acgaagttat 120
tccagacatg ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa 180
aaaatgcttt atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca ttataagctg 240
<210> 15
<211> 240
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 15
gtgaggaggg gggcgcccgc gggaggcgcc aaaacccggc gcggaggcca tgcatataac 60
ttcgtatagc atacattata cgaagttatc tcgagcttgg taaaggaatg gagaattaag 120
gctctagatc attagtggtt acactatagt attagaagta aaaaaaagat tataccaaca 180
aaataagaac atgttaatgt acttgtaatg aataaacatg aataaagctc ttatgctata 240
<210> 16
<211> 169
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 16
tttatcttta gtcagtttgt tttcgttttg ttttgttttt cagaactacc tctggcacat 60
cctccaaatg aaaggactca ctgggtgctt ctgggatcca tcctgttgtt cctcattgta 120
gtgtccacgg tcctcctctt cttgagaaaa caaggtattt cctccattg 169
<210> 17
<211> 230
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 17
tcctagccgt tttgtattaa ctctctgtga agaaattacc tcacaaatct attgctgtcg 60
ctagctcgct accttaggac cgttatagtt actagcataa cttcgtatag catacattat 120
acgaagttat ctcgagcttg gtaaaggaat ggagaattaa ggctctagat cattagtggt 180
tacactatag tattagaagt aaaaaaaaga ttataccaac aaaataagaa 230
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 18
ccggctgttg aaggaccag 19
<210> 19
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 19
tctccctggg aaatgctgca cttcag 26
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 20
tgcatcctgc aatttcacat ctg 23
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 21
acacaggtat ctcgccattc c 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 22
agccactcaa actttggcat t 21
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 23
ggtcatcctt gaagtttagt ttagc 25
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 24
caggacgcag gcgtttac 18
<210> 25
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 25
ctgcataatc agctacggtg gtgcgg 26
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 26
ttcagcgtga ttcgcttgta g 21
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 27
ctggagtgcc caagagtc 18
<210> 28
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 28
cagacatgga agaaacacaa cccgcac 27
<210> 29
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 29
ctgctaagcc gcttctgtc 19
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 30
gctctggctg gtcttcagta tg 22
<210> 31
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 31
agcagctctg ccctcat 17
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 32
ttgccgtatg gttggtttga ac 22
<210> 33
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 33
acagcctgct gtcacttgc 19
<210> 34
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 34
tacgggcgtt tactgtcac 19
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 35
accacatata ggtccttggg aac 23
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 36
ttctcaatgt gaccagcagt c 21
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 37
agggtcaacg ccacagcgaa tga 23
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 38
tcctgttctg tggaggatgt g 21

Claims (17)

1.一种遗传修饰的啮齿动物基因组，其在内源CD274基因座处包含人源化CD274基因，其中所述人源化CD274基因包含编码人CD274多肽的胞外序列的核酸序列，所述核酸序列有效连接至
(i)编码内源啮齿动物CD274多肽的胞内序列和跨膜序列的核酸序列，以及
(ii)内源啮齿动物CD274启动子；
其中所述人源化CD274基因编码功能性人源化CD274多肽，并且其中所述啮齿动物是小鼠或大鼠。
2.根据权利要求1所述的遗传修饰的啮齿动物基因组，其中编码内源啮齿动物CD274多肽的胞内序列和跨膜序列的核酸序列包含内源啮齿动物CD274基因的外显子6、外显子7和部分外显子5。
3.根据权利要求2所述的遗传修饰的啮齿动物基因组，其中所述人源化CD274基因还包含内源啮齿动物CD274基因的外显子1和外显子2。
4.根据权利要求3所述的遗传修饰的啮齿动物基因组，其中编码人CD274多肽的胞外序列的核酸序列包含人CD274基因的外显子3、外显子4和部分外显子5。
5.一种制备遗传修饰的啮齿动物的方法，所述方法包括：
(a)在分离的啮齿动物ES细胞中将编码人CD274多肽的胞外序列的核酸序列***内源啮齿动物CD274基因中；和
(b)使用(a)的啮齿动物ES细胞制备啮齿动物，其中所述啮齿动物的基因组在内源啮齿动物CD274基因座处包含人源化CD274基因，其中所述人源化CD274基因包含编码人CD274多肽的胞外序列的核酸序列，所述核酸序列有效连接至
(i)编码内源啮齿动物CD274多肽的胞内序列和跨膜序列的核酸序列，和
(ii)内源啮齿动物CD274启动子；
其中所述啮齿动物表达功能性人源化CD274多肽，并且其中所述啮齿动物是小鼠或大鼠。
6.一种制备其基因组包含人源化CD274基因的遗传修饰的啮齿动物的方法，所述方法包括：
修饰啮齿动物的基因组使得修饰的基因组在内源CD274基因座处包含人源化CD274基因，其中所述人源化CD274基因包含编码人CD274多肽的胞外序列的核酸序列，所述核酸序列有效连接至
(i)编码内源啮齿动物CD274多肽的胞内序列和跨膜序列的核酸序列，和
(ii)内源啮齿动物CD274启动子；
其中所述啮齿动物表达功能性人源化CD274多肽，并且其中所述啮齿动物是小鼠或大鼠。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中编码人CD274多肽的胞外序列的核酸序列包含人CD274基因的外显子3、外显子4和部分外显子5。
8.根据权利要求5或6所述的方法，其中编码人CD274多肽的胞外序列的核酸序列编码人CD274多肽的氨基酸19-238。
9.根据权利要求5或6所述的方法，其中编码内源啮齿动物CD274多肽的胞内序列和跨膜序列的核酸序列包含内源啮齿动物CD274基因的外显子6、外显子7和部分外显子5。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述人源化CD274基因包含内源啮齿动物CD274基因的外显子1和外显子2。
11.一种筛选能够***的药物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)向遗传修饰的啮齿动物施用肿瘤细胞，使得在啮齿动物中形成肿瘤，其中所述啮齿动物在内源CD274基因座处包含人源化CD274基因，其中所述人源化CD274基因包含编码人CD274多肽的胞外序列的核酸序列，所述核酸序列有效连接至
(i)编码内源啮齿动物CD274多肽的胞内序列和跨膜序列的核酸序列，和
(ii)内源啮齿动物CD274启动子；
其中所述啮齿动物表达功能性人源化CD274多肽，并且其中所述啮齿动物是小鼠或大鼠；
(b)向步骤(a)的啮齿动物施用药物；和
(c)确定步骤(b)的啮齿动物中肿瘤生长是否减少，其中减少肿瘤生长的药物能够***。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述药物是针对人CD274的抗体。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中以静脉内方式、腹膜内方式、肌内方式或皮下方式向所述啮齿动物施用所述药物。
14.一种分离自啮齿动物的啮齿动物细胞或组织，其基因组在内源啮齿动物CD274基因座处包含人源化CD274基因，其中所述人源化CD274基因包含编码人CD274多肽的胞外序列的核酸序列，所述核酸序列有效连接至
(i)编码内源啮齿动物CD274多肽的胞内序列和跨膜序列的核酸序列，以及
(ii)内源啮齿动物CD274启动子；
其中所述人源化CD274基因编码功能性人源化CD274多肽，并且其中所述啮齿动物是小鼠或大鼠；并且
其中所述啮齿动物细胞或组织不是啮齿动物ES细胞或啮齿动物各个形成和发育阶段的细胞或组织。
15.根据权利要求14所述的啮齿动物细胞或组织，其中编码内源啮齿动物CD274多肽的胞内序列和跨膜序列的核酸序列包含内源啮齿动物CD274基因的外显子6、外显子7和部分外显子5。
16.根据权利要求15所述的啮齿动物细胞或组织，其中所述人源化CD274基因还包含内源啮齿动物CD274基因的外显子1和外显子2。
17.根据权利要求16所述的啮齿动物细胞或组织，其中编码人CD274多肽的胞外序列的核酸序列包含人CD274基因的外显子3、外显子4和部分外显子5。
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