CN107213201A - 桑叶、石榴皮降血糖药用活性物质水解工艺及降血糖药 - Google Patents

桑叶、石榴皮降血糖药用活性物质水解工艺及降血糖药 Download PDF

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Abstract

本发明公开了桑叶、石榴皮降血糖药用活性物质提取工艺，包括桑叶降血糖药用活性物质提取方法和石榴皮降血糖药用活性物质提取方法，石榴皮降血糖药用活性物质提取方法，依次包括以下步骤：烘干、粉碎、加蒸馏水超声波提取上清液，加入单宁酶液和磷酸盐，离心，得到反应液沉淀和上清液分别处理并烘干后研磨成粉。将桑叶和石榴皮活性物质按1:0.5‑1:2的比例进行配比，充分混合均匀。本发明的优点是：以石榴皮为原料，获得高鞣花酸含量并具有强清除自由基能力的药用活性成分，与以桑叶为原料提取得到的高含量α‑葡糖苷酶抑制剂的药用活性成分合理配比后，能够降低糖尿病患者空腹血糖、餐后血糖，并减小自由基对胰岛β细胞的氧化损伤，改善糖尿病的并发症状。

Description

桑叶、石榴皮降血糖药用活性物质水解工艺及降血糖药
技术领域
本发明涉及桑叶、石榴皮降血糖药用活性物质水解工艺及降血糖药。
背景技术
糖尿病是一种常见的以慢性高血糖和糖脂代谢、蛋白质代谢紊乱为主要特点的内分泌疾病，其发病原因主要为胰岛素分泌绝对不足和胰岛抵抗。胰岛素不足时，血清葡萄糖含量持续增高，超过肾脏的重吸收能力，致使大量葡萄糖随尿***，引起渗透性利尿，导致机体脱水，脑细胞失水可引起脑功能紊乱直至昏迷，且由于糖尿病病人存在糖的利用障碍，转而通过分解脂肪产生能量，伴随着脂肪分解，酮体生成增加，导致糖尿病酮症酸中毒(杨轩璇.中药降糖药理作用研究进展[J]，河北中医，2004；26(4)：305-308)。研究显示，氧化应激与糖尿病的形成有密切联系，氧化应激产生过量的自由基会导致胰岛β细胞功能损伤，胰岛素分泌量不足及外周胰岛素抵抗，诱发糖尿病的形成，并引起糖尿病神经病、糖尿病视网膜病、糖尿病心脑血管疾病等多种并发症(Selvaraju V,Joshi M,Suresh S,Sanchez JA,Maulik N,Maulik G.Diabetes,oxidative stress,molecular mechanism,andcardiovascular disease--an overview.ToxicolMech Methods 2012；22(5):330–335.)。因此治疗糖尿病，除了要控制血糖之外，抑制自由基过量产生而导致的组织细胞氧化损伤也十分必要。
桑叶作为一味传统中药在古代就被用来治疗消渴症，《本草纲目》明确记载桑叶“煎之代茗，能止消渴”。现代药理学研究发现桑叶中的多糖、黄酮、生物碱等成分具有降血糖的作用，其中生物碱的降血糖作用最显著，它可显著抑制α-糖苷酶活性，降低碳水化合物的转化吸收(原爱红，马骏，蒋晓峰，等.桑叶中糖苷酶抑制活性组分的筛选及体外活性研究[J].同济大学学报(医学版),2005,26(4):8-11.)。桑叶生物碱中多种已知化合物的降血糖效果已经被诸多报道证实(You-Gui Li,Dong-FengJi,Shi Zhong,Tian-Bao Lin,Zhi-QiangLv,Gui-Yan Hu&Xin Wang.1-deoxynojirimycin inhibits glucose absorptionand accelerates glucose metabolism in streptozotocin-induced diabeticmice.Scientific reports,2013；3:1377；Li Y-G,Ji D-F,Zhong S,Lv Z-Q,Lin T-B。You-Gui Li,Dong-FengJi,Shi Zhong,Zhi-QiangLv,Tian-Bao Lin.Cooperative Anti-Diabetic Effects of Deoxynojirimycin-Polysaccharide by Inhibiting GlucoseAbsorption and Modulating Glucose Metabolism in Streptozotocin-InducedDiabetic Mice[J].Plos One,2013,8(6):e65892.)。
石榴皮中多酚化合物鞣花酸已被证实具有很强的抗氧化能力，能够体外清除·OH、超氧阴离子、DPPH·，抑制脂质过氧化，在体内能够降低氧化应激小鼠的肝脏和血液中脂质过氧化标志物丙二醛(MDA)的含量，提高肝脏和血液中总抗氧化能力(T-AOC)，同时提高肝脏中抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活力(Sun YQ,Tao X,Men XM,Li YM,Xu ZW,W T.In vitro and in vivo antioxidant activities ofthree major polyphenolic compounds in pomegranate peel:ellagic acid，punicalin，and punicalagin.Journal of Integrative Agriculture,2017)。但是石榴皮多酚中游离鞣花酸的含量较低，要获得高含量鞣花酸的石榴皮多酚需使石榴皮多酚中鞣花单宁水解释放鞣花酸，提高鞣花酸的含量。
因此本发明建立了石榴皮多酚鞣花酸的水解工艺，并利用桑叶生物碱的α-糖苷酶抑制剂作用及石榴皮多酚中鞣花酸的清除自由基的能力，将两种药用成合理配比组成配方，一方面降低餐后血糖，另一方面减少自由基导致的胰岛β细胞及其他组织器官氧化损伤，达到治疗糖尿病综合症的目的。
发明内容
本发明的目的在于提供桑叶、石榴皮降血糖药用活性物质水解工艺及降血糖药，通过两类药用活性物质的相互协同作用，在降低糖尿病患者餐后血糖，改善糖耐量的同时，修复受损的胰岛β细胞功能，达到治疗糖尿病综合症的作用。
为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：桑叶、石榴皮降血糖药用活性物质提取工艺，包括桑叶降血糖药用活性物质提取方法和石榴皮降血糖药用活性物质提取方法，所述桑叶降血糖药用活性物质提取方法，依次包括以下步骤：
A.采摘：采摘桑叶，每年5月至10月；
B.干燥：将采摘的桑叶干燥，干燥温度不大于50℃；
C.粉碎：粉碎粒度30目至80目；
D.加入酒精，然后超声波提取：酒精浓度50-70％，料液的重量比为1：30-50，提取时间4-6小时，提取温度30-50℃，超声功率：1000-1300W，提取完成后细筛过滤去除滤渣，得到提取液进行8000-10000rpm离心，得到上清液；
E.将D步骤产生的上清液旋蒸去除酒精，离心收集上清液，上清液用酸型阳离子交换树脂吸附12-24小时，自来水冲洗去杂后，树脂用0.25-0.5mol/L的氨水洗脱，收集洗脱液旋蒸去除氨水，浓缩至小体积后离心得上清夜；
F.重复步骤E，将上清液用强酸型阳离子交换树脂吸附2-4小时，自来水冲洗去杂后，树脂用0.25-0.5mol/L的氨水洗脱，收集洗脱液旋蒸去除氨水，浓缩至小体积后冷冻或喷雾干燥，得到桑叶生物碱的原料粉1；
所述石榴皮降血糖要用活性物质提取方法，依次包括以下步骤：
G.采摘：采摘桑叶，每年5月至10月；
H.干燥：将采摘的桑叶干燥，干燥温度不大于50℃；
I.粉碎：粉碎粒度30目至80目；
J.加入酒精，然后超声波提取：酒精浓度50-70％，料液的重量比为1：30-50，提取时间4-6小时，提取温度30-50℃，超声功率：1000-1300W，提取完成后细筛过滤去除滤渣，得到提取液进行8000-10000rpm离心，得到上清液；
K.将D步骤产生的上清液旋蒸去除酒精，离心收集上清液，上清液用酸型阳离子交换树脂吸附12-24小时，自来水冲洗去杂后，树脂用0.25-0.5mol/L的氨水洗脱，收集洗脱液旋蒸去除氨水，浓缩至小体积后离心得上清夜；
L.重复步骤E，将上清液用强酸型阳离子交换树脂吸附2-4小时，自来水冲洗去杂后，树脂用0.25-0.5mol/L的氨水洗脱，收集洗脱液旋蒸去除氨水，浓缩至小体积后冷冻或喷雾干燥，得到桑叶生物碱的原料粉1；
所述石榴皮降血糖药用活性物质提取方法，依次包括以下步骤：
a)采摘成熟石榴果实，剥下果皮于不大于50℃条件下干燥；
b)将干燥石榴皮粉碎，过30目至80目筛；
c)提取：石榴皮粉按1:30-1:50(w/v)加入蒸馏水，超声功率：1000-1300W，60℃-80℃提取4-6小时；提取完成后真空抽滤除去滤渣，收集富含多酚的上清液；
d)将c步骤中的多酚上清液中按50:1-100:1(v/v)的比例加入10-40U/L单宁酶液，并用磷酸盐缓冲液调节酸碱度至pH5-pH5.5，37℃-45℃反应过夜；
e)将d步骤中反应液8000-1000r/min离心，倾出上清液，沉淀用水洗涤后烘干保存，倾出的上清液85-100℃水浴中5-15分钟灭活单宁酶，8000-1000r/min离心，弃去蛋白沉淀，上清液用弱极性大孔树脂吸附过夜，蒸馏水冲洗去除缓冲盐、糖类等杂质，树脂用80-95％乙醇洗脱，收集洗脱液旋转蒸发去掉酒精，浓缩至小体积后烘箱烘干或冷冻干燥得到干燥固体，该固体与前述烘干的沉淀合并，共同于研磨仪中磨成细粉，该细粉即为石榴皮多酚的原料粉2。
采用桑叶、石榴皮降血糖药用活性物质提取工艺得到的活性物质制作降血糖药，将原料粉1、原料粉2按1:0.5-1:2的比例进行配比，充分混合均匀。
与现有技术相比，本发明的优点是：以石榴皮为原料，获得具有清除自由基能力强的多酚鞣花酸，与以桑叶为原料提取得到的高含量α-葡糖苷酶抑制剂合理配比后，使其协同发挥作用，开发出新的降糖药物。该产品能够降低糖尿病患者空腹血糖、餐后血糖，并减小自由基对胰岛β细胞的氧化损伤，改善糖尿病的并发症状。本发明所用植物材料资源丰富、价格低廉，提取制作工艺简单，提取溶剂为水，纯化洗脱液为乙醇，安全环保，适宜于工业化生产。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步说明：
图1为采用本工艺生产的药剂对小鼠糖耐量的影响对比图；
图2为采用本工艺生产的药剂对STZ诱导损伤的胰岛β细胞保护作用对比图；
图3本工艺生产的药剂对STZ诱导损伤的胰岛β细胞保护作用显微镜图；
图4为本工艺生产的药剂对DPPH自由基的清除作用。
具体实施方式
桑叶、石榴皮降血糖药用活性物质提取工艺，包括桑叶降血糖要用活性物质提取方法和石榴皮降血糖要用活性物质提取方法，所述桑叶降血糖要用活性物质提取方法，依次包括以下步骤：
A.采摘：采摘桑叶，每年5月至10月；
B.干燥：将采摘的桑叶干燥，干燥温度不大于50℃；
C.粉碎：粉碎粒度30目至80目；
D.加入酒精，然后超声波提取：酒精浓度50-70％，料液的重量比为1：30-50，提取时间4-6小时，提取温度30-50℃，超声功率：1000-1300W，提取完成后细筛过滤去除滤渣，得到提取液进行8000-10000rpm离心，得到上清液；
E.将D步骤产生的上清液旋蒸去除酒精，离心收集上清液，上清液用酸型阳离子交换树脂吸附12-24小时，自来水冲洗去杂后，树脂用0.25-0.5mol/L的氨水洗脱，收集洗脱液旋蒸去除氨水，浓缩至小体积后离心得上清夜；
F.重复步骤E，将上清液用强酸型阳离子交换树脂吸附2-4小时，自来水冲洗去杂后，树脂用0.25-0.5mol/L的氨水洗脱，收集洗脱液旋蒸去除氨水，浓缩至小体积后冷冻或喷雾干燥，得到桑叶生物碱的原料粉1；所述石榴皮降血糖要用活性物质提取方法，依次包括以下步骤：
a)采摘成熟石榴果实，剥下果皮于不大于50℃条件下干燥；
b)将干燥石榴皮粉碎，过30目至80目筛；
c)提取：石榴皮粉按1:30-1:50(w/v)加入蒸馏水，超声功率：1000-1300W，60℃-80℃提取4-6小时；提取完成后真空抽滤除去滤渣，收集富含多酚的上清液；
d)将c步骤中的多酚上清液中按50:1-100:1(v/v)的比例加入10-40U/L单宁酶液，并用磷酸盐缓冲液调节酸碱度至pH5-pH5.5，37-45℃反应12-24h；
e)将d步骤中反应液8000-1000r/min离心，倾出上清液，沉淀用水洗涤后烘干保存，倾出的上清液85-100℃水浴中5-15分钟灭活单宁酶，8000-1000r/min离心，弃去蛋白沉淀，上清液用弱极性大孔树脂吸附过夜，蒸馏水冲洗去除缓冲盐、糖类等杂质，树脂用80-95％乙醇洗脱，收集洗脱液旋转蒸发去掉酒精，浓缩至小体积后烘箱烘干或冷冻干燥得到干燥固体，该固体与前述干燥沉淀合并，共同于研磨仪中磨成细粉，该细粉即为石榴皮多酚的原料粉2。
采用桑叶、石榴皮降血糖药用活性物质提取工艺得到的活性物质制作降血糖药，将原料粉1、原料粉2按1:0.5-1:2的比例进行配比，充分混合均匀。
采用上述工艺生产的原料粉可以选自以下剂型：片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、口服液、混悬剂、溶液剂。有效成分含量：桑叶生物碱≥20％，鞣花酸含量≥20.0％。以下是对采用本工艺生产的原料进行药理药效实验。
1.试验目的
观察本工艺生产的药剂对小鼠糖耐量的影响、对STZ诱导损伤的胰岛β细胞保护作用及对自由基的清除作用，为本工艺生产的药剂降糖作用提供初步的实验依据。
2.受试药物
本工艺生产的药剂片原料，形状：棕色粉末，批号：170321，贮存方法：避光、干燥、常温(25℃以下)保存，配制方法：临用前在用0.9％生理盐水溶解至所需浓度。
3.试验动物
品种品系：C57/B6小鼠，级别：SPF级，性别：雌性，体重：18-20g，数量：50只，来源：中国科学院上海实验动物中心/上海斯莱克实验动物有限公司[生产许可证：SCXK(沪)2012-0005]。
4.实验条件
温度：22±1℃，湿度：50-70％，光照：150-200Lx，12小时明暗交替，噪音<50dB。饮水：自来水置于饮水瓶中自由饮用。饲料：全价营养颗粒饲料。饲养方式：自由饮食，小鼠饲养笼中给予充足的饲料和水，每笼饲养8只小鼠。
5.试剂与仪器
5.1试剂
蔗糖(中国医药上海化学试剂公司)；链脲佐菌素(STZ)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)购自美国sigma公司；血糖试剂条(美国强生公司)；胰岛β细胞株INS-1(中国科学院上海细胞库)。胎牛血清(杭州民康生物技术有限公司)；RPMI 1640培养基(杭州昊天生物技术有限公司)；DMSO(中国医学科学院生物工程研究所)；台盼蓝染色液(北京索莱宝科技有限公司)；水溶性维生素E(日本东京化工有限公司)。
5.2仪器设备
SpectraMax M5多功能酶标仪，美国分子仪器公司；OneTouchR Ultra血糖仪，强生(上海)医疗器材有限公司；CountStar细胞计数仪，上海睿钰生物科技有限公司；CO2培养箱，美国Therom公司；超净工作台，新加坡Esco公司。
6.试验方法
6.1小鼠筛选
取体重为18-20g的雌性C57/B6小鼠，禁食不禁水12小时，筛选空腹血糖在4-6mmol/L的糖尿病小鼠20只。
6.2糖耐量实验
试验小鼠禁食不禁水12小时后尾静脉取血，用OneTouchR Ultra血糖仪测定小鼠的空腹血糖值。本工艺生产的药剂组口服给予药剂50mg/kg，对照组口服给予相等剂量的生理盐水溶液，30分钟过后各组即时口服给予0.3g/ml的蔗糖溶液(用生理盐水配制)0.1ml/10g，测定给糖后30min、60min、120min的血糖。
6.3胰岛β细胞保护作用
将胰岛β细胞INS-1以1*105个/ml的密度接种于24孔板中，每孔250μl。实验组加入不同剂量本工艺生产的药剂溶液，每孔250μl使本工艺生产的药剂终浓度分别为0.125、1.25μg/ml，空白对照组加入同体积RPMI 1640完全培养液，每组设6复孔。
另外，实验孔加入16mM STZ溶液125μL，同时加入0.125、1.25μg/mL本工艺生产的药剂溶液125μL，每个浓度设6个复孔，并设正常对照组(细胞，未加STZ)、STZ损伤模型组(细胞，加STZ，不加药物)。培养箱中培养48h后，每孔弃去培养液，加入PBS洗涤细胞，0.25％胰酶消化，收集细胞，离心弃去上清液，加入500μL PBS，吹打均匀，即为细胞悬液。20μL台盼蓝染料与20μL细胞悬液混匀，用CountStar细胞计数仪进行细胞计数。
6.4DPPH自由基清除试验
依据用无水乙醇配制0.25mg/mL的DPPH自由基溶液，4℃避光保存。将待测试剂用DMSO稀释成60、40、20、10和5mg/L共5个梯度浓度，向96孔酶标板的微孔中分别加入100μL被测液和100μL自由基溶液，37℃孵育30min后，测定516nm处OD值。以无水乙醇代替自由基溶液作为本底对照，以DMSO代替被测液作为空白对照。根据下面公式计算自由基清除率：DPPH自由基清除率＝[1－(OD样品－OD本底)/OD空白]×100％
7.数据处理
用SPSS12软件进行统计分析，所有数据以均数±标准差表示，计量资料应用t检验评价试验结果。
8试验结果
8.1本工艺生产的药剂对糖尿病小鼠糖耐量的影响
从图1结果可见，与对照组相比，本工艺生产的药剂量组小鼠在口服给予蔗糖后血糖和血糖曲下面积均明显降低(P<0.01)。
8.2本工艺生产的药剂对胰岛β细胞的影响
由图2、图3可知，STZ可显著损伤胰岛β细胞INS-1，本工艺生产的药剂对STZ损伤的胰岛β细胞INS-1具有明显的保护作用，活细胞数量显著高于STZ损伤组(P<0.01)，且有随着剂量增加而提高的趋势，发挥这一作用可能是因为本工艺生产的药剂具有显著的清除自由基的功能。显微观察与细胞计数测定结果基本一致，如图3所示，正常对照组INS-1细胞扁平，贴壁牢固，呈不规则多边形；STZ致INS-1细胞数量减少，形状变圆，贴壁不牢，萎缩脱落；本工艺生产的药剂可减轻STZ对INS-1细胞的损伤，细胞数量增加，贴壁生长，细胞形态明显改善趋向正常。
注：与STZ模型组比较，**P<0.01。
8.3本工艺生产的药剂对自由基的清除作用
由图4可以看出，本工艺生产药剂对DPPH自由基有很强的清除作用，与常用的抗氧化剂水溶性维生素E相当。优越的清除自由基能力可能是本试剂能够保护胰岛β细胞的重要原因之一。
以上所述仅为本发明的具体实施例，但本发明的技术特征并不局限于此，任何本领域的技术人员在本发明的领域内，所作的变化或修饰皆涵盖在本发明的专利范围之中。

Claims (2)

1.桑叶、石榴皮降血糖药用活性物质提取工艺，其特征在于：包括桑叶降血糖要用活性物质提取方法和石榴皮降血糖要用活性物质提取方法，所述桑叶降血糖要用活性物质提取方法，依次包括以下步骤：
A.采摘：采摘桑叶，每年5月至10月；
B.干燥：将采摘的桑叶干燥，干燥温度不大于50℃；
C.粉碎：粉碎粒度30目至80目；
D.加入酒精，然后超声波提取：酒精浓度50-70％，料液的重量比为1：30-50，提取时间4-6小时，提取温度30-50℃，超声功率：1000-1300W，提取完成后细筛过滤去除滤渣，得到提取液进行8000-10000rpm离心，得到上清液；
E.将D步骤产生的上清液旋蒸去除酒精，离心收集上清液，上清液用酸型阳离子交换树脂吸附12-24小时，自来水冲洗去杂后，树脂用0.25-0.5mol/L的氨水洗脱，收集洗脱液旋蒸去除氨水，浓缩至小体积后离心得上清夜；
F.重复步骤E，将上清液用强酸型阳离子交换树脂吸附2-4小时，自来水冲洗去杂后，树脂用0.25-0.5mol/L的氨水洗脱，收集洗脱液旋蒸去除氨水，浓缩至小体积后冷冻或喷雾干燥，得到桑叶生物碱的原料粉1；
所述石榴皮降血糖药用活性物质提取方法，依次包括以下步骤：
a)采摘成熟石榴果实，剥下果皮于不大于50℃条件下干燥；
b)将干燥石榴皮粉碎，过30目至80目筛；
c)提取：石榴皮粉按1:30-1:50(w/v)加入蒸馏水，超声功率：1000-1300W，60℃-80℃提取4-6小时；提取完成后真空抽滤除去滤渣，收集富含多酚的上清液；d)将c步骤中的多酚上清液中按50:1-100:1(v/v)的比例加入10-40U/L单宁酶液，并用磷酸盐缓冲液调节酸碱度至pH5-pH5.5，37℃-45℃反应过夜；
e)将d步骤中反应液8000-1000r/min离心，倾出上清液，沉淀用水洗涤后烘干保存，倾出的上清液85-100℃水浴中5-15分钟灭活单宁酶，8000-1000r/min离心，弃去蛋白沉淀，上清液用弱极性大孔树脂吸附过夜，蒸馏水冲洗去除缓冲盐、糖类等杂质，树脂用80-95％乙醇洗脱，收集洗脱液旋转蒸发去掉酒精，浓缩至小体积后烘箱烘干或冷冻干燥得到干燥固体，该固体与前述烘干的沉淀合并，共同于研磨仪中磨成细粉，该细粉即为石榴皮多酚的原料粉2。
2.采用如权利要求1所述桑叶、石榴皮降血糖药用活性物质提取工艺得到的活性物质制作降血糖药，其特征在于：将原料粉1、原料粉2按1:0.5-1:2的比例进行配比，充分混合均匀。
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