ES2587344T3 - Ratón transgénico que comprende un polinucleótido que codifica C5aR humano o humanizado - Google Patents

Abstract

Un ratón transgénico que comprende y expresa un polinucleótido que codifica un C5aR humano o humanizado, en el que se ha sustituido de forma dirigida la región que codifica C5aR del exón 3 endógeno del locus de C5aR de ratón por una secuencia correspondiente que codifica C5aR humano o humanizado y en donde dicho C5aR humanizado difiere de C5aR de ratón codificado por dicho locus de ratón en que los dominios extracelulares se sustituyen por dominios extracelulares correspondientes de C5aR humano.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

(b)

opcionalmente, determinar la estructura del compuesto candidato; y

(c)

proporcionar el compuesto candidato o el nombre de la estructura del compuesto candidato.

Naturalmente, para agentes que son conocidos aunque no se han analizado previamente en cuanto a su función usando un escrutinio proporcionado por la presente invención, la determinación de la estructura del compuesto está implícita en la etapa (b). Esto es debido a que el experto en la técnica conocerá el nombre y/o la estructura del compuesto en el momento de realizar el escrutinio.

Tal y como se usa en la presente memoria, la expresión "proporcionar el agente" se debe entender que incluye cualquier medio sintético químico o recombinante para producir dicho agente o, alternativamente, la disposición de un agente que ha sido sintetizado previamente por cualquier persona o medio.

Los compuestos identificados para la administración a un animal no humano o humano como se describen en la presente memoria, se pueden formular para una administración mediante inyección a través de una vía subcutánea, intravenosa, intranasal o intraperitoneal. Alternativamente, pueden ser adecuados para una administración oral en forma de aditivos alimentarios, comprimidos, trociscos, etc.

Los diversos aspectos y realizaciones descritos en la presente memoria, a los que se hace referencia en los apartados individuales anteriores, se aplican, cuando sea adecuado, a otros apartados, cambiando lo que sea necesario. En consecuencia, los aspectos especificados en un apartado se pueden combinar con aspectos especificados en otros apartados, cuando sea adecuado.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1: Diagrama que muestra el diseño de una estructura artificial con una diana para la generación de ratones con un gen de C5aR humano activado.

Figura 2: Diagrama que muestra un locus de C5aR de ratón transgénico después de la deleción del gen PGKneo mediante Cre recombinasa.

Figura 3: Diagrama que muestra sitios de restricción seleccionados y exones del gen C5aR (C5r1) de ratón.

Figura 4: Localización de cebadores oligonucleotídicos usados en el ensayo de genotipado mediante PCR.

Figura 5: Análisis FACS que muestra que el C5aR humano se expresa en neutrófilos de ratones que son portadores del gen hC5aR. Se incubó sangre de ratones de tipo silvestre (+/+); heterocigóticos (H5Rf/+) y homocigóticos (H5Rf/H5Rf) con un anticuerpo 7F3 específico de C5aR humano conjugado con FITC. La zona de la derecha de la línea discontinua en el histograma de neutrófilos es la tinción positiva para 7F3-FITC.

Figura 6: Progreso de una enfermedad inflamatoria similar a AR en ratones homocigóticos para el gen C5aR humano activado y ratones de tipo silvestre. El panel de la izquierda muestra el aumento del grosor de los tobillos después de inyectar por vía i.p. suero de K/BxN los días 0 y 2. El panel de la derecha muestra la puntación clínica. Los ratones nº 10 y nº 25 son homocigóticos para el gen C5aR humano, el ratón nº 38 es un compañero de camada de tipo silvestre. El engrosamiento de los tobillos y la enfermedad clínica se desarrollaron tanto en ratones de tipo silvestre como homocigóticos para el gen hC5aR en la forma típica descrita para este modelo (Lee et al. (2002) Science, 297, 1689-1692).

Figura 7: Gráficos que muestran el progreso y la prevención de una enfermedad inflamatoria similar a la AR en ratones homocigóticos para el gen C5aR humano activado. El panel de la izquierda muestra el aumento en el engrosamiento de los tobillos después de inyectar por vía i. p. suero de K/BxN los días 0 y 2. El panel de la derecha muestra la puntuación clínica. Los ratones nº 7, 10, 24 y 25 son homocigóticos para el gen C5aR humano. Los ratones nº 7 y nº 24 fueron inyectados con el anticuerpo 7F3 neutralizante de C5aR humano, mientras que los ratones nº 10 y nº 25 fueron inyectados con un anticuerpo de control del isotipo. El ratón compañero de camada de tipo silvestre (ratón nº 38) también fue tratado con 7F3. El anticuerpo se inyectó los días -1 y +3. Los ratones a los que se había inyectado el anticuerpo de control, desarrollaron una enfermedad inflamatoria. En contraste los ratones con el gen hC5aR activado, a los que se había inyectado 7F3 estaban protegidos contra la inflamación. Los ratones de tipo silvestre a los que se había inyectado 7F3 no estaban protegidos contra la inflamación.

CLAVE PARA EL LISTADO DE SECUENCIAS

SEQ ID NO:1: Secuencia del locus del gen C5aR(C5r1) de ratón y ADN flanqueante.

SEQ ID NO:2: Secuencia del ADNc de C5aR humano.

SEQ ID NO:3: Secuencia de aminoácidos de C5aR humano.

SEQ ID NO:4: Cebador F1C (específico para el exón 3 de C5aR humano):

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

SEQ ID NO:5: Cebador R2a (específico para el exón 3 de C5aR humano):

SEQ ID NO:6: Cebador F3C (específico para el gen C5aR de ratón):

SEQ ID NO:7: Cebador R4C (específico para el gen C5aR de ratón):

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Técnicas generales y definiciones

A no ser que se indique de otro modo, las técnicas de ADN recombinante utilizadas en la presente invención son métodos convencionales, bien conocidos por los expertos en la técnica. Tales técnicas están descritas y explicadas a través de las publicaciones científicas, en fuentes tales como: J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (compilador), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, volúmenes 1 y 2, IRL Press (1991), D.M. Glover y B.D. Hames (compiladores), ADN Cloning: A Practical Approach, volúmenes 1-4, IRL Press (1995 y 1996), y F.M. Ausubel et al. (compiladores), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, incluyendo todas las actualizaciones hasta la fecha) y se incorporan en la presente memoria como referencia. En particular, estos documentos describen en detalle métodos para transcribir o replicar moléculas de ácido nucleico y las condiciones requeridas para ello.

Definiciones

A través de esta memoria descriptiva la palabra "comprenden" o variaciones, tales como "comprende" o "que comprende(n)", se entiende que implican la inclusión de un elemento establecido, un número entero o una etapa o un grupo de elementos, números enteros o etapas, pero no la exclusión de ningún otro elemento, número entero o etapa o grupo de elementos, números enteros o etapas.

Tal y como se usa en la presente memoria, un "ligando" de una proteína C5aR se refiere a una clase particular de sustancias que se unen a una proteína C5aR de mamífero, incluyendo ligandos naturales y formas sintéticas y/o recombinantes de los ligandos naturales. En una realización preferida, la unión al ligando de una proteína C5aR tiene lugar con afinidad elevada.

Tal y como se usa en la presente memoria, un "antagonista" es una sustancia que inhibe la unión de un agonista o un agonista inverso a una proteína C5aR e impide de este modo al menos una función característica de una proteína C5aR, tal como una actividad de unión (por ejemplo, unión de ligandos, unión de promotores, unión de anticuerpos), una actividad de señalización (por ejemplo, activación de una proteína G de mamífero, inducción de un aumento rápido y transitorio de la concentración de calcio libre en el citosol) y/o una función de respuesta celular (por ejemplo, estimulación de la quimiotaxis, exocitosis o liberación de mediadores inflamatorios por los leucocitos). El término antagonista abarca sustancias que se unen al receptor (por ejemplo, un anticuerpo, un mutante de un ligando natural, moléculas orgánicas de bajo peso molecular, otros inhibidores competitivos de la unión de ligandos) y sustancias que bloquean la función de los receptores sin unirse a ellos.

Tal y como se usa en la presente memoria, un "agonista" es una sustancia que favorece (induce, causa, potencia o aumenta) al menos una función característica de una proteína C5aR, tal como una actividad de unión (por ejemplo, unión de ligandos, inhibidores y/o promotores), una actividad de señalización (por ejemplo, activación de una proteína G de mamífero, inducción de un aumento rápido y transitorio de la concentración de calcio libre en el citosol) y/o una función de respuesta celular (por ejemplo, estimulación de la quimiotaxis, exocitosis o liberación de mediadores inflamatorios por los leucocitos). El término agonista abarca sustancias que se unen al receptor (por ejemplo, un anticuerpo, un homólogo de un ligando natural de otra especie) y sustancias que favorecen la función de receptores sin unirse a ellos (por ejemplo, activando una proteína asociada). En una realización preferida, el agonista es distinto de un homólogo de un ligando natural.

"Agonista inverso" tal y como se usa en la presente memoria se refiere a una molécula que se une o interacciona de otra manera con C5aR para inhibir la respuesta intracelular en la línea base, iniciada por la forma activa de C5aR por debajo del nivel base normal de actividad que se observa en ausencia de agonistas.

Por "mamífero transgénico" se entiende un mamífero (por ejemplo, ratón, rata, hámster, etc.), que tiene una secuencia de ácido nucleico no endógena (es decir, heteróloga) presente como un elemento extracromosómico en una porción de sus células o integrada de forma estable en su ADN de la línea germinal (es decir, en la secuencia genómica de la mayoría de sus células). El ácido nucleico heterólogo se introduce en la línea germinal de tales animales transgénicos mediante manipulación genética, por ejemplo, de embriones o células madre embrionarias del animal hospedador.

La expresión "biológicamente activo" o "funcional", cuando se usa en la presente memoria como un modificador de C5aR humano, se refiere a un polipéptido que muestra al menos una de las características funcionales atribuidas al C5aR humano natural, tal como la capacidad para actuar como receptor de C5a o para unirse a uno o varios ligandos naturales de C5aR humano.

15

25

35

45

55

Una "desactivación" de un gen (del inglés, "knock-out") significa una alteración en la secuencia del gen que da como resultado una disminución de la función del gen diana, preferiblemente de modo que la expresión del gen diana es indetectable o insignificante. Una desactivación de un gen endógeno significa que la función del gen ha disminuido sustancialmente, de modo que la expresión no es detectable o solo lo es a niveles insignificantes. Los animales transgénicos “desactivados” pueden ser animales transgénicos que tienen una desactivación heterocigótica de un gen o una desactivación homocigótica de un gen. Las "desactivaciones" incluyen también desactivaciones condicionales, en donde una alteración del gen diana puede ocurrir, por ejemplo, después de una exposición del animal a una sustancia que favorece la alteración del gen diana, la introducción de una enzima que favorece la recombinación en el sitio del gen diana (por ejemplo, Cre en el sistema Cre-lox), u otro método para dirigir la alteración del gen diana de forma posnatal.

Una "activación" de un gen diana (del inglés, "knock-in") significa una alteración en un genoma de una célula hospedadora que da como resultado una expresión alterada (por ejemplo, aumentada (incluyendo ectópica)) del gen diana, por ejemplo, mediante la introducción de una copia adicional del gen diana o mediante una inserción funcional de una secuencia reguladora que proporciona una expresión potenciada de una copia endógena del gen diana. Los animales transgénicos "activados" de interés para la presente invención son animales transgénicos que tienen una activación de un gen C5aR humano o humanizado. Tales animales transgénicos pueden estar activados de forma heterocigótica para el gen C5aR humano o humanizado o ser homocigóticos para la activación del gen C5aR humano o humanizado. Las "activaciones" también abarcan activaciones condicionales.

Por "estructura artificial" se entiende un ácido nucleico recombinante, generalmente ADN recombinante, que se ha generado con el fin de expresar una secuencia nucleotídica específica o que se va a emplear en la construcción de otras secuencias nucleotídicas recombinantes.

Por "ligada funcionalmente" se entiende una secuencia de ADN y una secuencia reguladora que están conectadas de tal modo que permiten la expresión del gen cuando las moléculas apropiadas (por ejemplo, las proteínas activadoras de la transcripción) están unidas a la secuencia reguladora.

Por "insertada funcionalmente" se entiende una secuencia nucleotídica de interés que está colocada de forma adyacente a una secuencia nucleotídica que dirige la transcripción y la traducción de la secuencia nucleotídica introducida de interés (es decir, que facilita la producción, por ejemplo, de un polipéptido codificado por una secuencia de C5aR humano).

La expresión "corresponde a" o "que corresponde a" significa homólogo a, o sustancialmente equivalente a, o funcionalmente equivalente a la secuencia designada.

La expresión "estructura artificial de gen transgénico" se refiere a una molécula de ácido nucleico, por ejemplo, un vector, que contiene el polinucleótido objeto, por ejemplo, el polinucleótido de C5aR humano o uno de sus fragmentos, ligado funcionalmente de un modo que es capaz de expresar el polinucleótido en una célula hospedadora. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "polinucleótido" incluye ácido desoxirribonucleico (ADN), y, cuando es apropiado, ácido ribonucleico (ARN). Tal y como se usa en la presente memoria el término también incluye análogos de ARN o ADN preparados a partir de análogos de nucleótidos, y cuando es aplicable para la realización que se describe, polinucleótidos monocatenarios (tales como sentido o antisentido) y bicatenarios.

Animales transgénicos

Los métodos para producir animales transgénicos son bien conocidos en la técnica. Un libro de texto general, útil para este tema es el de Houdebine, Transgenic animals -Generation and Use (Harwood Academic, 1997) que es una revisión amplia de las técnicas usadas para generar animales transgénicos desde peces hasta ratones y vacas. Los ratones transgénicos son de particular interés en el contexto de la presente invención.

Los avances en tecnologías para la micromanipulación de embriones permiten ahora la introducción de ADN heterólogo, por ejemplo, en óvulos de mamífero fertilizados. Por ejemplo, células madre totipotentes o pluripotentes se pueden transformar mediante microinyección, precipitación mediada por fosfato de calcio, fusión de liposomas, infección retrovírica u otros medios, después las células transformadas se introducen en el embrión, y el embrión se desarrolla a continuación en un animal transgénico. En un método preferido, los embriones en desarrollo se transfectan con el ADN deseado mediante electroporación, y los animales transgénicos se producen a partir del embrión infectado. En otro método preferido, sin embargo, los ADNs apropiados se coinyectan en el pronúcleo o el citoplasma de embriones, preferiblemente en la etapa de una sola célula, y se permite que los embriones se desarrollen hasta animales transgénicos maduros. Estas técnicas son bien conocidas. Véanse las revisiones de métodos de laboratorio convencionales para la microinyección de ADNs heterólogos en óvulos de mamífero fertilizados, incluyendo Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Press 1986); Krimpenfort et al., Bio/Technology 9:844 (1991); Palmiter et al., Cell, 41: 343 (1985); Kraemer et al., Genetic manipulation of the Mammalian Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1985); Hammer et al., Nature, 315: 680 (1985); Wagner et al., documento de patente de EE.UU. nº 5.175.385; Krimpenfort et al., documento de patente de EE.UU. nº 5.175.384.

Otro método usado para producir un animal transgénico implica microinyectar un ácido nucleico en óvulos en la etapa pronuclear por métodos convencionales. Los óvulos inyectados se cultivan después, antes de transferirlos a

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

los oviductos de las receptoras seudopreñadas.

Los animales transgénicos también se pueden producir mediante tecnología de transferencia nuclear, como se describe en Schnieke, A.E. et al., 1997, Science, 278: 2130 y Cibelli, J.B. et al., 1998, Science, 280: 1256. Usando este método, fibroblastos de animales donantes se transfectan de forma estable con un plásmido que incorpora las secuencias codificadoras de un dominio de unión o una pareja de unión de interés, bajo el control de elementos reguladores. Los transfectantes estables se fusionan luego con los ovocitos enucleados, se cultivan y se transfieren a hembras receptoras.

El análisis de animales que pueden contener secuencias transgénicas se realizaría normalmente por PCR o análisis por transferencia Southern, siguiendo métodos convencionales.

A modo de ejemplo específico para la construcción de mamíferos transgénicos, tales como vacas, estructuras artificiales de nucleótidos que comprenden una secuencia que codifica un dominio de unión fusionado con GFP se microinyectan usando, por ejemplo, la técnica descrita en el documento de patente de EE.UU. nº 4.873.191, en ovocitos que se obtienen a partir de ovarios extirpados recientemente del mamífero. Los ovocitos se aspiran de los folículos y se dejan asentar antes de la fertilización con esperma congelado, capacitado con heparina y fraccionado previamente mediante gradiente de Percoll para aislar la fracción móvil.

Los ovocitos fertilizados se centrifugan, por ejemplo, durante ocho minutos a 15.000 g para visualizar los pronúcleos para la inyección y luego se cultivan desde la etapa de cigoto hasta la etapa de mórula o blastocisto en medio condicionado de tejido de oviducto. Este medio se prepara usando tejidos luminales rascados de los oviductos y se diluye en medio de cultivo. Los cigotos deben colocarse en el medio de cultivo dos horas después de la microinyección.

A continuación, se sincroniza el estro en los mamíferos receptores previstos, tales como ganado vacuno, administrando coprostanol. El estro se produce en los dos días siguientes y los embriones se transfieren a los receptores 57 días después del estro. La transferencia con éxito puede ser evaluada en la descendencia por transferencia Southern.

Alternativamente, las estructuras artificiales deseadas se pueden introducir en células madre embrionarias (abreviadamente células ES, por la expresión inglesa Embryonic Stem) y las células se cultivan para asegurar una modificación a través del transgén. Las células modificadas se inyectan luego en la etapa embrionaria de blástula y las blástulas se reemplazan en los hospedadores seudopreñados. La descendencia resultante es quimérica con respecto a las células ES y las células hospedadoras, y se pueden obtener cepas no quiméricas que comprenden exclusivamente la progenie ES, usando reproducción cruzada convencional. Este técnica está descrita, por ejemplo, en el documento WO91/10741.

Los animales transgénicos comprenden una secuencia exógena de ácido nucleico, presente como un elemento extracromosómico o integrado de forma estable en todas o en una porción de sus células, especialmente en las células germinales. Se prefiere que un animal transgénico comprenda cambios estables para la secuencia de la línea germinal. Un cambio estable se consigue generalmente mediante la introducción del ADN en el genoma de la célula. Vectores para una integración estable incluyen plásmidos, retrovirus y otros virus animales, YACs y similares. Durante la construcción inicial del animal se generan "quimeras" o "animales quiméricos", en los cuales solo un subconjunto de células tiene el genoma alterado. Las quimeras se usan principalmente para fines de reproducción, con objeto de generar el animal transgénico deseado. Los animales que tienen una alteración heterocigótica se generan mediante reproducción de quimeras. Normalmente se crían heterocigóticos machos y hembras para generar animales homocigóticos.

En una realización preferida, los ratones transgénicos de la invención se producen introduciendo un transgén de C5aR humano en la línea germinal del ratón. Las células madre embrionarias (ES) son el tipo primario de célula diana para la introducción del transgén de C5aR humano en el ratón, para conseguir una recombinación homóloga. Las células ES se pueden obtener a partir de embriones de preimplantación cultivados in vitro y fusionados con embriones (Evans, M.J., et al., (1981) Nature 292, 154-156; Bradley, M. O., et al., (1984) Nature 309, 255-258; Gossler, et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 9065-9069; y Robertson, et al., (1986) Nature 322, 445-448). Los transgenes se pueden introducir eficazmente en las células ES mediante transfección de ADN o por transducción mediada por retrovirus. Tales células ES transformadas se pueden combinar después con los blastocistos de un animal no humano. Las células ES colonizan después el embrión y contribuyen a la línea germinal del animal quimérico resultante. Para una revisión véase Jaenisch, R. (1988) Science 240, 1468-1474. Las células embrionarias transfectadas se pueden incubar in vitro durante tiempos variables o ser reimplantadas en el hospedador de alquiler

o ambas cosas.

La descendencia transgénica del hospedador de alquiler se puede escrutar para analizar la presencia y/o la expresión del transgén por cualquier método adecuado. El escrutinio se realiza frecuentemente mediante análisis de transferencia Southern o transferencia Northern, usando una sonda que sea complementaria a al menos una porción del transgén. Como método alternativo o adicional se puede emplear el análisis por transferencia Western que emplea un anticuerpo contra la proteína codificada por el transgén, para escrutar la presencia del producto del transgén. En los ratones transgénicos, el ADN se prepara normalmente a partir de tejido de la cola y se analiza por

análisis Southern o PCR en busca del transgén. Alternativamente, se analizan los tejidos o las células que se cree que expresan el transgén a nivel más elevado para determinar la presencia y la expresión del transgén usando análisis Southern o PCR, aunque algunos tejidos o tipos de células se pueden usar para este análisis. La progenie de los animales transgénicos se puede obtener apareando el animal transgénico con una pareja adecuada o por fertili

5 zación in vitro de óvulos y/o esperma obtenidos a partir del animal transgénico.

Los métodos para producir ratones transgénicos a través de una recombinación homóloga entre el gen endógeno y una estructura artificial de transgén están descritos por Hanks, M et al. (Science 269: 679-682, 1995). Estructuras artificiales de C5aR humano y humanizado La estructura artificial de polinucleótido introducida puede codificar una secuencia de C5aR humano de tipo silvestre

10 como la mostrada en SEQ ID NO:3 o una variante alélica. Ejemplos no limitativos de variantes alélicas de SEQ ID NO:3 comprenden una o varias de las sustituciones siguien

tes: Aminoácido nº 2: Asp>Asn Aminoácido nº 279: Asn>Lys.

15 La estructura artificial de polinucleótido puede comprender una secuencia como la mostrada en SEQ ID NO:2, o una

variante alélica de la misma. Ejemplos no limitativos de variantes alélicas de SEQ ID NO:2 comprenden uno o varios de los siguientes cambios de bases:

Base nº 28: g>a

20 Base nº 474: c>t Base nº 861: t>g Base nº 1313-1314: inserción de a Base nº 1447-1448: inserción de a.

En un aspecto preferido, la secuencia que codifica C5aR está ligada funcionalmente a un promotor, que puede ser 25 una secuencia reguladora endógena o heteróloga, constitutiva o inducible y otras secuencias reguladoras necesarias

para la expresión en el ratón hospedador. Alternativamente, la estructura artificial introducida puede codificar C5aR humanizado que comprende dominios intracelulares de C5aR endógeno y dominios extracelulares de C5aR humano,

Los diversos dominios de C5aR humano que se pueden introducir en el C5aR humanizado se enumeran en la Tabla

30 1. Tabla 1:

aminoácidos 1 -37 dominio extracelular -extremo N-terminal aminoácidos 38 -60 dominio transmembranal aminoácidos 61 -71 dominio intracelular aminoácidos 72 -94 dominio transmembranal aminoácidos 95 -110 dominio extracelular -bucle extracelular 1 aminoácidos 111 -132 dominio transmembranal aminoácidos 133 -153 dominio intracelular aminoácidos 154 -174 dominio transmembranal aminoácidos 175 -200 dominio extracelular -bucle extracelular 2 aminoácidos 201 -226 dominio transmembranal aminoácidos 227 -242 dominio intracelular aminoácidos 243 -265 dominio transmembranal aminoácidos 266 -282 dominio extracelular -bucle extracelular 3 aminoácidos 283 -303 dominio transmembranal

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

aminoácidos 304 -350 dominio intracelular -extremo C-terminal.

Las estructuras artificiales de interés pueden contener ADNc, secuencias genómicas o ambos. Los métodos para aislar y clonar una secuencia deseada, así como estructuras artificiales adecuadas para la expresión de una secuencia seleccionada en un animal hospedador, son bien conocidos en la técnica. La estructura artificial puede incluir secuencias distintas de las secuencias que codifican C5aR. Por ejemplo, en la estructura artificial se puede incluir un gen marcador, tal como lac Z, en donde el aumento de la regulación de la expresión de la secuencia codificada dará como resultado un cambio en el fenotipo, fácilmente detectado.

La expresión "gen C5aR" se usa generalmente con el significado de un gen C5aR humano e isoformas, formas alternativas, variantes por corte y empalme, variantes mutadas, etc. de este gen humano. Esta expresión también se entiende que significa el marco de lectura abierto que codifica polipéptidos específicos, intrones y secuencias de nucleótidos no codificadoras adyacentes a 5' y 3', implicadas en la regulación de la expresión, hasta aproximadamente 1 kb más allá de la región codificadora, pero posiblemente más lejos en cualquier dirección. La secuencia de ADN que codifica C5aR puede ser ADNc o ADN genómico o uno de sus fragmentos. El gen se puede introducir en un vector apropiado para el mantenimiento extracromosómico o para la integración en el hospedador.

Las secuencias genómicas de particular interés comprenden el ácido nucleico presente entre el codón de iniciación y el codón de parada, incluyendo la totalidad de los intrones que normalmente se encuentran presentes en el cromosoma natural. Estas pueden incluir además regiones no traducidas en 3' y 5', encontradas en el ARNm maduro. Dichas secuencias pueden incluir además secuencias reguladoras transcripcionales y traduccionales específicas, tales como promotores, potenciadores, etc., incluyendo aproximadamente 1 kb, pero posiblemente más del ADN genómico flanqueante en el extremo 5' o 3' de la región transcrita. El ADN genómico se puede aislar como un fragmento de 100 kb o más pequeño; y está sustancialmente exento de secuencias cromosómicas flanqueantes.

Las secuencias de las regiones 5' del gen C5aR humano, y las secuencias adicionales de regiones aguas arriba del extremo 5' y secuencias aguas abajo del extremo 3', se pueden utilizar para elementos promotores, incluyendo sitios de unión de potenciadores, que proporcionan una expresión en tejidos en donde se expresa normalmente el C5aR. La expresión específica en tejidos es útil para proporcionar promotores que mimetizan el modelo natural de expresión. Los polimorfismos que se presentan de forma natural en la región del promotor son útiles para determinar variaciones naturales en la expresión, particularmente las asociadas con una enfermedad. Alternativamente, se pueden introducir mutaciones en la región del promotor para determinar el efecto de alterar la expresión en sistemas definidos experimentalmente. Los métodos para la identificación de motivos de ADN específicos, implicados en la unión de factores transcripcionales son conocidos en la técnica, por ejemplo, la similitud de secuencias con motivos de unión conocidos, estudios de retardo en geles, etc. Por ejemplo, véase Blackwell et al., (1995) Mol. Med. 1: 194205; Mortlock et al. (1996) Genome Res. 6: 327-33; y Joulin y Richard-Foy (1995) Eur. J. Biochem. 232: 620-626.

En un aspecto, los vectores adecuados para uso en la presente invención pueden comprender al menos un elemento de control de la expresión ligado funcionalmente a la secuencia de ácido nucleico que codifica el C5aR humano. Los elementos de control de la expresión se pueden insertar en el vector para controlar y regular la expresión de la secuencia de ácido nucleico. Ejemplos de elementos de control de la expresión incluyen, pero sin limitación, el sistema lac, regiones de operador y promotor del fago lambda, promotores de levadura y promotores obtenidos a partir de polioma, adenovirus, retrovirus o SV40. El vector puede comprender adicionalmente elementos funcionales que incluyen, pero sin limitación, secuencias líder, codones de terminación, señales de poliadenilación y cualquier otra secuencia necesaria o preferida para la transcripción y/o traducción apropiadas de la secuencia de ácido nucleico que codifica el C5aR humano.

En un aspecto preferido adicional, la estructura artificial comprende regiones homólogas a las secuencias de los extremos 3' y 5' que flanquean la secuencia codificadora de C5aR endógeno del mamífero no humano. Se entenderá que estas regiones de homología son útiles para la integración dirigida a una diana, de la estructura artificial en el locus de C5aR endógeno del mamífero transgénico.

Preferiblemente, la estructura artificial de polinucleótido comprende regiones homólogas a al menos 2 kb, más preferiblemente a aproximadamente 3 kb, situadas aguas arriba y aguas abajo del exón 3 del gen de C5aR endógeno. Por ejemplo, las secuencias situadas aguas abajo y aguas arriba pueden proceder de la secuencia entre los nucleótidos 7377-15045 de SEQ ID NO: 1.

Los expertos en la técnica entenderán que los vectores de este tipo se construyen usando una metodología convencional (Véase por ejemplo Sambrook et al., (compiladores) (1989) "Molecular Cloning, A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.; Ausubel et al., (compiladores) (1987) "Current Protocols in Molecular Biology" John Wiley and Sons, New York, N.Y.) o están comercialmente disponibles.

En algunos aspectos, puede ser preferible expresar el C5aR humano en tejidos que imitan el modelo natural de expresión en seres humanos. Un modelo específico de expresión se puede conseguir colocando el ácido nucleico que codifica el C5aR humano bajo el control de un promotor inducible o regulado en el desarrollo o bajo el control de un promotor específico de tejido o específico de un tipo de célula. A modo de ejemplo, los modelos específicos de

imagen6

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Los compuestos candidatos también se encuentran entre las biomoléculas que incluyen, pero sin limitación, sacáridos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas y sus derivados, análogos estructurales o combinaciones de los mismos.

Los compuestos candidatos se pueden obtener a partir de una amplia variedad de fuentes incluyendo colecciones de compuestos naturales o sintéticos. Por ejemplo, están disponibles numerosos medios para la síntesis al azar y directa de una amplia variedad de compuestos orgánicos y biomoléculas, incluyendo la expresión de oligonucleótidos y oligopéptidos aleatorizados. Alternativamente, están disponibles colecciones de compuestos naturales en forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetales y animales, o se producen fácilmente. Alternativamente, las colecciones y los compuestos producidos de forma natural o sintética se modifican fácilmente mediante medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales y se pueden usar para producir colecciones combinatorias. Agentes farmacológicos conocidos se pueden someter a modificaciones químicas directas o aleatorias, tales como acilación, alquilación, esterificación, amidificación, etc., para producir análogos estructurales.

El escrutinio también puede estar dirigido a compuestos farmacológicamente activos y sus productos químicos análogos.

El agente candidato se puede administrar al ratón transgénico de la invención (o a células procedentes del ratón transgénico) de cualquier modo deseado y/o apropiado para la administración del agente, para conseguir el resultado deseado. Por ejemplo, el agente candidato se puede administrar mediante inyección (por ejemplo, inyección intravenosa, intramuscular, subcutánea o directamente en el tejido en el cual se quiere conseguir el efecto deseado), oralmente o por cualquier otro medio deseable. Preferiblemente, el escrutinio in vivo implicará cierto número de animales que reciben cantidades y concentraciones variables del compuesto candidato (desde ausencia de compuesto hasta una cantidad de compuesto que se aproxima al límite superior de la cantidad que se puede administrar satisfactoriamente al ratón), y puede incluir la administración del agente en una formulación diferente. Los compuestos se pueden administrar solos o en combinaciones de dos o más, especialmente cuando la administración de una combinación de agentes puede dar como resultado un efecto sinérgico. El efecto de la administración del agente sobre el ratón transgénico se puede vigilar con una metodología convencional.

La gama de compuestos candidatos contemplados en la presente memoria incluye compuestos inhibidores de C5aR

o antagonistas de una función biológica de C5aR. En una realización, el compuesto se selecciona a partir del grupo que consiste en: un péptido, incluyendo un péptido obtenido a partir de C5aR o C5a u otros péptidos que no son C5aR y son capaces de inhibir, reducir o suprimir una función de C5aR, un mutante dominante negativo de C5aR; un inhibidor no peptídico de C5aR; un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se une a C5aR e inhibe una función de C5aR; una molécula orgánica pequeña y ácido nucleico, incluyendo ácido nucleico que codifica dicho péptido obtenido a partir de C5aR o C5a u otro inhibidor peptídico que no es C5aR, un ácido nucleico antisentido dirigido contra el ARNm que codifica el C5aR o una ribozima anti-C5aR o un ARN de interferencia pequeño (ARNi) que se dirige a la expresión del gen C5aR. Cierto número de estos tipos de compuestos se analizan a continuación.

Moléculas pequeñas

Los compuestos candidatos incluyen numerosas clases químicas, aunque preferiblemente son moléculas orgánicas, preferiblemente compuestos orgánicos pequeños que tienen un peso molecular de más de 100 y menos de aproximadamente 2.500 Dalton. Los compuestos candidatos comprenden grupos funcionales necesarios para la interacción estructural con proteínas, particularmente unión por puentes de hidrógeno y normalmente incluyen al menos un grupo amino, carbonilo, hidroxilo o carboxilo, preferiblemente al menos dos de los grupos químicos funcionales. Los compuestos candidatos comprenden frecuentemente estructuras carbonadas cíclicas o heterocíclicas y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas con uno o varios de los grupos funcionales anteriores. Los compuestos candidatos también se encuentran entre biomoléculas que incluyen péptidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas y derivados, análogos estructurales o combinaciones de los mismos. De hecho, virtualmente cualquier molécula orgánica pequeña que sea potencialmente capaz de unirse a una molécula diana biológica, puede encontrar uso en la presente invención siempre que sea suficientemente soluble y estable en soluciones acuosas para ser analizada respecto a su capacidad para unirse a la molécula diana biológica.

Los compuestos candidatos se obtienen a partir de una amplia variedad de fuentes, incluyendo colecciones de compuestos naturales o sintéticos. Por ejemplo, están disponibles numerosos medios para la síntesis al azar y dirigida de una amplia variedad de compuestos orgánicos y biomoléculas, incluyendo la expresión de oligonucleótidos aleatorizados. Alternativamente, están disponibles o se producen fácilmente colecciones de compuestos naturales en forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetales y animales. Adicionalmente, las colecciones y los compuestos producidos natural o sintéticamente, se modifican fácilmente mediante medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales. Los compuestos farmacológicos conocidos se pueden someter a modificaciones químicas dirigidas o aleatorias, tales como acilación, alquilación, esterificación, amidificación, etc., para producir análogos estructurales.

Inhibidores peptídicos o proteínicos

En otro aspecto, los compuestos candidatos son proteínas. Por "proteína" en este contexto se entiende al menos dos aminoácidos fijados covalentemente, que incluye proteínas, polipéptidos, oligopéptidos y péptidos. La proteína

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

puede estar constituida por aminoácidos de origen natural y enlaces peptídicos o estructuras peptidomiméticas sintéticas. Por tanto "aminoácido" o "residuo peptídico", tal y como se usan en la presente memoria, significan tanto aminoácidos naturales como sintéticos. Por ejemplo, homofenilalanina, citrulina y norleucina se consideran aminoácidos para los fines de la invención. "Aminoácido" también incluye residuos de iminoácidos, tales como prolina e hidroxiprolina. Las cadenas laterales pueden tener la configuración (R) o (S). En la realización preferida, los aminoácidos tienen la configuración (S) o (L). Si se emplean cadenas laterales no naturales, se pueden usar sustituyentes que no sean aminoácidos, por ejemplo, para impedir o retardar las degradaciones in vivo.

En un aspecto adicional preferido, los compuestos candidatos son proteínas naturales o fragmentos de proteínas naturales. Así, por ejemplo, se pueden usar extractos celulares que contienen proteínas o productos digeridos de forma aleatoria o dirigida, de extractos celulares proteínicos. De este modo se pueden preparar colecciones de proteínas procariotas y eucariotas. En esta realización son particularmente preferidas las colecciones de proteínas bacterianas, fúngicas, víricas y de mamífero, prefiriéndose estas últimas y siendo especialmente preferidas las proteínas humanas.

En otro aspecto preferido, los compuestos candidatos son péptidos con una longitud de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 aminoácidos, siendo preferidos los péptidos de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 aminoácidos, y siendo particularmente preferidos los de aproximadamente 7 a aproximadamente 15 aminoácidos. Los péptidos pueden ser materiales digeridos de proteínas naturales, péptidos aleatorios o péptidos aleatorios "sesgados". Por "aleatorizados" o equivalentes gramaticales, en la presente memoria se entiende que cada péptido consiste esencialmente en aminoácidos al azar. Puesto que generalmente estos péptidos aleatorios se sintetizan químicamente, pueden incorporar cualquier aminoácido en cualquier posición. El proceso sintético se puede diseñar para generar proteínas aleatorizadas para permitir la formación de la totalidad o la mayoría de las combinaciones posibles a lo largo de la longitud de la secuencia, formando de este modo una colección de compuestos proteínicos bioactivos candidatos aleatorizados.

La preparación y el escrutinio de colecciones químicas combinatorias son bien conocidos por los expertos en la técnica. Tales colecciones combinatorias incluyen, pero sin limitación, colecciones de péptidos (véase, por ejemplo, el documento de Patente de EE.UU. nº 5.010.175, Furka (1991) Int. J. Pept. Prot. Res., 37: 487-493, Houghton et al. (1991) Nature, 354: 84-88). La síntesis de péptidos no es de ningún modo el único enfoque previsto y destinado al uso en la presente invención. También se pueden usar otros métodos químicos para generar una diversidad de colecciones químicas. Tales métodos químicos incluyen pero sin limitación: peptoides (documento de Publicación PCT nº WO 91/19735, 26 Dic. 1991), péptidos codificados (documento de Publicación PCT WO 93/20242, 14 Oct. 1993), bio-oligómeros al azar (documento de Publicación PCT WO 92/00091, 9 enero 1992), benzodiazepinas (documento de Patente de EE.UU. nº 5.288.514), diversómeros, tales como hidantoínas, benzodiazepinas y dipéptidos (Hobbs et al., (1993) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 6909-6913), polipéptidos vinílogos (Hagihara et al. (1992) J. Amer. Chem. Soc. 114: 6568), peptidomiméticos no peptídicos con una estructura principal de beta-D-glucosa (Hirschmann et al., (1992) J. Amer. Chem. Soc. 114: 9217-9218), síntesis orgánicas análogas de colecciones de compuestos pequeños (Chen et al. (1994) J. Amer. Chem. Soc. 116: 2661), oligocarbamatos (Cho, et al., (1993) Science 261:1303) y/o peptidil-fosfonatos (Campbell et al., (1994) J. Org. Chem. 59: 658). Véase, en general, Gordon et al., (1994) J. Med. Chem. 37:1385, colecciones de ácidos nucleicos, colecciones de péptidos y ácidos nucleicos (véase, por ejemplo, el documento de Patente de EE.UU. nº 5.539.083), colecciones de anticuerpos (véase, por ejemplo, Vaughn et al. (1996) Nature Biotechnology, 14(3): 309-314), y el documento PCT/US96/10287), colecciones de carbohidratos (véase, por ejemplo, Liang et al. (1996) Science, 274: 1520-1522, y el documento de Patente de EE.UU. nº 5.593.853), y colecciones de moléculas orgánicas pequeñas (véase, por ejemplo, benzodiazepinas, Baum (1993) C&EN, Ene 18, página 33, isoprenoides documento de Patente de EE.UU. nº 5.569.588, tiazolidinonas y metatiazanonas documento de Patente de EE.UU. nº 5.549.974, pirrolidinas documentos de Patente de EE.UU. nº

5.525.735 y 5.519.134, compuestos de morfolino documento de Patente de EE.UU. nº 5.506.337, benzodiazepinas documento de Patente de EE.UU. nº 5.288.514 y similares).

Están comercialmente disponibles dispositivos para la preparación de colecciones combinatorias (véase, por ejemplo, 357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville Ky., Symphony, Rainin, Woburn, Mass., 433A Applied Biosystems, Foster City, Calif., 9050 Plus, Millipore, Bedford, Mass.).

En un aspecto, los inhibidores peptídicos de C5aR se sintetizan de forma química o recombinante como oligopéptidos (usualmente de una longitud de 10-25 aminoácidos) obtenidos a partir de una secuencia de C5aR o C5a. Alternativamente, los fragmentos de C5aR o C5a se producen mediante digestión de C5aR o C5a naturales o producidos recombinantemente, por ejemplo, usando una proteasa, por ejemplo, tripsina, termolisina, quimotripsina o pepsina. El análisis por ordenador (usando programas informáticos comercialmente disponibles, por ejemplo, MacVector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.) se usa para identificar sitios de escisión proteolítica. Los fragmentos proteolíticos o sintéticos pueden comprender todos los residuos de aminoácidos que sean necesarios para inhibir parcial o completamente la función de C5aR. Los fragmentos preferidos tendrán una longitud de al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 o más aminoácidos.

Los inhibidores proteicos o peptídicos también pueden ser mutantes dominantes negativos de C5aR. La expresión "mutante dominante negativo" se refiere a un polipéptido de C5aR que ha mutado desde su estado natural y que interacciona con una proteína con la que C5aR interacciona normalmente, impidiendo con ello que el C5aR endóge

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

no natural forme la interacción.

Anticuerpos anti-C5aR

El término "anticuerpo" tal y como se usa en la presente memoria, incluye moléculas intactas, así como fragmentos de las mismas, tales como Fab, F(ab')2 y Fv que son capaces de unirse a un determinante epitópico de C5aR. Estos fragmentos de anticuerpo conservan alguna capacidad para unirse selectivamente con su antígeno y se definen como sigue:

(1)

Fab, el fragmento que contiene un fragmento monovalente que se une a antígeno de una molécula de anticuerpo, se puede producir mediante digestión de un anticuerpo completo con la enzima papaína para proporcionar una cadena ligera intacta y una porción de una cadena pesada;

(2)

Fab', el fragmento de una molécula de anticuerpo se puede obtener tratando un anticuerpo completo con pepsina, seguido por reducción, para proporcionar una cadena ligera intacta y una porción de la cadena pesada; por cada molécula de anticuerpo se obtienen dos fragmentos Fab';

(3)

F(ab')2, el fragmento de anticuerpo que se puede obtener tratando un anticuerpo completo con la enzima pepsina sin reducción posterior; F(ab')2 es un dímero de dos fragmentos Fab' que se mantienen unidos a través de dos puentes disulfuro;

(4)

Fv, definido como un fragmento manipulado por ingeniería genética que contiene la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada, expresadas como dos cadenas; y

(5)

Anticuerpo de cadena sencilla ("SCA"), definido como una molécula manipulada por ingeniería genética que contiene la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada, unidas por un enlazador polipeptídico adecuado como una molécula de cadena sencilla fusionada genéticamente.

Los métodos para preparar estos fragmentos son conocidos en la técnica. (Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)).

Los anticuerpos se pueden preparar usando C5aR intacto o fragmentos del mismo, como antígeno inmunizante. Un péptido usado para inmunizar un animal puede proceder de ADNc traducido o de una síntesis química y se purifica y se conjuga con una proteína vehículo, si se desea. Tales vehículos comúnmente usados que se acoplan químicamente al péptido, incluyen hemocianina de lapa bocallave (KLH), tiroglobulina, seroalbúmina bovina (BSA) y toxoide de tétanos. El péptido acoplado se puede usar luego para inmunizar el animal (por ejemplo, un ratón o un conejo).

Si se desea, los anticuerpos policlonales se pueden purificar adicionalmente, por ejemplo, uniéndolos a una matriz y eluyéndolos de la matriz a la cual se une el péptido, contra el que se produjeron los anticuerpos. Los expertos en la técnica conocerán varios métodos comunes en las técnicas inmunológicas para la purificación y/o la concentración de anticuerpos policlonales, así como anticuerpos monoclonales (Véase por ejemplo, Coligan, et al. Unidad 9, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1991).

Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar usando cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo a través de líneas celulares continuas en cultivo, tal como, por ejemplo, la técnica del hibridoma, la técnica del hibridoma de linfocitos B humanos y la técnica del EBV-hibridoma (Kohler et al., Nature 256, 495-497, 1975; Kozbor et al., J. Immunol. Methods 81, 31-42, 1985; Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 2026-2030, 1983; Cole et al., Mol. Cell Biol. 62, 109-120, 1984).

Los métodos conocidos en la técnica permiten que los anticuerpos que muestran unión con C5aR se identifiquen y se aíslen de las colecciones de expresión de anticuerpos. Por ejemplo, un método para la identificación y el aislamiento de un dominio que se une a anticuerpo que muestra unión a C5aR, es un sistema de vector de bacteriófago. Este sistema de vector se ha usado para expresar una colección combinatoria de fragmentos Fab procedente del repertorio de anticuerpos de ratón en Escherichia coli (Huse, et al., Science, 246:1275-1281, 1989) y del repertorio de anticuerpos humanos (Mullinax, et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 87:8095-8099, 1990). Esta metodología también se puede aplicar a líneas celulares de hibridomas que expresan anticuerpos monoclonales que se unen a un ligando preseleccionado. Los hibridomas que secretan un anticuerpo monoclonal deseado se pueden producir de varios modos usando técnicas bien conocidas por los expertos con un conocimiento normal de la técnica y no se repetirán en el presente texto. Los detalles de estas técnicas se describen en referencias del tipo Monoclonal Antibodies -Hybridomas: A New Dimension in Biological Analysis, Editado por Roger H. Kennett, et al., Plenum Press, 1980; y el documento de Patente de EE.UU. nº 4.172.124.

Además se conocen en la técnica métodos para producir anticuerpos "humanizados" o quiméricos e incluyen combinar regiones variables de múridos con regiones constantes humanas (Cabili, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:3273, 1984), o injertar las regiones determinantes de complementaridad (CDRs) de anticuerpos de múridos en el marco humano (Riechmann, et al., Nature 332:323, 1988).

Compuestos antisentido

imagen7

imagen8

imagen9

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

163(2): 985-94; Arumugam et al., (2003) Kidney Int 63(1): 134-42; Arumugam et al., (2002) J. Surg. Res. 103(2):2607). En un modelo de lesión por IR miocárdica en ganado porcino, un antagonista de C5aR reducía marcadamente el tamaño del infarto (Riley et al., (2000) J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 120(2): 350-8).

Estudios con anticuerpos contra C5 también muestran reducciones similares en lesiones por IR (Fitch et al., (1999) Circulation 100(25):2499-506; de Vries et al., (2003) Transplantation 75(3): 375-82).

Estudios clínicos y experimentales han mostrado que la IR de órganos, tales como riñones, hígado, pulmones y corazón induce una liberación rápida de diversas citocinas. Aunque después de la reperfusión se reduce el nivel en muchas de estas moléculas, la IL-8 aumenta significativamente. La IL-8 es un potente quimioatrayente de neutrófilos. Los niveles de IL-8 se correlacionan negativamente con la función pulmonar y niveles elevados están asociados con un riesgo mortal incrementado en el trasplante de pulmón. La administración intravenosa de anticuerpos anti-IL8 al comienzo de la reperfusión reduce marcadamente la lesión en los pulmones y la infiltración de neutrófilos (de Perrot et al., (2003) Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167(4):490-511).

Hay pruebas que muestran que la lesión por IR tiene lugar con un patrón bifásico. Los macrófagos activados durante la isquemia median en la fase temprana de la lesión, mientras que los neutrófilos y los linfocitos están implicados principalmente en la segunda fase, retardada. El reclutamiento de neutrófilos y linfocitos da como resultado la liberación de citocinas antes y después de la reperfusión.

Puesto que C5a es un potente quimioatrayente de diversas células mieloides, incluyendo macrófagos y neutrófilos e induce también la producción de citocinas, se considera que podría ser beneficioso bloquear el C5aR con anticuerpos específicos evitando la liberación de IL-8 y la migración de neutrófilos y reducir de este modo la lesión por IR.

Síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) y lesión pulmonar aguda (LPA)

SDRA y LPA son síndromes que son el resultado de un edema e inflamación pulmonares. El desarrollo de SDRA/LPA está asociado con varios trastornos clínicos graves incluyendo la lesión pulmonar provocada por infección por neumonía, aspiración de contenidos gástricos, traumatismo, septicemia, pancreatitis aguda, sobredosis de fármacos y derivación cardiopulmonar. La septicemia es la causa principal del SDRA/LPA. Al igual que con la IR, la respuesta inflamatoria en LPA está asociada con el reclutamiento de grandes cantidades de neutrófilos y monocitos en los espacios aéreos distales de los pulmones. Moléculas proinflamatorias, tales como citocinas, radicales oxigenados y proteasas tienen una función y una inflamación excesiva puede empeorar el SDRA/LPA (Ware y Matthay (2000) N. Engl. J. Med. 342(18): 1334-49; Brower et al., (2001) Chest 120(4): 1347-67).

Se ha sugerido que las estrategias antiinflamatorias podrían ser beneficiosas para reducir el número de neutrófilos que emigran a los espacios extravasculares de los pulmones, para reducir la adhesión de neutrófilos al endotelio pulmonar y para reducir la liberación de factores quimiotácticos (Brower et al. (2001) Chest 120(4): 1347-67).

Estudios de pacientes con SDRA revelan que en las fases tempranas de la enfermedad, están presentes niveles elevados de IL-8 en el fluido BAL o en el fluido del edema pulmonar. Además, anticuerpos que neutralizan IL-8 reducían la lesión pulmonar en un modelo de conejos (Brower et al., (2001) Chest 120(4): 1347-67).

Para SDRA y LPA, bloquear el C5aR también puede ser un enfoque terapéuticamente viable. C5a es una potente molécula quimiotáctica y estimuladora de la liberación de citocinas. Los estudios descritos anteriormente que empleaban moléculas que antagonizaban C5a o C5aR, mostraron una reducción de la lesión en diversos modelos de inflamación.

Producción de compuestos identificados en los métodos de escrutinio de la invención

El método objeto descrito en la presente memoria comprende además producir o sintetizar el compuesto que se analiza en el ratón modificado genéticamente.

Los compuestos de peptidilo se preparan convenientemente por síntesis convencional de péptidos, tal como el método de síntesis de Merrifield (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154, 1963) y las miles de mejoras disponibles para esa tecnología (véase, por ejemplo, Synthetic Peptides: A User's Guide, Grant, compilador (1992), W.H. Freeman & Co., New York, págs. 382; Jones (1994) The Chemical Synthesis of Peptides, Clarendon Press, Oxford, págs. 230); Barany, G. y Merrifield, R. B. (1979) en The Peptides (Gross, E. y Meienhofer, J. compiladores), vol. 2, págs. 1-284, Academic Press, New York; Wünsch, E., compilador (1974) Synthese von Peptiden in Houben-Weyls Metoden der Organischen Chemie (Müller, E., compilador), vol. 15, 4ª ed., Partes 1 y 2, Thieme, Stuttgart; Bodanszky, M. (1984) Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg; Bodanszky, M. & Bodanszky, A. (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg; Bodanszky, M. (1985) Int. J. Peptide Protein Res. 25, 449-474.

Preferiblemente, el péptido se sintetiza sobre un soporte en fase sólida, tal como, por ejemplo, una perla de gel de poliestireno que comprende poliestireno reticulado con divinilbenceno, preferiblemente divinilbenceno al 1% (p/p), que se hincha más usando disolvente lipófilo, tal como, por ejemplo diclorometano o dimetilformamida (DMF). El poliestireno puede estar funcionalizado por adición de grupos de clorometano o aminometilo.

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Alternativamente, el gel de polidimetil-acrilamida reticulado y funcionalizado se puede usar una vez hinchado y solvatado, usando DMF o un disolvente aprótico dipolar. Otros soportes en fase sólida conocidos por los expertos en la técnica, también se pueden usar para la síntesis de péptidos, tales como, por ejemplo, perlas obtenidas a partir de polietilenglicol, producidas mediante el injerto de polietilenglicol en la superficie de perlas de poliestireno inerte. Los soportes sólidos preferidos comercialmente asequibles incluyen PAL-PEG-PS, PAC-PEG-PS, KA, KR o TGR (Applied Biosystems, CA 94404, EE.UU.).

Para la síntesis de péptidos en fase sólida, grupos bloqueantes que son estables frente a los tratamientos repetidos, necesarios para la eliminación del grupo amino bloqueante de la cadena peptídica en crecimiento y para los acoplamientos repetidos de aminoácidos, se usan para proteger las cadenas laterales de aminoácidos durante la síntesis y para enmascarar la reactividad indeseada de los grupos funcionales α-amino, carboxilo o de cadena lateral. Los grupos bloqueantes (también llamados grupos protectores o grupos enmascarantes) protegen por tanto el grupo amino del aminoácido que tiene un grupo carboxilo activado que está implicado en la reacción de acoplamiento o protegen el grupo carboxilo del aminoácido que tiene un grupo amino acilado que está implicado en la reacción de acoplamiento.

Durante la síntesis, el acoplamiento tiene lugar después de la eliminación de un grupo bloqueante sin una rotura de un enlace peptídico o de cualquier grupo protector fijado a otra parte del péptido. Adicionalmente, se requiere que el anclaje péptido-resina que protege el extremo C-terminal del péptido, esté protegido durante el proceso sintético hasta la escisión de la resina. Por consiguiente, mediante una selección acertada de α-aminoácidos protegidos de forma ortogonal, se añaden aminoácidos en las posiciones deseadas a un péptido en crecimiento mientras que todavía está anclado a la resina.

Los grupos preferidos que bloquean amino se pueden eliminar fácilmente, pero son suficientemente estables para sobrevivir en las condiciones de la reacción de acoplamiento y de otras manipulaciones, tales como, por ejemplo, modificaciones en los grupos de las cadenas laterales. En una realización, los grupos bloqueantes de amino se seleccionan a partir del grupo que comprende: (i) un grupo benciloxicarbonilo (Z o carbobenzoxi) que se elimina fácilmente mediante hidrogenación catalítica a temperatura ambiente y presión ordinaria o usando sodio en amoniaco líquido y ácido bromhídrico en ácido acético; (ii) un derivado de uretano; (iii) un grupo t-butoxicarbonilo (Boc) que se introduce usando azida de t-butoxicarbonilo o dicarbonato de di-terc-butilo y se elimina usando un ácido suave, tal como, por ejemplo, ácido trifluoroacético (TFA al 50% en diclorometano) o HCl en ácido acético/dioxano/acetato de etilo; (iv) un grupo 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) que se escinde en condiciones suavemente básicas, no hidrolíticas, tales como, por ejemplo, usando una amina primaria o secundaria (por ejemplo, piperidina al 20% en dimetil formamida); (v) un grupo 2-(4-bifenilil)propil(2)oxicarbonilo (Bpoc); (vi) un grupo 2-nitro-fenilsulfenilo (Nps); y (vii) un grupo ditia-succinilo (Dts). Boc se emplea ampliamente para proteger el extremo N-terminal en química Fmoc, o Fmoc se emplea ampliamente para proteger el extremo N-terminal en química Boc.

Los grupos protectores de las cadenas laterales variarán para las cadenas laterales funcionales de los aminoácidos que forman el péptido que se sintetiza. Los grupos protectores de las cadenas laterales se basan generalmente en el grupo Bzl o el grupo tBu. Los aminoácidos que tienen alcoholes o ácidos carboxílicos en la cadena lateral se protegen como éteres de Bzl, ésteres de Bzl, ésteres de cHex, éteres de tBu o ésteres de tBu. La protección de la cadena lateral de los aminoácidos con Fmoc requiere grupos bloqueantes que sean idealmente estables frente a bases y lábiles frente a ácidos débiles (TFA). Se han descrito muchos grupos protectores diferentes para la síntesis de péptidos (véase The Peptides, Gross et al. compiladores, vol. 3, Academic Press, New York, 1981). Por ejemplo, el grupo 4-metoxi-2,3,6-trimetilfenilsulfonilo (Nd-Mtr) es útil para la protección de la cadena lateral de arginina, sin embargo, la desprotección de Arg(Mtr) requiere un tratamiento prolongado con TFA. Para proteger la cistina se usa cierto número de grupos lábiles frente a ácidos débiles (TFA, trifluoroacetato de talio (III)/TFA) o grupos lábiles estables frente al TFA, pero no frente al trifluoroacetato de talio (III)/TFA o grupos estables frente a ácidos débiles.

Las dos estrategias de protección empleadas más ampliamente son las estrategias Boc/Bzl y Fmoc/tBu. En Boc/Bzl, se usa Boc para la protección de amino y las cadenas laterales de los diversos aminoácidos se protegen usando grupos protectores basados en Bzl o cHex. Un grupo Boc es estable en condiciones de hidrogenación catalítica y se usa de forma ortogonal junto con un grupo Z para la protección de muchos grupos de cadenas laterales. En Fmoc/tBu, se usa Fmoc para la protección de amino y las cadenas laterales se protegen con grupos protectores basados en tBu.

Alternativamente, el compuesto de peptidilo se produce mediante la expresión recombinante de un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de dicho péptido. Las colecciones que codifican péptidos aleatorios son particularmente preferidas para estos fines, porque proporcionan una amplia gama de diferentes compuestos para analizar. Alternativamente, se pueden escrutar ácidos nucleicos de origen natural. De acuerdo con esta realización, el ácido nucleico que codifica el compuesto de peptidilo se produce por síntesis convencional de oligonucleótidos o procede de una fuente natural y se clona en un vector de expresión adecuado, conectado funcionalmente con un promotor u otra secuencia reguladora capaz de regular la expresión en un sistema exento de células o en un sistema celular.

Los oligonucleótidos se sintetizan preferiblemente con secuencias de enlazador o adaptador en los extremos 5' y 3' para facilitar la clonación subsiguiente en un sistema de vector adecuado, usando técnicas convencionales.

imagen10

imagen11

imagen12

imagen13

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

14.

Fraccionar el ADN digerido en un gel de agarosa al 1%. Transferir a una membrana de nailon e hibridar mediante transferencia Southern con una sonda de hibridación del gen diana adecuada, para distinguir el gen diana inalterado de un gen diana que haya experimentado recombinación homóloga.

15.

Seleccionar colonias de células ES que muestren dos fragmentos de hibridación de aproximadamente igual intensidad -un fragmento del tamaño previsto para el gen diana inalterado y un fragmento del tamaño previsto para un gen diana que haya experimentado recombinación homóloga. Si los dos fragmentos tienen una intensidad de hibridación desigual, la población de células puede no ser clonal. Congelar las células y conservarlas en nitrógeno líquido.

Un total de 672 colonias de células ES transfectadas con la estructura artificial que se dirige a una diana hC5aR se escrutaron para detectar una recombinación homóloga entre la estructura artificial que se dirige a una diana y el genoma del ratón.

El ADN extraído de las colonias de células ES se digirió con EcoRV o XbaI y se sometió a electroforesis a través de un gel de agarosa. El ADN se transfirió a un filtro (por el método Southern) y se hibridó con un ADN de una sonda marcada con 32P en 5' o 3' usando condiciones convencionales. Después de lavar, el filtro se expuso a una película de rayos X. Este escrutinio proporcionó tres colonias que contenían el gen C5aR humano. En dos de estas colonias (5H1 y 6C8) se identificó que tenían un gen C5aR humano correctamente integrado en el locus del gen C5aR de ratón (los datos no se muestran).

Ejemplo 3: Implantación de células ES, generación de quimeras y transmisión de líneas germinales del gen C5aR humano

El método convencional para generar quimeras con células ES emplea embriones de ratón de 3,5 días de edad (blastocistos). Los embriones en este estadio tienen una gran cavidad llena de fluido en la cual se pueden colocar las células ES mediante inyección. Los blastocistos ya han salido de los oviductos y se encuentran en las trompas uterinas. Para las inyecciones, se deben recoger antes de que eclosionen (pérdida de zona pelúcida) y se fijen a la pared uterina. Para generar blastocistos para inyecciones de células ES se usan diversas cepas de ratones. En este ejemplo, se usó la cepa de ratones Balb/c para generar blastocistos. Esta cepa proporciona un número razonable de embriones. Tiende a producir quimeras de alta calidad que se pueden distinguir fácilmente por el color del pelaje cuando se usan con células ES procedentes de una variedad de subcepas de C57BL/6.

Las células ES procedentes de las colonias, 5H1 y 6C8 se inyectaron en ~200 blastocistos. Los blastocistos se implantaron en ratones hembras seudopreñadas. Nacieron unas 17 quimeras que tenían entre 5 y 50% el color de pelaje negro. Las 13 quimeras machos se aparearon con hembras C57BL/6 y produjeron unas 300 crías. Se observó la transmisión de la línea germinal del gen C5aR humano a 19 crías procedentes de 5 parejas de apareamiento quimera x C57BL/6.

La presencia del locus C5aR humano se confirmó por transferencia Southern. El ADN genómico extraído de la cola de ratón se digirió con EcoRV, se sometió a electroforesis y se hibridó con la sonda 3'. El filtro se desmontó y se volvió a analizar con la sonda Neo. Cierto número de ratones mostraron el gen C5aR. El genotipo de estos ratones se denominó hC5aRfloxed(neoR)/wt (abreviado H5Rf/+).

Ejemplo 4: Reproducción e identificación de ratones homocigóticos para el gen C5aR humano

Una generación de ratones H5Rf/+ se aparearon con ratones C57BL/6 supresores de Cre para eliminar el gen marcador neoR, generando de este modo ratones H5R/wt/Cre. Los ratones H5R/wt/Cre se aparearon con ratones C57BL/6 para eliminar el gen Cre, generando de este modo ratones H5R/wt heterocigóticos (H5R/+). Los apareamientos entre ratones H5R/+ produjeron ratones homocigóticos con genes activados H5R/H5R. También se establecieron algunos apareamientos H5Rf/+ x H5Rf/+ y generaron homocigóticos H5Rf/H5Rf.

La confirmación de que los ratones son portadores del gen C5aR humano se realizó usando un ensayo de genotipado basado en la PCR. El ensayo de genotipos mediante transferencia Southern empleado anteriormente para identificar ratones portadores del gen C5aR humano, se basaba en la hibridación con una sonda de ADN específica de ratón (no una sonda específica del gen C5aR humano). El ensayo de PCR descrito más adelante utilizaba cebadores que amplifican específicamente las secuencias del gen C5aR humano o de ratón.

Preparación del ADN de la cola

Puntas de la cola de 3 mm se colocaron en tubos Eppendorf estériles de 1,5 ml y se incubaron durante una noche a 65ºC en 200 ul de tampón de aislamiento de ADN (Tris-Cl 67 mM, pH 8,0 (Calbiochem), sulfato de amonio 16,6 mM (Sigma), cloruro de magnesio 6,5 mM (Promega), β-mercaptoetanol al 1% (ICN Biomedical) y Triton X100 al 0,05% (Sigma)). El líquido sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo de 1,5 ml que contenía 500 ul de etanol al 100% (UNIVAR), se mezcló y se incubó durante 2 horas a -20ºC, luego se centrifugó durante 15 minutos a 4ºC y 13.000 rpm (Labofuge 400R, Heraeus Instruments) para precipitar el ADN genómico purificado. El sedimento de ADN se lavó en etanol al 70% y se dejó secar antes de volver a ponerlo en suspensión en 50 ul de agua destilada. Se usó una parte alícuota de 1 ul como el ADN molde en el siguiente ensayo de PCR.

10

15

20

25

30

35

40

45

50

PCR para amplificar genes de C5aR humano y de ratón

Cada reacción de PCR contenía 5 ul de tampón 10x PCR exento de magnesio, 5 ul de cloruro de magnesio 25 mM, 0,5 ul de Taq ADN-polimerasa (2,5 unidades/ul), 1 ul de dNTPs 10 mM (Promega), 1 ul de cada cebador oligonucleotídico 10 mM (F1C, R2a, F3C y R4C) y 1 ul de ADN molde. El volumen total se completó hasta 50 ul con agua destilada. Los cebadores oligonucleotídicos empleados eran:

5'-TGGACTACAGCCACGACAAACG-3' (F1C) (SEQ ID NO:4) y 5'-AGGAAGGACATCATTATCCCCG-3' (R2a) (SEQ ID NO:5), ambos específicos del exón 3 de C5aR humano; y,

5'-CACCAGCCCCGAGATTTTTTC-3' (F3C) (SEQ ID NO:6) y 5'-TCAGAAACCAGATGGCGT-3' (R4C) (SEQ ID NO:7), ambos específicos del gen C5aR de ratón.

Las secuencias diana se amplificaron después usando un termociclador de PCR System 2700 (Applied Biosystems). La PCR empezó con una etapa de desnaturalización de 5 minutos a 95ºC, seguida por 25 ciclos de tres etapas: 95ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 60 segundos. Una etapa de extensión final: 5 minutos a 72ºC fue seguida por almacenamiento a 4ºC.

Electroforesis en gel

El genotipo de cada muestra se visualizó usando electroforesis en gel con 10 ul de producto de la PCR y 6x colorante de carga (Promega). El gel consistía en 80 ml de agarosa de calidad para ADN al 1,5% (Progen) en 1x TBE y 2 ul de bromuro de etidio (MP Biomedicals). Las muestras se hicieron correr a 100 voltios durante 30 minutos junto con una cadena de ADN de 1 kb (Promega). Se esperaba que el ADN de ratones homocigóticos H5Rf/H5Rf tuviera una sola banda de 237 pb, el ADN de ratones heterocigóticos H5Rf/+ tendría bandas de 237 pb y 565 pb y el ADN de ratones de tipo silvestre tuviera una sola banda de 565 pb. El análisis del gel mostraba que los ratones nº 10, 24 y 25 eran homocigóticos (H5Rf/H5Rf) (datos no mostrados). En algunas muestras, se observó un transcrito irrelevante con una longitud de 1139 pb (amplificado con los cebadores F3C y R2a).

La localización relativa en el locus de C5aR ratón/humano de los cebadores de la PCR, F1C, R2a, F3C y R4C, usados en el ensayo de genotipado se muestra en la Figura 4.

Ejemplo 5: C5aR humano se expresa en células aisladas de ratón con el gen activado

Para confirmar que el receptor de C5a humana se expresa en ratones que son portadores del gen C5aR humano, se aislaron neutrófilos a partir de la sangre de un ratón de tipo silvestre (+/+), un heterocigótico (H5Rf/+) y un homocigótico (H5Rf/H5Rf).

Tinción con inmunofluorescencia directa de C5aR en sangre completa de ratón

Se recogieron aproximadamente 30 ul de sangre venosa periférica de ratones homocigóticos (H5Rf/H5Rf), heterocigóticos (H5Rf/+) y de tipo silvestre (+/+) en un tubo que contenía EDTA (la concentración final de EDTA era 5 mM). Para la detección del receptor C5aR humano se tiñeron 30 ul de sangre con 5 ul de 7F3 marcado con FITC (isotiocianato de fluoresceína, Sigma), un anticuerpo específico para C5aR humano (7F3 no tiene reacción cruzada con el C5aR de ratón). La sangre y el anticuerpo se incubaron en un tubo de ensayo de 12 x 75 mm durante 15 minutos a temperatura ambiente. Para lisar los eritrocitos y fijar las células se añadieron 500 ul de solución de lisis BD (Becton Dickinson) a la solución de sangre/anticuerpo. Después de 15 minutos, las células se centrifugaron a 1.200 rpm durante 3 minutos a temperatura ambiente y el sedimento celular se volvió a suspender en 1 ml de tampón de lavado (1 x PBS, BSA al 0,1%, azida de sodio al 0,02%). Las células se analizaron en un citómetro de flujo FACS Calibur (Becton Dickinson) usando el programa informático Cell Quest (Becton Dickinson). Para cada muestra se contaron aproximadamente 5.000 células.

La Figura 5 muestra los resultados de este análisis. Los neutrófilos tanto de los ratones KI homocigóticos como heterocigóticos se unieron a 7F3, un anticuerpo específico para C5aR humano. En contraste, los neutrófilos de ratones de tipo silvestre no se tiñeron con 7F3. Los linfocitos de todos los genotipos de los ratones no se tiñeron con el AcMo 7F3. Esto era lo esperado, puesto que C5aR no se expresa en los linfocitos. Los monocitos procedentes de los ratones homocigóticos y heterocigóticos con el gen activado se tiñeron parcialmente con 7F3, lo que indica que un pequeño porcentaje de las células expresaba C5aR humano. Ninguno de los monocitos procedentes del ratón de tipo silvestre daba positivo en la tinción a través de 7F3.

En resumen, los ratones que son portadores del gen C5aR humano expresan C5aR humano en la superficie de los tipos celulares esperados. Esto indica que la célula de ratón es capaz de expresar y procesar el receptor de C5a humana.

Ejemplo 6: Los ratones con el gen C5aR humano activado se pueden usar para escrutar compuestos antiinflamatorios

Para demostrar la utilidad de los ratones con el gen C5aR humano activado, sometimos ratones homocigóticos (H5Rf/H5Rf) a un modelo de enfermedad inflamatoria, en concreto al modelo K/BxN de artritis reumatoide.

imagen14

imagen15

imagen16

imagen17

Claims (1)

1. imagen1