CN107227306A - 一种具有样本保存和灭活功能的拭子洗脱液 - Google Patents

一种具有样本保存和灭活功能的拭子洗脱液 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有样本保存和灭活功能的拭子洗脱液，是由异硫氰酸胍、乙二胺四乙酸、缓冲液、二硫苏糖醇、表面活性剂、玻璃珠或聚丙烯塑料珠以及去离子水组成，其中洗脱液中各组分的含量为20%～55%[w/v]异硫氰酸胍，1mM‑25mM乙二胺四乙酸，20‑100mM缓冲液，二硫苏糖醇1%‑5%[w/v]，1%‑5%表面活性剂，玻璃珠或聚丙烯塑料珠3‑10粒。本发明配制的洗脱液具有成本低，性能稳定，配制的洗脱液可以保存DNA/RNA,实现拭子样本洗脱和常温保存运输：并且可以灭活病原体，具有样本的灭活作用，可大大降低实验室暴露感染的风险，由于洗脱液中用到的异硫氰酸胍是常见的核酸提取用化学组分，所以还不影响后续核酸提取。

Description

一种具有样本保存和灭活功能的拭子洗脱液
技术领域
本发明涉及生物样本处理液，尤其是涉及一种具有样本保存和灭活功能的拭子洗脱液。
背景技术
为准确诊断疾病，采用拭子采集标本（微生物、脱落的细胞或分泌物等），并对标本进行保存、培养、分离等进一步处理，是临床医学检查常用的方法。
核酸样本DNA/RNA降解是PCR检测中常见问题。目前常见的样品处理液一般为生理盐水或PBS洗脱液，经过这些洗脱液处理后的核酸样本保存过程中，病原体会破裂，释放出核酸，但生理盐水和PBS洗脱液无法抑制DNase/RNase 活性，核酸很容易被降解，从而影响检测结果的准确性。实际临床核酸检测中，部分标本还需要寄送到第三方检验中心进行检测，运输过程中需要维持低温保存冷链运输，代价比较高。因此标本的常温运输保存也是需要解决的问题。
检测过程中还会遇到一些有生物危害性的样本，比如呼吸道传播疾病或接触传播疾病，这些样品采集后，医护人员在检验操作过程中容易带来实验室暴露感染。所以如何实现这些有生物危害性的样本采集后就被灭活，以减少实验室检验人员感染的风险，也是需要解决的问题。
中国发明专利《一种宫颈脱落细胞保存液》（CN200810200008.7）公开了一种保存液，包括以下组分及含量(重量)：醇类20％-50％；抗聚集试剂15％-50％；缓冲液5％-10％；离子强度维持试剂1％-20％；抗微生物试剂0.01％-0.5％；粘液溶解试剂0.1-5％；清洁剂0-0.5％。该专利的主要功能可使细胞在体外液体悬浮液环境中保持细胞形态。但是，该保存液对样本中的RNA样本无保存效果；同时，由于细胞未被灭活，细胞中的病毒有可能在操作中传染给检验操作人员。
在该技术领域，还有采用Trizol 保存液的，该保存液可以较好的保存RNA样本，也可通过加热灭活病毒，但由于存在有毒挥发气体，对操作者有危害。
除此之外，还有采用RNase inhibitor 酶类来保存RNA样本，但是成本较贵，其应用受限。
综上所述，开发一种能够有效实现拭子样本的常温保存运输，阻止Dnase/RNase降解核酸，灭活病原体，并且不影响后续检测的拭子洗脱液，对拭子样本的分子生物学研究和临床上的应用非常重要，也是目前迫切需要解决的重要技术难题。
发明内容
本发明的目的在于针对上述现有技术存在的缺陷而提供一种具有样本保存和灭活功能的拭子洗脱液。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
本发明所述的具有样本保存和灭活功能的拭子洗脱液，是由异硫氰酸胍、乙二胺四乙酸、缓冲液、二硫苏糖醇、表面活性剂、玻璃珠或聚丙烯塑料珠以及去离子水组成，其各组分的含量为：
20%～55%[w/v]异硫氰酸胍，1mM-25mM乙二胺四乙酸，20-100mM缓冲液，二硫苏糖醇1%-5%[w/v]，1%-5%表面活性剂，玻璃珠或聚丙烯塑料珠3-10粒。
所述缓冲液可以为Tris缓冲液，也可以为磷酸盐缓冲***。
所述表面活性剂为Triton X-100、SDS、Tween 20、Triton X-100、NP_40、十二烷基肌氨酸钠、CTAB中任意一种或其中2-3种的组合，浓度为1-5%。优选的表面活性剂为TritonX-100。
本发明的优点在于该洗脱液具有成本低，性能稳定，洗脱后样本可室温保存运输，并且具有样本的灭活作用，可大大降低实验室暴露感染的风险。
本发明配制的洗脱液可以保存DNA/RNA,实现拭子样本洗脱和常温保存运输：采用异硫氰酸胍作为离液剂和强变性剂，用于变性裂解细胞，具有抑制Dnase/RNase活性功能，可用于保存DNA和RNA不被酶降解；玻璃珠或聚丙烯塑料珠可以通过物理涡旋撞击作用，促进细胞从拭子上脱落；乙二胺四乙酸和缓冲液维持了DNA/RNA的缓冲环境，维持核酸的稳定性。
本发明配制的洗脱液可以灭活病原体：高浓度20%～55%[w/v]异硫氰酸胍作为离液剂和蛋白强变性剂，用于变性裂解细胞；二硫苏糖醇被用于蛋白质中二硫键的还原，促进细胞破裂；表面活性剂（如Triton X-100）是一种非离子型表面活性剂（或称去污剂），它能溶解脂质，以增加抗体对细胞膜的通透性，促进细胞破裂，从而灭活病原微生物。
本发明配制的洗脱液不影响后续核酸的提取：由于洗脱液中用到的异硫氰酸胍是常见的核酸提取用化学组分，所以不影响后续核酸提取。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做更加详细的说明。
实施例1
1、拭子洗脱液的配制：
取合适体积的烧杯，按照下表1配方称量试剂并依次加入烧杯，添加去离子水400ml，加热搅拌溶解，恢复室温后，用盐酸调节pH至6.0，补足去离子水至1L，搅拌后，制备得到1L 拭子洗脱液。
表1
2、标本采集处理：取临床PCR鉴定甲流阳性的患者拭子标本，病毒滴度有代表性，高中低（Realtime PCR检测CT值分别为26 、29、 32左右）各1例，分别浸入含8ml拭子洗脱液的10ml离心管中；
在涡旋仪上涡旋震荡5s，丢弃拭子，洗脱物分装2ml/支；
将洗脱物分别放置于37℃，常温，4℃，-20℃四个温度下进行热稳定性考核。
洗脱物37℃ 条件放置1天，2天，3天，6天，7天，进行核酸提取和Realtime PCR扩增检测。对多天的检测CT值进行汇总比较，确定样本是否稳定。
洗脱物常温条件放置1天，2天，3天，6天，7天，进行核酸提取和Realtime PCR扩增检测。对多天的检测CT值进行汇总比较，确定样本是否稳定。
洗脱物4℃条件放置1周，2周，3周，4周，5周，进行核酸提取和Realtime PCR扩增检测。对多天的检测CT值进行汇总比较，确定样本4℃条件放置是否稳定。
洗脱物-20℃条件放置1月，2月，3月，6月，7月，进行核酸提取和Realtime PCR扩增检测。对多天的检测CT值进行汇总比较，确定样本-20℃条件放置是否稳定。
3、样本提取和Realtime PCR检测：
采用Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit 货号：80204
甲流Realtime PCR检测试剂采用自配试剂，荧光定量PCR体系：1*PCR buffer、2.5mM镁离子、0.5U Taq DNA聚合酶、200μM dNTP，上、下游引物（SEQ ID NO 1-2）量均为200nM，检测探针 FAM BHQ1 标记（SEQ ID NO 3）量为100nM。其引物序列见下表2。
表2
实时荧光PCR设备采用安捷伦Mx3005P。
结果分析阈值线：300。
基线：3-15。
4、结果：
37℃保存7天以内，样本无明显降解，实验数据见下表3。
表3
注：第一天有异常数据，剔除。
常温保存7天以上样本无明显降解，实验数据见下表4。
表4
4℃保存5周以上，样本无明显降解，实验数据见下表5。
表5
-20℃保存半年以上，样本无明显降解，实验数据见下表6。
表6
通过上述考核，证明本发明配制的拭子洗脱液可以保存DNA/RNA,实现拭子样本洗脱和常温的保存。
5、本发明洗脱液的病毒灭活效果实验：
对拭子洗脱液进行稀释（稀释100倍），以去除对细胞的抑制效果，取200ul进行接种；
采用友康 NC0201 MDCK无血清细胞培养基配合NC0204 流感病毒分离无血清培养基，进行毒株活性验证。24h后，均无细胞病变，说明病毒已灭活。
6、上表3、4、5、6中拭子洗脱物提取和Realtime PCR结果正常，说明本发明配制的洗脱液对后续提取和Realtime PCR实验无影响。
实施例2
1、拭子洗脱液制备
取合适体积的烧杯，按照下表7配方称量试剂并依次加入烧杯，添加去离子水400ml，加热搅拌溶解，恢复室温后，用盐酸调节pH至6.0，补足去离子水至1L，搅拌后，即制备得到1L拭子洗脱液。
表7
2、标本采集处理：取临床PCR鉴定支原体阳性的患者拭子标本，病毒滴度有代表性，高中低（样本Realtime检测CT值分别为23、26、30左右）各1例，分别浸入含8ml拭子洗脱液的10ml离心管中；
在涡旋仪上涡旋震荡5s，丢弃拭子，分装2ml/支；
将洗脱物分别放置于37℃，常温，4℃，-20℃进行稳定性考核。
洗脱物37℃ 条件放置1天，2天，3天，6天，7天，进行核酸提取和Realtime PCR扩增检测。对多天的检测CT值进行汇总比较，确定样本是否稳定。
洗脱物常温条件放置1天，2天，3天，6天，7天，进行核酸提取和Realtime PCR扩增检测。对多天的检测CT值进行汇总比较，确定样本是否稳定。
洗脱物4℃条件放置1周，2周，3周，4周，5周，进行核酸提取和Realtime PCR扩增检测。对多天的检测CT值进行汇总比较，确定样本4℃条件放置是否稳定。
洗脱物-20℃条件放置1月，2月，3月，6月，7月，进行核酸提取和Realtime PCR扩增检测。对多天的检测CT值进行汇总比较，确定样本-20℃条件放置是否稳定。
3、样本提取和Realtime PCR检测：
采用Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit 货号：80204
支原体Realtime PCR检测试剂采用自配试剂，荧光定量PCR体系：1*PCR buffer、2.5mM镁离子、0.5U Taq DNA聚合酶、200μM dNTP，上、下游引物（SEQ ID NO 4-5）量均为200nM，检测探针 FAM BHQ1 标记（SEQ ID NO 6）量为100nM，其引物序列见下表8。
表8
实时荧光PCR设备采用：安捷伦Mx3005P
结果分析阈值线：300。
基线：3-15。
4、结果
37℃保存7天以上，样本无明显降解，实验数据见下表9。
表9
常温保存7天以上，样本无明显降解，实验数据见下表10。
表10
4℃保存5周以上，样本无明显降解，实验数据见下表11。
表11
-20℃保存半年以上，样本无明显降解，实验数据见下表12。
表12
5、本发明洗脱液的病毒灭活效果实验：
对拭子洗脱液进行稀释（稀释100倍），以去除对细胞的抑制效果，取200ul进行接种。
采用郑州安图生物工程股份有限公司生产的M0502 肺炎支原体培养试剂，进行毒株活性验证。48h后，均无病毒生长，说明支原体已灭活。
6、上表9、10、11、12中拭子洗脱物提取和Realtime PCR结果正常，说明本发明配制的洗脱液对后续提取和Realtime PCR实验无影响。

Claims (4)

1.一种具有样本保存和灭活功能的拭子洗脱液，其特征在于：是由异硫氰酸胍、乙二胺四乙酸、缓冲液、二硫苏糖醇、表面活性剂、玻璃珠或聚丙烯塑料珠以及去离子水组成，其各组分的含量为：
20%～55%异硫氰酸胍，1mM-25mM乙二胺四乙酸，20-100mM缓冲液，1%-5%二硫苏糖醇，1%-5%表面活性剂，玻璃珠或聚丙烯塑料珠3-10粒。
2.根据权利要求1所述的具有样本保存和灭活功能的拭子洗脱液，其特征在于：所述缓冲液为Tris缓冲液或磷酸盐缓冲***。
3.根据权利要求1所述的具有样本保存和灭活功能的拭子洗脱液，其特征在于：所述表面活性剂为Triton X-100、SDS、Tween 20、Triton X-100、NP_40、十二烷基肌氨酸钠、CTAB中任意一种或2-3种的组合，浓度为1-5%。
4.根据权利要求3所述的具有样本保存和灭活功能的拭子洗脱液，其特征在于：所述表面活性剂为Triton X-100。
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