CN104263721A - 一种保护痰液中核酸(dna和rna)的痰纸及核酸提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物学领域中如何保存痰液样本中核酸(DNA和RNA)完整性的方法。本发明提供了一种痰纸，可在常温下方便贮存痰液样本中核酸。痰纸上浸润了核酸保护液，可作用于痰液样本中的核酸酶，使酶失活，有效保护痰液中的DNA和RNA免受降解，便于保存和运输痰液样本。在室温(25～35℃)下，痰液样本中的核酸可稳定保存7～14天。本发明同时提供了相应的核酸提取方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物学领域中如何保存痰液样本中核酸(DNA和RNA)完整性的方法，具体地涉及在常温下方便贮存痰液样本中核酸的痰纸和核酸提取方法。
技术背景
在人体气管、支气管的内壁都覆盖着一层粘膜，在粘膜下层含较多的粘液腺和浆液腺。正常情况下，杯状细胞和腺体分泌少量粘液覆盖在粘膜层表面，对粘膜起保护作用，可保持气管粘膜的湿润，以便把吸入气管、支气管内的尘埃颗粒、细菌等粘附住，阻挡其进入肺组织深处。当气管、支气管和肺受到有害因素的刺激或致病菌感染而发生炎症时，呼吸道的粘膜充血、水肿，大量炎性细胞浸润，血管扩张，渗出增加，粘膜层的杯状细胞和粘膜下层的腺体增生肥大，粘液分泌大量增多，产生一些变性坏死组织细胞，潴留在支气管内，粘液和这些变性坏死的组织细胞就构成了痰。正常人一般不咯痰或仅有少量泡沫样痰或粘液样痰，当呼吸道有病变时，呼吸道粘膜受刺激，分泌物增多，痰也增多。病变包括支气管扩张症、肺脓肿、肺结核、肺癌等；痰液中包含粘液、异物、病原微生物，各种炎症细胞及坏死脱落的粘膜上皮细胞、肿瘤细胞等成分。
痰液中的核酸(DNA和RNA)是呼吸道恶性肿瘤和呼吸道感染等疾病的分子诊断的重要标本。从肺癌患者痰液脱落细胞中提取核酸(DNA和RNA)，通过PCR、荧光定量PCR等分子生物学检测手段进行基因检测，可用于肺癌病人的普查与诊断。但是，痰液中含有高活性的核酸分解酶(DNA酶和RNA酶)，导致痰液中的DNA和RNA很容易被降解。DNA和RNA降解可导致分子检测准确性和灵敏度降低，在降解严重的情况下甚至不能用于分子诊断，这直接限制了通过痰液检测呼吸道肿瘤或感染等疾病的临床应用，降低了痰液这一重要临床样本在疾病诊断中的价值。因此，发明一种能用于常温下贮存痰液，保护痰液中DNA和RNA不受降解的方法，对临床应用痰液进行分子检测具有重要的应用价值。本发明提供了一种保护痰液中核酸(DNA和RNA)的痰纸及核酸提取方法。在痰纸上浸润了核酸保护液，其中含有螯合剂、还原剂和缓冲液，提供保存核酸的最适宜环境。将肺癌病人的痰液包裹在痰纸内，在吸附痰液中水分的同时，可有效保护痰液中的游离核酸和脱落细胞中的核酸。
发明内容
本发明提供了一种保存痰液样本的一次性痰纸，用于解决痰液的方便储存及痰液中核酸的保护问题。
痰纸预先经核酸保护液浸润处理，核酸保护液由螯合剂、还原剂和缓冲液等成分组成。病人将痰吐到痰纸上，痰纸在吸收水分的同时，核酸保护液的成分作用于痰液中的核酸酶，使酶失活，有效保护痰液中的DNA和RNA免受降解，便于保存和运输痰液样本。提取核酸时，将痰纸加到特定裂解液中，震荡30min，再将裂解液加到核酸吸附柱上，经过特定洗涤液(WB1、WB2)洗涤后，用洗脱液将核酸从吸附柱上洗脱下来。提取出的核酸(DNA和RNA)包括了痰液中的游离核酸和细胞/组织中的核酸。
核酸保护液的成分包括但不限于DTT、EDTA、Tris-HCl，在配方中的浓度见表1：
表1：核酸保护液配方
核酸保护液中，DTT浓度为5mmol/L～500mmol/L，其中最适浓度为115mmol/L～135mmol/L；EDTA浓度为10mmol/L～1.0mol/L，其中最适浓度为720mmol/L～850mmol/L；Tris-HCl浓度为10mmol/L～200mmol/L，其中最适浓度为50mmol/L～150mmol/L，最适pH为pH5.8～pH7.2。
裂解液中含有DTT、吐温、曲拉通、盐酸胍、EDTA，在配方中的浓度见表2：
表2：裂解液配方
裂解液中，DTT浓度为5mmol/L～500mmol/L，其中最适浓度为215mmol/L～260mmol/L；EDTA浓度为10mmol/L～1.0mol/L，其中最适浓度为180mmol/L～285mmol/L；吐温-20浓度为0.5％～10％，其中最适浓度为3.5％～4.2％；曲拉通X-100浓度为0.5％～10％，其中最适浓度为3.8％～4.5％；盐酸胍浓度为2mol/L～6mol/L，其中最适浓度为4mol/L～6mol/L。
洗涤液WB1的成分及配方见表3：
表3：洗涤液WB1配方
洗涤液WB2的成分及配方见表4：
表4：洗涤液WB2配方
痰纸的形式可以为下列三种方式之一，但不限于这三种形式：
1.方形或圆形纸片，正面浸润核酸保护液，反面为防水材料，病人吐痰至正面后自行折叠包装。
2.信封式，内部浸润核酸保护液，外部为防水材料，病人吐痰至信封里，自粘合封口。
3.盒式，在扁平形状的纸盒里放有浸润DNA保护液的纸片(一片在盒底，一片在盖子上，充分包裹痰液)，病人吐痰至盒中，关上即可。
本发明具有以下优势和应用价值：
①一次性使用，操作简单，使用方便，无污染危险；
②有效保护痰液中游离核酸及脱落细胞中核酸分子的完整性和稳定性；
③在室温(25～35℃)下，痰液样本中的核酸可稳定保存7～14天，在样品运输过程中不需要采取低温保护措施；
④从痰液样本中提取核酸的方法操作简便，提取出的核酸质量高，可用于临床检验。
具体实施方式
下面以具体实施例对本发明做进一步的详细说明。应当理解的是，具体实施例仅是对本发明做出更清楚的说明，而不是对本发明的限制。
实施例：
在医院取得存储于痰纸中的病人的痰液样本10份，样本在室温(25～35℃)下保存了1～14天不等。
将含有痰液的痰纸用手术剪剪碎，置于试管中，按1:5的比例加入裂解液，在摇床上震荡30min。将核酸吸附柱置于收集管中，将上述裂解液全部转移到核酸吸附柱中，室温离心(12,000rpm，1min)，弃滤液。向核酸吸附柱中加入500μL的洗涤液WB1，室温离心(12,000rpm，1min)，弃滤液。在核酸吸附柱中加入500μL洗涤液WB2，室温离心(12,000rpm，1min)，弃滤液。将核酸吸附柱置于新的1.5mL无核酸酶污染离心管中室温静置或超净工作台风干3-5min，以彻底挥发残余的乙醇。向吸附柱柱膜中央上方小心加入50μL经65℃温浴的无核酸酶污染的纯水，室温静置3～5min，离心(12,000rpm，1min)，洗脱液即为核酸溶液。
检测核酸溶液的浓度和纯度，结果如下表所示：
| 浓度(ng/μL) | 260/280 | 260/230 | |
| 样本1 | 124.6 | 1.86 | 1.77 |
| 样本2 | 203.2 | 1.75 | 1.84 |
| 样本3 | 89.3 | 1.87 | 1.72 |
| 样本4 | 167.3 | 1.80 | 1.76 |
| 样本5 | 72.8 | 1.72 | 1.65 |
| 样本6 | 267.7 | 1.83 | 1.88 |
| 样本7 | 184.8 | 1.88 | 1.74 |
| 样本8 | 112.5 | 1.86 | 1.78 |
| 样本9 | 137.5 | 1.77 | 1.81 |
| 样本10 | 218.4 | 1.96 | 1.85 |
Claims (7)
1.一种痰纸，包裹痰液后可在常温下保护痰液中的核酸(DNA和RNA)不被降解。
2.如权利要求1所述的痰纸上浸润了核酸保护液，成分包括DTT(DL-Dithiothreitol，二硫苏糖醇)、EDTA(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，乙二胺四乙酸及其二钠盐)、Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液)。
3.如权利要求2所述的核酸保护液，DTT浓度为5mmol/L～500mmol/L，其中最适浓度为115mmol/L～135mmol/L；EDTA浓度为10mmol/L～1.0mol/L，其中最适浓度为720mmol/L～850mmol/L；Tris-HCl浓度为10mmol/L～200mmol/L，其中最适浓度为50mmol/L～150mmol/L，最适pH为pH5.8～pH7.2。
4.如权利要求1所述的痰纸，由正反面构成，正面浸润核酸保护液，反面为防水材料。
5.如权利要求1所述的痰纸，在外形上可以为方形或圆形纸片、信封式或盒式。
6.一种用于提取保存于痰纸上的痰液样本核酸的裂解液，成分包括DTT(DL-Dithiothreitol，二硫苏糖醇)、EDTA(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，乙二胺四乙酸及其二钠盐)、吐温-20(Tween-20，Polyethylene glycol sorbitan monolaurate)、曲拉通X-100(Triton X-100,t-Octylphenoxypolyethoxyethanol)和盐酸胍(Guanidine Hydrochloride)。
7.如权利要求6所述的裂解液，DTT浓度为5mmol/L～500mmol/L，其中最适浓度为215mmol/L～260mmol/L；EDTA浓度为10mmol/L～1.0mol/L，其中最适浓度为180mmol/L～285mmol/L；吐温-20浓度为0.5％～10％，其中最适浓度为3.5％～4.2％；曲拉通X-100浓度为0.5％～10％，其中最适浓度为3.8％～4.5％；盐酸胍浓度为2mol/L～6mol/L，其中最适浓度为4mol/L～6mol/L。
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