CN107228914A

CN107228914A - 一种合相色谱‑串联质谱法测定无烟气烟草制品中降烟碱对映异构体含量的方法

Info

Publication number: CN107228914A
Application number: CN201710697590.1A
Authority: CN
Inventors: 陈欢; 韩书磊; 付亚宁; 刘彤; 侯宏卫; 胡清源
Original assignee: National Tobacco Quality Supervision and Inspection Center
Current assignee: National Tobacco Quality Supervision and Inspection Center
Priority date: 2017-08-15
Filing date: 2017-08-15
Publication date: 2017-10-03

Abstract

本发明公开了一种合相色谱‑串联质谱法测定无烟气烟草制品中降烟碱对映异构体含量的方法。其特征在于：将无烟气烟草制品样品干燥、粉碎和过筛，样品经过氢氧化钠溶液浸润后，采用二氯甲烷萃取，萃取液经基质分散固相萃取净化后，使用两根手性柱串联‑合相色谱‑串联质谱法分析，采用峰面积归一化法定量检测无烟气烟草制品中S‑降烟碱和R‑降烟碱的比例。本方法提供的检测方法，样品萃取净化方法简单高效，可降低样品液对色谱柱的污染，合相色谱‑串联质谱法检测方法灵敏度高，特异性好，可排除假阳性，分析时间短，能够满足大批量无烟气烟草制品样品中降烟碱的手性分析。

Description

一种合相色谱-串联质谱法测定无烟气烟草制品中降烟碱对映异构体含量的方法

技术领域

本发明属于理化分析技术领域，具体涉及一种合相色谱-串联质谱法测定无烟气烟草制品中降烟碱对映异构体含量的方法。

背景技术

降烟碱是无烟气烟草制品中的主要生物碱之一，对无烟气烟草制品品质有重要影响，并是烟草特有亚硝胺——亚硝基降烟碱（NNN）的前体物质。降烟碱分子含有一个手性中心，所以降烟碱有两个对映体：S-(-)-降烟碱（简称S-降烟碱）和R-(+)-降烟碱（简称R-降烟碱）。根据对映异构体的特性，降烟碱的两个对映对映体可能具有完全不同的代谢机理和生理特性。因此，有必要对无烟气烟草制品中降烟碱的对映异构体含量进行分析测定。

目前，文献报道降烟碱对映异构体的测定方法主要有气相色谱-质谱联用法（GC-MS，Beiträge Zur Tabakforschung. 2013;25(7):649-659. Chirality. 1999;11(1):82-84.）、多维气相色谱-质谱联用法（MDGC-MS，J. Chromatogr. B. 2008;865(1):13-17.）、毛细管电泳法（CE，Electrophoresis. 2009;30(2):349–356.）等，但是，GC-MS和MDGC-MS需要在前处理过程中进行衍生化，费时费力，CE仅使用保留时间进行定性，定性能力相对较差，容易出现假阳性结果。因此有必要开发一种灵敏度高、精密度好、适合大批量准确定量无烟气烟草制品中S-降烟碱和R-降烟碱的方法。

发明内容

本发明的目的正是基于上述技术不足，建立了一种合相色谱-串联质谱法测定无烟气烟草制品中降烟碱对映异构体含量的方法。本方法在前处理过程中不需要衍生化过程，实现了S-降烟碱和R-降烟碱的基线分离，并使用二级质谱进行定性和定量，避免出现假阳性结果，所以，本方法具有操作简便、灵敏度高、准确定好等优点。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

将无烟气烟草制品样品干燥、粉碎和过筛，样品经过氢氧化钠溶液浸润后，采用二氯甲烷萃取，萃取液经基质分散固相萃取净化后，使用串联手性柱-合相色谱-串联质谱法分析，采用峰面积归一化法定量检测无烟气烟草制品中S-降烟碱和R-降烟碱的比例。

具体步骤如下：

1. 标准溶液的配制

称取约100.0 mg的S-(-)-降烟碱标准品，用甲醇溶液稀释定容到50 mL棕色容量瓶中，配制成浓度约为2.0 mg/mL的S-(-)-降烟碱标准储备液；称取约100.0 mg的R-(+)-降烟碱标准品，用甲醇溶液稀释定容到50 mL棕色容量瓶中，配制成浓度约为2.0 mg/mL的R-(+)-降烟碱标准储备液；利用S-(-)-降烟碱标准储备液和R-(+)-降烟碱标准储备液稀释配制S-(-)-降烟碱和R-(+)-降烟碱浓度分别为100 μg/mL和100 μg/mL的混合标准溶液

2. 无烟气烟草制品样品的混匀

将无烟气烟草制品样品置于40 ℃烘箱中，1小时后将无烟气烟草制品取出，粉碎后过0.45毫米孔径标准筛。

3. 无烟气烟草制品样品的萃取

选择正己烷、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷五种溶剂进行萃取效率的比较。结果发现，二氯甲烷对降烟碱的萃取效率最高，甲基叔丁基醚和乙酸乙酯次之，正己烷和三氯甲烷的萃取效率最差，故选择二氯甲烷为最终的萃取溶剂。

优化的萃取步骤为：

称取0.3 g已粉碎的样品于15 mL具塞离心管中，加入2.0 mL 5%的氢氧化钠溶液（质量比），涡旋1 min混匀后静置10 min浸润样品，取10 mL二氯甲烷到离心管中，并于旋涡混合器上以4000 rpm速度振荡30 min。

4. 萃取液的净化

取1.5 mL上清液于2 mL净化离心管中（内含150 mg无水硫酸镁，50mg PSA吸附剂，25mg GCB吸附剂，统称基质分散固相萃取材料），于旋涡混合器上以4000 rpm振荡2 min，以10000 rpm离心1 min。取上清液过0.45 μm有机相滤膜后进液相分析。

5. 串联手性柱-合相色谱-串联质谱法条件

分析柱1为Trefoil CEL1柱（柱长 150 mm ，内径3.0 mm ，固定相粒径2.5 µm），分析柱2为Chiralcel OD-H液相色谱柱(柱长 250 mm ，内径4.6 mm ，固定相粒径5 µm)；流动相A为：CO₂，流动相B：含0.05%异丙胺的甲醇；流速为1.0 mL/min；梯度洗脱条件为：0.0 min，97% A；0.5 min，97% A；8.0 min，92% A；12.0 min，92% A； 30.0 min，90% A。柱温40 ℃；进样室温度：10 ℃；进样体积2 μL；背压：1600 psi；ISM补偿流路流动相为含0.1%甲酸的甲醇，流速为0.3 mL/min。分析时间总计30 min。质谱条件：离子源：电喷雾源，扫描方式为正离子扫描，离子源温度为300 ℃，电喷雾电压为5000 V，雾化气压力为40 psi；检测方式：多反应监测（MRM）；MRM参数见下表1。通过对峰面积进行归一化定量S-降烟碱和R-降烟碱占总降烟碱的比例。

6. 检出限和定量限

在优化条件下，按照目标物信噪比为3时对应的浓度作为检出限，按照目标物信噪比为10时对应的浓度作为检出限。S-降烟碱的检出限和定量限分别为0.12 μg/g和0.40 μg/g，R-降烟碱的检出限和定量限分别为0.12 μg/g和0.40 μg/g。

7. 精密度

取同一无烟气烟草制品样品进行5次日内和日间平行测定，考察了本发明方法的精密度，结果见表2和表3。结果表明，无烟气烟草制品样品中S-降烟碱的日内和日间测定结果的变异系数分别为1.08%和2.45%，精密度较好。

本发明提供了一种无烟气烟草制品中降烟碱的手性分析合相色谱串联质谱法，具有以下优良效果：①首次使用合相色谱-串联质谱法检测方法测定无烟气烟草制品中降烟碱对映异构体含量，该方法与文献报道测定降烟碱对映异构体含量的方法相比，具有灵敏度高，特异性好的优点，可避免假阳性结果，且分离度好，能实现对S-降烟碱和R-降烟碱的基线分离；②通过萃取溶剂的优化，使用二氯甲烷作为萃取溶剂，萃取效率最佳；③通过萃取液的净化，可降低样品液对色谱柱的污染；④分析时间短，能够满足大批量无烟气烟草制品中降烟碱的手性分析。

附图说明

图1为不同萃取溶剂对目标化合物的萃取效率示意图。

图2为混合标准溶液的色谱图。

图3为典型无烟气烟草制品样品的色谱图。

具体实施方式

本发明通过以下具体实施例作进一步描述，但不限制本发明。

实施例1：

1. 仪器及试剂

ACQUITY UPC2超高效合相色谱仪（美国Waters公司），6410B三重串联四级杆质谱仪（美国Agilent公司），AE163电子天平（感量：0.0001 g，瑞士Mettler公司），高速粉碎机（武汉银彩科技有限公司），美国ColeparmerVotex-Genie涡旋振荡器，德国SIGMA 3-30K-高速台式冷冻型离心机。二氯甲烷（色谱纯），氢氧化钠（分析纯），甲酸（色谱纯），甲醇（色谱纯），S-降烟碱标准品，R-降烟碱标准品。

2. 样品前处理

（1）无烟气烟草制品样品的混匀：将无烟气烟草制品样品置于40 ℃烘箱中，1小时后将无烟气烟草制品取出，粉碎后过0.45毫米孔径标准筛。

（2）无烟气烟草制品样品的萃取：称取0.3 g已粉碎的样品于15mL具塞离心管中，加入2.0mL 5% 的氢氧化钠溶液，涡旋1min混匀后静置10 min浸润样品。取10 mL二氯甲烷到离心管中，并于旋涡混合器上以4000 rpm速度振荡30 min。

（3）萃取液的净化：取1.5 mL上清液于2 mL净化离心管中（内含150 mg无水硫酸镁，50 mg PSA吸附剂，25 mg GCB吸附剂），于旋涡混合器上以4000 rpm振荡2 min，以10000rpm离心1min。取上清液过0.45 μm有机相滤膜后进液相分析。

3. 标准溶液的配制

4. 仪器分析条件

分析柱1为Trefoil CEL1柱（柱长 150 mm ，内径3.0 mm ，固定相粒径2.5 µm），分析柱2为Chiralcel OD-H液相色谱柱(柱长 250 mm ，内径4.6 mm ，固定相粒径5 µm)；流动相A为：CO₂，流动相B：含0.05%异丙胺的甲醇；流速为1.0 mL/min；梯度洗脱条件为：0.0 min，97% A；0.5 min，97% A；8.0 min，92% A；12.0 min，92% A； 30.0 min，90% A。柱温40 ℃；进样室温度：10 ℃；进样体积2 μL；背压：1600 psi；ISM补偿流路流动相为含0.1%甲酸的甲醇，流速为0.3 mL/min。分析时间总计30 min。质谱条件：离子源：电喷雾源，扫描方式为正离子扫描，离子源温度为300 ℃，电喷雾电压为5000 V，雾化气压力为40 psi；检测方式：多反应监测（MRM）；MRM参数见表1。

对峰面积进行归一化定量S-降烟碱和R-降烟碱占总降烟碱的比例。

根据上述测定方法，选择5种无烟气烟草制品样品，测得S-降烟碱的比例分别为61.84%、67.28%、65.84%、62.26%和67.35%。

Claims

1.一种合相色谱-串联质谱法测定无烟气烟草制品中降烟碱对映异构体含量的方法，其特征在于：将无烟气烟草制品样品干燥、粉碎和过筛，样品经过氢氧化钠溶液浸润后，采用二氯甲烷萃取，萃取液经基质分散固相萃取净化后，使用手性柱-合相色谱-串联质谱分析，采用峰面积归一化法定量检测无烟气烟草制品中S-降烟碱和R-降烟碱的比例，具体步骤如下：

（1）标准溶液的配制：称取100.0 mg的S-降烟碱标准品，用甲醇溶液稀释定容到50 mL棕色容量瓶中，配制成浓度为2.0 mg/mL的S-降烟碱标准储备液；称取100.0 mg的R-降烟碱标准品，用甲醇溶液稀释定容到50 mL棕色容量瓶中，配制成浓度为2.0 mg/mL的R-降烟碱标准储备液；利用S-降烟碱标准储备液和R-降烟碱标准储备液稀释配制S-降烟碱和R-降烟碱浓度分别为100 μg/mL和100 μg/mL的混合标准溶液；

（2）无烟气烟草制品样品的混匀：将无烟气烟草制品样品置于40 ^oC烘箱中，1小时后将无烟气烟草制品取出，粉碎后过0.45毫米孔径标准筛；

（3）无烟气烟草制品样品的萃取：称取0.3 g已粉碎的样品于15 mL具塞离心管中，加入2.0 mL 5% 的氢氧化钠溶液，涡旋1 min混匀后静置10 min浸润样品；取10 mL二氯甲烷到上述具塞离心管中，并于旋涡混合器上以4000 rpm速度振荡30 min；

（4）萃取液的净化：取1.5 mL萃取上清液于2 mL内含有基质分散固相萃取材料的净化离心管中，于旋涡混合器上以4000 rpm振荡2 min，以10000 rpm离心1 min，取上清液过0.45 μm有机相滤膜后进液相分析；

（5）串联手性柱-合相色谱串联质谱法条件：分析柱1为Trefoil CEL1柱，柱长 150 mm，内径3.0 mm ，固定相粒径2.5 µm，分析柱2为Chiralcel OD-H液相色谱柱，柱长 250 mm ，内径4.6 mm ，固定相粒径5 µm；流动相A为：CO2，流动相B：含0.05%异丙胺的甲醇；流速为1.0 mL/min；梯度洗脱条件为：0.0 min，97% A；0.5 min，97% A；8.0 min，92% A；12.0 min，92% A； 30.0 min，90% A；柱温40 ℃；进样室温度：10 ℃；进样体积2 μL；背压：1600 psi；ISM补偿流路流动相为含0.1%甲酸的甲醇，流速为0.3 mL/min；分析时间总计30 min；质谱条件：离子源：电喷雾源，扫描方式为正离子扫描，离子源温度为300 ℃，电喷雾电压为5000V，雾化气压力为40 psi；检测方式：多反应监测（MRM）；通过对峰面积进行归一化定量S-降烟碱和R-降烟碱占总降烟碱的比例。

2.根据权利要求1所述的合相色谱-串联质谱法测定无烟气烟草制品中降烟碱对映异构体含量的方法，其特征在于：步骤（4）中所述的基质分散固相萃取材料含：150 mg无水硫酸镁，50 mg PSA吸附剂，25 mg GCB吸附剂。