CN107208112A - 用于预防或降低细菌和真菌病原体对作物植物的感染的方法和组合物 - Google Patents

用于预防或降低细菌和真菌病原体对作物植物的感染的方法和组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN107208112A
CN107208112A CN201580073784.3A CN201580073784A CN107208112A CN 107208112 A CN107208112 A CN 107208112A CN 201580073784 A CN201580073784 A CN 201580073784A CN 107208112 A CN107208112 A CN 107208112A
Authority
CN
China
Prior art keywords
plant
nucleic acid
infection
acid molecules
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201580073784.3A
Other languages
English (en)
Inventor
D·W·加布里埃尔
S·张
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Florida
University of Florida Research Foundation Inc
Integrated Plant Genetics Inc
Original Assignee
University of Florida Research Foundation Inc
Integrated Plant Genetics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Florida Research Foundation Inc, Integrated Plant Genetics Inc filed Critical University of Florida Research Foundation Inc
Publication of CN107208112A publication Critical patent/CN107208112A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8281—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for bacterial resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)

Abstract

本发明教导了可用于治疗、预防或治愈活体植物的病原体感染的方法和组合物。具体而言，本发明教导了增强植物对病原体相关分子模式的响应的方法。本文所述的方法和组合物对治疗活体营养型病原体(包括韧皮部杆菌(Liberibacter))是有效的。具体而言，该组合物和方法可用于保护植物免受细胞内和细胞间的细菌和真菌攻击和感染，包括Bcl‑2相关抗凋亡基因6(BAG6)基因的沉默。

Description

用于预防或降低细菌和真菌病原体对作物植物的感染的方法 和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年11月25日提交的美国临时申请62/084,372的优先权，其通过提述以其整体并入本文。
电子提交文本的说明
电子提交的文本文件的内容通过提述以其整体并入本文：序列表的计算机可读形式的副本(文件名：UFFL077WO_ST25.txt，创建日期：2015年11月25日，文件大小72.9千字节)。
技术领域
本发明涉及用于预防、降低或消除细菌和真菌病原体对作物植物的感染的方法和组合物。
背景技术
所有动物和植物细胞都具有高度调控的细胞***程序，其被设计来限制对一个细胞或一群细胞的损伤从而不影响整个生物体。例如，这就是细胞在晒伤造成的辐射损伤后死亡的原因；否则，辐射损伤会引起可能导致癌症的突变，或导致具有严重老化的外观和性能的皮肤组织。这种***程序在全部生物体中都受到严格控制，并需要多种因素的组合来共同触发细胞死亡程序。一旦开始，其是不可逆转的。
一些病原体已经进化出机制来避免触发细胞死亡程序，从而绕过重要的植物防御。需要一种重新控制细胞死亡防御机制的解决方案来应对这些病原体的出现。
发明概述
本发明教导了可用于保护植物免受细胞内和细胞间的细菌和真菌攻击和感染的组合物和方法，包括BAG6基因的沉默。
本发明涉及用于预防、降低或消除细菌和真菌病原体对作物植物的感染的方法和组合物。
具体而言，本公开教导了使用RNA干扰(RNAi)和反义RNA(aRNA)方法二者的去除天然抗凋亡蛋白阻断的潜力，所述天然抗凋亡蛋白阻断特异性抑制针对病原体的植物凋亡响应。更具体地，本发明教导了对BAG6同源物的基因特异性靶向。在一个实施方案中，特异性靶标为柑橘类(citrus)BAG6同源物(CtBAG6)，更具体地基于在克莱门氏小柑橘(Clementine)基因组(clementine 0.9_012925m，SEQ ID NO:8)中发现的名为CtBAG6C的完整DNA序列。在另一个实施方案中，可以使用甜橙基因组同源物(orange1.1g046468m)，因为orange DNA1.1g046468m片段与clementine 0.9_012925m在DNA水平具有98.1％的同一性。因此，在一些实施方案中，从Carrizo、Hamlin或Valencia或任何其他柑橘类来源的PCR克隆策略，可能可用于鉴定用于进行沉默的CtBAG6同源物。
本文还教导了通过抑制BAG6同源物来保护植物免受活体营养型细菌和真菌引起的感染。更具体地教导了保护柑橘细胞免受活体营养型的感染。更具体地教导了保护柑橘韧皮部免受Las的感染。
本文还教导了通过使用已用本发明的方法沉默的砧木(rootstock)，来保护非转基因的嫁接的接穗。在一些实施方案中，本发明教导了RNAi可以从转基因砧木穿越嫁接部到达非转基因接穗，从而避免需要接穗转化，并降低销售可能散落转基因花粉的转基因植物和/或销售转基因水果所带来的调控负担。此外，公开了一种RNA移动前导体，其赋予将反义RNA(aRNA)从转基因砧木穿越嫁接部移动到非转基因接穗的能力。尽管目前认为RNAi和aRNA两者通过激活相同的通路起作用，但是其过程导致对靶基因的相同沉默效果的程度不同(differing magnitude)。
本文还教导了基于韧皮部特异性基因表达的沉默构建体，其：1)导致将工程化的沉默保持在仅限于韧皮部，以及2)允许从韧皮部扩散到叶肉和表皮细胞。
在一些实施方案中，本发明教导了抑制、预防或降低植物的细菌或真菌感染的方法，包括表达基于BAG6蛋白或核酸序列的反义或RNA干扰构建体。
在一些实施方案中，本发明教导了通过使用AtBag6或CiBag6(SEQ ID NO:1)或SEQID NO:8，或由与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:8的预测肽序列具有至少70％的氨基酸序列相似性的氨基酸序列编码的蛋白或蛋白片段，来鉴定BAG6家族基因的方法。在一些实施方案中，本发明教导了分离的核酸分子并将其用于控制植物疾病的目的，所述核酸分子编码与CiBag6(SEQ ID NO:1)或SEQ ID NO:8同源性的至少15个连续碱基对。在其它实施方案中，本发明的方法和组合物可用于治疗、降低或消除柑橘类植物中的疾病。
在一些实施方案中，本发明教导了下调BAG6基因来治疗由活体营养型植物病原体引起的疾病。在具体实施方案中，由本发明的方法和组合物治疗的疾病是由韧皮部杆菌(Liberibacter)引起的。在一些实施方案中，通过本发明的方法和组合物治疗的疾病是由感染柑橘类植物的韧皮部杆菌引起的。在一些实施方案中，本发明的韧皮部杆菌为韧皮部杆菌亚洲种(Ca.Liberibacter asiaticus(Las))。
在一些实施方案中，本发明教导了本发明的分离的核酸分子可操作地连接至编码内质网(ER)驻留信号序列的核酸分子。
在一些实施方案中，本发明教导了本发明的分离的核酸分子可操作地连接至编码一个或多个表达控制元件的核酸分子。在一些实施方案中，本发明的核酸使用CaMV 35S或AtSuc2启动子表达。在一些实施方案中，本发明教导了用于表达本发明教导的核酸的载体。
在一些实施方案中，本发明教导了被转化以包含至少一种本发明的核酸分子的宿主细胞。在一些实施方案中，本发明的宿主细胞是真核或原核宿主细胞。
在一些实施方案中，本发明提供了增强植物对感染的免疫响应的方法，所述方法包括下调BAG6基因的表达，其中与具有未改变的BAG6基因表达的对照植物相比，所述植物响应于PAMP而具有增加的NDR1表达。
在一些实施方案中，本发明教导了增强植物对感染的免疫响应的方法，所述方法包括下调BAG6基因的表达，其中与具有未改变的BAG6基因表达的对照植物相比，所述植物响应于PAMP暴露而具有增加的NDR1表达。
在一些实施方案中，本发明教导了与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:8具有至少90％序列同一性的BAG6基因的下调。在一些实施方案中，本发明教导了反义RNA用于下调BAG6基因的用途。在一些实施方案中，本发明教导了RNAi用于下调BAG6基因的用途。
在一些实施方案中，本发明的方法增加了针对至少一种活体营养型病原体的植物抗性。在一些实施方案中，本发明的活体营养型病原体为韧皮部杆菌。
在一些实施方案中，本发明教导了包含构建体的重组或转基因植物或其部分，所述构建体包含能够引发RNA干扰并下调与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:8具有至少90％序列同一性的BAG6基因的多核苷酸，其中所述重组植物表现出对PAMP引发的增强的响应。在其它实施方案中，本发明提供来源于转基因植物的转基因植物细胞、转基因种子和子代植物及其部分，其包含重组核酸构建体，所述重组核酸构建体包含核酸分子，所述核酸分子包含可操作地连接至异源性启动子的来自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:8的至少18个连续核苷酸，其在被转录时降低植物中的BAG6基因的表达。
在其它实施方案中，本发明教导了具有重组砧木和未转化的接穗的嫁接植物。
附图简述
图1.用于沉默CiBag6基因的构建体的示意图。Carrizo Cibag6cDNA图示在构建体上。构建体pIPG1150和pIPG1160为反义(aRNA)，构建体pIPG1157、pIPG1159和pIPG1174为反向重复构建体。仅使用CiBag6的5'非翻译区(5'-UTR)的一部分(标记为“TR”)来构建pIPG1157、pIPG1159和pIPG1174。如所示使用了CaMV 35S启动子(35S)和拟南芥(Arabidopsis)蔗糖转运蛋白AtSuc2基因启动子(Suc2)。另外，如所示使用了104核苷酸移动前导体(ML)来构建pIPG1160，并使用了从来自pCAMBIA2301的uidA基因的5'末端取得的两个uidA片段(标记为“GUS frag.1”，516bp和“GUS frag.2”，1848bp)。最后，如所示，使用来自pCAMBIA的190bp的过氧化氢酶内含子(“内含子”)构建pIPG1174。
图2.通过qPCR测量的在不同转基因系中的CiBAG6C表达水平。为了确定使用的各种沉默构建体是否实际上沉默了转基因Carrizo系中天然的CiBAG6C表达，基于CiBAG6C序列(但在克隆并用于沉默目的的区域之外)设计了DNA引物。cDNA由已用DNA酶(其获取自所使用的每个转化的植物系)处理的RNA提取物制备。NT为非转基因对照。
图3.Las鞭毛蛋白-22引发的植物基础防御响应。为了确定与基础植物防御响应持续相关的数个基因是否受到沉默CiBAG6C的影响，使用了已知可用于检测已知在柑橘类中响应PAMP诱导物的三种基因的PCR引物(发病原相关1或PR1；增强的疾病易感性1或EDS1，以及非种族特异性疾病抗性1或NDR1)。通过qPCR检测上述三种防御响应基因的每一种在柑橘类中的表达水平。为了诱发柑橘类植物防御响应，使用Las鞭毛蛋白22(Las flg22)作为接种Las的代替物(proxy)。将接种了水(NT CK)的非转基因(NT)Carrizo中的防御响应与均接种了Las flg22的NT Carrizo和CtBAG6沉默的Carrizo系中的防御响应进行比较。对照还包括确定未接种Las flg22的作为对照的NT Carrizo和CtBAG6沉默系二者中的PR1、EDS1和NDR1的水平。在接种后24小时(24hpi)和接种后48小时(48hpi)取得样品。
发明详述
凋亡
I型程序性细胞死亡(PCD)或凋亡是在植物和动物细胞中发现的遗传程序性的和高度调控的细胞死亡机制，其允许受损的细胞***。凋亡对于消除可能损害整个生物体的功能的受损或被感染的细胞极其重要。典型的凋亡引发因素是能够损伤细胞或其DNA内容物的环境损害或应激。在对应激特别是对引起线粒体损伤的应激的应答(Portt等，2011)中，产生包括超氧阴离子、过氧化氢、一氧化氮和游离羟化物自由基的活性氧(Reactiveoxygen species,ROS)。ROS产生是动物和植物细胞中抵御生物病原如细菌和真菌的第一道防线。ROS也是能够引发凋亡的主要信号之一。除了ROS产生之外，应激还激活蛋白“Bax”和神经鞘脂“神经酰胺(ceremide)”的产生，这三种都是直接的促凋亡信使。这三个主要的促凋亡信使能相互独立地发挥作用，因为它们的任一种(Bax、ROS或神经酰胺)的水平的增加都足以引发凋亡，但最常见的是它们共同作用。
从植物细胞死亡受益的病原体，如疫霉属(Phytopthora)、罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)、假单胞菌属(Pseudomonas)和木杆菌属(Xyella)的生活方式为死体营养型；即，它们杀死宿主细胞以提供营养物质来支持在植物群体中的生长。这样的病原体可能对抑制凋亡(I型)或坏死(III型)程序性细胞死亡的影响不大(Portt等，2011)。其他病原体，例如专性寄生真菌(锈菌和霉菌)和一些细菌如根瘤菌(Rhizobium)为活体营养型，必须使用吸器或侵染线(infection thread)来建立密切的细胞膜与膜的接触。
用于控制感染的程序性细胞死亡
韧皮部杆菌是活体营养型的终极形式，其完全生活在活的宿主细胞内并被宿主细胞的细胞质包围。对于活体营养型，预计宿主细胞死亡会严重限制植物活体(in planta)的生长。对必须完全生活在活的韧皮部细胞中的韧皮部杆菌而言，如果它们的韧皮部宿主细胞就这么死亡了，它们将别无选择。活体营养型病原体通常具有可用于抑制凋亡或坏死性程序性细胞死亡的多重机制。在死体营养型病原体(依赖于杀死植物细胞从而以内容物为食的那些)的情况下，抑制宿主细胞死亡导致营养物质的否决(denial)，结果为产生抗性。死体营养型病原体天然地引发PCD。
韧皮部杆菌和其他活体营养型细菌
相比之下，原养型病原体依赖于功能完全的活细胞来生存。例如，韧皮部杆菌属的全部种和株，都在植物中完全活在活的植物韧皮部细胞中。描述的第一个种是黄龙病(HLB)的致病因子，韧皮部杆菌亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus，Las)，黄龙病通常称为柑橘类“绿化”病。HLB对柑橘类是致死性的，是三大最具损害性的柑橘类疾病之一。描述的第二个种是韧皮部杆菌非洲种(Ca.L.africanus，Laf)，发现于非洲，第三个是韧皮部杆菌美洲种(Ca.Liberibacter americanus，Lam)，发现于巴西。全部三种都导致柑橘类中的HLB。除三种与HLB相关的柑橘类韧皮部杆菌，还描述了三种非柑橘类的韧皮部杆菌菌种。韧皮部杆菌茄科植物种(Ca.L.solanacearum,Lso)已鉴别为美国、墨西哥、危地马拉、洪都拉斯和新西兰的马铃薯(“Zebra chip”)、番茄(“psyllid yellows”)和其他茄科作物的严重疾病致病原(Hansen等,2008；Abad等,2009；Liefting等,2009；Secor等,2009)。最近，发现Lso的不同单倍型感染瑞典、挪威、芬兰、西班牙和加那利群岛的胡萝卜(Alfaro-Fernandez等，2012a,2012b Munyaneza等，2012a,2012b；Nelson等，2011)。第五种韧皮部杆菌，韧皮部杆菌欧洲种(Ca.L.europaeus(Leu))最近发现于梨衰退植原体(pear declinephytoplasma)的载体，即木虱，梨木虱(Cacopsylla pyri)中。最后，第六种韧皮部杆菌，Liberibacter crescens(Lcr)最近在从患病的山番木瓜(Babaco)分离后进行了表征。除Lcr不是已知的病原体外，全部的其他所述韧皮部杆菌均为病原性的且必须通过特定的昆虫注入活的植物细胞内。此外，病原性韧皮部杆菌仅可在特定的昆虫和植物细胞内生存；作为专性寄生虫，其并不具有游离的存活状态---它们是极端活体营养型。
作为普通活体营养型的一例，引起柑橘溃疡病的柑橘黄单胞菌(Xanthomonascitri)侵入叶片内的空气空间，并依赖于诱导活细胞中的细胞***以破坏叶片表面(Brunings和Gabriel，2003)。显然，对于活体营养型，宿主细胞死亡预计将严重限制在植物中的生长。对必须完全生活在活的韧皮部细胞中的韧皮部杆菌而言，如果它们的韧皮部宿主细胞就这样死亡，它们将别无选择。
避免程序性细胞死亡的机制
Las和Lam的基因组不同(与其它的比较)在于，Las具有4个拷贝的过氧化物酶(Zhang等，2011)，而Lam具有2个(Wulff等，2014)。它们是关键的溶源性转换基因(赋予定殖到植物或昆虫的能力)。使用Las和Lam(Lso也可能)两者，这些基因以拷贝数在质粒原噬菌体上扩增，以增加转录本拷贝数，并因此增加蛋白水平(Zhang等，2011)。过氧化物酶降解活性氧(ROS)如过氧化氢。ROS产生是昆虫和植物宿主抵抗微生物的主要防御之一。由于韧皮部杆菌定殖于活的韧皮部细胞并在植物细胞质中增殖，因此对韧皮部杆菌而言，降解ROS的能力是生存的关键问题。
过氧化物酶也抑制PCD，并且由于ROS是PCD的强促凋亡诱导剂，所以，特别是在某些营养缺乏下，吸收和降解ROS的能力是事关生存的问题，其原因仅是保持其宿主细胞存活。由于韧皮部杆菌能够占据明显体积的细胞质，因此，吸收和降解ROS的能力可能是抑制柑橘细胞凋亡的关键。Lam导致比Las多更多的疾病，却总是以显著更低的滴度存在(Lopes等，2009)。这可能是四个过氧化物酶的活性允许了Las的更高滴度，并且其与所述更高滴度共同允许了对ROS更大的总吸收和失活，降低了ROS诱导的对柑橘细胞的促凋亡作用。
植物病原体提供一系列由植物检测并能引发PCD的分子信号。植物PCD***上也有内置的制动(built in brakes)，并且在最近的人工抑制细胞死亡程序的成功尝试中，其中一些已经在转基因植物中得以开发利用。活体营养型对引发PCD的避免涉及通过随着时间演变进行消除，直到可能的最大程度，产生“病原体相关分子模式”(PAMP)。PAMP被植物检测为外来分子，并在植物中引发称为“天然免疫”的强大防御响应。
先天免疫包括ROS的产生，ROS包括超氧化物阴离子、过氧化氢、一氧化氮和羟化物自由基。ROS响应应激而产生，特别是引起线粒体损伤的应激(Portt等，2011)。ROS产生是动物和植物细胞中抵御生物病原如细菌和真菌的第一道防线。ROS也是能够引发凋亡的主要信号之一。Las和Lam二者的基因组序列与和它们最近的根瘤菌属亲属物种(基因组大小>6.4Mb)相比，在大小上高度地减小(均为1.26Mb)；显然，尽管二者都编码鞭毛蛋白的结构基因，但Las和Lam二者均表现为缺乏鞭毛(一种已知的PAMP)。此外，Lam缺乏制备脂多糖(LPS)所需的大多数基因，而脂多糖是一种特别有效的PAMP和整合至大多数革兰氏阴性细菌的外膜的重要防御性屏障分子。
程序性细胞死亡的植物调控因子
在转基因植物中表达时，抗凋亡蛋白具有不同的且通常特异性的抗凋亡作用。编码这些抗凋亡因子的许多基因的过表达可以预防凋亡，并因此保护细胞免受生物和非生物应激的影响，所述许多基因包括编码多种分子伴侣、热休克蛋白和ROS清除剂，如超氧化物歧化酶和过氧化物酶的基因。Bcl-2家族是充分表征的一组“核心”抗凋亡调节因子，具有很强的通用效果；这些蛋白质抑制Bax的产生，并且不影响ROS的产生。Bcl-2蛋白如果过表达，则广泛抑制植物中由生物和非生物应激二者引起的凋亡。例如，抗凋亡基因bcl-xL(源自鸡)和ced-9(源自秀丽隐杆线虫(caenorhabditis elegans))的表达在番茄中阻断凋亡，并增强对病毒诱导的坏死和非生物应激的耐受性(Xu等，2004)。同样，抗凋亡基因bcl-2(源自人)和op-iap(源自杆状病毒)的表达，在烟草中阻断凋亡并赋予对几种死体营养型真菌病原体的抗性(Dickman等，2001)。迄今为止未发现Bcl-2的植物同源物。
还报道了碱性(而非酸性)的发病原相关(PR)蛋白的抗凋亡作用，并且它们中的许多都影响生物和非生物应激二者诱导的反应。例如，当来自辣椒的碱性PR-1蛋白在转基因烟草中过表达时显示出增强重金属耐受性，并且提供显著更高的抗疫霉属、罗尔斯通氏菌属和丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)的抗性(Sarowar等，2005)。与对照系相比，在所有情况下，野生型或生物应激型转基因系中的坏死大大降低。显然，由这些病原体引起的坏死并不是致病酶的直接作用，而是引发PCD的间接作用导致了坏死。同样，当来自葡萄的碱性PR-1蛋白在转基因烟草中过表达时显示出提供用丁香假单胞菌(P.syringae)挑战接种中显著降低的疾病病损(Zhijian等，2010)。Gilchrist和Lincoln(2011)报道，当在几种转基因宿主物种中表达时，葡萄PR-1蛋白会抑制凋亡，在此过程中通过阻断症状诱导而提供了对苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)的大大提高的耐受性，而这又导致在植物活体中总细菌生长的大量减少。应该注意，只有来自植物PR-1家族的少数成员显示出病原体的诱导型表达，并具有针对病原体的抑制活性(Li等，2011)。例如，拟南芥和水稻分别含有22和39个PR-1型基因，但发现分别只有1和2个成员可由病原体或昆虫攻击诱导(Van Loon等，2006)。
BAG6作为程序性细胞死亡的调控因子
本发明部分地基于发明人的意想不到的发现，即植物中的柑橘BAG6基因的下调，导致响应于病原体侵入的增加的程序性细胞死亡。
在一些实施方案中，本发明教导了植物中BAG6的下调导致防御响应蛋白NDR-1的产生增加。在BAG6沉默的柑橘类中这种提高的NDR-1产生特别显著，因为已知该基因的水平提高会增加拟南芥中对细菌和真菌两者的基础抗性，并且被认为可能增加柑橘类中对Las的抗性(Lu等，2013)。
因此，在一些实施方案中，本发明教导了下调BAG6基因用于增加植物对病原体的抗性。在一些实施方案中，本发明内容教导了下调BAG6基因以增加对活体营养型病原体的抗性。在其他实施方案中，本发明教导了下调Bag6基因以增加对由Las、Lam和Lso引起的柑橘类绿化病的抗性。
在一些实施方案中，本发明教导了下调Carizzo-CiBAG6(SEQ ID NO:8)。
尚未预测、预期或建议在任何植物***中BAG6的沉默基因(其导致对相应的BAG6蛋白的产生的抑制)能增加下游防御响应蛋白的表达水平并保护免受病原体感染或病原体感染的影响。
本文中公开了在柑橘类中沉默BAG6(而不是像本文介绍的其他实例那样的过表达)增强防御响应蛋白的产生，并保护免受病原体感染的影响，这是惊人的发现。
出于基因沉默的目的，可以代替使用反义RNA或RNAi两者来激活RNAi途径，尽管该过程导致的相同下游效应的程度不同。
通过选择性时空沉默进行的BAG6的受控调节
本通过人工除去程序性细胞死亡(PCD)的天然植物抑制剂之一，特别是当植物检测到病原体的存在时所涉及的那种天然植物抑制剂，发明教导了以非常快速的方式响应于病原体的有效防御。如果这种制动去除(drake removal)在所有的植物组织中广泛发生，则可能会具有以下不期望的结果：使植物对死体营养型病原体更加易感。
然而，如果可以将PCD制动去除限制在仅韧皮部和附近的细胞，则不会有利于死体营养型病原体，因为死体营养型并不将韧皮部作为首要靶标来攻击。由于韧皮部杆菌和黄单胞菌是引起主要植物疾病并且为原养型的两种细菌属，因此，选择性除去PCD制动控制，能够赋予对韧皮部杆菌、黄单胞菌属和其他活体营养型病原体(包括真菌)以免疫性，而对死体营养型没有增加的易感性的这种不期望的效果。
在一些实施方案中，本发明教导了两种基于RNA的用于选择性沉默Bag6基因的方法，其通过以下方式：1)仅砧木是转基因的，而嫁接到砧木上的接穗是非转基因的；2)所使用的RNA限于仅韧皮部细胞(Las存在之处)，和3)在另一种情况下使用的RNA，其允许对韧皮部外的细胞进行受限的迁移。本发明教导了，本发明的选择性沉默方法在转基因砧木和非转基因接穗两者中对于提高基础防御响应和疾病抗性均是有效的。本公开对美国水果作物生产者显著有益，因为所得的植物变得对严重疾病具有抗性，具有非转基因接穗和(对于市场销售很重要地)非转基因植物。在一些实施方案中，本申请中的术语重组和转基因可互换使用。
如本文所用，用于程序性细胞死亡的术语“制动(drake)”可以与术语PCD的抑制或PCD的抑制剂的互换使用。
序列同一性
在一些实施方案中，本发明教导了下调CiBAG6同源物或直系同源物，其中所述同源物或直系同源物与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:8具有至少99.9％、99.8％、99.7％、99.6％、99.5％、99.4％、99.3％、99.2％、99.1％、99％、98.9％、98.8％、98.7％、98.6％、98.5％、98.4％、98.3％、98.2％、98.1％、98％、97.9％、97.8％、97.7％、97.6％、97.5％、97.4％、97.3％、97.2％、97.1％、97％、96.9％、96.8％、96.7％、96.6％、96.5％、96.4％、96.3％、96.2％、96.1％、96％、95.9％、95.8％、95.7％、95.6％、95.5％、95.4％、95.3％、95.2％、95.1％、95％、94.9％、94.8％、94.7％、94.6％、94.5％、94.4％、94.3％、94.2％、94.1％、94％、93.9％、93.8％、93.7％、93.6％、93.5％、93.4％、93.3％、93.2％、93.1％、93％、92.9％、92.8％、92.7％、92.6％、92.5％、92.4％、92.3％、92.2％、92.1％、92％、91.9％、91.8％、91.7％、91.6％、91.5％、91.4％、91.3％、91.2％、91.1％、91％、90.9％、90.8％、90.7％、90.6％、90.5％、90.4％、90.3％、90.2％、90.1％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％、60％、59％、58％、57％、56％、55％、54％、53％、52％、51％、50％、49％、48％、47％、46％、45％、44％、43％、42％、41％或40％的序列同一性。
在一些实施方案中，CiBAG6同源物或直系同源物的序列同一性是基于各基因的核酸序列的比对和比较来计算的。在其他实施方案中，同源物或直系同源物的序列同一性是基于编码的蛋白质的比对和比较来计算的。
在一些实施方案中，本发明的比对和序列同一性计算是使用ClustalOmega软件以默认设置来计算的。
在一些实施方案中，本发明的CiBAG6基因同源物和直系同源物编码保守的氨基酸取代。保守的氨基酸取代是这样的取代：在进行该取代后对原蛋白的性质干扰最少，即，所述蛋白的结构和特别是功能是保守的，并且未被此类取代显著改变。保守取代通常维持：(a)取代区域中的多肽骨架的结构，例如片层或螺旋构象；(b)分子在靶位点的电荷或疏水性；或(c)侧链的大小。关于保守取代的进一步信息可以见于例如Ben Bassat等.(J.Bacteriol.,169:751-757,1987)、O’Regan等.(Gene,77:237-251,1989)、Sahin-Toth等(Protein Sci.,3:240-247,1994)、Hochuli等(Bio/Technology,6:1321-1325,1988)以及广泛使用的遗传学和分子生物学教科书中。Blosum矩阵通常用于确定多肽序列的相关性。Blosum矩阵是使用可靠比对的大数据库(BLOCKS数据库)创建的，其中计入了关联度小于某些阈值百分比同一性的成对序列比对(Henikoff等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:10915-10919,1992)。同一性90％的阈值用于BLOSUM90矩阵的高度保守的靶频率。同一性65％的阈值用于BLOSUM65矩阵。在选择的百分比同一性处，在Blosum矩阵中零以上的分数被认为是“保守取代”。下表显示了示例性的保守氨基酸取代。
表1.BLOSUM取代矩阵
在一些实施方案中，本发明的直系同源物和同源物可具有不超过3、5、10、15、20、25、30、40、50或100个的保守氨基酸变化(例如非常高度保守或高度保守的氨基酸取代)。在其他实施方案中，发现变体序列中的一个或几个疏水性残基(例如Leu、Ile、Val、Met、Phe或Trp)可以被不同的疏水残基(例如Leu、Ile、Val、Met、Phe或Trp)代替，从而产生功能上与公开的由CiBAG6的核酸序列编码的氨基酸序列相似的变体。
在一些实施方案中，通过改变编码区，变体可以不同于公开的序列，以适应上述分子所要引入的具体生物体的密码子使用偏好。在其它实施方案中，可以通过利用遗传密码子的简并性来改变编码序列而改变上述编码区，使得尽管核苷酸序列基本上的改变的，但它仍然编码具有与公开的由CiBAG6的核酸序列编码的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列的蛋白。
重组DNA构建体
本发明的另一方面提供了重组核酸构建体，其包含与DNA可操作地连接的异源启动子，所述DNA包括至少一个18个或更多个连续核苷酸的区段，所述区段与具有选自SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:8的序列的DNA的相等长度区段具有约95％至约100％的同一性。例如通过在植物中表达该重组核酸构建体的转录物，所述重组核酸构建体可用于提供具有对细菌或真菌感染的改进的抗性的植物。所述连续核苷酸的数量可以超过18，例如来自SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:8的19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个，或大于30个，例如约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190、约200、约210、约220、约230、约240、约250、约260、约270、约280、约290、约300、约310、约320、约330、约340、约350、约360、约370、约380、约390、约400、约410、约420、约430、约440、约450、约460、约470、约480、约490、约500、约510、约520、约530、约540、约550、约560、约570、约580、约590、约600、约610、约620、约630、约640、约650、约660、约670、约680、约690、约700、约710、约720、约730、约740、约750、约760、约770、约780、约790、约800、约810、约820、约830、约840、约850、约860、约870、约880、约890、约900或大于900个连续核苷酸。
在一些实施方案中，在重组载体中提供本发明的重组核酸构建体。“重组载体”意指用于将遗传信息从一个细胞转移到另一个细胞的重组多核苷酸分子。适用于本发明的实施方案包括但不限于：重组质粒、重组粘粒、人工染色体、和重组病毒载体例如重组植物病毒载体和重组杆状病毒载体。
RNA干扰
在一些实施方案中，本发明还教导了能够产生抑制剂核酸分子的表达载体。在一些实施方案中，本发明教导了RNA干扰(RNAi)用于下调CiBAG6基因或CiBAG6基因的同源物或直向同源物的用途。因此，在一些实施方案中，本发明教导了反义、反向重复、小RNA、人工miRNA或其它RNAi引发序列的表达。
在一些实施方案中，本发明的RNAi构建体包含能够引发BAG6基因的RNAi抑制的序列，其包括核酸片段，所述核酸片段包含与BAG6基因靶区域(例如在SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:8中公开的那些)高于约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
在一些实施方案中，将反义或小RNA分子靶向于靶基因的编码部分的一段。在其他实施方案中，将本发明的RNAi序列靶向于靶基因的5'或3'非翻译区(UTR)。在其它实施方案中，将本发明的RNAi序列靶向于靶基因的启动子。选择用于RNAi分子设计的序列靶区域的方法更详细地描述于(Fougerolles等，2007；美国专利号7,732,593)中。
在一些实施方案中，本发明的RNAi分子可以在各种位置进行修饰，包括糖部分、磷酸二酯键和/或碱基。例如，为了进一步提高上述分子在体内的稳定性，可通过保护基团阻断发夹结构的3'端。例如，可以使用保护基团例如反向核苷酸、反向无碱基部分或氨基端修饰的核苷酸。反向核苷酸可以包括反向脱氧核苷酸。反向无碱基部分可以包含反向脱氧脱碱基部分，例如3'，3'连接或5'，5'-连接的脱氧无碱基部分(美国专利公开2011/251258)。
在一些实施方案中，本发明还教导了通过反义技术下调基因。在一些实施方案中，本发明可以使用其它已知用于下调基因表达的方法实施，包括T-DNA敲除系、tilling技术、TAL介导的基因破坏、转录基因沉默和定点甲基化。
实施例1：鉴定柑橘CiBAG6同源物并证明在Carrizo、Hamlin和Valencia中的单个相同的同源物。
使用预测的AtBAG6蛋白序列进行BLAST-P检索，以鉴定克莱门氏小柑橘基因组内的单个柑橘基因座，该基因组可在线获取(http://www.phytozome.net/)，本文称为CiBag6(clementine 0.9_012925m，编码区包括在SEQ ID NO:8中)。然后使用该基因座的DNA序列，即AtBag6同源物来确定它可能与克莱门氏小柑橘或甜橙中的Bag6基因家族的其他成员有多么密切相关。除了单个CiBag6之外，克莱门氏小柑橘和甜橙品种Hamlin或Valencia看起来都没有任何其他序列与AtBag6在多于18个碱基对上具有高序列相似性(>50％)。这证明，不仅柑橘没有携带多个Bag6同源物，而且在CiBAG6上的任何选择作为探针或用于沉默目的区域，都可能针对靶CiBag6基因是特异性的。从全部三个柑橘品种中分离了柑橘mRNA，并使用标准方法(Jiang等，2012)用合适的PCR引物进行逆转录酶PCR(rtPCR)以扩增包含102bp的5'非翻译区(以及包括ATG起始位点的5'翻译区)的930bp的外显子片段。将这些DNA片段克隆到pGEM-T中，对来自上述三个柑橘品种中的每一个的三个克隆进行测序。所述DNA序列与来自Carrizo的CiBAG6(SEQ ID NO:1)的完整930bp片段有98％相同，并与SEQ ID NO:1的前200bp几乎100％相同(在Carrizo和Hamlin或Valencia之间有1bp差异)。
实施例2：具有CaMV启动子的反义RNA(aRNA)构建体。
将Carrizo CiBAG6C(SEQ ID NO:1)的从ATG起始密码子到所述片段的编码末端(SEQ ID NO:1的位置103-930)的828bp区域，以反义方向克隆到携带单个CaMV启动子的pIPG973(WO 2013/032985 A1)中。然后将CiBAG6C反义片段与来自pCAMBIA2301的uidA基因的516bp(以正义方向)进行转录融合，形成pIPG1150(参见表2和图1；SEQ ID NO:2)。将该克隆用于转化Carrizo幼苗，产生通过PCR确认的多个转化事件。将每个转基因事件编号，并使用提取自每个确认的转基因Carrizo事件的RNA通过rtPCR确认CiBAG6C反义构建体的表达。然后评估每个确认的表达转基因事件以确定Carrizo中的CiBAG6是否实际上被沉默。基于CiBAG6C转录物(cDNA)序列(但在克隆并用于沉默目的的区域之外)设计了DNA引物。从图2可见，相对于沉默的系中的任一个，对照Carrizo显示了更高的相对CiBAG6C表达水平(标记为1150-12、-34、-39、-40、-44和-45)。这些结果清楚地表明pIPG1150中的aRNA构建体对于沉默CiBAG6是有效的。
为了确定CiBAG6C沉默的系的对已知PAMP诱导剂的响应是否受到影响(Shi等，2013，2014)，通过qPCR检测了三种防御响应基因的每一种的表达水平。使用已知可用于检测柑橘类中的这些响应的PCR引物(发病原相关1或PR1；增强的疾病易感性1或EDS1，以及非种族特异性疾病抗性1或NDR1)(Shi等，2014)。
为了诱导柑橘类植物防御响应，使用Las鞭毛蛋白22(Las flg22)作为诱导剂和接种Las的代替物，使用溶于水的10μM的Las flg22诱导剂(Shi等，2013)。将接种有水(NT CK)的非转基因(NT)Carrizo中的防御响应与均接种有Las flg22的NT Carrizo和CtBAG6沉默的Carrizo系进行比较。对照还包括确定作为对照的未接种Las flg22的NT Carrizo和CtBAG6沉默系二者中的PR1、EDS1和NDR1的水平。从图3可知，1150-12系(用pIPG1150沉默)中的NDR1的表达水平特别突出，因为其在诱导后24小时和48小时均比NT对照显著更高(>10倍高)。NDR-1的表达增加是显著的，因为已知该基因的升高的水平在拟南芥中增加对细菌和真菌的基础抗性，并提示其可能在柑橘类中增加对Las的抗性(Lu等，2013)。该结果清楚地表明，在Carrizo中发生了CtBAG6的沉默，伴随着防御响应基因的表达增加，并且可能在Carrizo中增加对Las(flg22的生物体来源)的抗性，以及可能增加对其他活体营养型细菌和真菌的抗性。
表2：使用的CtBAG6沉默构建体的概述
pIPG1150 CaMV启动子；aRNA(无移动前导序列) 实施例2
pIPG1157 CaMV启动子；具有1848bp GUS环的RNAi构建体 实施例4
pIPG1159 AtSuc2启动子；具有1848bp GUS环的RNAi构建体 实施例5
pIPG1160 具有移动前导体的AtSuc2启动子；aRNA 实施例3
pIPG1174 CaMV启动子；具有190bp内含子的RNAi构建体 实施例6
实施例3：具有AtSuc2启动子的反义RNA(aRNA)构建体。
如实施例2中那样，将Carrizo CiBAG6C(SEQ ID NO:1)自ATG起始密码子至片段的编码末端(SEQ ID NO:1的103-930位置)的828bp区域，以反义方向克隆到携带单个CaMV启动子的pIPG980(WO 2013/032985 A1)中，形成pIPG1160(参见表2和图1；SEQ ID NO:3)。将来自拟南芥(arabidopsis thaliana)的潜在移动前导序列，即来自GenBank：GQ395494.1(SEQ ID NO:7)中的核苷酸位置326至核苷酸429的开花基因座T(FT)，以正义方向转录融合于用于构建pIPG1160的aRNA构建体的5'端(图1)。
如实施例2所述，通过PCR确认每个转基因事件，并使用提取自每个确认的转基因Carrizo事件的RNA通过rtPCR确认CiBAG6C反义构建体的表达。然后评估每个确认的表达转基因事件，以确定Carrizo中的CiBAG6是否实际上被沉默。从图2可以看出，对照Carrizo显示出远高于1160-13的相对CtBAG6C表达水平，这再次清楚地证明了pIPG1160构建体(本次使用了AtSuc2启动子并提供了潜在的长距运输前导体)对于沉默CiBAG6是有效的。
再次地，为了确定CiBAG6C沉默系的对已知的PAMP诱导剂Las flg22的响应是否受到影响，如实施例2中那样通过qPCR检测了三种防御响应基因PR1、EDS1和NDR1的每一种的表达水平。从图3可知，在1160-13系(用PIPG1160进行沉默)中，在诱导后24小时，NDR1的表达水平显著高于(5倍高)NT对照。在诱导后24小时，EDS1的表达水平是NT对照的1.7倍高。在48小时之时，由这种构建体引起的沉默的效果与对照没有显著差异。总体而言，由该构建体引起的对CiBAG6的沉默的效果比用pIPG1150观察到的效果小，并且可能是由于与用于构建pIPG1150的CaMV启动子相比，用于构建pIPG1160的AtSuc2启动子的启动子强度和组织特异性预期是降低的(表2)。该结果清楚地证明在Carrizo中发生了CiBAG6的沉默，伴随着防御响应基因的表达增加，并且可能在Carrizo中增加至少对Las(flg22的来源生物体)的抗性，及可能对其他活体营养型细菌和真菌的抗性。该结果还表明，AtSuc2启动子可能可用于预防以下非所欲的后果：对CiBAG6的过度沉默，或对CiBAG6的过于广泛的沉默。
实施例4：具有CaMV启动子和GUS环的RNAi构建体。
出于沉默的目的，基于获取自柑橘砧木栽培种Carrizo枳橙(citrange)(甜橙(Citrus sinensis)L.Osbeck×枸橘(Poncirus trifoliata)L.Raf.)和甜橙栽培种Hamlin和Valencia的三个CtBAG6cDNA克隆之间的高水平序列同一性(如在实施例1中解释的几乎100％)，选择了包括基因的5'非翻译区中的101bp和第一外显子的编码区内的99bp的长度为200bp的区域。对于为了能够嫁接传递用于非转基因的Hamlin和Valencia接穗的沉默RNA(在转基因Carrizo砧木再生以后进行嫁接)，与Hamlin和Valencia的同源性是重要的，以期望在嫁接的接穗中发生沉默。
将Carrizo CiBAG6C(SEQ ID NO:1)的前200bp以正义方向克隆到pIPG980(WO2013/032985 A1)中，其携带单个CaMV启动子，然后是来自形成GUS环的uidA基因的1,848bp片段，然后是相同的200bp的CiBAG6C序列，但是以反义方向，形成pIPG1157(参见表2和图1；SEQ ID NO:4)。在表达时，每个由pIPG1157形成的mRNA会退火以形成茎环结构。该克隆用于转化Carrizo幼苗，产生通过PCR确认的多个转化事件。
如实施例2所述，使用提取自每个确认的转基因Carrizo事件的RNA通过rtPCR确认了每个转基因事件的表达。然后评估每个确认的表达转基因事件，以确定Carrizo中的CiBAG6是否实际上被沉默。从图2可以看出，对照Carrizo显示出比三个1157转基因事件(1157-6、1157-9和1157-16)高得多的CtBAG6C表达水平，再次清楚地证明pIPG1157构建体(本次使用了RNAi而非aRNA来进行沉默)对于沉默CiBAG6是有效的。
再次，为了确定CiBAG6C沉默系对已知PAMP诱导剂Las flg22的响应是否受到影响，如实施例2和3中那样通过qPCR检测了三种防御响应基因PR1、EDS1和NDR1的每一种的表达水平。从图3可知，1157-9系(用pIPG1157进行沉默)中的NDR1的表达水平特别引人注目，因为其在诱导后24小时处比NT对照显著更高(9.6倍高)，在诱导后48小时已升至30倍高。与用等量的Las flg22诱导的NT对照比较，EDS1和PR1两者分别上升为4.8倍和25倍高。同样，NDR-1的表达增加是显著的，因为已知该基因的水平升高增加拟南芥中对细菌和真菌两者的基础抗性，并且被认为可能增加柑橘类中对Las的抗性(Lu等，2013)。该结果清楚地证明，使用与实施例2中的aRNA构建体(pIPG1150)所用的相同启动子驱动的RNAi构建体，在Carrizo中发生了CtBAG6的沉默，但伴随有比使用aRNA时观察到的更大的防御响应基因的表达增加，可能强烈增加Carrizo中对Las(flg22的来源生物体)的抗性，以及可能的对其他活体营养型细菌和真菌的抗性。
实施例5：具有AtSuc2启动子和GUS环的RNAi构建体。
创建了与实施例4中使用的相同的构建体(除了用单个AtSuc2启动子代替pIPG1157的单个CaMV启动子以外)，以形成pIPG1159(参见表2和图1；SEQ ID NO:5)。该克隆用于转化Carrizo幼苗，产生通过PCR确认的多个转化事件。
如实施例2所述，使用提取自每个确认的转基因Carrizo事件的RNA，通过rtPCR确认了每种转基因事件的表达。然后评估每个确认的表达转基因事件，以确定Carrizo中的CiBAG6是否实际上被沉默。从图2可以看出，对照Carrizo显示出远高于检测的七个1159转基因事件(1159-1、1159-2、1159-5、1159-6、1159-9、1159-16和1159-21)的相对CtBAG6C表达水平，再次清楚地证明pIPG1159构建体(再次使用RNAi而非aRNA进行沉默,但RNAi基因表达由AtSuc2启动子驱动)对于沉默CiBAG6是有效的。
再次，为了确定CiBAG6C沉默系对已知PAMP诱导剂Las flg22的响应是否受到影响，如实施例2、3和4中那样通过qPCR检测了三种防御响应基因PR1、EDS1和NDR1的每一种的表达水平。从图3可以看出，1159-6系(用pIPG1159进行沉默)中的NDR1的表达水平特别引人注目，因为其在诱导后24小时显著高于对照(19倍高)，而与用在实施例3中由AtSuc2启动子可操作地驱动的aRNA构建体相似(pIPG 1160-13)，所述效果在48小时大大降低(至NDR-1表达的7倍高)，但仍显著不同于所有对照。然而，与反义构建体不同，1159-6系的EDS1和PR1二者的表达水平分别是Las flg22诱导后24小时的NT对照的7.6倍和6.6倍高。该结果清楚地证明，使用与实施例3(pIPG1160)中的aRNA构建体所用的相同启动子驱动的RNAi构建体，在Carrizo中发生了CtBAG6的沉默，但伴随有比使用aRNA时观察到的更高的防御响应基因的表达，可能强烈增加Carrizo中对Las(flg22的生物体来源)的抗性，以及可能的对其他活体营养型细菌和真菌的抗性。与实施例3(pIPG1160)一样，在诱导后24小时对诱导的防御响应基因的效果比诱导后48小时更强，表明AtSuc2启动子可以提供调控更好的反应。
实施例6：具有35S启动子和内含子环的RNAi构建体。
已显示在RNAi构建体的创建中，使用内含子比DNA环的随机段(randomstretches)更有效(Stoutjesdijk等，2002)。因此，从pIPG973进行PCR扩增出190bp的过氧化氢酶内含子，并用其代替在pIPG1157中使用的GUS片段2环，以形成pIPG1174(参见表2和图1；SEQ ID NO:6)。该克隆用于转化Carrizo幼苗，产生通过PCR确认的多个转化事件。
如实施例2所述，使用提取自每个确认的转基因Carrizo事件的RNA，通过rtPCR确认了每种转基因事件的表达。然后评估每个确认的表达转基因事件，以确定Carrizo中的CiBAG6是否实际上被沉默。从图2可以看出，对照Carrizo显示出比检测的六个1174转基因事件(1174-1、1174-11、1174-12、1174-29、1174-30和1174-35)高得多的相对CtBAG6C表达水平，再次清楚地证明pIPG1174构建体(再次使用了RNAi而非aRNA进行沉默，但过氧化氢酶内含子作为环)对于沉默CiBAG6是有效的。
再次，为了确定CiBAG6C沉默系对已知PAMP诱导剂Las flg22的响应是否受到影响，如实施例2、3、4和5中那样通过qPCR检测了三种防御响应基因PR1、EDS1和NDR1的每一种的表达水平。从图3可知，在诱导后24和48小时，1174-29系(用pIPG1174进行沉默)中的NDR1的表达水平显著高于对照(6-7.7倍高)。与由CaMV启动子驱动的其他沉默系一致，在通过Las flg22诱导后的48小时的效果和24小时几乎一样显著。该结果清楚地证明，使用由与实施例4中的RNAi构建体(pIPG1157)中所用的相同的启动子驱动的RNAi构建体，在Carrizo中发生了CtBAG6的沉默。
实施例7：RNAi和aRNA二者从转基因砧木至非转基因的柑橘接穗的移动。
将32个非转基因成熟Hamlin(甜橙)柑橘接穗嫁接到经沉默、经转化的表达表达pIPG1150、pIPG1159、pIPG1160或pIPG1174的Carrizo砧木系上。在这些测定中测试了代表四种不同沉默构建体的每一种的四个嫁接植物。通过PCR验证了提取自每个系的RNA的质量，以确保一致性。使用两种构建体(aRNA构建体pIPG1150和RNAi构建体pIPG1159)，沉默信号未能移动。一个未能移动的aRNA构建体被工程化改造为适度移动，并添加了移动前导体。一个RNAi构建体(自IPG1174表达)非常有效地移动到非转基因Hamlin甜橙接穗中。
实施例8：用Las对CiBAG6C沉默系的挑战(challenge)接种。
将表现出HLB症状并且还通过实时PCR检测显示(Las细菌感染的强阳性PCR信号)的感染Las的柑橘靠接(approach grafted)到未感染的转基因CiBAG6C沉默系上。几个月后，转基因CiBAG6C沉默系变成PCR阳性，表明Las细菌感染通过嫁接部。在两个月的期间内表现出至少四次阳性PCR测试后，认为所述CiBAG6C系被Las感染，并将来自感染源树的嫁接部切断。追踪PCR结果至少4个月。
实施例9：用Las对具有嫁接的非转基因Hamlin或Valencia成熟接穗的CiBAG6C沉默的砧木进行挑战接种。
用实施例8中那样的Las对来自实施例7的嫁接成熟的非转基因Hamlin芽进行挑战接种，所述Hamlin芽被微嫁接到转基因Carrizo系上并确证表现出移动沉默。
实施例10：沉默的CiBAG6C系表现出耐热性和耐寒性二者。
将两种不同的转基因系(1150-53和1174-57)和两种非转基因系(NT)置于高恒温应激下(42℃，6天)；这些热处理的水平对治愈HLB的柑橘是有效的。虽然所有植物均在这些处理下存活，但对照植物明显受损，局部落叶且恢复缓慢，而两种沉默的Carrizo系表现为几乎没有损伤或落叶，且无需恢复期。还对两种系测试了5天的耐寒性(-1℃)。对照和沉默的植物都表现出来自所述处理的冷损伤(叶子枯萎)。恢复7天后，沉默系明显已经完全恢复，叶片损失很少，而对照植物几乎完全落叶。对靶凋亡调控基因CiBAG6C的抑制看起来强烈增强了柑橘类植物对非生物应激的抗性，并且可以为柑橘种植者提供保护新种植的树木免受霜冻损伤的手段。
除非另有定义，本文所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然与本文所述相似或等同的任何方法和材料均可以用于本发明的实践或测试中，但是本文描述了优选的方法和材料。
出于所有目的，引用的所有出版物、专利、专利出版物、核酸和氨基酸序列通过提述以其整体并入本文。
本文所讨论的出版物仅仅是因为其在本申请的提交日之前公开而提供。本文中的任何内容都不应解释为承认本发明由于在先发明而不具有先于该出版物的资格。
虽然已经结合本发明的具体实施方案描述了本发明，但是应当理解其能够进行进一步的修改，并且本申请旨在涵盖本发明的任何变化，用途或调整，其一般而言遵循本发明的主旨并且包括对本公开内容的这样的偏离，所述偏离在本发明所属领域内已知或惯常的实践内，并且适用于所附权利要求书所述以及前文所述的基本特征。
参考文献
Brunings,A.M和Gabriel,D.W.2003.Xanthomonas citri:breaking thesurface.Molecular Plant Pathology 4:141-157.
Chibucos,M.C.,C.W.Collmer,T.Torto-Alalibo,M.Gwinn-Giglio,M.,Lindeberg,D.Li和B.M.Tyler.2009.Programmed cell death in host symbiontassociations,Gene Ontology.阅稿BMC Microbiol.9(Suppl.1):S5.29.
Dickman,M.B.,Park,Y.K.,T.,Li,W.,Clemente,T.,French,R.2001.Abrogation of disease development in plants expressing animalantiapoptotic genes.Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:6957-6962.
Doukhanina,E.V.,S.Chen,E.van der Zalm,A.Godzik,J.Reed,和M.B.Dickman.2006.Identification and functional characterization of the BAGprotein family in Arabidopsis thaliana.Journal of Biological Chemistry281:18793-18801
Gilchrist,D.和Lincoln,J.2011.Pierce’s Disease control and bacterialpopulation dynamics in winegrape varieties grafted to rootstocks expressinganti-apoptotic sequences.Proceedings of the 2011Pierce's Disease ResearchSymposium,Sacramento,pp118-121.
Jiang,Y.,Ding,X.,Chen,X.,Wang,Y.,Song,W.2013.The rice XA21bindingprotein 25encodes anankyrin repeat containing protein and is required forfull Xa21-mediated disease resistance.Plant J.73:814-823.
Kasai A,Bai S,Li T,Harada T(2011)Graft-Transmitted siRNA Signal fromthe Root Induces Visual Manifestation of Endogenous Post-TranscriptionalGeneSilencing in the Scion.PLoSONE 6(2):e16895.
Li ZT,Dhekney SA,Gray DJ.2011.PR-1gene family of grapevine:a uniquelyduplicated PR-1gene from a Vitis interspecific hybrid confers high levelresistance to bacterial disease in transgenic tobacco.Plant Cell Rep.30:1-11.
Lacomme,C.和S.S.Cruz.1999.Bax-induced cell death in tobacco issimilar to the hypersensitive response.Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 96,no.14:7956-7961.
Lopes,S.A.,Bertolini,E.,Frare,G.F.,Martins,E.C.,Wulff,N.A.,Teixeira,D.C.,Fernandes,N.G.,和Cambra,M.2009.Graft transmission efficiencies andmultiplication of‘Candidatus Liberibacter americanus’and‘Ca.Liberibacterasiaticus’in citrus plants.Phytopathology99:301-306
Lu,H.,Zhang,C.,Albrecht,U.,Shimizu,R.,Wang,G.,Bowman,K.D.2013.Overexpression of a citrus NDR1ortholog increases disease resistancein Arabidopsis.Front.Plant Sci.4:Article157:1-10.
Melnyk,CW.,Molnar,A.和D.C.Baulcombe 2011.Intercellular and systemicmovement of RNA silencing signals.The EMBO Journal 30:3553-3563.
Portt,L.,Norman,G.,Clapp,C.,Greenwood,M.,和Greenwood,M.T.Anti-apoptosis and cell survival:A review.Biochimica et Biophysica Acta 1813:238–259.
Reynolds,A.,D.Leake,Q.Boese,S.Scaringe,W.S.Marshall,和A.Khvorova.2004.Rational siRNA design for RNA interference.NatureBiotechnology 22:326-330.
Sarowar,S.,Y.J.Kim,E.N.Kim,K.D.Kim,B.K.Hwang,R.Islam,和J.S.Shin.2005.Overexpression of a pepper basic pathogenesis-related protein1gene in tobacco plants enhances resistance to heavy metal and pathogenstresses.Plant Cell Reports 24,no.4:216-224.
Shi,Q.,Febres,V.J.,Jones,J.B.,Moore,G.A.2014.Responsiveness ofdifferent citrus genotypes to the Xanthomonas citri ssp.citri-derivedpathogen-associated molecular pattern(PAMP)flg22correlates with resistance tocitrus canker.Molecular Plant Pathology.论文首次在线发表；DOI:10.1111/mpp.12206.
Shi,Q.,Febres,V.J.,Jones,J.B.,Moore,G.A.2013.Flg22derived fromXanthomonas citri subsp.Citri and‘Candidatus Liberibacter asiaticus’triggersimilar defense responses in mandarin and grapefruit.Phytopathology.103(Suppl.2):S2.132.
Stoutjesdijk PA1,Singh SP,Liu Q,Hurlstone CJ,Waterhouse PA,GreenAG.2002.hpRNA-mediated targeting of the Arabidopsis FAD2gene gives highlyefficient and stable silencing.Plant Physiol.129:1723-31.
Takayama,S.,Sato,T.,Krajewski,S.,Kochel,K.,Irie,S.,Millan,J.A.,和Reed,J.C.1995.Cloning and functional analysis of BAG-1,a novel BCL-2bindingprotein with anti-cell death activity.Cell 80,279–284).
Van Loon L,Rep M,Pieterse C.2006.Significance of inducible defense-related proteins in infected plants.Annu.Rev.Phytopathol.44:135-162.
Watanabe N,Lam E(2008)BAX inhibitor-1modulates endoplasmic reticulumstress mediated programmed cell death in Arabidopsis.J Biol Chem283:3200–3210.
Williams,B.,Kabbage,M.,Britt,R.,和Dickman,M.B.2010.AtBAG7,anArabidops is Bcl-2-associated athano gene,resides in the endoplasmicreticulum and is involved in the unfolded proteinresponse.Proc.Natl.Acad.Sci.USA107:6088-6093.
Xu,P.,Rogers,S.J.,Roossinck,M.J.,2004.Expression of antiapoptoticgenes bcl-xL and ced-9in tomato enhances tolerance to viral-induced necrosisand abiotic stress.Proc.Natl.Acad.Sci.USA101:15805-15810.
Zhang,S.,Flores-Cruz,Z.,Zhou,L.,Kang,B.H.,Fleites,L.,Gooch,M.D.,Wulff,N.A.,Davis,M.J.,Duan,Y.,和Gabriel,D.W.2011.Ca.Liberibacter asiaticuscarries an excision plasmid prophage and a chromosomally integrated prophagethat becomes lytic in plant infections.Molec.Plant-Microbe Interactions 24:458-468.
序列表
<110> 弗罗里达大学研究基金会有限公司(University of Florida ResearchFoundation, Inc.)
综合植物遗传股份有限公司(Integrated Plant Genetics, Inc.)
<120> 用于预防或降低细菌和真菌病原体对作物植物的感染的方法和组合物
<130> UFFL:077WO
<150> 62/084,372
<151> 2014-11-25
<160> 8
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 930
<212> DNA
<213> Carrizo枳橙
<400> 1
ttctggatgc cttctaacag tgagcagagg gagcctgaaa agaaggccca aaggcaaggg 60
aaatgctggt tgtcactaga tacaaacagc cctaaacttt ttatgcatgg tgaagatgat 120
aaagaaaaag tgaaccaaca atttccgtac cccttttttt ggatgccttt tcaaactgag 180
gaaggggagg ttgaaaagaa agatcgaaag gagaagaatg ttgcttcaat atcagccgaa 240
gaatcacctt ctgattctaa gtttatgcag gtgaagcctc cagagagtga tgaaaggatg 300
aaaaattttg agccaaacga cgatttttct gataataagg ctaaaagctc acaactgatg 360
gagggcactg ctaataaaaa aattattcct gtaaggcaag tggaaatgtg cagggaggac 420
cactctgaca gtgctgagaa tggagttgca gcagataatt cctccagaac cagtaagatg 480
agacagtcct catctccacc gaagacaaca aaattacctc ctgtttgtct gagactggaa 540
cctttgtcaa agaagaaaaa tggtaatggg aattccagat cccctagtcc tccaggcctg 600
aaaagacaga cagacgaata cgttcacaag ccttctgctt catcagtatt gaaagagagc 660
ccgccacagg gttcccaatc tgctgatgat tcctttaaaa gaaggggaga tgggaaccca 720
aagaaaacag agaaaaaagc cttgggcgtg gtcgatggta agaactgtga aaataaaaat 780
gagcatttga agactggttc tcatatggag aactccatca ggttgtccac tgatttggaa 840
gatgtagctg ggaaatcatc cgcagtgaga aatggaaaag acactgatgg atgtgcctta 900
attcaagata agaaggcaac atctgagtaa 930
<210> 2
<211> 10230
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒
<400> 2
gttaacgcta gccaccacca ccaccaccac gtgtgaatta caggtgacca gctcgaattt 60
ccccgatcgt tcaaacattt ggcaataaag tttcttaaga ttgaatcctg ttgccggtct 120
tgcgatgatt atcatataat ttctgttgaa ttacgttaag catgtaataa ttaacatgta 180
atgcatgacg ttatttatga gatgggtttt tatgattaga gtcccgcaat tatacattta 240
atacgcgata gaaaacaaaa tatagcgcgc aaactaggat aaattatcgc gcgcggtgtc 300
atctatgtta ctagatcggg aattaaacta tcagtgtttg acaggatata ttggcgggta 360
aacctaagag aaaagagcgt ttattagaat aacggatatt taaaagggcg tgaaaaggtt 420
tatccgttcg tccatttgta tgtgcatgcc aaccacaggg ttcccctcgg gatcaaagta 480
ctttgatcca acccctccgc tgctatagtg cagtcggctt ctgacgttca gtgcagccgt 540
cttctgaaaa cgacatgtcg cacaagtcct aagttacgcg acaggctgcc gccctgccct 600
tttcctggcg ttttcttgtc gcgtgtttta gtcgcataaa gtagaatact tgcgactaga 660
accggagaca ttacgccatg aacaagagcg ccgccgctgg cctgctgggc tatgcccgcg 720
tcagcaccga cgaccaggac ttgaccaacc aacgggccga actgcacgcg gccggctgca 780
ccaagctgtt ttccgagaag atcaccggca ccaggcgcga ccgcccggag ctggccagga 840
tgcttgacca cctacgccct ggcgacgttg tgacagtgac caggctagac cgcctggccc 900
gcagcacccg cgacctactg gacattgccg agcgcatcca ggaggccggc gcgggcctgc 960
gtagcctggc agagccgtgg gccgacacca ccacgccggc cggccgcatg gtgttgaccg 1020
tgttcgccgg cattgccgag ttcgagcgtt ccctaatcat cgaccgcacc cggagcgggc 1080
gcgaggccgc caaggcccga ggcgtgaagt ttggcccccg ccctaccctc accccggcac 1140
agatcgcgca cgcccgcgag ctgatcgacc aggaaggccg caccgtgaaa gaggcggctg 1200
cactgcttgg cgtgcatcgc tcgaccctgt accgcgcact tgagcgcagc gaggaagtga 1260
cgcccaccga ggccaggcgg cgcggtgcct tccgtgagga cgcattgacc gaggccgacg 1320
ccctggcggc cgccgagaat gaacgccaag aggaacaagc atgaaaccgc accaggacgg 1380
ccaggacgaa ccgtttttca ttaccgaaga gatcgaggcg gagatgatcg cggccgggta 1440
cgtgttcgag ccgcccgcgc acgtctcaac cgtgcggctg catgaaatcc tggccggttt 1500
gtctgatgcc aagctggcgg cctggccggc cagcttggcc gctgaagaaa ccgagcgccg 1560
ccgtctaaaa aggtgatgtg tatttgagta aaacagcttg cgtcatgcgg tcgctgcgta 1620
tatgatgcga tgagtaaata aacaaatacg caaggggaac gcatgaaggt tatcgctgta 1680
cttaaccaga aaggcgggtc aggcaagacg accatcgcaa cccatctagc ccgcgccctg 1740
caactcgccg gggccgatgt tctgttagtc gattccgatc cccagggcag tgcccgcgat 1800
tgggcggccg tgcgggaaga tcaaccgcta accgttgtcg gcatcgaccg cccgacgatt 1860
gaccgcgacg tgaaggccat cggccggcgc gacttcgtag tgatcgacgg agcgccccag 1920
gcggcggact tggctgtgtc cgcgatcaag gcagccgact tcgtgctgat tccggtgcag 1980
ccaagccctt acgacatatg ggccaccgcc gacctggtgg agctggttaa gcagcgcatt 2040
gaggtcacgg atggaaggct acaagcggcc tttgtcgtgt cgcgggcgat caaaggcacg 2100
cgcatcggcg gtgaggttgc cgaggcgctg gccgggtacg agctgcccat tcttgagtcc 2160
cgtatcacgc agcgcgtgag ctacccaggc actgccgccg ccggcacaac cgttcttgaa 2220
tcagaacccg agggcgacgc tgcccgcgag gtccaggcgc tggccgctga aattaaatca 2280
aaactcattt gagttaatga ggtaaagaga aaatgagcaa aagcacaaac acgctaagtg 2340
ccggccgtcc gagcgcacgc agcagcaagg ctgcaacgtt ggccagcctg gcagacacgc 2400
cagccatgaa gcgggtcaac tttcagttgc cggcggagga tcacaccaag ctgaagatgt 2460
acgcggtacg ccaaggcaag accattaccg agctgctatc tgaatacatc gcgcagctac 2520
cagagtaaat gagcaaatga ataaatgagt agatgaattt tagcggctaa aggaggcggc 2580
atggaaaatc aagaacaacc aggcaccgac gccgtggaat gccccatgtg tggaggaacg 2640
ggcggttggc caggcgtaag cggctgggtt gtctgccggc cctgcaatgg cactggaacc 2700
cccaagcccg aggaatcggc gtgacggtcg caaaccatcc ggcccggtac aaatcggcgc 2760
ggcgctgggt gatgacctgg tggagaagtt gaaggccgcg caggccgccc agcggcaacg 2820
catcgaggca gaagcacgcc ccggtgaatc gtggcaagcg gccgctgatc gaatccgcaa 2880
agaatcccgg caaccgccgg cagccggtgc gccgtcgatt aggaagccgc ccaagggcga 2940
cgagcaacca gattttttcg ttccgatgct ctatgacgtg ggcacccgcg atagtcgcag 3000
catcatggac gtggccgttt tccgtctgtc gaagcgtgac cgacgagctg gcgaggtgat 3060
ccgctacgag cttccagacg ggcacgtaga ggtttccgca gggccggccg gcatggccag 3120
tgtgtgggat tacgacctgg tactgatggc ggtttcccat ctaaccgaat ccatgaaccg 3180
ataccgggaa gggaagggag acaagcccgg ccgcgtgttc cgtccacacg ttgcggacgt 3240
actcaagttc tgccggcgag ccgatggcgg aaagcagaaa gacgacctgg tagaaacctg 3300
cattcggtta aacaccacgc acgttgccat gcagcgtacg aagaaggcca agaacggccg 3360
cctggtgacg gtatccgagg gtgaagcctt gattagccgc tacaagatcg taaagagcga 3420
aaccgggcgg ccggagtaca tcgagatcga gctagctgat tggatgtacc gcgagatcac 3480
agaaggcaag aacccggacg tgctgacggt tcaccccgat tactttttga tcgatcccgg 3540
catcggccgt tttctctacc gcctggcacg ccgcgccgca ggcaaggcag aagccagatg 3600
gttgttcaag acgatctacg aacgcagtgg cagcgccgga gagttcaaga agttctgttt 3660
caccgtgcgc aagctgatcg ggtcaaatga cctgccggag tacgatttga aggaggaggc 3720
ggggcaggct ggcccgatcc tagtcatgcg ctaccgcaac ctgatcgagg gcgaagcatc 3780
cgccggttcc taatgtacgg agcagatgct agggcaaatt gccctagcag gggaaaaagg 3840
tcgaaaaggt ctctttcctg tggatagcac gtacattggg aacccaaagc cgtacattgg 3900
gaaccggaac ccgtacattg ggaacccaaa gccgtacatt gggaaccggt cacacatgta 3960
agtgactgat ataaaagaga aaaaaggcga tttttccgcc taaaactctt taaaacttat 4020
taaaactctt aaaacccgcc tggcctgtgc ataactgtct ggccagcgca cagccgaaga 4080
gctgcaaaaa gcgcctaccc ttcggtcgct gcgctcccta cgccccgccg cttcgcgtcg 4140
gcctatcgcg gccgctggcc gctcaaaaat ggctggccta cggccaggca atctaccagg 4200
gcgcggacaa gccgcgccgt cgccactcga ccgccggcgc ccacatcaag gcaccctgcc 4260
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 4320
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 4380
ttggcgggtg tcggggcgca gccatgaccc agtcacgtag cgatagcgga gtgtatactg 4440
gcttaactat gcggcatcag agcagattgt actgagagtg caccatatgc ggtgtgaaat 4500
accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg catcaggcgc tcttccgctt cctcgctcac 4560
tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt 4620
aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca 4680
gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc 4740
ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact 4800
ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct 4860
gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag 4920
ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca 4980
cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa 5040
cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc 5100
gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag 5160
aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg 5220
tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca 5280
gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc 5340
tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgcatt ctaggtacta 5400
aaacaattca tccagtaaaa tataatattt tattttctcc caatcaggct tgatccccag 5460
taagtcaaaa aatagctcga catactgttc ttccccgata tcctccctga tcgaccggac 5520
gcagaaggca atgtcatacc acttgtccgc cctgccgctt ctcccaagat caataaagcc 5580
acttactttg ccatctttca caaagatgtt gctgtctccc aggtcgccgt gggaaaagac 5640
aagttcctct tcgggctttt ccgtctttaa aaaatcatac agctcgcgcg gatctttaaa 5700
tggagtgtct tcttcccagt tttcgcaatc cacatcggcc agatcgttat tcagtaagta 5760
atccaattcg gctaagcggc tgtctaagct attcgtatag ggacaatccg atatgtcgat 5820
ggagtgaaag agcctgatgc actccgcata cagctcgata atcttttcag ggctttgttc 5880
atcttcatac tcttccgagc aaaggacgcc atcggcctca ctcatgagca gattgctcca 5940
gccatcatgc cgttcaaagt gcaggacctt tggaacaggc agctttcctt ccagccatag 6000
catcatgtcc ttttcccgtt ccacatcata ggtggtccct ttataccggc tgtccgtcat 6060
ttttaaatat aggttttcat tttctcccac cagcttatat accttagcag gagacattcc 6120
ttccgtatct tttacgcagc ggtatttttc gatcagtttt ttcaattccg gtgatattct 6180
cattttagcc atttattatt tccttcctct tttctacagt atttaaagat accccaagaa 6240
gctaattata acaagacgaa ctccaattca ctgttccttg cattctaaaa ccttaaatac 6300
cagaaaacag ctttttcaaa gttgttttca aagttggcgt ataacatagt atcgacggag 6360
ccgattttga aaccgcggtg atcacaggca gcaacgctct gtcatcgtta caatcaacat 6420
gctaccctcc gcgagatcat ccgtgtttca aacccggcag cttagttgcc gttcttccga 6480
atagcatcgg taacatgagc aaagtctgcc gccttacaac ggctctcccg ctgacgccgt 6540
cccggactga tgggctgcct gtatcgagtg gtgattttgt gccgagctgc cggtcgggga 6600
gctgttggct ggctggtggc aggatatatt gtggtgtaaa caaattgacg cttagacaac 6660
ttaataacac attgcggacg tttttaatgt actgaattaa cgccgaatta attcggggga 6720
tctggatttt agtactggat tttggtttta ggaattagaa attttattga tagaagtatt 6780
ttacaaatac aaatacatac taagggtttc ttatatgctc aacacatgag cgaaacccta 6840
taggaaccct aattccctta tctgggaact actcacacat tattatggag aaactcgagc 6900
ttgtcgatcg actctagcta gaggatcgat ccgaacccca gagtcccgct cagaagaact 6960
cgtcaagaag gcgatagaag gcgatgcgct gcgaatcggg agcggcgata ccgtaaagca 7020
cgaggaagcg gtcagcccat tcgccgccaa gctcttcagc aatatcacgg gtagccaacg 7080
ctatgtcctg atagcggtcc gccacaccca gccggccaca gtcgatgaat ccagaaaagc 7140
ggccattttc caccatgata ttcggcaagc aggcatcgca atgggtcacg acgagatcat 7200
cgccgtcggg catgcgcgcc ttgagcctgg cgaacagttc ggctggcgcg agcccctgat 7260
gctcttcgtc cagatcatcc tgatcgacaa gaccggcttc catccgagta cgtgctcgct 7320
cgatgcgatg tttcgcttgg tggtcgaatg ggcaggtagc cggatcaagc gtatgcagcc 7380
gccgcattgc atcagccatg atggatactt tctcggcagg agcaaggtga gatgacagga 7440
gatcctgccc cggcacttcg cccaatagca gccagtccct tcccgcttca gtgacaacgt 7500
cgagcacagc tgcgcaagga acgcccgtcg tggccagcca cgatagccgc gctgcctcgt 7560
cctgcagttc attcagggca ccggacaggt cggtcttgac aaaaagaacc gggcgcccct 7620
gcgctgacag ccggaacacg gcggcatcag agcagccgat tgtctgttgt gcccagtcat 7680
agccgaatag cctctccacc caagcggccg gagaacctgc gtgcaatcca tcttgttcaa 7740
tcatgcgaaa cgatccagat ccggtgcaga ttatttggat tgagagtgaa tatgagactc 7800
taattggata ccgaggggaa tttatggaac gtcagtggag catttttgac aagaaatatt 7860
tgctagctga tagtgacctt aggcgacttt tgaacgcgca ataatggttt ctgacgtatg 7920
tgcttagctc attaaactcc agaaacccgc ggctgagtgg ctccttcaat cgttgcggtt 7980
ctgtcagttc caaacgtaaa acggcttgtc ccgcgtcatc ggcgggggtc ataacgtgac 8040
tcccttaatt ctccgctcat gatcagattg tcgtttcccg ccttcagttt ccaagcttgg 8100
cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc 8160
gccttgcagc acatccccct ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc 8220
gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatgcta gagcagcttg agcttggatc 8280
agattgtcgt ttcccgcctt cagtttagct tcatggagtc aaagattcaa atagaggacc 8340
taacagaact cgccgtaaag actggcgaac agttcataca gagtctctta cgactcaatg 8400
acaagaagaa aatcttcgtc aacatggtgg agcacgacac acttgtctac tccaaaaata 8460
tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa agggtaatat 8520
ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg aagatagtgg 8580
aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc atcgttgaag 8640
atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc atcgtggaaa 8700
aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc tccactgacg 8760
taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata taaggaagtt 8820
catttcattt ggagagaaca cgggggactc ttgaccatgg ttactcagat gttgccttct 8880
tatcttgaat taaggcacat ccatcagtgt cttttccatt tctcactgcg gatgatttcc 8940
cagctacatc ttccaaatca gtggacaacc tgatggagtt ctccatatga gaaccagtct 9000
tcaaatgctc atttttattt tcacagttct taccatcgac cacgcccaag gcttttttct 9060
ctgttttctt tgggttccca tctccccttc ttttaaagga atcatcagca gattgggaac 9120
cctgtggcgg gctctctttc aatactgatg aagcagaagg cttgtgaacg tattcgtctg 9180
tctgtctttt caggcctgga ggactagggg atctggaatt cccattacca tttttcttct 9240
ttgacaaagg ttccagtctc agacaaacag gaggtaattt tgttgtcttc ggtggagatg 9300
aggactgtct catcttactg gttctggagg aattatctgc tgcaactcca ttctcagcac 9360
tgtcagagtg gtcctccctg cacatttcca cttgccttac aggaataatt tttttattag 9420
cagtgccctc catcagttgt gagcttttag ccttattatc agaaaaatcg tcgtttggct 9480
caaaattttt catcctttca tcactctctg gaggcttcac ctgcataaac ttagaatcag 9540
aaggtgattc ttcggctgat attgaagcaa cattcttctc ctttcgatct ttcttttcaa 9600
cctccccttc ctcagtttga aaaggcatcc aaaaaaaggg gtacggaaat tgttggttca 9660
ctttttcttt atcatcttca ccatgcatta agatctgaac gcgtatgaat gttacgtcct 9720
gtagaaaccc caacccgtga aatcaaaaaa ctcgacggcc tgtgggcatt cagtctggat 9780
cgcgaaaact gtggaattga tcagcgttgg tgggaaagcg cgttacaaga aagccgggca 9840
attgctgtgc caggcagttt taacgatcag ttcgccgatg cagatattcg taattatgcg 9900
ggcaacgtct ggtatcagcg cgaagtcttt atatcgaaag gttgggcagg ccagcgtatc 9960
gtgctgcgtt tcgatgcggt cactcattac ggcaaagtgt gggtcaataa tcaggaagtg 10020
atggagcatc agggcggcta tacgccattt gaagccgatg tcacgccgta tgttattgcc 10080
gggaaaagtg tacgtatcac cgtttgtgtg aacaacgaac tgaactggca gactatcccg 10140
ccgggaatgg tgattaccga cgaaaacggc aagaaaaagc agtcttactt ccatgatttc 10200
tttaactatg ccggaatcca tcgcactagt 10230
<210> 3
<211> 10816
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒
<400> 3
tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg 60
tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg 120
caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 180
aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa 240
cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gcatgatata tctcccaatt tgtgtagggc 300
ttattatgca cgcttaaaaa taataaaagc agacttgacc tgatagtttg gctgtgagca 360
attatgtgct tagtgcatct aatcgcttga gttaacgccg gcgaagcggc gtcggcttga 420
acgaatttct agctagacat tatttgccga ctaccttggt gatctcgcct ttcacgtagt 480
ggacaaattc ttccaactga tctgcgcgcg aggccaagcg atcttcttct tgtccaagat 540
aagcctgtct agcttcaagt atgacgggct gatactgggc cggcaggcgc tccattgccc 600
agtcggcagc gacatccttc ggcgcgattt tgccggttac tgcgctgtac caaatgcggg 660
acaacgtaag cactacattt cgctcatcgc cagcccagtc gggcggcgag ttccatagcg 720
ttaaggtttc atttagcgcc tcaaatagat cctgttcagg aaccggatca aagagttcct 780
ccgccgctgg acctaccaag gcaacgctat gttctcttgc ttttgtcagc aagatagcca 840
gatcaatgtc gatcgtggct ggctcgaaga tacctgcaag aatgtcattg cgctgccatt 900
ctccaaattg cagttcgcgc ttagctggat aacgccacgg aatgatgtcg tcgtgcacaa 960
caatggtgac ttctacagcg cggagaatct cgctctctcc aggggaagcc gaagtttcca 1020
aaaggtcgtt gatcaaagct cgccgcgttg tttcatcaag ccttacggtc accgtaacca 1080
gcaaatcaat atcactgtgt ggcttcaggc cgccatccac tgcggagccg tacaaatgta 1140
cggccagcaa cgtcggttcg agatggcgct cgatgacgcc aactacctct gatagttgag 1200
tcgatacttc ggcgatcacc gcttccccca tgatgtttaa ctttgtttta gggcgactgc 1260
cctgctgcgt aacatcgttg ctgctccata acatcaaaca tcgacccacg gcgtaacgcg 1320
cttgctgctt ggatgcccga ggcatagact gtaccccaaa aaaacatgtc ataacaagaa 1380
gccatgaaaa ccgccactgc gccgttacca ccgctgcgtt cggtcaaggt tctggaccag 1440
ttgcgtgacg gcagttacgc tacttgcatt acagcttacg aaccgaacga ggcttatgtc 1500
cactgggttc gtgcccgaat tgatcacagg cagcaacgct ctgtcatccg cggtgatcac 1560
aggcagcaac gctctgtcat cgttacaatc aacatgctac cctccgcgag atcatccgtg 1620
tttcaaaccc ggcagcttag ttgccgttct tccgaatagc atcggtaaca tgagcaaagt 1680
ctgccgcctt acaacggctc tcccgctgac gccgtcccgg actgatgggc tgcctgtatc 1740
gagtggtgat tttgtgccga gctgccggtc ggggagctgt tggctggctg gtggcaggat 1800
atattgtggt gtaaacaaat tgacgcttag acaacttaat aacacattgc ggacgttttt 1860
aatgtactga attaacgccg aattaattcg ggggatctgg attttagtac tggattttgg 1920
ttttaggaat tagaaatttt attgatagaa gtattttaca aatacaaata catactaagg 1980
gtttcttata tgctcaacac atgagcgaaa ccctatagga accctaattc ccttatctgg 2040
gaactactca cacattatta tggagaaact cgagcttgtc gatcgactct agctagagga 2100
tcgatccgaa ccccagagtc ccgctcagaa gaactcgtca agaaggcgat agaaggcgat 2160
gcgctgcgaa tcgggagcgg cgataccgta aagcacgagg aagcggtcag cccattcgcc 2220
gccaagctct tcagcaatat cacgggtagc caacgctatg tcctgatagc ggtccgccac 2280
acccagccgg ccacagtcga tgaatccaga aaagcggcca ttttccacca tgatattcgg 2340
caagcaggca tcgccatggg tcacgacgag atcatcgccg tcgggcatgc gcgccttgag 2400
cctggcgaac agttcggctg gcgcgagccc ctgatgctct tcgtccagat catcctgatc 2460
gacaagaccg gcttccatcc gagtacgtgc tcgctcgatg cgatgtttcg cttggtggtc 2520
gaatgggcag gtagccggat caagcgtatg cagccgccgc attgcatcag ccatgatgga 2580
tactttctcg gcaggagcaa ggtgagatga caggagatcc tgccccggca cttcgcccaa 2640
tagcagccag tcccttcccg cttcagtgac aacgtcgagc acagctgcgc aaggaacgcc 2700
cgtcgtggcc agccacgata gccgcgctgc ctcgtcctgc agttcattca gggcaccgga 2760
caggtcggtc ttgacaaaaa gaaccgggcg cccctgcgct gacagccgga acacggcggc 2820
atcagagcag ccgattgtct gttgtgccca gtcatagccg aatagcctct ccacccaagc 2880
ggccggagaa cctgcgtgca atccatcttg ttcaatcatg cgaaacgatc cagatccggt 2940
gcagattatt tggattgaga gtgaatatga gactctaatt ggataccgag gggaatttat 3000
ggaacgtcag tggagcattt ttgacaagaa atatttgcta gctgatagtg accttaggcg 3060
acttttgaac gcgcaataat ggtttctgac gtatgtgctt agctcattaa actccagaaa 3120
cccgcggctg agtggctcct tcaatcgttg cggttctgtc agttccaaac gtaaaacggc 3180
ttgtcccgcg tcatcggcgg gggtcataac gtgactccct taattctccg ctcatgatca 3240
gattgtcgtt tcccgccttc agtttccaag cttgcaaaat agcacaccat ttatgtttat 3300
attttcaaat tatttaatac atttcaatat ttcataagtg tgattttttt tttttttgtc 3360
aatttcataa gtgtgatttg tcatttgtat taaacaattg tatcgcgcag tacaaataaa 3420
cagtgggaga ggtgaaaatg cagttataaa actgtccaat aatttactaa cacatttaaa 3480
tatctaaaaa gagtgtttca aaaaaaattc ttttgaaata agaaaagtga tagatatttt 3540
tacgctttcg tctgaaaata aaacaataat agtttattag aaaaatgtta tcaccgaaaa 3600
ttattctagt gccactcgct cggatcgaaa ttcgaaagtt atattctttc tctttaccta 3660
atataaaaat cacaagaaaa atcaatccga atatatctat caacatagta tatgccctta 3720
catattgttt ctgacttttc tctatccgaa tttctcgctt catggttttt ttttaacata 3780
ttctcattta attttcatta ctattatata actaaaagat ggaaataaaa taaagtgtct 3840
ttgagaatcg aacgtccata tcagtaagat agtttgtgtg aaggtaaaat ctaaaagatt 3900
taagttccaa aaacagaaaa taatatatta cgctaaaaaa gaagaaaata attaaataca 3960
aaacagaaaa aaataatata cgacagacac gtgtcacgaa gataccctac gctatagaca 4020
cagctctgtt ttctcttttc tatgcctcaa ggctctctta acttcactgt ctcctcttcg 4080
gataatccta tccttctctt cctataaata cctctccact cttcctcttc ctccaccact 4140
acaaccaccg caacaaccac caaaaaccct ctcaaagaaa tttctttttt ttcttacttt 4200
cttggtttgt caaaccatgg ggatgtctat aaatataaga gaccctctta tagtaagcag 4260
agttgttgga gacgttcttg atccgtttaa tagatcaatc actctaaagg ttacttatgg 4320
ccaaactcga gttactcaga tgttgccttc ttatcttgaa ttaaggcaca tccatcagtg 4380
tcttttccat ttctcactgc ggatgatttc ccagctacat cttccaaatc agtggacaac 4440
ctgatggagt tctccatatg agaaccagtc ttcaaatgct catttttatt ttcacagttc 4500
ttaccatcga ccacgcccaa ggcttttttc tctgttttct ttgggttccc atctcccctt 4560
cttttaaagg aatcatcagc agattgggaa ccctgtggcg ggctctcttt caatactgat 4620
gaagcagaag gcttgtgaac gtattcgtct gtctgtcttt tcaggcctgg aggactaggg 4680
gatctggaat tcccattacc atttttcttc tttgacaaag gttccagtct cagacaaaca 4740
ggaggtaatt ttgttgtctt cggtggagat gaggactgtc tcatcttact ggttctggag 4800
gaattatctg ctgcaactcc attctcagca ctgtcagagt ggtcctccct gcacatttcc 4860
acttgcctta caggaataat ttttttatta gcagtgccct ccatcagttg tgagctttta 4920
gccttattat cagaaaaatc gtcgtttggc tcaaaatttt tcatcctttc atcactctct 4980
ggaggcttca cctgcataaa cttagaatca gaaggtgatt cttcggctga tattgaagca 5040
acattcttct cctttcgatc tttcttttca acctcccctt cctcagtttg aaaaggcatc 5100
caaaaaaagg ggtacggaaa ttgttggttc actttttctt tatcatcttc accatgcatt 5160
aagatctgaa cgcgtatgaa tgttacgtcc tgtagaaacc ccaacccgtg aaatcaaaaa 5220
actcgacggc ctgtgggcat tcagtctgga tcgcgaaaac tgtggaattg atcagcgttg 5280
gtgggaaagc gcgttacaag aaagccgggc aattgctgtg ccaggcagtt ttaacgatca 5340
gttcgccgat gcagatattc gtaattatgc gggcaacgtc tggtatcagc gcgaagtctt 5400
tatatcgaaa ggttgggcag gccagcgtat cgtgctgcgt ttcgatgcgg tcactcatta 5460
cggcaaagtg tgggtcaata atcaggaagt gatggagcat cagggcggct atacgccatt 5520
tgaagccgat gtcacgccgt atgttattgc cgggaaaagt gtacgtatca ccgtttgtgt 5580
gaacaacgaa ctgaactggc agactatccc gccgggaatg gtgattaccg acgaaaacgg 5640
caagaaaaag cagtcttact tccatgattt ctttaactat gccggaatcc atcgcactag 5700
tgttaacgct agccaccacc accaccacca cgtgtgaatt acaggtgacc agctcgaatt 5760
tccccgatcg ttcaaacatt tggcaataaa gtttcttaag attgaatcct gttgccggtc 5820
ttgcgatgat tatcatataa tttctgttga attacgttaa gcatgtaata attaacatgt 5880
aatgcatgac gttatttatg agatgggttt ttatgattag agtcccgcaa ttatacattt 5940
aatacgcgat agaaaacaaa atatagcgcg caaactagga taaattatcg cgcgcggtgt 6000
catctatgtt actagatcgg gaattaaact atcagtgttt gacaggatat attggcgggt 6060
aaacctaaga gaaaagagcg tttattagaa taacggatat ttaaaagggc gtgaaaaggt 6120
ttatccgttc gtccatttgt atgtgcatgc caaccacagg gttcccctcg ggatcaaagt 6180
actttgatcc aacccctccg ctgctatagt gcagtcggct tctgacgttc agtgcagccg 6240
tcttctgaaa acgacatgtc gcacaagtcc taagttacgc gacaggctgc cgccctgccc 6300
ttttcctggc gttttcttgt cgcgtgtttt agtcgcataa agtagaatac ttgcgactag 6360
aaccggagac attacgccat gaacaagagc gccgccgctg gcctgctggg ctatgcccgc 6420
gtcagcaccg acgaccagga cttgaccaac caacgggccg aactgcacgc ggccggctgc 6480
accaagctgt tttccgagaa gatcaccggc accaggcgcg accgcccgga gctggccagg 6540
atgcttgacc acctacgccc tggcgacgtt gtgacagtga ccaggctaga ccgcctggcc 6600
cgcagcaccc gcgacctact ggacattgcc gagcgcatcc aggaggccgg cgcgggcctg 6660
cgtagcctgg cagagccgtg ggccgacacc accacgccgg ccggccgcat ggtgttgacc 6720
gtgttcgccg gcattgccga gttcgagcgt tccctaatca tcgaccgcac ccggagcggg 6780
cgcgaggccg ccaaggcccg aggcgtgaag tttggccccc gccctaccct caccccggca 6840
cagatcgcgc acgcccgcga gctgatcgac caggaaggcc gcaccgtgaa agaggcggct 6900
gcactgcttg gcgtgcatcg ctcgaccctg taccgcgcac ttgagcgcag cgaggaagtg 6960
acgcccaccg aggccaggcg gcgcggtgcc ttccgtgagg acgcattgac cgaggccgac 7020
gccctggcgg ccgccgagaa tgaacgccaa gaggaacaag catgaaaccg caccaggacg 7080
gccaggacga accgtttttc attaccgaag agatcgaggc ggagatgatc gcggccgggt 7140
acgtgttcga gccgcccgcg cacgtctcaa ccgtgcggct gcatgaaatc ctggccggtt 7200
tgtctgatgc caagctggcg gcctggccgg ccagcttggc cgctgaagaa accgagcgcc 7260
gccgtctaaa aaggtgatgt gtatttgagt aaaacagctt gcgtcatgcg gtcgctgcgt 7320
atatgatgcg atgagtaaat aaacaaatac gcaaggggaa cgcatgaagg ttatcgctgt 7380
acttaaccag aaaggcgggt caggcaagac gaccatcgca acccatctag cccgcgccct 7440
gcaactcgcc ggggccgatg ttctgttagt cgattccgat ccccagggca gtgcccgcga 7500
ttgggcggcc gtgcgggaag atcaaccgct aaccgttgtc ggcatcgacc gcccgacgat 7560
tgaccgcgac gtgaaggcca tcggccggcg cgacttcgta gtgatcgacg gagcgcccca 7620
ggcggcggac ttggctgtgt ccgcgatcaa ggcagccgac ttcgtgctga ttccggtgca 7680
gccaagccct tacgacatat gggccaccgc cgacctggtg gagctggtta agcagcgcat 7740
tgaggtcacg gatggaaggc tacaagcggc ctttgtcgtg tcgcgggcga tcaaaggcac 7800
gcgcatcggc ggtgaggttg ccgaggcgct ggccgggtac gagctgccca ttcttgagtc 7860
ccgtatcacg cagcgcgtga gctacccagg cactgccgcc gccggcacaa ccgttcttga 7920
atcagaaccc gagggcgacg ctgcccgcga ggtccaggcg ctggccgctg aaattaaatc 7980
aaaactcatt tgagttaatg aggtaaagag aaaatgagca aaagcacaaa cacgctaagt 8040
gccggccgtc cgagcgcacg cagcagcaag gctgcaacgt tggccagcct ggcagacacg 8100
ccagccatga agcgggtcaa ctttcagttg ccggcggagg atcacaccaa gctgaagatg 8160
tacgcggtac gccaaggcaa gaccattacc gagctgctat ctgaatacat cgcgcagcta 8220
ccagagtaaa tgagcaaatg aataaatgag tagatgaatt ttagcggcta aaggaggcgg 8280
catggaaaat caagaacaac caggcaccga cgccgtggaa tgccccatgt gtggaggaac 8340
gggcggttgg ccaggcgtaa gcggctgggt tgtctgccgg ccctgcaatg gcactggaac 8400
ccccaagccc gaggaatcgg cgtgacggtc gcaaaccatc cggcccggta caaatcggcg 8460
cggcgctggg tgatgacctg gtggagaagt tgaaggccgc gcaggccgcc cagcggcaac 8520
gcatcgaggc agaagcacgc cccggtgaat cgtggcaagc ggccgctgat cgaatccgca 8580
aagaatcccg gcaaccgccg gcagccggtg cgccgtcgat taggaagccg cccaagggcg 8640
acgagcaacc agattttttc gttccgatgc tctatgacgt gggcacccgc gatagtcgca 8700
gcatcatgga cgtggccgtt ttccgtctgt cgaagcgtga ccgacgagct ggcgaggtga 8760
tccgctacga gcttccagac gggcacgtag aggtttccgc agggccggcc ggcatggcca 8820
gtgtgtggga ttacgacctg gtactgatgg cggtttccca tctaaccgaa tccatgaacc 8880
gataccggga agggaaggga gacaagcccg gccgcgtgtt ccgtccacac gttgcggacg 8940
tactcaagtt ctgccggcga gccgatggcg gaaagcagaa agacgacctg gtagaaacct 9000
gcattcggtt aaacaccacg cacgttgcca tgcagcgtac gaagaaggcc aagaacggcc 9060
gcctggtgac ggtatccgag ggtgaagcct tgattagccg ctacaagatc gtaaagagcg 9120
aaaccgggcg gccggagtac atcgagatcg agctagctga ttggatgtac cgcgagatca 9180
cagaaggcaa gaacccggac gtgctgacgg ttcaccccga ttactttttg atcgatcccg 9240
gcatcggccg ttttctctac cgcctggcac gccgcgccgc aggcaaggca gaagccagat 9300
ggttgttcaa gacgatctac gaacgcagtg gcagcgccgg agagttcaag aagttctgtt 9360
tcaccgtgcg caagctgatc gggtcaaatg acctgccgga gtacgatttg aaggaggagg 9420
cggggcaggc tggcccgatc ctagtcatgc gctaccgcaa cctgatcgag ggcgaagcat 9480
ccgccggttc ctaatgtacg gagcagatgc tagggcaaat tgccctagca ggggaaaaag 9540
gtcgaaaagg tctctttcct gtggatagca cgtacattgg gaacccaaag ccgtacattg 9600
ggaaccggaa cccgtacatt gggaacccaa agccgtacat tgggaaccgg tcacacatgt 9660
aagtgactga tataaaagag aaaaaaggcg atttttccgc ctaaaactct ttaaaactta 9720
ttaaaactct taaaacccgc ctggcctgtg cataactgtc tggccagcgc acagccgaag 9780
agctgcaaaa agcgcctacc cttcggtcgc tgcgctccct acgccccgcc gcttcgcgtc 9840
ggcctatcgc ggccgctggc cgctcaaaaa tggctggcct acggccaggc aatctaccag 9900
ggcgcggaca agccgcgccg tcgccactcg accgccggcg cccacatcaa ggcaccctgc 9960
ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc 10020
acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt 10080
gttggcgggt gtcggggcgc agccatgacc cagtcacgta gcgatagcgg agtgtatact 10140
ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg tactgagagt gcaccatatg cggtgtgaaa 10200
taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggcg ctcttccgct tcctcgctca 10260
ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg 10320
taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc 10380
agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc 10440
cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac 10500
tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc 10560
tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata 10620
gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc 10680
acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca 10740
acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag 10800
cgaggtatgt aggcgg 10816
<210> 4
<211> 11429
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒
<400> 4
tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg 60
tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg 120
caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 180
aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa 240
cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gcatgatata tctcccaatt tgtgtagggc 300
ttattatgca cgcttaaaaa taataaaagc agacttgacc tgatagtttg gctgtgagca 360
attatgtgct tagtgcatct aatcgcttga gttaacgccg gcgaagcggc gtcggcttga 420
acgaatttct agctagacat tatttgccga ctaccttggt gatctcgcct ttcacgtagt 480
ggacaaattc ttccaactga tctgcgcgcg aggccaagcg atcttcttct tgtccaagat 540
aagcctgtct agcttcaagt atgacgggct gatactgggc cggcaggcgc tccattgccc 600
agtcggcagc gacatccttc ggcgcgattt tgccggttac tgcgctgtac caaatgcggg 660
acaacgtaag cactacattt cgctcatcgc cagcccagtc gggcggcgag ttccatagcg 720
ttaaggtttc atttagcgcc tcaaatagat cctgttcagg aaccggatca aagagttcct 780
ccgccgctgg acctaccaag gcaacgctat gttctcttgc ttttgtcagc aagatagcca 840
gatcaatgtc gatcgtggct ggctcgaaga tacctgcaag aatgtcattg cgctgccatt 900
ctccaaattg cagttcgcgc ttagctggat aacgccacgg aatgatgtcg tcgtgcacaa 960
caatggtgac ttctacagcg cggagaatct cgctctctcc aggggaagcc gaagtttcca 1020
aaaggtcgtt gatcaaagct cgccgcgttg tttcatcaag ccttacggtc accgtaacca 1080
gcaaatcaat atcactgtgt ggcttcaggc cgccatccac tgcggagccg tacaaatgta 1140
cggccagcaa cgtcggttcg agatggcgct cgatgacgcc aactacctct gatagttgag 1200
tcgatacttc ggcgatcacc gcttccccca tgatgtttaa ctttgtttta gggcgactgc 1260
cctgctgcgt aacatcgttg ctgctccata acatcaaaca tcgacccacg gcgtaacgcg 1320
cttgctgctt ggatgcccga ggcatagact gtaccccaaa aaaacatgtc ataacaagaa 1380
gccatgaaaa ccgccactgc gccgttacca ccgctgcgtt cggtcaaggt tctggaccag 1440
ttgcgtgacg gcagttacgc tacttgcatt acagcttacg aaccgaacga ggcttatgtc 1500
cactgggttc gtgcccgaat tgatcacagg cagcaacgct ctgtcatccg cggtgatcac 1560
aggcagcaac gctctgtcat cgttacaatc aacatgctac cctccgcgag atcatccgtg 1620
tttcaaaccc ggcagcttag ttgccgttct tccgaatagc atcggtaaca tgagcaaagt 1680
ctgccgcctt acaacggctc tcccgctgac gccgtcccgg actgatgggc tgcctgtatc 1740
gagtggtgat tttgtgccga gctgccggtc ggggagctgt tggctggctg gtggcaggat 1800
atattgtggt gtaaacaaat tgacgcttag acaacttaat aacacattgc ggacgttttt 1860
aatgtactga attaacgccg aattaattcg ggggatctgg attttagtac tggattttgg 1920
ttttaggaat tagaaatttt attgatagaa gtattttaca aatacaaata catactaagg 1980
gtttcttata tgctcaacac atgagcgaaa ccctatagga accctaattc ccttatctgg 2040
gaactactca cacattatta tggagaaact cgagcttgtc gatcgactct agctagagga 2100
tcgatccgaa ccccagagtc ccgctcagaa gaactcgtca agaaggcgat agaaggcgat 2160
gcgctgcgaa tcgggagcgg cgataccgta aagcacgagg aagcggtcag cccattcgcc 2220
gccaagctct tcagcaatat cacgggtagc caacgctatg tcctgatagc ggtccgccac 2280
acccagccgg ccacagtcga tgaatccaga aaagcggcca ttttccacca tgatattcgg 2340
caagcaggca tcgccatggg tcacgacgag atcatcgccg tcgggcatgc gcgccttgag 2400
cctggcgaac agttcggctg gcgcgagccc ctgatgctct tcgtccagat catcctgatc 2460
gacaagaccg gcttccatcc gagtacgtgc tcgctcgatg cgatgtttcg cttggtggtc 2520
gaatgggcag gtagccggat caagcgtatg cagccgccgc attgcatcag ccatgatgga 2580
tactttctcg gcaggagcaa ggtgagatga caggagatcc tgccccggca cttcgcccaa 2640
tagcagccag tcccttcccg cttcagtgac aacgtcgagc acagctgcgc aaggaacgcc 2700
cgtcgtggcc agccacgata gccgcgctgc ctcgtcctgc agttcattca gggcaccgga 2760
caggtcggtc ttgacaaaaa gaaccgggcg cccctgcgct gacagccgga acacggcggc 2820
atcagagcag ccgattgtct gttgtgccca gtcatagccg aatagcctct ccacccaagc 2880
ggccggagaa cctgcgtgca atccatcttg ttcaatcatg cgaaacgatc cagatccggt 2940
gcagattatt tggattgaga gtgaatatga gactctaatt ggataccgag gggaatttat 3000
ggaacgtcag tggagcattt ttgacaagaa atatttgcta gctgatagtg accttaggcg 3060
acttttgaac gcgcaataat ggtttctgac gtatgtgctt agctcattaa actccagaaa 3120
cccgcggctg agtggctcct tcaatcgttg cggttctgtc agttccaaac gtaaaacggc 3180
ttgtcccgcg tcatcggcgg gggtcataac gtgactccct taattctccg ctcatgatca 3240
gattgtcgtt tcccgccttc agtttccaag cttggcactg gccgtcgttt tacaacgtcg 3300
tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc 3360
cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct 3420
gaatggcgaa tgctagagca gcttgagctt ggatcagatt gtcgtttccc gccttcagtt 3480
tagcttcatg gagtcaaaga ttcaaataga ggacctaaca gaactcgccg taaagactgg 3540
cgaacagttc atacagagtc tcttacgact caatgacaag aagaaaatct tcgtcaacat 3600
ggtggagcac gacacacttg tctactccaa aaatatcaaa gatacagtct cagaagacca 3660
aagggcaatt gagacttttc aacaaagggt aatatccgga aacctcctcg gattccattg 3720
cccagctatc tgtcacttta ttgtgaagat agtggaaaag gaaggtggct cctacaaatg 3780
ccatcattgc gataaaggaa aggccatcgt tgaagatgcc tctgccgaca gtggtcccaa 3840
agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa gacgttccaa ccacgtcttc 3900
aaagcaagtg gattgatgtg atatctccac tgacgtaagg gatgacgcac aatcccacta 3960
tccttcgcaa gacccttcct ctatataagg aagttcattt catttggaga gaacacgggg 4020
gactcttgac catggttctg gatgccttct aacagtgagc agagggagcc tgaaaagaag 4080
gcccaaaggc aagggaaatg ctggttgtca ctagatacaa acagccctaa actttttatg 4140
catggtgaag atgataaaga aaaagtgaac caacaatttc cgtacccctt tttttggatg 4200
ccttttcaaa ctgaggaagg ggaggttgaa aagaaccgcg ggaattcgat tgcgcgtcga 4260
catgttacgt cctgtagaaa ccccaacccg tgaaatcaaa aaactcgacg gcctgtgggc 4320
attcagtctg gatcgcgaaa actgtggaat tgatcagcgt tggtgggaaa gcgcgttaca 4380
agaaagccgg gcaattgctg tgccaggcag ttttaacgat cagttcgccg atgcagatat 4440
tcgtaattat gcgggcaacg tctggtatca gcgcgaagtc tttatatcga aaggttgggc 4500
aggccagcgt atcgtgctgc gtttcgatgc ggtcactcat tacggcaaag tgtgggtcaa 4560
taatcaggaa gtgatggagc atcagggcgg ctatacgcca tttgaagccg atgtcacgcc 4620
gtatgttatt gccgggaaaa gtgtacgtat caccgtttgt gtgaacaacg aactgaactg 4680
gcagactatc ccgccgggaa tggtgattac cgacgaaaac ggcaagaaaa agcagtctta 4740
cttccatgat ttctttaact atgccggaat ccatcgcagc gtaatgctct acaccacgcc 4800
gaacacctgg gtggacgata tcaccgtggt gacgcatgtc gcgcaagact gtaaccacgc 4860
gtctgttgac tggcaggtgg tggccaatgg tgatgtcagc gttgaactgc gtgatgcggg 4920
atcaacaggt ggttgcaact ggacaaggca ctagcgggac tttgcaagtg gtgaatccgc 4980
acctctggca accgggtgaa ggttatctct atgaactgtg cgtcacagcc aaaagccaga 5040
cagagtgtga tatctacccg cttcgcgtcg gcatccggtc agtggcagtg aagggcgaac 5100
agttcctgat taaccacaaa ccgttctact ttactggctt tggtcgtcat gaagatgcgg 5160
acttgcgtgg caaaaggatt cgataacgtg ctgatggtgc acgaccacgc attaatggac 5220
tggattgggg ccaactccta ccgtacctcg cattaccctt acgctgaaga gatgctcgac 5280
tgggcagatg aacatggcat cgtggtgatt gatgaaactg ctgctgtcgg ctttaacctc 5340
tctttaggca ttggtttcga agcgggcaac aagccgaaag aactgtacag cgaagaggca 5400
gtcaacgggg aaactcagca agcgcactta caggcgatta aagagctgat agcgcgtgac 5460
aaaaaccacc caagcgtggt gatgtggagt attgccaacg aaccggatac ccgtccgcaa 5520
ggtgcacggg aatatttcgc gccactggcg gaagcaacgc gtaaactcga cccgacgcgt 5580
ccgatcacct gcgtcaatgt aatgttctgc gacgctcaca ccgataccat cagcgatctc 5640
tttgatgtgc tgtgcctgaa ccgttattac ggatggtatg tccaaagcgg cgatttggaa 5700
acggcagaga aggtactgga aaaagaactt ctggcctggc aggagaaact gcatcagccg 5760
attatcatca ccgaatacgg cgtggatacg ttagccgggc tgcactcaat gtacaccgac 5820
atgtggagtg aagagtatca gtgtgcatgg ctggatatgt atcaccgcgt ctttgatcgc 5880
gtcagcgccg tcgtcggtga acaggtatgg aatttcgccg attttgcgac ctcgcaaggc 5940
atattgcgcg ttggcggtaa caagaaaggg atcttcactc gcgaccgcaa accgaagtcg 6000
gcggcttttc tgctgcaaaa acgctggact ggcatgaact tcggtgaaaa accgcagcag 6060
ggaggcaaac aagctagcca ccaccaccac caccacgtgt gactcgagtt cttttcaacc 6120
tccccttcct cagtttgaaa aggcatccaa aaaaaggggt acggaaattg ttggttcact 6180
ttttctttat catcttcacc atgcataaaa agtttagggc tgtttgtatc tagtgacaac 6240
cagcatttcc cttgcctttg ggccttcttt tcaggctccc tctgctcact gttagaaggc 6300
atccagaaac tagtgttaac gctagccacc accaccacca ccacgtgtga attacaggtg 6360
accagctcga atttccccga tcgttcaaac atttggcaat aaagtttctt aagattgaat 6420
cctgttgccg gtcttgcgat gattatcata taatttctgt tgaattacgt taagcatgta 6480
ataattaaca tgtaatgcat gacgttattt atgagatggg tttttatgat tagagtcccg 6540
caattataca tttaatacgc gatagaaaac aaaatatagc gcgcaaacta ggataaatta 6600
tcgcgcgcgg tgtcatctat gttactagat cgggaattaa actatcagtg tttgacagga 6660
tatattggcg ggtaaaccta agagaaaaga gcgtttatta gaataacgga tatttaaaag 6720
ggcgtgaaaa ggtttatccg ttcgtccatt tgtatgtgca tgccaaccac agggttcccc 6780
tcgggatcaa agtactttga tccaacccct ccgctgctat agtgcagtcg gcttctgacg 6840
ttcagtgcag ccgtcttctg aaaacgacat gtcgcacaag tcctaagtta cgcgacaggc 6900
tgccgccctg cccttttcct ggcgttttct tgtcgcgtgt tttagtcgca taaagtagaa 6960
tacttgcgac tagaaccgga gacattacgc catgaacaag agcgccgccg ctggcctgct 7020
gggctatgcc cgcgtcagca ccgacgacca ggacttgacc aaccaacggg ccgaactgca 7080
cgcggccggc tgcaccaagc tgttttccga gaagatcacc ggcaccaggc gcgaccgccc 7140
ggagctggcc aggatgcttg accacctacg ccctggcgac gttgtgacag tgaccaggct 7200
agaccgcctg gcccgcagca cccgcgacct actggacatt gccgagcgca tccaggaggc 7260
cggcgcgggc ctgcgtagcc tggcagagcc gtgggccgac accaccacgc cggccggccg 7320
catggtgttg accgtgttcg ccggcattgc cgagttcgag cgttccctaa tcatcgaccg 7380
cacccggagc gggcgcgagg ccgccaaggc ccgaggcgtg aagtttggcc cccgccctac 7440
cctcaccccg gcacagatcg cgcacgcccg cgagctgatc gaccaggaag gccgcaccgt 7500
gaaagaggcg gctgcactgc ttggcgtgca tcgctcgacc ctgtaccgcg cacttgagcg 7560
cagcgaggaa gtgacgccca ccgaggccag gcggcgcggt gccttccgtg aggacgcatt 7620
gaccgaggcc gacgccctgg cggccgccga gaatgaacgc caagaggaac aagcatgaaa 7680
ccgcaccagg acggccagga cgaaccgttt ttcattaccg aagagatcga ggcggagatg 7740
atcgcggccg ggtacgtgtt cgagccgccc gcgcacgtct caaccgtgcg gctgcatgaa 7800
atcctggccg gtttgtctga tgccaagctg gcggcctggc cggccagctt ggccgctgaa 7860
gaaaccgagc gccgccgtct aaaaaggtga tgtgtatttg agtaaaacag cttgcgtcat 7920
gcggtcgctg cgtatatgat gcgatgagta aataaacaaa tacgcaaggg gaacgcatga 7980
aggttatcgc tgtacttaac cagaaaggcg ggtcaggcaa gacgaccatc gcaacccatc 8040
tagcccgcgc cctgcaactc gccggggccg atgttctgtt agtcgattcc gatccccagg 8100
gcagtgcccg cgattgggcg gccgtgcggg aagatcaacc gctaaccgtt gtcggcatcg 8160
accgcccgac gattgaccgc gacgtgaagg ccatcggccg gcgcgacttc gtagtgatcg 8220
acggagcgcc ccaggcggcg gacttggctg tgtccgcgat caaggcagcc gacttcgtgc 8280
tgattccggt gcagccaagc ccttacgaca tatgggccac cgccgacctg gtggagctgg 8340
ttaagcagcg cattgaggtc acggatggaa ggctacaagc ggcctttgtc gtgtcgcggg 8400
cgatcaaagg cacgcgcatc ggcggtgagg ttgccgaggc gctggccggg tacgagctgc 8460
ccattcttga gtcccgtatc acgcagcgcg tgagctaccc aggcactgcc gccgccggca 8520
caaccgttct tgaatcagaa cccgagggcg acgctgcccg cgaggtccag gcgctggccg 8580
ctgaaattaa atcaaaactc atttgagtta atgaggtaaa gagaaaatga gcaaaagcac 8640
aaacacgcta agtgccggcc gtccgagcgc acgcagcagc aaggctgcaa cgttggccag 8700
cctggcagac acgccagcca tgaagcgggt caactttcag ttgccggcgg aggatcacac 8760
caagctgaag atgtacgcgg tacgccaagg caagaccatt accgagctgc tatctgaata 8820
catcgcgcag ctaccagagt aaatgagcaa atgaataaat gagtagatga attttagcgg 8880
ctaaaggagg cggcatggaa aatcaagaac aaccaggcac cgacgccgtg gaatgcccca 8940
tgtgtggagg aacgggcggt tggccaggcg taagcggctg ggttgtctgc cggccctgca 9000
atggcactgg aacccccaag cccgaggaat cggcgtgacg gtcgcaaacc atccggcccg 9060
gtacaaatcg gcgcggcgct gggtgatgac ctggtggaga agttgaaggc cgcgcaggcc 9120
gcccagcggc aacgcatcga ggcagaagca cgccccggtg aatcgtggca agcggccgct 9180
gatcgaatcc gcaaagaatc ccggcaaccg ccggcagccg gtgcgccgtc gattaggaag 9240
ccgcccaagg gcgacgagca accagatttt ttcgttccga tgctctatga cgtgggcacc 9300
cgcgatagtc gcagcatcat ggacgtggcc gttttccgtc tgtcgaagcg tgaccgacga 9360
gctggcgagg tgatccgcta cgagcttcca gacgggcacg tagaggtttc cgcagggccg 9420
gccggcatgg ccagtgtgtg ggattacgac ctggtactga tggcggtttc ccatctaacc 9480
gaatccatga accgataccg ggaagggaag ggagacaagc ccggccgcgt gttccgtcca 9540
cacgttgcgg acgtactcaa gttctgccgg cgagccgatg gcggaaagca gaaagacgac 9600
ctggtagaaa cctgcattcg gttaaacacc acgcacgttg ccatgcagcg tacgaagaag 9660
gccaagaacg gccgcctggt gacggtatcc gagggtgaag ccttgattag ccgctacaag 9720
atcgtaaaga gcgaaaccgg gcggccggag tacatcgaga tcgagctagc tgattggatg 9780
taccgcgaga tcacagaagg caagaacccg gacgtgctga cggttcaccc cgattacttt 9840
ttgatcgatc ccggcatcgg ccgttttctc taccgcctgg cacgccgcgc cgcaggcaag 9900
gcagaagcca gatggttgtt caagacgatc tacgaacgca gtggcagcgc cggagagttc 9960
aagaagttct gtttcaccgt gcgcaagctg atcgggtcaa atgacctgcc ggagtacgat 10020
ttgaaggagg aggcggggca ggctggcccg atcctagtca tgcgctaccg caacctgatc 10080
gagggcgaag catccgccgg ttcctaatgt acggagcaga tgctagggca aattgcccta 10140
gcaggggaaa aaggtcgaaa aggtctcttt cctgtggata gcacgtacat tgggaaccca 10200
aagccgtaca ttgggaaccg gaacccgtac attgggaacc caaagccgta cattgggaac 10260
cggtcacaca tgtaagtgac tgatataaaa gagaaaaaag gcgatttttc cgcctaaaac 10320
tctttaaaac ttattaaaac tcttaaaacc cgcctggcct gtgcataact gtctggccag 10380
cgcacagccg aagagctgca aaaagcgcct acccttcggt cgctgcgctc cctacgcccc 10440
gccgcttcgc gtcggcctat cgcggccgct ggccgctcaa aaatggctgg cctacggcca 10500
ggcaatctac cagggcgcgg acaagccgcg ccgtcgccac tcgaccgccg gcgcccacat 10560
caaggcaccc tgcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct 10620
cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg 10680
cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg acccagtcac gtagcgatag 10740
cggagtgtat actggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat 10800
atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgctcttcc 10860
gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct 10920
cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg 10980
tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 11040
cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 11100
aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 11160
cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 11220
gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 11280
ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 11340
cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 11400
aggattagca gagcgaggta tgtaggcgg 11429
<210> 5
<211> 11614
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒
<400> 5
tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg 60
tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg 120
caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 180
aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa 240
cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gcatgatata tctcccaatt tgtgtagggc 300
ttattatgca cgcttaaaaa taataaaagc agacttgacc tgatagtttg gctgtgagca 360
attatgtgct tagtgcatct aatcgcttga gttaacgccg gcgaagcggc gtcggcttga 420
acgaatttct agctagacat tatttgccga ctaccttggt gatctcgcct ttcacgtagt 480
ggacaaattc ttccaactga tctgcgcgcg aggccaagcg atcttcttct tgtccaagat 540
aagcctgtct agcttcaagt atgacgggct gatactgggc cggcaggcgc tccattgccc 600
agtcggcagc gacatccttc ggcgcgattt tgccggttac tgcgctgtac caaatgcggg 660
acaacgtaag cactacattt cgctcatcgc cagcccagtc gggcggcgag ttccatagcg 720
ttaaggtttc atttagcgcc tcaaatagat cctgttcagg aaccggatca aagagttcct 780
ccgccgctgg acctaccaag gcaacgctat gttctcttgc ttttgtcagc aagatagcca 840
gatcaatgtc gatcgtggct ggctcgaaga tacctgcaag aatgtcattg cgctgccatt 900
ctccaaattg cagttcgcgc ttagctggat aacgccacgg aatgatgtcg tcgtgcacaa 960
caatggtgac ttctacagcg cggagaatct cgctctctcc aggggaagcc gaagtttcca 1020
aaaggtcgtt gatcaaagct cgccgcgttg tttcatcaag ccttacggtc accgtaacca 1080
gcaaatcaat atcactgtgt ggcttcaggc cgccatccac tgcggagccg tacaaatgta 1140
cggccagcaa cgtcggttcg agatggcgct cgatgacgcc aactacctct gatagttgag 1200
tcgatacttc ggcgatcacc gcttccccca tgatgtttaa ctttgtttta gggcgactgc 1260
cctgctgcgt aacatcgttg ctgctccata acatcaaaca tcgacccacg gcgtaacgcg 1320
cttgctgctt ggatgcccga ggcatagact gtaccccaaa aaaacatgtc ataacaagaa 1380
gccatgaaaa ccgccactgc gccgttacca ccgctgcgtt cggtcaaggt tctggaccag 1440
ttgcgtgacg gcagttacgc tacttgcatt acagcttacg aaccgaacga ggcttatgtc 1500
cactgggttc gtgcccgaat tgatcacagg cagcaacgct ctgtcatccg cggtgatcac 1560
aggcagcaac gctctgtcat cgttacaatc aacatgctac cctccgcgag atcatccgtg 1620
tttcaaaccc ggcagcttag ttgccgttct tccgaatagc atcggtaaca tgagcaaagt 1680
ctgccgcctt acaacggctc tcccgctgac gccgtcccgg actgatgggc tgcctgtatc 1740
gagtggtgat tttgtgccga gctgccggtc ggggagctgt tggctggctg gtggcaggat 1800
atattgtggt gtaaacaaat tgacgcttag acaacttaat aacacattgc ggacgttttt 1860
aatgtactga attaacgccg aattaattcg ggggatctgg attttagtac tggattttgg 1920
ttttaggaat tagaaatttt attgatagaa gtattttaca aatacaaata catactaagg 1980
gtttcttata tgctcaacac atgagcgaaa ccctatagga accctaattc ccttatctgg 2040
gaactactca cacattatta tggagaaact cgagcttgtc gatcgactct agctagagga 2100
tcgatccgaa ccccagagtc ccgctcagaa gaactcgtca agaaggcgat agaaggcgat 2160
gcgctgcgaa tcgggagcgg cgataccgta aagcacgagg aagcggtcag cccattcgcc 2220
gccaagctct tcagcaatat cacgggtagc caacgctatg tcctgatagc ggtccgccac 2280
acccagccgg ccacagtcga tgaatccaga aaagcggcca ttttccacca tgatattcgg 2340
caagcaggca tcgccatggg tcacgacgag atcatcgccg tcgggcatgc gcgccttgag 2400
cctggcgaac agttcggctg gcgcgagccc ctgatgctct tcgtccagat catcctgatc 2460
gacaagaccg gcttccatcc gagtacgtgc tcgctcgatg cgatgtttcg cttggtggtc 2520
gaatgggcag gtagccggat caagcgtatg cagccgccgc attgcatcag ccatgatgga 2580
tactttctcg gcaggagcaa ggtgagatga caggagatcc tgccccggca cttcgcccaa 2640
tagcagccag tcccttcccg cttcagtgac aacgtcgagc acagctgcgc aaggaacgcc 2700
cgtcgtggcc agccacgata gccgcgctgc ctcgtcctgc agttcattca gggcaccgga 2760
caggtcggtc ttgacaaaaa gaaccgggcg cccctgcgct gacagccgga acacggcggc 2820
atcagagcag ccgattgtct gttgtgccca gtcatagccg aatagcctct ccacccaagc 2880
ggccggagaa cctgcgtgca atccatcttg ttcaatcatg cgaaacgatc cagatccggt 2940
gcagattatt tggattgaga gtgaatatga gactctaatt ggataccgag gggaatttat 3000
ggaacgtcag tggagcattt ttgacaagaa atatttgcta gctgatagtg accttaggcg 3060
acttttgaac gcgcaataat ggtttctgac gtatgtgctt agctcattaa actccagaaa 3120
cccgcggctg agtggctcct tcaatcgttg cggttctgtc agttccaaac gtaaaacggc 3180
ttgtcccgcg tcatcggcgg gggtcataac gtgactccct taattctccg ctcatgatca 3240
gattgtcgtt tcccgccttc agtttccaag cttgcaaaat agcacaccat ttatgtttat 3300
attttcaaat tatttaatac atttcaatat ttcataagtg tgattttttt tttttttgtc 3360
aatttcataa gtgtgatttg tcatttgtat taaacaattg tatcgcgcag tacaaataaa 3420
cagtgggaga ggtgaaaatg cagttataaa actgtccaat aatttactaa cacatttaaa 3480
tatctaaaaa gagtgtttca aaaaaaattc ttttgaaata agaaaagtga tagatatttt 3540
tacgctttcg tctgaaaata aaacaataat agtttattag aaaaatgtta tcaccgaaaa 3600
ttattctagt gccactcgct cggatcgaaa ttcgaaagtt atattctttc tctttaccta 3660
atataaaaat cacaagaaaa atcaatccga atatatctat caacatagta tatgccctta 3720
catattgttt ctgacttttc tctatccgaa tttctcgctt catggttttt ttttaacata 3780
ttctcattta attttcatta ctattatata actaaaagat ggaaataaaa taaagtgtct 3840
ttgagaatcg aacgtccata tcagtaagat agtttgtgtg aaggtaaaat ctaaaagatt 3900
taagttccaa aaacagaaaa taatatatta cgctaaaaaa gaagaaaata attaaataca 3960
aaacagaaaa aaataatata cgacagacac gtgtcacgaa gataccctac gctatagaca 4020
cagctctgtt ttctcttttc tatgcctcaa ggctctctta acttcactgt ctcctcttcg 4080
gataatccta tccttctctt cctataaata cctctccact cttcctcttc ctccaccact 4140
acaaccaccg caacaaccac caaaaaccct ctcaaagaaa tttctttttt ttcttacttt 4200
cttggtttgt caaaccatgg ttctggatgc cttctaacag tgagcagagg gagcctgaaa 4260
agaaggccca aaggcaaggg aaatgctggt tgtcactaga tacaaacagc cctaaacttt 4320
ttatgcatgg tgaagatgat aaagaaaaag tgaaccaaca atttccgtac cccttttttt 4380
ggatgccttt tcaaactgag gaaggggagg ttgaaaagaa ccgcgggaat tcgattgcgc 4440
gtcgacatgt tacgtcctgt agaaacccca acccgtgaaa tcaaaaaact cgacggcctg 4500
tgggcattca gtctggatcg cgaaaactgt ggaattgatc agcgttggtg ggaaagcgcg 4560
ttacaagaaa gccgggcaat tgctgtgcca ggcagtttta acgatcagtt cgccgatgca 4620
gatattcgta attatgcggg caacgtctgg tatcagcgcg aagtctttat atcgaaaggt 4680
tgggcaggcc agcgtatcgt gctgcgtttc gatgcggtca ctcattacgg caaagtgtgg 4740
gtcaataatc aggaagtgat ggagcatcag ggcggctata cgccatttga agccgatgtc 4800
acgccgtatg ttattgccgg gaaaagtgta cgtatcaccg tttgtgtgaa caacgaactg 4860
aactggcaga ctatcccgcc gggaatggtg attaccgacg aaaacggcaa gaaaaagcag 4920
tcttacttcc atgatttctt taactatgcc ggaatccatc gcagcgtaat gctctacacc 4980
acgccgaaca cctgggtgga cgatatcacc gtggtgacgc atgtcgcgca agactgtaac 5040
cacgcgtctg ttgactggca ggtggtggcc aatggtgatg tcagcgttga actgcgtgat 5100
gcgggatcaa caggtggttg caactggaca aggcactagc gggactttgc aagtggtgaa 5160
tccgcacctc tggcaaccgg gtgaaggtta tctctatgaa ctgtgcgtca cagccaaaag 5220
ccagacagag tgtgatatct acccgcttcg cgtcggcatc cggtcagtgg cagtgaaggg 5280
cgaacagttc ctgattaacc acaaaccgtt ctactttact ggctttggtc gtcatgaaga 5340
tgcggacttg cgtggcaaaa ggattcgata acgtgctgat ggtgcacgac cacgcattaa 5400
tggactggat tggggccaac tcctaccgta cctcgcatta cccttacgct gaagagatgc 5460
tcgactgggc agatgaacat ggcatcgtgg tgattgatga aactgctgct gtcggcttta 5520
acctctcttt aggcattggt ttcgaagcgg gcaacaagcc gaaagaactg tacagcgaag 5580
aggcagtcaa cggggaaact cagcaagcgc acttacaggc gattaaagag ctgatagcgc 5640
gtgacaaaaa ccacccaagc gtggtgatgt ggagtattgc caacgaaccg gatacccgtc 5700
cgcaaggtgc acgggaatat ttcgcgccac tggcggaagc aacgcgtaaa ctcgacccga 5760
cgcgtccgat cacctgcgtc aatgtaatgt tctgcgacgc tcacaccgat accatcagcg 5820
atctctttga tgtgctgtgc ctgaaccgtt attacggatg gtatgtccaa agcggcgatt 5880
tggaaacggc agagaaggta ctggaaaaag aacttctggc ctggcaggag aaactgcatc 5940
agccgattat catcaccgaa tacggcgtgg atacgttagc cgggctgcac tcaatgtaca 6000
ccgacatgtg gagtgaagag tatcagtgtg catggctgga tatgtatcac cgcgtctttg 6060
atcgcgtcag cgccgtcgtc ggtgaacagg tatggaattt cgccgatttt gcgacctcgc 6120
aaggcatatt gcgcgttggc ggtaacaaga aagggatctt cactcgcgac cgcaaaccga 6180
agtcggcggc ttttctgctg caaaaacgct ggactggcat gaacttcggt gaaaaaccgc 6240
agcagggagg caaacaagct agccaccacc accaccacca cgtgtgactc gagttctttt 6300
caacctcccc ttcctcagtt tgaaaaggca tccaaaaaaa ggggtacgga aattgttggt 6360
tcactttttc tttatcatct tcaccatgca taaaaagttt agggctgttt gtatctagtg 6420
acaaccagca tttcccttgc ctttgggcct tcttttcagg ctccctctgc tcactgttag 6480
aaggcatcca gaaactagtg ttaacgctag ccaccaccac caccaccacg tgtgaattac 6540
aggtgaccag ctcgaatttc cccgatcgtt caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat 6600
tgaatcctgt tgccggtctt gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc 6660
atgtaataat taacatgtaa tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt atgattagag 6720
tcccgcaatt atacatttaa tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata 6780
aattatcgcg cgcggtgtca tctatgttac tagatcggga attaaactat cagtgtttga 6840
caggatatat tggcgggtaa acctaagaga aaagagcgtt tattagaata acggatattt 6900
aaaagggcgt gaaaaggttt atccgttcgt ccatttgtat gtgcatgcca accacagggt 6960
tcccctcggg atcaaagtac tttgatccaa cccctccgct gctatagtgc agtcggcttc 7020
tgacgttcag tgcagccgtc ttctgaaaac gacatgtcgc acaagtccta agttacgcga 7080
caggctgccg ccctgccctt ttcctggcgt tttcttgtcg cgtgttttag tcgcataaag 7140
tagaatactt gcgactagaa ccggagacat tacgccatga acaagagcgc cgccgctggc 7200
ctgctgggct atgcccgcgt cagcaccgac gaccaggact tgaccaacca acgggccgaa 7260
ctgcacgcgg ccggctgcac caagctgttt tccgagaaga tcaccggcac caggcgcgac 7320
cgcccggagc tggccaggat gcttgaccac ctacgccctg gcgacgttgt gacagtgacc 7380
aggctagacc gcctggcccg cagcacccgc gacctactgg acattgccga gcgcatccag 7440
gaggccggcg cgggcctgcg tagcctggca gagccgtggg ccgacaccac cacgccggcc 7500
ggccgcatgg tgttgaccgt gttcgccggc attgccgagt tcgagcgttc cctaatcatc 7560
gaccgcaccc ggagcgggcg cgaggccgcc aaggcccgag gcgtgaagtt tggcccccgc 7620
cctaccctca ccccggcaca gatcgcgcac gcccgcgagc tgatcgacca ggaaggccgc 7680
accgtgaaag aggcggctgc actgcttggc gtgcatcgct cgaccctgta ccgcgcactt 7740
gagcgcagcg aggaagtgac gcccaccgag gccaggcggc gcggtgcctt ccgtgaggac 7800
gcattgaccg aggccgacgc cctggcggcc gccgagaatg aacgccaaga ggaacaagca 7860
tgaaaccgca ccaggacggc caggacgaac cgtttttcat taccgaagag atcgaggcgg 7920
agatgatcgc ggccgggtac gtgttcgagc cgcccgcgca cgtctcaacc gtgcggctgc 7980
atgaaatcct ggccggtttg tctgatgcca agctggcggc ctggccggcc agcttggccg 8040
ctgaagaaac cgagcgccgc cgtctaaaaa ggtgatgtgt atttgagtaa aacagcttgc 8100
gtcatgcggt cgctgcgtat atgatgcgat gagtaaataa acaaatacgc aaggggaacg 8160
catgaaggtt atcgctgtac ttaaccagaa aggcgggtca ggcaagacga ccatcgcaac 8220
ccatctagcc cgcgccctgc aactcgccgg ggccgatgtt ctgttagtcg attccgatcc 8280
ccagggcagt gcccgcgatt gggcggccgt gcgggaagat caaccgctaa ccgttgtcgg 8340
catcgaccgc ccgacgattg accgcgacgt gaaggccatc ggccggcgcg acttcgtagt 8400
gatcgacgga gcgccccagg cggcggactt ggctgtgtcc gcgatcaagg cagccgactt 8460
cgtgctgatt ccggtgcagc caagccctta cgacatatgg gccaccgccg acctggtgga 8520
gctggttaag cagcgcattg aggtcacgga tggaaggcta caagcggcct ttgtcgtgtc 8580
gcgggcgatc aaaggcacgc gcatcggcgg tgaggttgcc gaggcgctgg ccgggtacga 8640
gctgcccatt cttgagtccc gtatcacgca gcgcgtgagc tacccaggca ctgccgccgc 8700
cggcacaacc gttcttgaat cagaacccga gggcgacgct gcccgcgagg tccaggcgct 8760
ggccgctgaa attaaatcaa aactcatttg agttaatgag gtaaagagaa aatgagcaaa 8820
agcacaaaca cgctaagtgc cggccgtccg agcgcacgca gcagcaaggc tgcaacgttg 8880
gccagcctgg cagacacgcc agccatgaag cgggtcaact ttcagttgcc ggcggaggat 8940
cacaccaagc tgaagatgta cgcggtacgc caaggcaaga ccattaccga gctgctatct 9000
gaatacatcg cgcagctacc agagtaaatg agcaaatgaa taaatgagta gatgaatttt 9060
agcggctaaa ggaggcggca tggaaaatca agaacaacca ggcaccgacg ccgtggaatg 9120
ccccatgtgt ggaggaacgg gcggttggcc aggcgtaagc ggctgggttg tctgccggcc 9180
ctgcaatggc actggaaccc ccaagcccga ggaatcggcg tgacggtcgc aaaccatccg 9240
gcccggtaca aatcggcgcg gcgctgggtg atgacctggt ggagaagttg aaggccgcgc 9300
aggccgccca gcggcaacgc atcgaggcag aagcacgccc cggtgaatcg tggcaagcgg 9360
ccgctgatcg aatccgcaaa gaatcccggc aaccgccggc agccggtgcg ccgtcgatta 9420
ggaagccgcc caagggcgac gagcaaccag attttttcgt tccgatgctc tatgacgtgg 9480
gcacccgcga tagtcgcagc atcatggacg tggccgtttt ccgtctgtcg aagcgtgacc 9540
gacgagctgg cgaggtgatc cgctacgagc ttccagacgg gcacgtagag gtttccgcag 9600
ggccggccgg catggccagt gtgtgggatt acgacctggt actgatggcg gtttcccatc 9660
taaccgaatc catgaaccga taccgggaag ggaagggaga caagcccggc cgcgtgttcc 9720
gtccacacgt tgcggacgta ctcaagttct gccggcgagc cgatggcgga aagcagaaag 9780
acgacctggt agaaacctgc attcggttaa acaccacgca cgttgccatg cagcgtacga 9840
agaaggccaa gaacggccgc ctggtgacgg tatccgaggg tgaagccttg attagccgct 9900
acaagatcgt aaagagcgaa accgggcggc cggagtacat cgagatcgag ctagctgatt 9960
ggatgtaccg cgagatcaca gaaggcaaga acccggacgt gctgacggtt caccccgatt 10020
actttttgat cgatcccggc atcggccgtt ttctctaccg cctggcacgc cgcgccgcag 10080
gcaaggcaga agccagatgg ttgttcaaga cgatctacga acgcagtggc agcgccggag 10140
agttcaagaa gttctgtttc accgtgcgca agctgatcgg gtcaaatgac ctgccggagt 10200
acgatttgaa ggaggaggcg gggcaggctg gcccgatcct agtcatgcgc taccgcaacc 10260
tgatcgaggg cgaagcatcc gccggttcct aatgtacgga gcagatgcta gggcaaattg 10320
ccctagcagg ggaaaaaggt cgaaaaggtc tctttcctgt ggatagcacg tacattggga 10380
acccaaagcc gtacattggg aaccggaacc cgtacattgg gaacccaaag ccgtacattg 10440
ggaaccggtc acacatgtaa gtgactgata taaaagagaa aaaaggcgat ttttccgcct 10500
aaaactcttt aaaacttatt aaaactctta aaacccgcct ggcctgtgca taactgtctg 10560
gccagcgcac agccgaagag ctgcaaaaag cgcctaccct tcggtcgctg cgctccctac 10620
gccccgccgc ttcgcgtcgg cctatcgcgg ccgctggccg ctcaaaaatg gctggcctac 10680
ggccaggcaa tctaccaggg cgcggacaag ccgcgccgtc gccactcgac cgccggcgcc 10740
cacatcaagg caccctgcct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg 10800
cagctcccgg agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt 10860
cagggcgcgt cagcgggtgt tggcgggtgt cggggcgcag ccatgaccca gtcacgtagc 10920
gatagcggag tgtatactgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 10980
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgct 11040
cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat 11100
cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga 11160
acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt 11220
ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt 11280
ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc 11340
gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa 11400
gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct 11460
ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta 11520
actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg 11580
gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcgg 11614
<210> 6
<211> 9468
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒
<400> 6
gttaacgcta gccaccacca ccaccaccac gtgtgaatta caggtgacca gctcgaattt 60
ccccgatcgt tcaaacattt ggcaataaag tttcttaaga ttgaatcctg ttgccggtct 120
tgcgatgatt atcatataat ttctgttgaa ttacgttaag catgtaataa ttaacatgta 180
atgcatgacg ttatttatga gatgggtttt tatgattaga gtcccgcaat tatacattta 240
atacgcgata gaaaacaaaa tatagcgcgc aaactaggat aaattatcgc gcgcggtgtc 300
atctatgtta ctagatcggg aattaaacta tcagtgtttg acaggatata ttggcgggta 360
aacctaagag aaaagagcgt ttattagaat aacggatatt taaaagggcg tgaaaaggtt 420
tatccgttcg tccatttgta tgtgcatgcc aaccacaggg ttcccctcgg gatcaaagta 480
ctttgatcca acccctccgc tgctatagtg cagtcggctt ctgacgttca gtgcagccgt 540
cttctgaaaa cgacatgtcg cacaagtcct aagttacgcg acaggctgcc gccctgccct 600
tttcctggcg ttttcttgtc gcgtgtttta gtcgcataaa gtagaatact tgcgactaga 660
accggagaca ttacgccatg aacaagagcg ccgccgctgg cctgctgggc tatgcccgcg 720
tcagcaccga cgaccaggac ttgaccaacc aacgggccga actgcacgcg gccggctgca 780
ccaagctgtt ttccgagaag atcaccggca ccaggcgcga ccgcccggag ctggccagga 840
tgcttgacca cctacgccct ggcgacgttg tgacagtgac caggctagac cgcctggccc 900
gcagcacccg cgacctactg gacattgccg agcgcatcca ggaggccggc gcgggcctgc 960
gtagcctggc agagccgtgg gccgacacca ccacgccggc cggccgcatg gtgttgaccg 1020
tgttcgccgg cattgccgag ttcgagcgtt ccctaatcat cgaccgcacc cggagcgggc 1080
gcgaggccgc caaggcccga ggcgtgaagt ttggcccccg ccctaccctc accccggcac 1140
agatcgcgca cgcccgcgag ctgatcgacc aggaaggccg caccgtgaaa gaggcggctg 1200
cactgcttgg cgtgcatcgc tcgaccctgt accgcgcact tgagcgcagc gaggaagtga 1260
cgcccaccga ggccaggcgg cgcggtgcct tccgtgagga cgcattgacc gaggccgacg 1320
ccctggcggc cgccgagaat gaacgccaag aggaacaagc atgaaaccgc accaggacgg 1380
ccaggacgaa ccgtttttca ttaccgaaga gatcgaggcg gagatgatcg cggccgggta 1440
cgtgttcgag ccgcccgcgc acgtctcaac cgtgcggctg catgaaatcc tggccggttt 1500
gtctgatgcc aagctggcgg cctggccggc cagcttggcc gctgaagaaa ccgagcgccg 1560
ccgtctaaaa aggtgatgtg tatttgagta aaacagcttg cgtcatgcgg tcgctgcgta 1620
tatgatgcga tgagtaaata aacaaatacg caaggggaac gcatgaaggt tatcgctgta 1680
cttaaccaga aaggcgggtc aggcaagacg accatcgcaa cccatctagc ccgcgccctg 1740
caactcgccg gggccgatgt tctgttagtc gattccgatc cccagggcag tgcccgcgat 1800
tgggcggccg tgcgggaaga tcaaccgcta accgttgtcg gcatcgaccg cccgacgatt 1860
gaccgcgacg tgaaggccat cggccggcgc gacttcgtag tgatcgacgg agcgccccag 1920
gcggcggact tggctgtgtc cgcgatcaag gcagccgact tcgtgctgat tccggtgcag 1980
ccaagccctt acgacatatg ggccaccgcc gacctggtgg agctggttaa gcagcgcatt 2040
gaggtcacgg atggaaggct acaagcggcc tttgtcgtgt cgcgggcgat caaaggcacg 2100
cgcatcggcg gtgaggttgc cgaggcgctg gccgggtacg agctgcccat tcttgagtcc 2160
cgtatcacgc agcgcgtgag ctacccaggc actgccgccg ccggcacaac cgttcttgaa 2220
tcagaacccg agggcgacgc tgcccgcgag gtccaggcgc tggccgctga aattaaatca 2280
aaactcattt gagttaatga ggtaaagaga aaatgagcaa aagcacaaac acgctaagtg 2340
ccggccgtcc gagcgcacgc agcagcaagg ctgcaacgtt ggccagcctg gcagacacgc 2400
cagccatgaa gcgggtcaac tttcagttgc cggcggagga tcacaccaag ctgaagatgt 2460
acgcggtacg ccaaggcaag accattaccg agctgctatc tgaatacatc gcgcagctac 2520
cagagtaaat gagcaaatga ataaatgagt agatgaattt tagcggctaa aggaggcggc 2580
atggaaaatc aagaacaacc aggcaccgac gccgtggaat gccccatgtg tggaggaacg 2640
ggcggttggc caggcgtaag cggctgggtt gtctgccggc cctgcaatgg cactggaacc 2700
cccaagcccg aggaatcggc gtgacggtcg caaaccatcc ggcccggtac aaatcggcgc 2760
ggcgctgggt gatgacctgg tggagaagtt gaaggccgcg caggccgccc agcggcaacg 2820
catcgaggca gaagcacgcc ccggtgaatc gtggcaagcg gccgctgatc gaatccgcaa 2880
agaatcccgg caaccgccgg cagccggtgc gccgtcgatt aggaagccgc ccaagggcga 2940
cgagcaacca gattttttcg ttccgatgct ctatgacgtg ggcacccgcg atagtcgcag 3000
catcatggac gtggccgttt tccgtctgtc gaagcgtgac cgacgagctg gcgaggtgat 3060
ccgctacgag cttccagacg ggcacgtaga ggtttccgca gggccggccg gcatggccag 3120
tgtgtgggat tacgacctgg tactgatggc ggtttcccat ctaaccgaat ccatgaaccg 3180
ataccgggaa gggaagggag acaagcccgg ccgcgtgttc cgtccacacg ttgcggacgt 3240
actcaagttc tgccggcgag ccgatggcgg aaagcagaaa gacgacctgg tagaaacctg 3300
cattcggtta aacaccacgc acgttgccat gcagcgtacg aagaaggcca agaacggccg 3360
cctggtgacg gtatccgagg gtgaagcctt gattagccgc tacaagatcg taaagagcga 3420
aaccgggcgg ccggagtaca tcgagatcga gctagctgat tggatgtacc gcgagatcac 3480
agaaggcaag aacccggacg tgctgacggt tcaccccgat tactttttga tcgatcccgg 3540
catcggccgt tttctctacc gcctggcacg ccgcgccgca ggcaaggcag aagccagatg 3600
gttgttcaag acgatctacg aacgcagtgg cagcgccgga gagttcaaga agttctgttt 3660
caccgtgcgc aagctgatcg ggtcaaatga cctgccggag tacgatttga aggaggaggc 3720
ggggcaggct ggcccgatcc tagtcatgcg ctaccgcaac ctgatcgagg gcgaagcatc 3780
cgccggttcc taatgtacgg agcagatgct agggcaaatt gccctagcag gggaaaaagg 3840
tcgaaaaggt ctctttcctg tggatagcac gtacattggg aacccaaagc cgtacattgg 3900
gaaccggaac ccgtacattg ggaacccaaa gccgtacatt gggaaccggt cacacatgta 3960
agtgactgat ataaaagaga aaaaaggcga tttttccgcc taaaactctt taaaacttat 4020
taaaactctt aaaacccgcc tggcctgtgc ataactgtct ggccagcgca cagccgaaga 4080
gctgcaaaaa gcgcctaccc ttcggtcgct gcgctcccta cgccccgccg cttcgcgtcg 4140
gcctatcgcg gccgctggcc gctcaaaaat ggctggccta cggccaggca atctaccagg 4200
gcgcggacaa gccgcgccgt cgccactcga ccgccggcgc ccacatcaag gcaccctgcc 4260
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 4320
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 4380
ttggcgggtg tcggggcgca gccatgaccc agtcacgtag cgatagcgga gtgtatactg 4440
gcttaactat gcggcatcag agcagattgt actgagagtg caccatatgc ggtgtgaaat 4500
accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg catcaggcgc tcttccgctt cctcgctcac 4560
tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt 4620
aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca 4680
gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc 4740
ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact 4800
ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct 4860
gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag 4920
ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca 4980
cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa 5040
cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc 5100
gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag 5160
aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg 5220
tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca 5280
gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc 5340
tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgcatt ctaggtacta 5400
aaacaattca tccagtaaaa tataatattt tattttctcc caatcaggct tgatccccag 5460
taagtcaaaa aatagctcga catactgttc ttccccgata tcctccctga tcgaccggac 5520
gcagaaggca atgtcatacc acttgtccgc cctgccgctt ctcccaagat caataaagcc 5580
acttactttg ccatctttca caaagatgtt gctgtctccc aggtcgccgt gggaaaagac 5640
aagttcctct tcgggctttt ccgtctttaa aaaatcatac agctcgcgcg gatctttaaa 5700
tggagtgtct tcttcccagt tttcgcaatc cacatcggcc agatcgttat tcagtaagta 5760
atccaattcg gctaagcggc tgtctaagct attcgtatag ggacaatccg atatgtcgat 5820
ggagtgaaag agcctgatgc actccgcata cagctcgata atcttttcag ggctttgttc 5880
atcttcatac tcttccgagc aaaggacgcc atcggcctca ctcatgagca gattgctcca 5940
gccatcatgc cgttcaaagt gcaggacctt tggaacaggc agctttcctt ccagccatag 6000
catcatgtcc ttttcccgtt ccacatcata ggtggtccct ttataccggc tgtccgtcat 6060
ttttaaatat aggttttcat tttctcccac cagcttatat accttagcag gagacattcc 6120
ttccgtatct tttacgcagc ggtatttttc gatcagtttt ttcaattccg gtgatattct 6180
cattttagcc atttattatt tccttcctct tttctacagt atttaaagat accccaagaa 6240
gctaattata acaagacgaa ctccaattca ctgttccttg cattctaaaa ccttaaatac 6300
cagaaaacag ctttttcaaa gttgttttca aagttggcgt ataacatagt atcgacggag 6360
ccgattttga aaccgcggtg atcacaggca gcaacgctct gtcatcgtta caatcaacat 6420
gctaccctcc gcgagatcat ccgtgtttca aacccggcag cttagttgcc gttcttccga 6480
atagcatcgg taacatgagc aaagtctgcc gccttacaac ggctctcccg ctgacgccgt 6540
cccggactga tgggctgcct gtatcgagtg gtgattttgt gccgagctgc cggtcgggga 6600
gctgttggct ggctggtggc aggatatatt gtggtgtaaa caaattgacg cttagacaac 6660
ttaataacac attgcggacg tttttaatgt actgaattaa cgccgaatta attcggggga 6720
tctggatttt agtactggat tttggtttta ggaattagaa attttattga tagaagtatt 6780
ttacaaatac aaatacatac taagggtttc ttatatgctc aacacatgag cgaaacccta 6840
taggaaccct aattccctta tctgggaact actcacacat tattatggag aaactcgagc 6900
ttgtcgatcg actctagcta gaggatcgat ccgaacccca gagtcccgct cagaagaact 6960
cgtcaagaag gcgatagaag gcgatgcgct gcgaatcggg agcggcgata ccgtaaagca 7020
cgaggaagcg gtcagcccat tcgccgccaa gctcttcagc aatatcacgg gtagccaacg 7080
ctatgtcctg atagcggtcc gccacaccca gccggccaca gtcgatgaat ccagaaaagc 7140
ggccattttc caccatgata ttcggcaagc aggcatcgca atgggtcacg acgagatcat 7200
cgccgtcggg catgcgcgcc ttgagcctgg cgaacagttc ggctggcgcg agcccctgat 7260
gctcttcgtc cagatcatcc tgatcgacaa gaccggcttc catccgagta cgtgctcgct 7320
cgatgcgatg tttcgcttgg tggtcgaatg ggcaggtagc cggatcaagc gtatgcagcc 7380
gccgcattgc atcagccatg atggatactt tctcggcagg agcaaggtga gatgacagga 7440
gatcctgccc cggcacttcg cccaatagca gccagtccct tcccgcttca gtgacaacgt 7500
cgagcacagc tgcgcaagga acgcccgtcg tggccagcca cgatagccgc gctgcctcgt 7560
cctgcagttc attcagggca ccggacaggt cggtcttgac aaaaagaacc gggcgcccct 7620
gcgctgacag ccggaacacg gcggcatcag agcagccgat tgtctgttgt gcccagtcat 7680
agccgaatag cctctccacc caagcggccg gagaacctgc gtgcaatcca tcttgttcaa 7740
tcatgcgaaa cgatccagat ccggtgcaga ttatttggat tgagagtgaa tatgagactc 7800
taattggata ccgaggggaa tttatggaac gtcagtggag catttttgac aagaaatatt 7860
tgctagctga tagtgacctt aggcgacttt tgaacgcgca ataatggttt ctgacgtatg 7920
tgcttagctc attaaactcc agaaacccgc ggctgagtgg ctccttcaat cgttgcggtt 7980
ctgtcagttc caaacgtaaa acggcttgtc ccgcgtcatc ggcgggggtc ataacgtgac 8040
tcccttaatt ctccgctcat gatcagattg tcgtttcccg ccttcagttt ccaagcttgg 8100
cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc 8160
gccttgcagc acatccccct ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc 8220
gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatgcta gagcagcttg agcttggatc 8280
agattgtcgt ttcccgcctt cagtttagct tcatggagtc aaagattcaa atagaggacc 8340
taacagaact cgccgtaaag actggcgaac agttcataca gagtctctta cgactcaatg 8400
acaagaagaa aatcttcgtc aacatggtgg agcacgacac acttgtctac tccaaaaata 8460
tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa agggtaatat 8520
ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg aagatagtgg 8580
aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc atcgttgaag 8640
atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc atcgtggaaa 8700
aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc tccactgacg 8760
taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata taaggaagtt 8820
catttcattt ggagagaaca cgggggactc ttgaccatgg ttctggatgc cttctaacag 8880
tgagcagagg gagcctgaaa agaaggccca aaggcaaggg aaatgctggt tgtcactaga 8940
tacaaacagc cctaaacttt ttatgcatgg tgaagatgat aaagaaaaag tgaaccaaca 9000
atttccgtac cccttttttt ggatgccttt tcaaactgag gaaggggagg ttgaaaagaa 9060
ccgcggctgc aggtaaattt ctagtttttc tccttcattt tcttggttag gacccttttc 9120
tctttttatt tttttgagct tcgatctgtt tttaaactga tctatttttt aattgattgg 9180
ttatggtgta aatattacat agctttaact gataatctga ttactttatt tcgtgtgtaa 9240
ttgattaatt ctgcagctcg agttcttttc aacctcccct tcctcagttt gaaaaggcat 9300
ccaaaaaaag gggtacggaa attgttggtt cactttttct ttatcatctt caccatgcat 9360
aaaaagttta gggctgtttg tatctagtga caaccagcat ttcccttgcc tttgggcctt 9420
cttttcaggc tccctctgct cactgttaga aggcatccag aaactagt 9468
<210> 7
<211> 104
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 7
gatgtctata aatataagag accctcttat agtaagcaga gttgttggag acgttcttga 60
tccgtttaat agatcaatca ctctaaaggt tacttatggc caaa 104
<210> 8
<211> 1766
<212> DNA
<213> 克莱门氏小柑橘(Citrus clementina)
<400> 8
aaaacgtaac atgtatccct caaatatctt tcctatcggg tctggccctg aaacttctcg 60
aactttcaag cagaggaaaa tcaatttcta tatatgatcc cacaaacccc taacattttc 120
tattgtaaac gcaattacag aaaccttaaa aaacagtttc agaaagaata ttttccgacg 180
atacgatgga taatctgccc cacgggagaa gttaccggag cataccgtct cgcggtcggc 240
cgcgctcttc ctacgcgccg agcgtgagag agattccggt ccagtacgtc ggctcggagg 300
agaagcagtc gagggaatcc aattcggcgg tgaagatcca gaaggttttc agagcattcc 360
tggtgaggaa aagcgtgaag aagatcaagg agataagagg cgaagtggag gagatcgaga 420
agcggatctc gacgggggat actattgatt tgattgcgag ggattcacaa gagagattga 480
aattgaatga gatgttgatg agtttgcttt tcaggttgga ttctgttaga ggcgttgatt 540
ctggagttag ggattgcaga aaggcggtta ttaagaaggc gattgcgttg caagaatttc 600
tggatgccgc cttttcttcc aataatagca ggaacgatca gaacggtgag gatgaaaatg 660
tcgtggaagc tgttgacgag cagaatcagt cggcgcaggt ggagtgcacg gaggagaatg 720
gtgaaagaac tgacgcattt gatgaaaaag agaccgttga aaatcaaaac gaggtcggag 780
acgaagagac tgtcgaaaat caaggcgacg acggagaagc tcgggaggtt gttgaggagt 840
gcgacgatgt gatgccatcg gtgagtaatg gtccggcacc ggaagagaat gtaggaacaa 900
gtcaaagtga gagtgaagcc gattcctcgg caaatcccga agaggatgag aattcatcac 960
cgaaacaaga aaacaatgca gctggagctg gagaggtcga agagaatgtg aaagagagcg 1020
ggggcgaagg agaggtcgaa gagaatgtgc aacagagtgg gggcgaagga gcaagagacg 1080
agaactcgaa gaacaaagag ctgttggaga ggatgatgga ggatcatggg agaatgatgg 1140
aaatgatggc gcaattattt gagaggaatg aaatgcagac gaggttgttg agtgctctgt 1200
ctcatagggt tgagcagctg gagaaggctt tcatgcgtga gaggttgagg aggaagaaaa 1260
agaagaacgc tgctggcgct gctgatggtt gtgaaacgtc gcgggataac aagaaatgcg 1320
gaaagagata gtgatttgag atttgtctct caaatgtctt ttgtttaaca cgtttttatg 1380
tttgtaattt caattcaaac ttgctgttgg tggtaatggt gatttgagag attgtgtgtg 1440
ttaattggca atgcccgtgt gttaatctta gttattaatc attacagtca ttcaatcact 1500
cagcatcctc taaaactctc cctaatgagc gatagtgtca ttttgagcgc ttcacatcag 1560
taggggatga gaatatgggt cacgatttgt ttatttgatt ggatgtgaat taaatgggtt 1620
tgaattagaa aaaaataata tgtttaataa acgagtgaat tcgatttaat ttgttaatta 1680
aataaattaa attcgggttt gaagatatta attcgtttat ttatttatga ttcgtttaat 1740
gaatgggtta taaacgaatt gaatac 1766

Claims (15)

1.一种重组核酸分子，其包含核酸序列，所述核酸序列包含可操作地连接至异源启动子的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:8的至少18个连续核苷酸，其中所述核酸分子的转录降低BAG6基因在植物细胞中的表达。
2.根据权利要求1所述的重组核酸分子，其可操作地连接至移动前导序列。
3.根据权利要求2所述的重组核酸分子，其中所述移动前导序列包含SEQ ID NO:7的至少18个连续核苷酸。
4.根据权利要求1所述的重组核酸分子，其可操作地连接至GUS环序列或内含子序列。
5.一种重组载体，其包含权利要求1的重组核酸分子。
6.一种转基因植物细胞，其包含权利要求1的重组核酸分子。
7.一种转基因植物，其包含权利要求1的重组核酸分子。
8.一种转基因种子，其包含权利要求1的重组核酸分子。
9.一种抑制、预防或降低植物的细菌或真菌感染的方法，包括在所述植物中表达权利要求1的核酸构建体。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述植物为柑橘树。
11.根据权利要求9的方法，其中所述感染由活体营养型植物病原体引起。
12.根据权利要求9所述的方法，其中所述感染由韧皮部杆菌引起。
13.根据权利要求12的方法，其中所述感染由感染柑橘类的韧皮部杆菌引起。
14.根据权利要求12的方法，其中所述感染由韧皮部杆菌亚洲种(Las)引起。
15.根据权利要求9所述的方法，其中与对照植物相比，所述植物响应于PAMP而具有增加的NDR1表达。
CN201580073784.3A 2014-11-25 2015-11-25 用于预防或降低细菌和真菌病原体对作物植物的感染的方法和组合物 Pending CN107208112A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462084372P 2014-11-25 2014-11-25
US62/084,372 2014-11-25
PCT/US2015/062698 WO2016086142A1 (en) 2014-11-25 2015-11-25 Methods and compositions for preventing or reducing infections of crop plants by bacterial and fungal pathogens

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107208112A true CN107208112A (zh) 2017-09-26

Family

ID=56075046

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580073784.3A Pending CN107208112A (zh) 2014-11-25 2015-11-25 用于预防或降低细菌和真菌病原体对作物植物的感染的方法和组合物

Country Status (4)

Country Link
US (1) US10738321B2 (zh)
CN (1) CN107208112A (zh)
BR (1) BR112017011076A2 (zh)
WO (1) WO2016086142A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110295183A (zh) * 2019-07-29 2019-10-01 西南大学 一种基于CsPrx25超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法
CN111088375A (zh) * 2019-12-30 2020-05-01 广州海关技术中心 基于rpa技术检测胡萝卜种子中的马铃薯斑纹片病菌的方法及试剂盒

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112017011076A2 (pt) 2014-11-25 2018-08-07 Integrated Plant Genetics Inc métodos e composições para prevenir ou reduzir infecções de plantas cultivadas por agentes patogênicos fúngicos e bacterianos
WO2023081782A2 (en) * 2021-11-03 2023-05-11 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Controlling citrus huanglongbing (hlb) by mitigating cell death of the phloem tissues caused by candidatus liberibacter asiaticus (clas) by suppressing reactive oxygen species (ros)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030093835A1 (en) * 2001-07-30 2003-05-15 Detlef Weigel Chimeric genes controlling flowering
US20110035839A1 (en) * 2004-12-21 2011-02-10 Linda Lutfiyya Recombinant DNA Constructs and Methods for Controlling Gene Expression
US20130190387A1 (en) * 2006-01-20 2013-07-25 Quark Pharmaceuticals, Inc. Treatment or prevention of oto-pathologies by inhibition of pro-apoptotic genes
US20140109472A1 (en) * 2012-01-27 2014-04-24 The Texas A&M University System Pathogen resistant citrus compositions, organisms, systems, and methods

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3214177A3 (en) 1998-04-08 2017-11-22 Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation Methods and means for obtaining modified phenotypes
AR020078A1 (es) 1998-05-26 2002-04-10 Syngenta Participations Ag Metodo para alterar la expresion de un gen objetivo en una celula de planta
AU2004248136B2 (en) 2003-06-02 2011-09-15 University Of Massachusetts Methods and compositions for controlling efficacy of RNA silencing
WO2010011346A1 (en) 2008-07-24 2010-01-28 Rxi Pharmaceuticals Corporation Rnai constructs and uses therof
CN101914540A (zh) 2010-08-09 2010-12-15 大连大学 一种将rna干扰引入植物的方法
US9371541B2 (en) * 2011-01-05 2016-06-21 The Curators Of The University Of Missouri Genes implicated in resistance to soybean cyst nematode infection and methods of their use
EP2744905B1 (en) 2011-08-16 2016-08-03 Syngenta Participations AG Methods and compositions for introduction of exogenous dsrna into plant cells
US9392758B2 (en) 2011-08-26 2016-07-19 Integrated Plant Genetics, Inc. Transformation of mature citrus
BR112017011076A2 (pt) 2014-11-25 2018-08-07 Integrated Plant Genetics Inc métodos e composições para prevenir ou reduzir infecções de plantas cultivadas por agentes patogênicos fúngicos e bacterianos

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030093835A1 (en) * 2001-07-30 2003-05-15 Detlef Weigel Chimeric genes controlling flowering
US20110035839A1 (en) * 2004-12-21 2011-02-10 Linda Lutfiyya Recombinant DNA Constructs and Methods for Controlling Gene Expression
US20130190387A1 (en) * 2006-01-20 2013-07-25 Quark Pharmaceuticals, Inc. Treatment or prevention of oto-pathologies by inhibition of pro-apoptotic genes
US20140109472A1 (en) * 2012-01-27 2014-04-24 The Texas A&M University System Pathogen resistant citrus compositions, organisms, systems, and methods

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CORBESIER, L等: "FT Protein Movement Contributes to Long-Distance Signaling in Floral Induction of Arabidopsis.", 《SCIENCE》 *
KNEPPER C等: ""The role of NDR1 in pathogen perception and plant defense signaling", 《PLANT SIGNALING & BEHAVIOR》 *
NCBI: "登录号：XM_006437904.1", 《NCBI_GENBANK》 *
NCBI: "登录号：XM_006491149.1", 《NCBI_GENBANK》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110295183A (zh) * 2019-07-29 2019-10-01 西南大学 一种基于CsPrx25超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法
CN110295183B (zh) * 2019-07-29 2023-05-02 西南大学 一种基于CsPrx25超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法
CN111088375A (zh) * 2019-12-30 2020-05-01 广州海关技术中心 基于rpa技术检测胡萝卜种子中的马铃薯斑纹片病菌的方法及试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
WO2016086142A1 (en) 2016-06-02
BR112017011076A2 (pt) 2018-08-07
US20170268019A1 (en) 2017-09-21
US10738321B2 (en) 2020-08-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102630763B1 (ko) 동시 유전자 편집 및 반수체 유도
CN110402085A (zh) 用于生物控制植物病原体的***和方法
KR100581163B1 (ko) 하이브리드 바실러스 튜린지엔시스 독소, 이를 암호화하는 핵산 및 이를 사용한 해충의 방제방법
CN101889088B (zh) 从植物基因组中切除核酸序列的方法
CN107208112A (zh) 用于预防或降低细菌和真菌病原体对作物植物的感染的方法和组合物
AU2023282248A1 (en) Induced expression in plants
CN101842488B (zh) 使用转多基因改变α-和β-生育三烯酚含量的组成和方法
CN111836825A (zh) 优化的植物crispr/cpf1***
CN107119063B (zh) 一种提高蛹虫草中虫草素含量的方法
TW201127957A (en) Modified oil encapsulating proteins and uses thereof
CN106834338B (zh) 拟南芥基因rem16的表达载体及其在调控植株开花期中的应用
CN112566924A (zh) 改善植物中基因组工程化和再生的方法
CN112585269A (zh) 改善植物中基因组工程化和再生的方法ii
CN106916828A (zh) 一种调控杨树叶片发育的生长调节因子基因及其应用
CN110951736B (zh) 一种核定位信号f4nls及其在提高碱基编辑效率与拓展可编辑碱基范围中的应用
WO2001077318A1 (en) Regulatory element from a sugarcane proline rich protein and uses thereof
KR20230163460A (ko) 식물에서의 증가된 형질전환성 및 반수체 유도
CN108165579B (zh) 一种优化的鉴定月季RhPDS基因的VIGS沉默体系的方法
CN106350526A (zh) 大豆圣豆9号MYB转录因子家族基因GmMYB84及其应用
CN113614227A (zh) 介导植物基因组稳定整合的丝氨酸重组酶
CN113039278A (zh) 通过指导的内切核酸酶和单链寡核苷酸进行基因组编辑
CN113584074B (zh) 假重组嵌合黄瓜花叶病毒介导的基因沉默***及其应用
KR20210137055A (ko) 네이티브 miRNA의 게놈 편집을 통한 표적 유전자 발현의 억제
BRPI0215958B1 (pt) métodos para produção de metionina
CN106459161A (zh) 涉及谷氨酸受体多肽编码基因的构建体和方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20170926