CN107249607A - 包括工程化内皮细胞的生物相容性植入物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及适于外科植入受试者的植入物。在一些实施方案中，植入物包括生物相容性支架材料和含有工程化内皮细胞，例如E4ORF1+工程化内皮细胞或表达某些标志物分子的工程化内皮细胞的血管。本发明提供植入物、制备这种植入物的方法和利用这种植入物的治疗方法。

Description

包括工程化内皮细胞的生物相容性植入物
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年12月19日提交的美国临时专利申请No.62/094,915的权益，其内容通过引用并入本文。
参考引用
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背景技术
生物相容性植入物已经用于各种应用中，包括例如修复或替代人体内损伤或缺陷的组织。一些此类植入物包括生物相容性支架材料，当将其外科植入宿主受试者的身体时，变得填入受试者的细胞并整合到受试者的组织中。为了确保足够的氧气和营养供应，这些植入物通常必须在外科植入后被投以内皮细胞，然后内皮细胞必须形成与受试者的现有血管***连接的功能性血管。因此，内皮细胞浸润这种植入的支架并形成功能性血管的程度和速度是这类植入物最终成功的重要决定因素。在体外-即在外科植入之前-产生含有预先形成的血管的三维生物相容性支架的能力可以显著增加这类植入物在体内整合到宿主受试者的组织中的速度和效力。然而，生产这类植入物的先前尝试成败参半。例如，使用胶原凝胶或Matrigel在体外诱导血管形成的若干先前尝试未能导致血管萌芽或形成具有由极化内皮细胞包围的明显内腔(patent lumen)的血管。(关于一些这类的先前尝试的讨论，参见Nakatsu等人(2003)“Angiogenic sprouting and capillary lumen formationmodeled by human umbilical vein endothelial cells(HUVEC)in fibrin gels:therole of fibroblasts and angiopoietin-1.”Microvascular Research,第66卷，第102–112页。)其他尝试涉及在涂布有细胞外基质组分的珠上培养内皮细胞单层，然后将珠嵌入纤维蛋白凝胶中。发现这种方法只有在皮肤成纤维细胞在凝胶顶部生长才能导致具有明显内腔的血管形成。没有此类成纤维细胞的共培养，发现内皮细胞最初形成短的、狭窄的索状结构，其随后在没有血管形成的情况下崩解。见Nakatsu等(2003年)。与这些发现一致，已报道成纤维细胞是内皮细胞内腔形成所必需的。参见Newman等人(2011)“The requirementfor fibroblasts in angiogenesis:fibroblast-derived matrix proteins areessential for endothelial cell lumen formation；”Molecular Biology of theCell,Vol.22,pp.3791-3800。
发明内容
本发明部分地基于如下惊人的发现：表达腺病毒E4ORF1蛋白的工程化内皮细胞可以在体外在三维生物相容性支架内侧形成具有明显内腔的血管。尽管之前已经显示E4ORF1+内皮细胞可以在将这些细胞与液体Matrigel共注射到小鼠的侧腹中后在体内在Matrigel塞中形成新血管，并且E4ORF1+内皮细胞可以在Matrigel包被的培养板上形成新血管生成管(参见美国专利8,465,732)，据申请人所知，这种细胞在体外在三维支架内形成具有开放内腔的真正血管的能力以前未被证实。如本文所述，现已出乎意料地发现，真正的E4ORF1+血管可以在短短几天的时间内在体外在三维生物相容性支架材料内形成具有开放内腔的血管-即使在不存在其它细胞类型如成纤维细胞的情况下-并且含有血管的植入物可以在体外培养和维持长达6周的一段时间。有趣的是，还发现这些植入物中的血管可以延伸超过生物相容性支架的边界-产生似乎在围绕支架材料的培养基中自由浮动的突出血管。基于这些发现，本发明提供适于外科植入受试者的特定的新的和改进的植入物，以及这种植入物的制造和使用方法。
因此，在一个实施方案中，本发明提供一种适于外科植入受试者的植入物，包括：(a)生物相容性支架材料和(b)设置在所述生物相容性支架材料内的血管，其中所述血管包括E4ORF1+工程化内皮细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供一种制备适于外科植入受试者的植入物的方法，所述方法包括：在体外培养与生物相容性支架材料接触的工程化E4ORF1+内皮细胞群，直到在生物相容性支架材料内形成血管，从而形成包括E4ORF1+血管的植入物。
用于本发明的植入物和方法中的生物相容性支架材料通常是三维结构-使得血管可以设置在三维结构内。在一些这类实施方案中，本发明的植入物包括连接血管的网络，其可以包括毛细血管。在一些此类实施例中，血管具有开放/明显内腔。在一些这类实施方案中，一个或多个血管可以突出超过生物相容性支架材料的边界。
在一些实施方案中，用于本发明的植入物和方法中的E4ORF1+工程化内皮细胞还表达ETV2多肽(即它们是E4ORF1+ETV2+内皮细胞)。在其它这类实施方案中，E4ORF1+工程化内皮细胞还表达重组ETS家族转录因子(即它们是E4ORF1+ETS+)。
在一些实施方案中，工程化E4ORF1+内皮细胞可以是胎儿细胞，或出生后细胞或成体细胞。在一些实施方案中，用于本发明的植入物和方法的工程化E4ORF1+内皮细胞是哺乳动物内皮细胞。在一些实施方案中，工程化E4ORF1+内皮细胞是人内皮细胞。在一些实施方案中，工程化E4ORF1+内皮细胞衍生自人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。
在一些实施方案中，用于本发明的植入物和方法的工程化E4ORF1+内皮细胞是器官特异性内皮细胞。例如，在一些实施方案中，工程化内皮细胞可以是造血***特异性内皮细胞、或神经***特异性内皮细胞、或心脏特异性内皮细胞、或肺特异性内皮细胞、或肝特异性内皮细胞、或肾脏特异性内皮细胞、或肌肉特异性内皮细胞、或软骨特异性内皮细胞、或肌腱特异性内皮细胞或脂肪组织特异性内皮细胞。在一些这类实施方案中，所使用的器官特异性内皮细胞衍生自要放置植入物的器官或组织。
在一些实施方案中，用于本发明的植入物和方法中的工程化E4ORF1+内皮细胞衍生自将要外科植入植入物的受试者的内皮细胞-即它们是自体内皮细胞。在其它实施方案中，工程化E4ORF1+内皮细胞衍生自与要外科植入植入物的受试者相同物种的供体的内皮细胞-即它们是同种异体内皮细胞。在一些这类实施方案中，同种异体供体是与要外科植入植入物的受试者组织匹配的(或部分匹配的)。例如，在一些实施方案中，供体具有与要外科植入植入物的受试者相同的MHC型(或HLA型)。在一些其它实施方案中，供体具有与要外科植入植入物的受试者部分匹配的MHC型(或HLA型)。还在其它实施方案中，供体具有不同于要外科植入植入物的受试者的MHC型(或HLA型)。
在一些实施方案中，用于本发明的植入物和方法的生物相容性支架材料除了工程化内皮细胞之外还含有一种或多种另外的细胞类型。在一些这类实施方案中，另外的细胞类型可以经遗传修饰。在其他这类实施方案中，另外的细胞类型可以是天然的(即不经遗传修饰的)。在一些这类实施方案中，另外的细胞类型可以是胎儿细胞、出生后细胞或成体细胞。在一些实施方案中，此类另外的细胞类型可以是干细胞或祖细胞。在其它实施方案中，这类其它细胞类型可以是分化的细胞。在一些实施方案中，这类干细胞或祖细胞可以是造血干细胞、骨干细胞、肌肉干细胞、神经干细胞、上皮干细胞、皮肤干细胞、间充质干细胞、肠干细胞或精原干细胞。在一些实施方案中，分化的细胞可以是分化的造血细胞、骨细胞、肌细胞、神经细胞、周细胞、毛囊细胞、脂肪细胞、角质细胞、上皮细胞、皮肤细胞、成纤维细胞、肠细胞或睾丸细胞。
在一些实施方案中，用于本发明的植入物和方法的生物相容性支架材料在植入物内在4℃下是固体。在一些实施方案中，生物相容性支架材料在21℃下是固体。在一些实施方案中，生物相容性支架材料包括一种或多种细胞外基质分子，例如胶原蛋白或纤维蛋白。在一些实施方案中，植入物内的生物相容性支架材料包括脱细胞动物组织，例如脱细胞猪组织。在一些实施方案中，植入物内的生物相容性支架材料不是Matrigel。在一些实施方案中，植入物内的生物相容性支架材料不包括透明质酸。
在一些实施方案中，本发明的植入物不包括血清。在一些实施方案中，本发明的植入物不包括外源生长因子。在一些实施方案中，本发明的植入物不包括外源血管生成因子。在一些实施方案中，本发明的植入物不包括外源VEGF。在一些实施方案中，本发明的植入物不包括外源FGF。
在一些实施方案中，本发明的植入物不包括成纤维细胞。在一些实施方案中，本发明的植入物不包括成纤维细胞衍生的血管生成因子。在一些实施方案中，本发明的植入物不包括成纤维细胞衍生的细胞外基质组分。
在一些实施方案中，本发明的植入物不包括微载体珠。在一些实施方案中，本发明的植入物不包括涂布有细胞外基质分子的微载体珠。
在一些实施方案中，本发明提供治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括将如本文所述的植入物植入受试者。在一些这类方法中，受试者具有组织缺损，并且将植入物在组织缺损部位外科植入受试者。在一些这类方法中，工程化E4ORF1+内皮细胞是器官特异性内皮细胞，并且将植入物外科植入衍生所述器官特异性内皮细胞的器官中。在一些这类方法中，受试者是哺乳动物受试者。在一些这类方法中，受试者是人类受试者。在一些这类方法中，工程化E4ORF1+内皮细胞衍生自受试者自己的内皮细胞-即它们是自体内皮细胞。在其他这类方法中，植入物中的工程化E4ORF1+内皮细胞衍生自同种异体供体的内皮细胞，例如与受试者具有相同MHC-或HLA-型的同种异体供体，或具有与受试者的MHC-或HLA-型部分匹配的同种异体供体。
本发明的这些和其它实施方案在本文所附实施例、权利要求和附图部分中进一步描述。此外，对于本领域技术人员显而易见的是，本文描述的实施例的某些修改和组合落在本发明的范围内，并且可以在没有过度实验的情况下进行。
附图说明
图1A和1B.已经用表达E4ORF1和绿色荧光蛋白(GFP)的工程化内皮细胞接种并体外保持的植入物的荧光显微镜图像-如实施例1所述。每个图像底部的白色条代表400微米。来自内皮细胞中GFP表达的绿色荧光在黑白图像中显示为白色。具有开放内腔的血管结构可以在图1A和图1B中看到。在图1B中，可以看到血管突出超过支架材料的边界。
图2A和2B.在外科植入后48小时从小鼠腹部取出后的两个植入物的照片。图2A中的“试验”植入物在外科植入之前已经用E4ORF1+工程化内皮细胞接种，并且保持在培养物中-如实施例1和2所述。在图2A的圆圈区域中可以看到植入物内的血管形成和血液。图2B中的“对照”植入物在外科植入前尚未接种内皮细胞，并且示出无可检测的血管形成或血液流动。
图3.外科植入后4周从小鼠腹部取出后的两个植入物的照片。右侧所示的“试验”植入物在植入之前已经用E4ORF1+工程化内皮细胞接种，并且保持在培养物中-如实施例中所述。在右侧的“试验”植入物中可以看到明显的血管形成和血液内容物-在该黑白图像中显示为在植入物边缘上的暗色/黑色区域。左侧的“对照”植入物在植入前尚未接种内皮细胞。
图4A-D.外科植入小鼠腹部并在植入后2周取出的植入物的组织切片的显微照片。图4A和图4B中的“试验”植入物已经用E4ORF1+工程化内皮细胞接种，如实施例中所述。图4C和图4D中的“对照”植入物在植入前尚未接种内皮细胞。与图4C和4D中的植入物相比，图4A和4B中的“试验”植入物显示增加的细胞性。
具体实施方式
本专利公开内容的“发明内容”、“附图”、“附图说明”、“实施例”和“权利要求”部分描述了本发明的一些主要实施方案。本“具体实施方式”部分提供了与本发明的组合物和方法有关的特定附加描述，并且旨在结合本专利公开内容的所有其它部分来阅读。此外，同样对于本领域技术人员将显而易见的是，贯穿本专利公开内容描述的不同实施方案可以并且旨在以各种不同的方式组合。本文描述的这类具体实施方案的组合旨在落入本发明的范围内。
以下提供了某些定义。其他术语在本专利公开内容的其他部分中定义，具有从使用它们的上下文中是清楚的、或根据本领域常规含义使用的含义。
定义
如本文所使用的，当关于数值使用时，术语“约”和“近似”表示在所述值的+或-20％内。
本文所用的术语“培养”是指细胞在各种类型培养基上或培养基中的繁殖。“共培养”是指两种或更多种不同类型的细胞在各种类型培养基上或培养基中的繁殖，例如，在一些实施方案中，可以共培养内皮细胞和干细胞或祖细胞。
如本文所用，术语“有效量”是指如本文所述的指定的试剂或细胞群(例如E4ORF1多肽、编码E4ORF1多肽的核酸分子或E4ORF1+工程化内皮细胞群)的足以实现对于本文所述的一种或多种结果的可检测效果的量。例如，在内皮细胞中表达E4ORF1的情况下，待引入/递送至内皮细胞的核酸分子(例如载体中的)的有效量可以是与任何合适的对照(例如E4ORF1-内皮细胞)相比导致内皮细胞存活或增殖的可检测增加的量。在将编码E4ORF1的核酸分子导入内皮细胞的情况下，核酸分子(例如载体中的)的有效量可以是与任何合适的对照(例如E4ORF1-细胞)相比导致内皮细胞存活或增殖的可检测增加的量。在涉及向受试者施用E4ORF1+内皮细胞的方法的情况下，有效量可以是与任何合适的对照(例如E4ORF1-内皮细胞)相比导致一种或多种期望的生物或治疗指标的可检测改善(例如，改善的内皮/血管再生，改善的血管发生，改善的植入物的存活或移植等)的量。任何个别情况下任何适当的“有效量”可以凭经验来确定，例如使用本领域已知的标准技术，例如剂量递增研究，并且可以考虑诸如计划的用途、计划的递送/给药方式，期望的递送/给药频率等来确定。此外，“有效量”可以使用诸如本专利公开内容的实施例部分中所述的评估植入物中血管的形成和/或评估将植入物在体内整合到组织中的那些测定来确定。
当与本文中的细胞相关地使用时，术语“工程化”是指由人工程化以产生所述表型(例如E4ORF1+或ETV2+或表达重组ETS转录因子)、或表达所述核酸分子或多肽的细胞。术语“工程化细胞”不旨在包括天然存在的细胞，而是旨在包括例如包括重组核酸分子的细胞、或者另外被人为改变的细胞(例如通过遗传修饰-如下文定义)，例如使得它们表达它们不会另外表达的多肽，或者使得它们以比在非工程化内皮细胞中观察到的程度基本上更高的水平表达多肽。
“遗传修饰”或“基因-修饰的”或“经遗传修饰的”是指细胞的正常核苷酸序列的任何添加、缺失或破坏。例如，在一些实施方案中，所描述的内皮细胞已经遗传修饰，使得它们含有编码腺病毒E4ORF1多肽的核酸分子、和/或编码本文所述的任何其它特定多肽的核酸分子(例如ETS转录因子多肽，如ETV2多肽)。类似地，在一些实施方案中，本文所述的内皮细胞或本文所述的任何其它细胞类型(例如干细胞或祖细胞或神经细胞、肌细胞、周细胞、上皮细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、角化细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、T细胞、B细胞或毛囊干细胞)也可以根据需要包括一种或多种其它遗传修饰。术语“遗传修饰”包括基因递送运载体的使用，包括但不限于转导(体内或体外的病毒介导的核酸转移给接受者)，转染(分离的核酸由细胞摄取)，脂质体介导的转移及本领域公知的其它方式。
当与本文中的细胞相关地使用时，术语“天然”或“野生型”是指未经遗传修饰的细胞(如该术语在上文中定义的)或不是“工程化的”细胞(如该术语在上文中定义的)。例如，已经从受试者获得并且未经人遗传修饰的内皮细胞或其他细胞类型被认为是“天然的”或“野生型”细胞。
如本文所用，短语“分离的植入物”是指不在受试者体内而是离体/体外的植入物。例如，在培养基中的体外植入物被认为是“分离的植入物”。通常地，“分离的”植入物是在体外而不是在体内建立的，并且尚未在体内植入或孵育的。因此，通常地，分离的植入物是指在体外建立的植入物，其尽管适合于外科植入，但是尚未外科植入受试者。涉及“植入物”的本发明的所有实施方案通常涉及“分离的植入物”。
如本文所用，术语“重组”是指使用分子生物学和基因工程(例如分子克隆)的方法由人(包括由机器)产生的，并且包括不会另外天然存在的核苷酸序列的核酸分子。因此，将重组核酸分子与天然存在(例如在生物体的基因组中)的核酸分子相区分。包括mRNA序列的互补DNA或“cDNA”拷贝的核酸分子，没有如在相应的基因组DNA序列中发现的任何介入的内含子序列，因此被认为是重组核酸分子。举例来说，重组E4ORF1核酸分子可以包括E4ORF1编码序列，其可操作地连接到启动子和/或在天然存在的腺病毒基因组中该编码序列通常不与其关联的其它遗传元件。类似地，重组ETV2核酸分子可以包括ETV2cDNA序列(即，并非天然存在于生物体的基因组中的序列)，和/或可以包括ETV2编码序列，其可操作地连接到启动子和/或在生物体的基因组中该编码序列通常不与其关联的其它遗传元件。
术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，并且除非另有说明，是指哺乳动物例如人和非人灵长类动物，以及兔、大鼠、小鼠、山羊、猪和其他哺乳动物物种。
如本文中的与细胞群相关地使用的短语“基本上纯的”是指特定类型(例如通过一种或多种指定的细胞标志物的表达、形态特征或功能特征来确定的)的细胞群，或两种或更多种不同细胞类型一起使用的实施方案中的指定类型(复数)的细胞群，即，所述细胞占总细胞群的至少约50％、优选至少约75-80％、更优选至少约85-90％、最优选至少约95％。因此，“基本上纯的细胞群”是指含有少于约50％、优选少于约20-25％、更优选少于约10-15％、最优选少于约5％的不是指定的一种或多种类型的细胞。
核酸分子和多肽
腺病毒早期4(E4)区域含有至少6个开放阅读框(E4ORF)。以前已经显示了整个E4区域调节血管生成并促进内皮细胞的存活(参见Zhang等人(2004)，J.Biol.Chem.279(12):11760-66)。以前也已经显示，在整个E4区域内，负责内皮细胞中的这些生物学作用的正是E4ORF1序列。参见美国专利8,465,732。还参见Seandel等人(2008)，“Generation of afunctional and durable vascular niche by the adenoviral E4ORF1 gene,”PNAS,105(49):19288-93。本文描述的本发明的几个实施方案涉及为E4ORF1+(即表达E4ORF1多肽)的工程化内皮细胞。类似地，本文描述的本发明的几个实施方案涉及为ETV2+或ETS+的工程化内皮细胞。这些细胞分别含有表达ETV2多肽或ETS家族转录因子多肽。所有这些多肽(E4ORF1、ETV2、ETS)在本文统称为“本发明的多肽”。
“本发明的多肽”由核酸分子编码。因此，在一些实施方案中，本发明涉及编码腺病毒E4ORF1多肽的核酸分子、编码ETS转录因子多肽的核酸分子和/或编码ETV2转录因子多肽的核酸分子。此类核酸分子在本文统称为“本发明的核酸分子”。
本发明的多肽和本发明的核酸分子可以具有本文指定的或本领域已知的氨基酸序列或核苷酸序列，或者可以具有为这些氨基酸或核苷酸序列的变体、衍生物、突变体或片段的氨基酸或核苷酸序列，条件是此类变体、衍生物、突变体或片段具有或编码这样的多肽：具有本文所述的一种或多种功能性质、或一种或多种本文所述用途所需的性质、或不阻止或阻遏本文所述的一种或多种性质或用途(其包括但不限于在体外促进内皮细胞存活的能力，以及内皮细胞在体外在植入物中形成血管的能力)。
在涉及ETS转录因子多肽例如ETV2多肽的实施方案中，多肽可以是任何哺乳动物ETS转录因子多肽，例如人、非人灵长类动物、兔、大鼠、小鼠、山羊或猪多肽。在一些优选的实施方案中，多肽可以是人多肽。此类多肽的氨基酸序列和编码此类多肽的核酸序列是本领域公知的，并且可以在众所周知的公知数据库如Genbank数据库中获得。
在涉及腺病毒E4ORF1多肽的那些实施方案中，所用多肽序列可以来自任何合适的腺病毒类型或腺病毒株，例如人腺病毒2型、3型、5型、7型、9型、11型、12型、14型、34型、35型、46型、50型或52型。在一些优选的实施方案中，所用多肽序列来自人腺病毒5型。此类腺病毒多肽的氨基酸序列和编码此类多肽的核酸序列是本领域公知的并可获自公知的公开数据库，如Genbank数据库。例如，合适的序列包括以下：人腺病毒9(Genbank登录号CAI05991)，人腺病毒7(Genbank登录号AAR89977)，人腺病毒46(Genbank登录号AAX70946)，人腺病毒52(Genbank登录号ABK35065)，人腺病毒34(Genbank登录号AAW33508)，人腺病毒14(Genbank登录号AAW33146)，人腺病毒50(Genbank登录号AAW33554)，人腺病毒2(Genbank登录号AP.sub.--000196)，人腺病毒12(Genbank登录号AP.sub._000141)，人腺病毒35(Genbank登录号AP.sub.--000607)，人腺病毒7(Genbank登录号AP.sub.--000570)，人腺病毒1(Genbank登录号AP.sub.--000533)，人腺病毒11(Genbank登录号AP_000474)，人腺病毒3(Genbank登录号ABB 17792)，和人腺病毒5型(Genbank登录号D12587)。
在一些实施方案中，本发明的多肽和核酸分子具有与本文中具体描述的或本领域已知的那些相同的氨基酸或核苷酸序列(例如在公共序列数据库如Genbank数据库中)。在一些实施方案中，本发明的多肽和核酸分子可以具有为此类序列的变体、衍生物、突变体或片段的氨基酸或核苷酸序列，例如与此类序列具有大于85％序列同一性的变体、衍生物、突变体或片段。在一些实施方案中，所述变体、衍生物、突变体或片段与已知序列具有约85％的同一性，或与已知序列具有约88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一些实施方案中，使用已知核苷酸序列这样的变体、衍生物、突变体或片段，其相对于已知核苷酸序列长度变化约50个核苷酸、或约45个核苷酸、或约40个核苷酸、或约35个核苷酸、或约30个核苷酸、或约28个核苷酸、26个核苷酸、24个核苷酸、22个核苷酸、20个核苷酸、18个核苷酸、16个核苷酸、14个核苷酸、12个核苷酸、10个核苷酸、9个核苷酸、8个核苷酸、7个核苷酸、6个核苷酸、5个核苷酸、4个核苷酸核苷酸、2个核苷酸或1个核苷酸。在一些实施方案中，使用已知氨基酸序列这样的变体、衍生物、突变体或片段，其相对于已知核苷酸序列长度变化约50个氨基酸、或约45个氨基酸、或约40个氨基酸、或约35个氨基酸、或约30个氨基酸、或约28个氨基酸、26个氨基酸、24个氨基酸、22个氨基酸、20个氨基酸、18个氨基酸、16个氨基酸、14个氨基酸、12个氨基酸、10个氨基酸、9个氨基酸、8个氨基酸、7个氨基酸、6个氨基酸、5个氨基酸、4个氨基酸、3个氨基酸、2个氨基酸或1个氨基酸。
在使用E4ORF1核酸或氨基酸序列的那些实施方案中，在一些实施方案中，在没有来自腺病毒E4区域的其他序列下-例如不在整个E4区域的核苷酸序列的背景下，或不与由E4区编码的其他多肽一起-使用此类序列。然而，在一些其它实施方案中，此类序列可以与来自E4区域的一种或多种其它核酸或氨基酸序列例如E4ORF2、E4ORF3、E4ORF4或E4ORF5序列，或其变体、突变体或其片段结合使用。例如，虽然E4ORF1序列可以用于含有其它序列、基因或编码区(例如启动子、标记基因、抗生素抗性基因等)的构建体(例如病毒载体)中，但是在某些实施方案中，E4ORF1序列用于不含整个E4区域或不含来自整个E4区域的其它ORF如E4ORF2、E4ORF3、E4ORF4和/或E4ORF5的构建体。
本发明的核酸分子可以用于含有各种其它核酸序列、基因或编码区的构建体，这取决于期望的用途，例如抗生素抗性基因、报告基因或表达标签(例如，诸如编码GFP的核苷酸序列等)，或可能期望的任何其它核苷酸序列或基因。本发明的多肽可以单独表达或作为融合蛋白的一部分表达。
在一些实施方案中，本发明的核酸分子可以在一个或多个启动子的控制下以允许表达。可以使用能够驱动核酸序列在期望细胞类型中表达的任何启动子。合适的启动子的实例包括但不限于CMV、SV40、RSV、HIV-Ltr和MML启动子。启动子也可以是来自腺病毒基因组的启动子或其变体。例如，在使用E4ORF1的情况下，启动子可以是用于驱动腺病毒中相应基因表达的启动子。
在一些实施方案中，本发明的核酸分子可以置于诱导型启动子的控制下，使得核酸序列的表达可以根据需要打开或关闭。可以使用任何合适的诱导型表达***，例如四环素诱导型表达***或激素诱导型表达***。例如，本发明的核酸分子可以在需要时表达，然后当达到期望的结果时例如当内皮细胞已经有足够的生长或增殖时关闭。打开或关闭表达的能力可以对体内应用特别有用。
本发明的核酸分子可以包括天然存在的核苷酸、合成核苷酸或其组合。例如，在一些实施方案中，本发明的核酸分子可以包括RNA，例如在细胞内稳定并可用于直接在细胞内指导蛋白质表达/产生的合成修饰的RNA。在其它实施方案中，本发明的核酸分子可以包括DNA。在使用DNA的实施方案中，DNA序列可以可操作地连接到一个或多个合适的启动子和/或调节元件以允许(和/或促进、增强或调节)细胞内的表达，并可存在于一个或多个合适的载体或构建体中。本发明的核酸分子可以在同一核酸构建体中引入内皮细胞，或者它们可以在单独的核酸构建体中引入。
本发明的核酸分子可以使用本领域已知的任何合适的***引入内皮细胞，所述***包括但不限于转染技术和病毒介导的转导技术。可以根据本发明使用的转染方法包括但不限于脂质体介导的转染、聚凝胺(polybrene)介导的转染、DEAE葡聚糖介导的转染、电穿孔、磷酸钙沉淀、显微注射和微粒子轰击。可以使用的病毒介导的转导方法包括但不限于慢病毒介导的转导、腺病毒介导的转导、逆转录病毒介导的转导、腺相关病毒介导的转导和疱疹病毒介导的转导。
本发明还提供载体，包括含有本发明的核酸分子的表达载体。例如，在一个实施方案中，本发明提供包括编码ETS转录因子多肽的核苷酸序列和编码E4ORF1多肽的核苷酸序列的表达载体。在一些这类实施方案中，ETS转录因子是ETV2。在一些这类实施方案中，表达载体是慢病毒载体。在一些实施方案中，编码ETS转录因子多肽的核苷酸序列和编码E4ORF1多肽的核苷酸序列处于单独的启动子的控制下。在一些实施方案中，编码ETS转录因子多肽的核苷酸序列和编码E4ORF1多肽的核苷酸序列处于相同启动子的控制下，例如在ETS和E4ORF1序列之间具有内部核糖体进入位点序列(IRES)。
在一些实施方案中，可以使用肽模拟物。肽模拟物是设计成模拟多肽的小蛋白质样链。此类分子可以设计成模拟本发明的任何多肽(例如ETV2或E4ORF1多肽)。修饰肽以产生肽模拟物或以其他方式设计肽模拟物的各种不同方式是本领域已知的，并且可用于产生本发明多肽之一的肽模拟物。
本发明的多肽和核酸分子的处理、操作和表达可以使用分子生物学和细胞生物学的常规技术进行。此类技术是本领域公知的。例如，本领域技术人员可以参考Sambrook、Fritsch和Maniatis编著的“Molecular Cloning A Laboratory Manual，第2版，ColdSprings Harbor Laboratory Press,1989)；系列Methods of Enzymology(AcademicPress,Inc.)或指导用于处理、操作和表达核苷酸和/或氨基酸序列的合适技术的任何其他标准文本的教导。与处理或表达E4ORF1序列相关的其它方面记载于美国专利8,465,732中，其内容通过引用并入本文。
工程化内皮细胞
在一些实施方案中，本发明提供“工程化内皮细胞”。
在一些实施方案中，工程化内皮细胞是E4ORF1+工程化内皮细胞。在一些实施方案中，工程化内皮细胞是E4ORF1+ETV2+工程化内皮细胞。在一些实施方案中，工程化内皮细胞是E4ORF1+ETS+工程化内皮细胞。
在其它实施方案中，工程化内皮细胞表达一种或多种标志物。实际上，应当注意，在本文描述的涉及E4ORF1+工程化内皮细胞的所有实施方案中，作为E4ORF1+细胞的替代物，可以使用已经被这样工程化的内皮细胞(例如通过用核酸分子转染或转导，或通过用任何其它试剂例如蛋白质或化学试剂处理)，其使得它们表达一种或多种以下标志物，或者表达与非工程化内皮细胞相比(例如，与天然内皮细胞相比或与未经如此工程化但以其他方式类似处理的内皮细胞相比)升高水平的一种或多种以下标志物，例如，一种或多种以下标志物的水平高2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍。所述标志物是：整合素α11，Matrilin 2，TIMP金属肽酶抑制剂3，δ样4，弹性蛋白，Smoothelin样2，Syndecan 1，酸性钙调节蛋白(Calponin)3，蛋白C(凝血因子Va和VIIIa的灭活剂)，生长分化因子3，间隙连接蛋白α4 37kDa，具有1型血小板反应蛋白基序18的ADAM金属肽酶，白介素33，瘦蛋白受体，硫酸酯酶1，Ephrin-A1，二肽基肽酶4，胶原，VIII型，α1，趋化因子(C-C基序)配体2，软骨酸性蛋白1，半胱氨酰白三烯受体2，成纤维细胞生长因子2(碱性)，层粘连蛋白β3，CD82分子，胰岛素受体，Ephrin-B1，趋化因子(C-C基序)受体样1，间隙连接蛋白，α4，37kDa和腓骨蛋白(Fibulin)2。上述标志物及其相应的基因符号也在下表1中示出。
表1：在工程化E4ORF1+内皮细胞中上调的标志物。
*如通过RNA-Seq测定的，与第12代(P12)不表达E4ORF1的HUVEC相比，在第12代(P12)表达E4ORF1的HUVEC中的表达增加倍数。
在一些这类实施方案中，工程化内皮细胞表达或表达升高水平的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或所有29个上述标志物。在一些这类实施方案中，工程化内皮细胞表达或表达升高水平的弹性蛋白。在一些这类实施方案中，工程化内皮细胞表达或表达升高水平的弹性蛋白、蛋白C、软骨酸性蛋白1和腓骨蛋白2。在一些这类实施方案中，工程化内皮细胞表达或表达升高水平的弹性蛋白、蛋白C、软骨酸性蛋白1、腓骨蛋白2、matrilin 2、smoothelin样2、生长分化因子3、白介素33、瘦蛋白受体和半胱氨酰白三烯受体2。
工程化内皮细胞可以衍生自本领域已知的任何合适的内皮细胞来源。在一些实施方案中，内皮细胞是原代内皮细胞。在一些实施方案中，工程化内皮细胞是哺乳动物细胞，例如人或非人灵长类动物细胞，或兔、大鼠、小鼠、山羊、猪或其它哺乳动物细胞。在一些实施方案中，内皮细胞是原代人内皮细胞。在一些实施方案中，内皮细胞是脐静脉内皮细胞(UVEC)，例如人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。在一些实施方案中，内皮细胞是天然的内皮细胞。在一些实施方案中，内皮细胞是遗传修饰的内皮细胞。在一些实施方案中，工程化内皮细胞可以衍生自干细胞或祖细胞。例如，在一些实施方案中，工程化内皮细胞可以衍生自多能干细胞，例如诱导多能干细胞(iPS细胞)或胚胎干细胞(ES细胞)。在一些实施方案中，工程化内皮细胞可以衍生自内皮祖细胞。在一些实施方案中，工程化内皮细胞可以使用重编程方法从分化的非内皮细胞类型衍生，所述重编程方法例如直接重编程方法或者其中将分化的细胞重编程为较低分化的细胞类型(例如多能或专能细胞类型)、然后将较低分化的细胞随后分化为内皮细胞的方法。在一些实施方案中，工程化内皮细胞是器官特异性内皮细胞。例如，在一些实施方案中，工程化内皮细胞可以是造血***特异性内皮细胞、或神经***特异性内皮细胞、或心脏特异性内皮细胞、或肺特异性内皮细胞、或肝特异性内皮细胞、或肾脏特异性内皮细胞、或肌肉特异性内皮细胞、或软骨特异性内皮细胞或脂肪组织特异性内皮细胞。在一些这类实施方案中，所用器官特异性内皮细胞来源于要放置植入物的器官或组织。例如，在一些实施方案中，如果要将植入物植入肺组织中，或用于治疗肺缺陷，则使用的内皮细胞可以是肺特异性内皮细胞。类似地，如果要将植入物植入肝组织，或用于治疗肝脏缺陷，则使用的内皮细胞可以是肝特异性内皮细胞。可以使用的其它合适的内皮细胞包括先前描述的如美国专利号8,465,732中适于E4ORF1表达的那些，其内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，将工程化内皮细胞进行遗传修饰，使得除了本文所述的任何特定分子或标志物(例如E4ORF1)的表达以外，它们还包括一种或多种遗传修饰。例如，此类细胞可以包括已知参与或疑似参与影响内皮细胞的疾病或病症的基因的校正版本，或者任何其它基因，例如可以期望在内皮细胞中提供或使用工程化内皮细胞施用或递送的治疗有用的基因。
本发明的工程化内皮细胞可以以各种形式存在或提供。例如，在一些实施方案中，工程化内皮细胞可以包括细胞群，例如分离的细胞群。在一些实施方案中，工程化内皮细胞可以包括体外细胞群-例如要添加到植入物中的细胞群或包括在植入物内的细胞群。在一些实施方案中，工程化内皮细胞可以包括基本上纯的细胞群。类似地，在一些实施方案中，本发明的分离的植入物可以包括基本上纯的内皮细胞群。例如，在一些实施方案中，构成总细胞群的至少约50％、优选至少约75-80％、更优选至少约85-90％、最优选至少约95％的细胞将是本发明的工程化内皮细胞。在一些实施方案中，工程化内皮细胞可以以含有工程化细胞和一种或多种另外的组分的组合物的形式提供。例如，在一些实施方案中，本发明可以提供包括如本文所述的工程化内皮细胞群连同载体溶液如生理盐水溶液、细胞悬浮基、细胞培养基等的组合物。在一些实施方案中，此类组合物可以是治疗性组合物-包括工程化内皮细胞群和适合施用于受试者如人受试者的载体溶液。如果需要，可以包括其它治疗上可接受的试剂。本领域普通技术人员可以容易地根据预期用途选择要包括在治疗性组合物中的合适的试剂。
在一些实施方案中，本发明的工程化内皮细胞在使用(例如治疗使用)之前经有丝***失活，使得它们不能复制。这可以通过例如使用化学试剂如丝裂霉素C或通过照射工程化内皮细胞来实现。
生物相容性支架
在某些实施方案中，根据本发明使用的生物相容性支架可以是或可以包括下述、基本上由下述组成、或由下述组成：生物相容性的、能够被细胞浸润并适用于外科植入活体受试者的任何材料(例如包括多孔结构)。这种支架的实例包括但不限于包括下述、基本上由下述组成、或由下述组成的那些支架：脱细胞化动物组织(例如脱细胞化猪组织，例如可从Bard,Inc.获得的XenMatrix)，或一种或多种细胞外基质(“ECM”)组分，如胶原蛋白、层粘连蛋白和/或纤维蛋白。在一些实施方案中，生物相容性支架包括至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的胶原。在一些实施方案中，生物相容性支架包括至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的层粘连蛋白。在一些实施方案中，生物相容性支架包括至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的纤维蛋白。在一些实施方案中，生物相容性支架是在4℃下和/或室温(约21℃)下或两者下均为固体的生物相容性支架。在一些实施方案中，生物相容性支架不包括透明质酸。在一些实施方案中，生物相容性支架不包括超过约5％、4％、3％、2％、1％或0.5％的透明质酸。在一些实施方案中，生物相容性支架不包括Matrigel。在一些实施方案中，生物相容性支架材料可以根据其要植入的组织位置来选择，例如基于其生物力学性质或任何其它生物学特性。
植入物
本文描述的植入物包括生物相容性支架材料和工程化内皮细胞。在一些实施方案中，生物相容性支架具有三维结构，并且工程化内皮细胞在植入物内形成血管。
在一些实施方案中，植入物还可以包括除内皮细胞之外的其他细胞类型。在一些实施方案中，此类另外的细胞类型可以是干细胞或祖细胞，例如胚胎干(ES)细胞，诱导型多能干细胞(iPSC)，造血干细胞，骨干细胞，肌肉干细胞，神经干细胞，上皮干细胞，皮肤干细胞，间充质干细胞，肠干细胞，精原干细胞等。在一些实施方案中，此类另外的细胞类型可以是分化的细胞如造血细胞，骨细胞，肌肉细胞，神经细胞，上皮细胞，皮肤细胞，成纤维细胞，肠细胞，睾丸细胞等。在一些实施方案中，此类其它细胞类型可以是经遗传修饰的细胞。在一些实施方案中，此类另外的细胞类型可以是天然的(即非遗传修饰的)细胞。可以与本发明的工程化内皮细胞一起提供或使用的细胞的其它实例在美国专利8,465,732中提供，其内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，取决于植入物的预期用途，植入物可以具有任何合适的尺寸和/或形状。例如，如果植入物旨在用于替代或修复特定的组织缺损，则植入物可以配置成使得其具有适于***该组织缺损的尺寸和形状。
植入物的培养方法和制备方法
培养细胞的方法是本领域公知的，并且可以使用任何合适的细胞培养方法。例如，本发明的工程化内皮细胞或含有此类细胞的植入物可以使用已知用于培养其他内皮细胞的方法或已知用于培养E4ORF1+内皮细胞的方法来培养，例如如美国专利8,465,732中所记载的，其内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，本发明的工程化内皮细胞或含有此类细胞的植入物可在不存在血清或不存在外源生长因子的情况下，或在不存在血清和外源生长因子二者的情况下，或在不存在外源血管生成因子的情况下培养。
本发明的工程化内皮细胞也可以冷冻保存。用于细胞培养和细胞冷冻保存的各种方法是本领域技术人员已知的，例如在R.Ian Freshney("Freshney")的Culture ofAnimal Cells:A Manual of Basic Technique，第4版(2000)中记载的方法，其内容通过引用并入本文。
本发明的植入物可以通过本领域已知的任何合适的方法制备。例如，在一个实施方案中，本发明提供如本文所述的用于制备植入物的方法，包括在体外使生物相容性支架与工程化内皮细胞群接触。在一些实施方案中，初始接触步骤可以包括将生物相容性支架材料置于工程化内皮细胞培养物中或其上。在一些实施方案中，初始接触步骤可以包括将工程化内皮细胞置于生物相容性支架材料上或其中。在初始接触步骤期间，以及在其之后，工程化内皮细胞、生物相容性支架和所得的植入物可以在已知适合于内皮细胞培养的培养条件下(例如本文所述的那些)保持。生物相容性支架可以与工程化内皮细胞群一起孵育足够的时间以使内皮细胞浸润生物相容性支架，或者孵育足够的时间以使内皮细胞如所预期地在生物相容性支架内形成血管。例如，在一些实施方案中，生物相容性支架可以在使用植入物例如植入受试者之前与工程化内皮细胞群孵育约1天(24小时)、2天(48小时)、3天、4天、5天、6天或7天(1周)，或约2周、3周、4周、5周或6周或更长时间。
受试者和治疗方法
在一些实施方案中，可以植入本发明的植入物的受试者是可期望使用植入物来帮助治疗组织缺损的任何动物物种的受试者。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如选自由灵长类动物(例如人和猴)、啮齿动物(例如小鼠、大鼠和兔)、羊物种(例如绵羊和山羊)、牛物种(如奶牛)、猪物种、马科物种、猫科物种和犬科物种组成的组的哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是人。
本发明的植入物可用于治疗有需要的受试者的组织缺损。这样的受试者可具有“组织缺损”。如本文所用，术语“组织缺损”旨在涵盖组织破坏、组织损伤或组织功能障碍的各种类型的病况和类型，包括但不限于：由外伤性损伤、衰老、退行性疾病、遗传性病症、传染病、自身免疫性疾病或癌症引起的。本文提供的治疗方法可以提供或旨在实现受试者中组织缺损的替代、重建、再生、修复或补充。例如，在一个实施方案中，本文所述的植入物可用于治疗受试者的糖尿病(例如通过替代或补充缺陷型胰岛素分泌组织)或治疗神经病变。在另一个实施方案中，本文所述的植入物可用于治疗神经病变，例如通过将植入物置于受损神经附近，例如具有损伤的、有缺陷的或不存在的髓鞘的神经，此类植入物可以在其中促进神经(包括其髓鞘)的修复。
本发明的植入物可以使用本领域已知的标准外科方法或技术经外科植入有需要的受试者。例如，根据需要，根据本发明的植入物可以在组织缺损部位或靠近组织缺损部位外科植入。
在一些实施方案中，本发明的植入物含有衍生自要植入植入物的同一受试者的工程化内皮细胞-即自体细胞。在其它实施方案中，本发明的植入物含有衍生自同种异体供体受试者的工程化内皮细胞。在一些这类实施方案中，同种异体供体与将要放置植入物的受试者具有组织匹配(例如HLA匹配或MHC匹配)。在一些这类实施方案中，同种异体供体与将要放置植入物的受试者错配或部分匹配(例如HLA部分错配或MHC部分错配)。在工程化内皮细胞衍生自同种异体供体的实施方案中，可能需要用一种或多种免疫抑制剂治疗受试者，以便降低“异源”内皮细胞排斥的风险。
试剂盒
本发明还提供用于制造本文所述的植入物并用于实施本文所述的各种方法的试剂盒。这样的试剂盒可以包括本文所述的任何组分，包括但不限于核苷酸序列(例如编码E4ORF1)，工程化内皮细胞(例如E4ORF1+内皮细胞)，天然内皮细胞，用于检测工程化内皮细胞或其中表达的蛋白质或核酸分子的构件或组合物(例如核酸探针、抗体等)，用于培养工程化内皮细胞或用于维持或培养含有工程化内皮细胞、生物相容性支架材料的植入物的培养基或组合物，或其任意组合。所有此类试剂盒可以任选地包括使用说明书、容器、培养器皿等。标签可随附试剂盒，并且可以包括任何书写或记录材料，其可以是提供针对使用试剂盒内容物的指令或其他信息的电子的或计算机可读的形式(例如盘，光盘，存储芯片或磁带)。
本发明的某些方面可以在以下非限制性实施例中进一步描述。
实施例
实施例1：含有工程化内皮细胞的植入物的体外培养
如实施例3所述培养表达腺病毒E4ORF1蛋白和绿色荧光蛋白(GFP)的工程化E4ORF1+人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。将工程化E4ORF1+HUVEC在标准条件下在24孔板中铺板并允许达到汇合。使用脱细胞化猪胶原基质(XenMatrixTM Surgical Graft,Bard Davol,Inc.Warwick，RI)。胶原基质通过用剪刀或使用6mm真皮冲头(dermal punch)将基质材料切成小块来制备。两种替代方法用于接种含工程化HUVEC的胶原基质。在第一种方法中，将胶原基质直接置于在24孔板的表面上培养的工程化HUVEC的单层的顶部。在第二种方法中，将胶原基质置于24孔板的孔中，将从其培养器皿收获的工程化HUVEC置于胶原基质的顶部。观察到在两种条件下的工程化HUVEC在24小时内生长到胶原基质中，并且在试验的所有时间点(长达6周)内在胶原基质内保持存活。血管可以在用工程化内皮细胞接种的48小时内可视化，并且在试验的所有时间点(长达6周)存在。工程化E4ORF1+HUVEC形成具有开放内腔的血管结构，这在整个胶原基质中都能观察到(参见图1A)，并且其还从基质的边界突出并进入周围的培养基(参见图1B)。
实施例2：体内植入含有工程化内皮细胞的胶原基质
如实施例1所述，用工程化HUVEC接种胶原基质。用工程化HUVEC接种后，将细胞在体外培养8天至6周，随后植入小鼠(免疫受损的小鼠用于使对人内皮细胞的任何排斥反应最小化)。将小鼠麻醉并准备进行外科手术。在腹部皮肤上做了一个8mm切口。将镊子***腹肌和皮肤之间以产生将要由植入物占据的空间。每只动物接受一个“对照”植入物(包括已经在培养基中浸泡但尚未接种有内皮细胞的胶原基质材料)和一个“试验”植入物(包括工程化HUVEC)。在植入后48小时至4周收获植入物。当取出植入物时，发现试验植入物比对照植入物更强烈地附着于周围的小鼠组织。在48小时的时间点，试验植入物已经部分吻合，如通过穿透移植物的血液的存在所证明的(图2A)，而对照植入物没有(图2B)。在取出移植物期间，试验基质也显著地附着于周围组织，而没有内皮细胞的基质表现出不附着。图3示出在植入后4周与对照相比，在试验植入物中看到更高程度的血管形成。将植入物切片并进行组织学检查。似乎试验植入物比对照植入物表现出更大程度的细胞性。参见图4。
实施例3：E4ORF1+工程化内皮细胞和含有E4ORF1+工程化内皮细胞的植入物的培 养。
出于在胶原基质上培养内皮细胞的目的，从没有已知疾病的自愿供体获得人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，并用腺病毒E4ORF1转导以产生E4ORF1+HUVEC。使用本领域的方法标准将工程化HUVEC作为贴壁细胞生长。该标准包括在100％汇合时***细胞，在37℃培养，在组织培养处理的板、烧瓶或孔上扩增，并使用如下限定的培养基：补充有内皮细胞补充物(50μg/ml)、胎牛血清(FBS，终浓度：20％)、抗生素-抗真菌溶液、HEPES缓冲液(10mM)、肝素(50μg/ml)和Glutamax的培养基199。当细胞增殖时，培养基在继代培养期间更换到较大的烧瓶中或如果培养基培养超过2天时更换。
当基质水合时，内皮细胞仅与基质接触。当用胶原基质培养E4ORF1+内皮细胞时，使用培养方法的几种变体。在一种方法中，将固体胶原基质用锋利的刀具(例如剃刀刀片，解剖刀或剪刀)切成25mm2的块。在另一种方法中，将固体胶原基质用牙科冲头(dentalpunch)切成圆形片。在另一种方法中，E4ORF1+内皮细胞(EC)处于汇合单层中，以基质置于其顶部，并以充足培养基覆盖基质。EC迁移到基质中。在一种培养方法中，将基质置于具有充足培养基的孔中以覆盖基质。将E4ORF1+EC加入到含有基质的孔的培养基悬浮液中。EC在基质上附着并生长，直到接触介导的生长抑制。对于长期培养，每隔2-3天更换培养基，注意不要直接接触基质，以防血管结构破裂。在每种方法中24小时内注意到E4ORF1+EC侵袭胶原基质，越来越多的侵袭会持续数日，取决于接种的细胞数量和移植物的大小。没有注意到过度生长(定义为E4ORF1+EC以多层、球或团块生长)-与细胞在汇合处生长停滞相一致。在48小时时注意到具有血管外观的含有内腔的结构，并持续数周(图1B)。
通过将这些基质外科植入到免疫受损的NOD scidγ(NSG)小鼠(其不能对人E4ORF1+EC产生免疫应答)中进行体内实验。将麻醉的小鼠清洁、剃毛并稳定。在皮肤上做一个小的8mm切口。在闭合时***平头端的镊子，然后在皮肤和肌肉之间***后打开以产生空腔。以反方向重复此操作。然后将对照和试验基质置于这些空腔中。

Claims (92)

1.一种适于外科植入受试者的分离的植入物，其包括：(a)生物相容性支架材料和(b)设置在所述生物相容性支架材料内的血管，其中所述血管包括E4ORF1+工程化内皮细胞。
2.根据权利要求1所述的分离的植入物，其包括连接的血管的网络。
3.根据权利要求1所述的分离的植入物，其中所述血管包括毛细血管。
4.根据权利要求1所述的分离的植入物，其中所述血管具有开放的内腔。
5.根据权利要求1所述的分离的植入物，其中一个或多个所述血管突出超过所述生物相容性支架材料的边界。
6.根据权利要求1所述的分离的植入物，其中所述E4ORF1+工程化内皮细胞是E4ORF1+ETV2+。
7.根据权利要求1所述的分离的植入物，其中工程化内皮细胞表达重组ETS家族转录因子。
8.根据权利要求1所述的分离的植入物，其中工程化E4ORF1+内皮细胞是哺乳动物内皮细胞。
9.根据权利要求1所述的分离的植入物，其中工程化E4ORF1+内皮细胞是人内皮细胞。
10.根据权利要求1所述的植入物，其中工程化E4ORF1+内皮细胞衍生自人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。
11.根据权利要求1所述的分离的植入物，其中工程化E4ORF1+内皮细胞是器官特异性内皮细胞。
12.根据权利要求1所述的分离的植入物，其中工程化E4ORF1+内皮细胞衍生自要外科植入所述植入物的受试者的内皮细胞。
13.根据权利要求1所述的分离的植入物，其中工程化E4ORF1+内皮细胞衍生自具有与要外科植入所述植入物的受试者相同的MHC-或HLA-型的同种异体供体的内皮细胞。
14.根据权利要求1所述的分离的植入物，其中工程化E4ORF1+内皮细胞衍生自具有与要外科植入所述植入物的受试者部分匹配的MHC-或HLA型的同种异体供体的内皮细胞。
15.根据权利要求1所述的分离的植入物，其中工程化E4ORF1+内皮细胞衍生自与要外科植入所述植入物的受试者相比在MHC-或HLA-型方面具有差异的同种异体供体的内皮细胞。
16.根据权利要求1所述的分离的植入物，其还包括设置在所述生物相容性支架材料内的干细胞或祖细胞。
17.根据权利要求16所述的分离的植入物，其中所述干细胞或祖细胞选自造血干细胞、骨干细胞、肌肉干细胞、神经干细胞、毛囊干细胞、上皮干细胞、皮肤干细胞、间充质干细胞、肠干细胞和精原干细胞。
18.根据权利要求1所述的分离的植入物，其还包括设置在所述生物相容性支架材料内的一种或多种另外的细胞类型。
19.根据权利要求18所述的分离的植入物，其中所述另外的细胞类型选自由以下组成的组：造血细胞、骨细胞、肌细胞、神经细胞、周细胞、毛囊细胞、脂肪细胞、角质细胞、上皮细胞、皮肤细胞、成纤维细胞、肠细胞和睾丸细胞。
20.根据权利要求1所述的分离的植入物，其中所述生物相容性支架材料在4℃下是固体。
21.根据权利要求1所述的分离的植入物，其中所述生物相容性支架材料在21℃下是固体。
22.根据权利要求1所述的分离的植入物，其中所述生物相容性支架材料包括一种或多种细胞外基质分子。
23.根据权利要求1所述的分离的植入物，其中所述生物相容性支架材料包括胶原蛋白。
24.根据权利要求1所述的分离的植入物，其中所述生物相容性支架材料包括纤维蛋白。
25.根据权利要求1所述的分离的植入物，其中所述生物相容性支架材料包括层粘连蛋白。
26.根据权利要求1所述的分离的植入物，其中所述生物相容性支架材料包括脱细胞动物组织。
27.根据权利要求1所述的分离的植入物，其中所述生物相容性支架材料包括脱细胞猪组织。
28.根据权利要求1所述的分离的植入物，其中所述生物相容性支架材料不是Matrigel。
29.根据权利要求1所述的分离的植入物，其中所述生物相容性支架材料不包括透明质酸。
30.根据权利要求1所述的分离的植入物，其中所述植入物不包括血清。
31.根据权利要求1所述的分离的植入物，其中所述植入物不包括外源生长因子。
32.根据权利要求1所述的分离的植入物，其中所述植入物不包括外源血管生成因子。
33.根据权利要求1所述的分离的植入物，其中所述植入物不包括外源VEGF。
34.根据权利要求1所述的分离的植入物，其中所述植入物不包括外源FGF。
35.根据权利要求1所述的分离的植入物，其中所述植入物不包括成纤维细胞。
36.根据权利要求1所述的分离的植入物，其中所述植入物不包括成纤维细胞衍生的血管生成因子。
37.根据权利要求1所述的分离的植入物，其中所述植入物不包括成纤维细胞衍生的细胞外基质组分。
38.根据权利要求1所述的分离的植入物，其中所述植入物不包括微载体珠。
39.根据权利要求1所述的分离的植入物，其中所述植入物不包括涂布有细胞外基质分子的微载体珠。
40.一种制备适于外科植入受试者的植入物的方法，所述方法包括：在体外培养与生物相容性支架材料接触的工程化E4ORF1+内皮细胞群，直到在所述生物相容性支架材料内形成血管，从而形成包括E4ORF1+血管的植入物。
41.根据权利要求40所述的方法，其中进行所述培养，直到形成连接的血管的网络。
42.根据权利要求40所述的方法，其中进行所述培养，直到一个或多个血管突出超过所述生物相容性支架材料的边界。
43.根据权利要求40所述的方法，其中所述培养进行至少24小时。
44.根据权利要求40所述的方法，其中所述培养进行至少48小时。
45.根据权利要求40所述的方法，其中所述培养进行至少3天。
46.根据权利要求40所述的方法，其中所述培养进行至少4天。
47.根据权利要求40所述的方法，其中所述培养进行至少5天。
48.根据权利要求40所述的方法，其中所述培养进行至少1周。
49.根据权利要求40所述的方法，其中所述工程化E4ORF1+内皮细胞是E4ORF1+ETV2+。
50.根据权利要求40所述的方法，其中所述工程化E4ORF1+内皮细胞表达重组ETS家族转录因子。
51.根据权利要求40所述的方法，其中所述工程化E4ORF1+内皮细胞是器官特异性内皮细胞。
52.根据权利要求40所述的方法，其中所述工程化E4ORF1+内皮细胞是哺乳动物内皮细胞。
53.根据权利要求40所述的方法，其中所述工程化E4ORF1+内皮细胞是人内皮细胞。
54.根据权利要求40所述的方法，其中所述工程化E4ORF1+内皮细胞衍生自要外科植入所述植入物的受试者的内皮细胞。
55.根据权利要求40所述的方法，其中所述工程化E4ORF1+内皮细胞衍生自具有与要外科植入所述植入物的受试者相同的MHC-或HLA-型的同种异体供体的内皮细胞。
56.根据权利要求40所述的方法，其中所述工程化E4ORF1+内皮细胞衍生自具有与要外科植入所述植入物的受试者相同的MHC-或HLA-型的同种异体供体的内皮细胞。
57.根据权利要求40所述的方法，其中所述工程化E4ORF1+内皮细胞衍生自具有与要外科植入所述植入物的受试者部分匹配的MHC-或HLA型的同种异体供体的内皮细胞。
58.根据权利要求40所述的方法，其中所述工程化E4ORF1+内皮细胞衍生自与要外科植入所述植入物的受试者相比在MHC-或HLA-型方面具有差异的同种异体供体的内皮细胞。
59.根据权利要求40所述的方法，其中所述工程化E4ORF1+内皮细胞衍生自人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。
60.根据权利要求40所述的方法，其中所述血管包括毛细血管。
61.根据权利要求40所述的方法，其中所述血管具有内腔。
62.根据权利要求40所述的方法，其中所述生物相容性支架材料包括设置在其中的干细胞或祖细胞。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述干细胞或祖细胞选自造血干细胞、骨干细胞、肌肉干细胞、神经干细胞、上皮干细胞、皮肤干细胞、毛囊干细胞、间充质干细胞、肠干细胞和精原干细胞。
64.根据权利要求40所述的方法，其中所述生物相容性支架材料包括设置在其中的一种或多种另外的细胞类型。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述另外的细胞类型选自由以下组成的组：造血细胞、骨细胞、肌细胞、神经细胞、周细胞、毛囊、脂肪细胞、角质细胞、上皮细胞、皮肤细胞、成纤维细胞、肠细胞和睾丸细胞。
66.根据权利要求40所述的方法，其中所述生物相容性支架材料在4℃下是固体。
67.根据权利要求40所述的方法，其中所述生物相容性支架材料在21℃下是固体。
68.根据权利要求40所述的方法，其中所述生物相容性支架材料不是Matrigel。
69.根据权利要求40所述的方法，其中所述生物相容性支架材料不包括透明质酸。
70.根据权利要求40所述的方法，其中所述生物相容性支架材料包括一种或多种细胞外基质分子。
71.根据权利要求40所述的方法，其中所述生物相容性支架材料包括胶原蛋白。
72.根据权利要求40所述的方法，其中所述生物相容性支架材料包括脱细胞动物组织。
73.根据权利要求40所述的方法，其中所述生物相容性支架材料包括脱细胞猪组织。
74.根据权利要求40所述的方法，其中培养在不存在血清的情况下进行。
75.根据权利要求40所述的方法，其中培养在不存在外源生长因子的情况下进行。
76.根据权利要求40所述的方法，其中所述培养在不存在外源血管生成因子的情况下进行。
77.根据权利要求40所述的方法，其中所述培养在不存在外源VEGF的情况下进行。
78.根据权利要求40所述的方法，其中培养在不存在外源FGF的情况下进行。
79.根据权利要求40所述的方法，其中培养在不存在成纤维细胞的情况下进行。
80.根据权利要求40所述的方法，其中培养在不存在成纤维细胞衍生的血管生成因子的情况下进行。
81.根据权利要求40所述的方法，其中培养在不存在成纤维细胞衍生的细胞外基质组分的情况下进行。
82.根据权利要求40所述的方法，其中培养在不存在微载体珠的情况下进行。
83.根据权利要求40所述的方法，其中培养在不存在涂布有细胞外基质分子的微载体珠的情况下进行。
84.一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括将根据权利要求1-39中任一项所述的植入物植入所述受试者。
85.根据权利要求84所述的方法，其中所述受试者具有组织缺损，并且其中将所述植入物在所述组织缺损的部位外科植入所述受试者。
86.根据权利要求84所述的方法，其中所述工程化E4ORF1+内皮细胞是器官特异性内皮细胞，并且其中将所述植入物外科植入衍生所述器官特异性内皮细胞的器官中。
87.根据权利要求84所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物受试者。
88.根据权利要求84所述的方法，其中所述受试者是人受试者。
89.根据权利要求84所述的方法，其中所述植入物中的所述工程化E4ORF1+内皮细胞衍生自所述受试者自己的内皮细胞。
90.根据权利要求84所述的方法，其中所述植入物中的所述工程化E4ORF1+内皮细胞衍生自与受试者具有相同MHC-或HLA-型的同种异体供体的内皮细胞。
91.根据权利要求84所述的方法，其中所述植入物中的所述工程化E4ORF1+内皮细胞衍生自具有与要外科植入所述植入物的受试者部分匹配的MHC-或HLA型的同种异体供体的内皮细胞。
92.根据权利要求84所述的方法，其中所述植入物中的所述工程化E4ORF1+内皮细胞衍生自与要外科植入所述植入物的受试者相比在MHC-或HLA-型方面具有差异的同种异体供体的内皮细胞。
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