CN107208098A - 用于控制鞘翅目害虫染色质重塑基因亲代rnai抑制 - Google Patents

用于控制鞘翅目害虫染色质重塑基因亲代rnai抑制 Download PDF

Info

Publication number
CN107208098A
CN107208098A CN201580072334.2A CN201580072334A CN107208098A CN 107208098 A CN107208098 A CN 107208098A CN 201580072334 A CN201580072334 A CN 201580072334A CN 107208098 A CN107208098 A CN 107208098A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
complement
diabroticaspp
polynucleotides
fragment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201580072334.2A
Other languages
English (en)
Inventor
K·E·纳尔瓦
K·阿罗拉
S·E·沃登
B·齐格弗里德
C·卡朱里亚
E·菲什里维奇
N·P·斯托勒
M·弗雷
R·哈姆
A·M·威莱斯阿朗戈
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Nebraska
Corteva Agriscience LLC
Original Assignee
Dow AgroSciences LLC
University of Nebraska
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dow AgroSciences LLC, University of Nebraska filed Critical Dow AgroSciences LLC
Publication of CN107208098A publication Critical patent/CN107208098A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N57/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds
    • A01N57/10—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having phosphorus-to-oxygen bonds or phosphorus-to-sulfur bonds
    • A01N57/16—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having phosphorus-to-oxygen bonds or phosphorus-to-sulfur bonds containing heterocyclic radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Catching Or Destruction (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开涉及通过在鞘翅目害虫中对靶编码序列和转录的非编码序列的RNA干扰介导的抑制而控制鞘翅目害虫的核酸分子及其使用方法。本发明公开还涉及使表达的核酸分子对于控制鞘翅目害虫有用的方法、以及由此获得的植物细胞和植物。

Description

用于控制鞘翅目害虫染色质重塑基因亲代RNAI抑制
优先权声明
本申请要求2014年12月16日提交的美国临时专利申请系列号62/092,768、以及2015年6月2日提交的美国临时专利申请系列号62/170,076的申请日的利益，在此通过提述将二者公开全体并入本文。
技术领域
本发明一般性地涉及由鞘翅目害虫引起的植物损害的遗传控制。在特定的实施方案中，本发明涉及目标编码多核苷酸和非编码多核苷酸的鉴定、及其重组DNA技术在鞘翅目害虫细胞中转录后阻遏或抑制目标编码多核苷酸和非编码多核苷酸表达从而提供植保作用的用途。
背景
西方玉米根虫(WCR)(Diabrotica virgifera virgifera LeConte，玉米根萤叶甲)是北美的一种破坏性最大的玉米根虫物种，在美国中西部玉米种植区受到特别关注。北方玉米根虫(NCR)(巴氏根萤叶甲)是与WCR共栖大致相同范围的近缘物种。有几种根萤叶甲属的其他相关亚种是美洲的严重害虫：墨西哥玉米根虫(MCR)[墨西哥玉米根萤叶甲(D.virgifera zeae Krysan and Smith)]；南方玉米根虫(SCR)(十一星根萤叶甲)；黄瓜条根萤叶甲(D.balteata LeConte)；D.undecimpunctata tenella；南美叶甲(D.speciosaGermar)、和D.u.undecimpunctata Mannerheim。美国农业部已估计玉米根虫每年造成10亿美元收入损失，包括8亿美元产量损失和2亿美元处理成本。
WCR和NCR两者都以卵的形式在夏季期间潜伏在土壤中。这些昆虫在整个冬季都停留在卵阶段。卵是椭圆的、白色、且长度小于0.004英寸(0.1mm)。幼虫在5月下旬或6月上旬孵出，卵孵化的精确时间由于温度差异和位置而在各年间有所变化。新孵出的幼虫是白色的蠕虫，长度小于0.125英寸(3.18mm)。一旦孵出，幼虫便开始以玉米根为食。玉米根虫经历三个幼虫龄。在进食几周后，幼虫蜕皮，进入若虫阶段。它们在土壤中化蛹，然后它们在7月和8月中以成虫从土壤出现。成体根虫长度约0.25英寸(6.35mm)。
玉米根虫幼虫在玉米和几种其他禾本科物种上完成发育。在黄色狗尾草上饲养的幼虫较晚出现，并且作为成虫比玉米上饲养的幼虫具有更小的头壳尺寸。Ellsbury等人，(2005)Environ.Entomol.34:627-34。WCR成虫以玉米穗丝、花粉、和暴露的穗尖上的籽粒为食。当优选的穗丝和花粉变得可得到时，成虫会快速向其移动。NCR成虫也以玉米植物的生殖组织为食。WCR雌虫通常交配一次。Branson et al.(1977)Ann.Entom.Soc.America 70(4):506-8。
玉米中的大部分根虫损伤由幼虫进食引起。新孵出的根虫最初以细的玉米根毛为食，并钻入根尖中。随着幼虫长得更大，它们以初生根为食并钻入其中。在有大量玉米根虫时，幼虫啮食往往导致根部被一直修剪到玉米杆基部。严重的根损伤干扰根将水和养分转运到植物中的能力，降低植物生长，并导致籽粒产生减少，由此经常急剧降低总产量。严重的根损伤还经常导致玉米植物的倒伏，其使收获变得更难，并进一步降低产量。此外，成虫以玉米生殖组织为食可以导致穗尖的穗丝修剪。如果这种“穗丝剪切”在花粉脱落期间足够严重，则传粉可能受到破坏。
可以通过作物轮作、化学杀虫剂、生物杀虫剂(例如，孢子形成***苏云金芽孢杆菌(Bt))、表达Bt毒素的转基因植物、或这些手段的组合来尝试控制玉米根虫。作物轮作的缺陷是限制了农田的用途。此外，一些根虫物种可以在玉米之外的作物田间产卵，或者长期的滞育(diapause)可导致卵孵化经历多年，因此会降低用玉米和其他作物实施的作物轮作的效率。
化学杀虫剂是最为人们所倚重的实现玉米根虫控制的手段。然而，使用化学杀虫剂并不是完美的玉米根虫控制策略；如果把化学杀虫剂的成本与使用杀虫剂后仍可能发生的根虫害所致的产量损失的成本相加，则美国每年由于玉米根虫可能损失超过10亿美元。大的幼虫群体、大雨、和不适当的杀虫剂应用均可导致玉米根虫控制不充分。此外，杀虫剂的连续使用可能选择杀虫剂抗性根虫品系，并且由于它们对非靶物种有毒性，有严重的影响环境之虞。
RNA干扰(RNAi)是一种利用内源细胞途径的方法，由此对足够大小的整个或任何部分靶基因特异性的干扰RNA(iRNA)分子(例如，双链RNA(dsRNA)分子)导致由其编码的mRNA的降解。在最近几年，在许多物种和实验***，例如线虫秀丽隐杆线虫、植物、昆虫胚胎、和组织培养物中的细胞中，已经使用RNAi进行基因“敲低”。参见，例如Fire等人，(1998)Nature 391:806-11；Martinez等人，(2002)Cell 110:563-74；McManus和Sharp(2002)Nature Rev.Genetics 3:737-47。
RNAi通过包括切丁酶(DICER)蛋白质复合物的内源途径完成mRNA的降解。切丁酶将长的dsRNA分子切割成约20个核苷酸的短片段，称作小干扰RNA(siRNA)。siRNA解旋成两个单链RNA：乘客链(passenger strand)和引导链(guide strand)。乘客链被降解，引导链则被整合到RNA诱导的沉默复合物(RISC)中。微核糖核酸(miRNA)在结构上是非常近似的分子，从前体分子切割而来，前体分子包含连接杂交的乘客链和引导链的多核苷酸“环”，微核糖核酸可以类似地并入RISC中。当引导链与互补的mRNA分子特异性结合并诱导RISC复合物的催化成分Argonaute被切割时，发生转录后基因沉默。已知该过程遍布在一些真核生物，例如植物、线虫和一些昆虫的体内，尽管最初的siRNA和/或miRNA的浓度有限。
只有与siRNA和/或miRNA互补的转录本才会被切割和降解，因此mRNA表达的敲低是序列特异性的。在植物中，存在切丁酶基因的几种功能类群。RNAi的基因沉默效应持续数天，在实验条件下可导致目标转录物的丰度下降90％以上，导致相应的蛋白质水平的降低。在昆虫中，至少有两种切丁酶基因，其中切丁酶1促进Argonaute1的miRNA指导性降解。Leeet al.(2004)Cell 117(1):69-81。切丁酶2促进Argonaute2的siRNA引导的降解。
美国专利7,612,194和美国专利公开文本2007/0050860、2010/0192265、和2011/0154545披露了自玉米根萤叶甲若虫分离的9112种表达序列标签(EST)序列的文库。在美国专利7,612,194和美国专利公开号2007/0050860中提出将与其中披露的玉米根萤叶甲液泡型H+-ATP酶(V-ATP酶)的几个特定部分序列之一互补的核酸分子与启动子可操作连接，以在植物细胞中表达反义RNA。美国专利公开文本No.2010/0192265提出将启动子与核酸分子可操作连接以在植物细胞中表达反义RNA，所述核酸分子与具有未知且未公开的功能的玉米根萤叶甲基因的特定部分序列互补(该部分序列据称与秀丽隐杆线虫中的C56C10.3基因产物58％相同)。美国专利公开文本No.2011/0154545提出将启动子与核酸分子可操作连接以在植物细胞中表达反义RNA，所述核酸分子与玉米根萤叶甲外被体(coatomer)beta亚单位基因的两个特定部分序列互补。此外，美国专利7,943,819公开了自玉米根萤叶甲幼虫、若虫、和切开的中肠分离的906种表达序列标签(EST)序列的文库，并且提出了将启动子与核酸分子可操作连接以在植物细胞中表达双链RNA，所述核酸分子与玉米根萤叶带电的多泡体蛋白4b基因的特定部分序列互补。
除了V-ATP酶的几个特定部分序列和未知功能的基因的特定部分序列之外，在美国专利7,612,194和美国专利公开文本2007/0050860、2010/0192265和2011/0154545中没有进一步提出使用其中列出的超过9000个序列中的任何特定序列进行RNA干扰。此外，美国专利7,612,194、以及美国专利公开文本2007/0050860、2010/0192265、和2011/0154545都没有教示提供的超过9000个序列中哪些其他序列在用作dsRNA或siRNA时在玉米根虫物种中会是致命的、甚至没有教示其有任何其他方面的用处。除了带电多泡体蛋白4b基因的特定部分序列之外，美国专利7,943,819没有提出使用其文中的超过900个序列的任何特定序列进行RNA干扰。此外，美国专利7,943,819没有教示其提供的超过900个序列中哪些其他序列在用作dsRNA或siRNA时在玉米根虫物种中会是致命的、甚至没有教示其有任何其他方面的用处。美国专利申请公开文本U.S.2013/040173和PCT申请公开文本WO 2013/169923描述了源自玉米根萤叶甲Snf7基因的序列在玉米中进行RNA干扰的用途。(还公开于Bolognesi等人，(2012)PLOS ONE 7(10):e47534.doi:10.1371/journal.pone.0047534)。
与玉米根虫DNA互补的绝大多数序列(例如上述)用作dsRNA或siRNA时不提供对玉米根虫物种的植保作用。例如，Baum等人(2007,Nature Biotechnology 25:1322-1326)描述了RNAi对几个WCR基因靶的抑制作用。这些作者报告，在超过520ng/cm2的极高iRNA(例如，dsRNA)浓度下，他们测试的26个靶基因中有8个不能提供实验上有意义的鞘翅目害虫死亡率。
美国专利7,612,194和美国专利申请公开2007/0050860的作者们首次报道了在玉米植株中靶向西方玉米根虫的植物体内(in planta)RNAi。Baum et al.(2007)Nat.Biotechnol.25(11):1322-6。这些作者们描述了一种高通量体内饵食RNAi***，用来筛选用于开发转基因RNAi玉米的潜在靶基因。在290种靶物的初始基因池中，只有14种基因展现了幼虫控制潜力。最有效的双链RNA(dsRNA)中之一靶向了编码囊泡性ATP酶亚单位A(V-ATPase)的基因，导致相应的内源mRNA的迅速阻遏，并以低浓度的dsRNA引发了特异性的RNAi应答。由此，这些作者首次记录了植物体内RNAi作为害虫管理工具的潜力，同时证明，有效的靶物是无法先验地准确鉴定的，即使从较小的一组候选基因鉴定亦然。
RNAi用于昆虫控制的另一个潜在应用涉及亲代RNAi(pRNAi)。最先描述的pRNAi是在秀丽隐杆线虫中，通过将dsRNA注入体腔(或通过摄取施用dsRNA)，导致后代胚胎中的基因无活性，从而鉴定了pRNAi。Fire et al.(1998)同上；Timmons and Fire(1998)Nature395(6705):854。在鞘翅目模式生物赤拟谷盗(Tribolium castaneum)中描述了类似的过程，其中对雌性蛹注射了控制胚胎发育过程中分节的三个独特基因的相应dsRNA，导致后代胚胎中的合子基因的敲低。Bucher et al.(2002)Curr.Biol.12(3):R85-6。该研究中几乎所有的后代幼虫在注射后一周均显示了基因特异性表型。尽管功能基因组学研究中dsRNA的注射在各种昆虫中已经取得成功，但要使得RNAi成为害虫管理的有效工具，需要从肠道环境中通过口服暴露于dsRNA来摄取dsRNA，随后下调必需基因。Auer and Frederick(2009)Trends Biotechnol.27(11):644-51。
亲代RNAi已经被用于描述许多昆虫种类中的胚胎基因的功能，包括跳虫(springtail)，Orchesella cincta(Konopova and Akam(2014)Evodevo 5(1):2)；褐飞虱(Nilaparvata lugens)；芜菁叶蜂(Athalia rosae)(Yoshiyama et al.(2013)J.InsectPhysiol.59(4):400-7)；德国小蠊(Blattella germanica)(Piulachs et al.(2010)Insect Biochem.Mol.Biol.40:468-75)；和豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)(Mao et al.(2013)Arch Insect Biochem Physiol 84(4):209-21)。在所有这些情况下，pRNAi反应都是通过将dsRNA注射到亲代雌性的血腔中来实现的。
公开概要
本文中公开了用于控制鞘翅目害虫的核酸分子(例如，靶基因、DNA、dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、和hpRNA)及其使用方法，所述鞘翅目害虫包括，例如，鞘翅目害虫，诸如玉米根萤叶甲(D.virgifera LeConte)(西方玉米根虫，“WCR”)；巴氏根萤叶甲(D.barberiSmith and Lawrence,北方玉米根虫，“NCR”)；十一星根萤叶甲(D.u.howardi Barber；南方玉米根虫，“SCR”)；墨西哥玉米根萤叶甲(D.v.zeae Krysan and Smith,墨西哥玉米根虫，“MCR”)；黄瓜条根萤叶甲(D.balteata LeConte)；D.u.tenella；南美叶甲(D.speciosaGermar)；和D.u.undecimpunctata Mannerheim。在具体的实例中，公开了示例性核酸分子，其与鞘翅目害虫中的一个或多个天然核酸序列的至少一部分可以同源。在一些实施方案中，通过降低现有世代的产生下一代害虫的能力来控制鞘翅目害虫。在某些实例中，将核酸分子递送给鞘翅目害虫并不会导致对害虫的显著死亡，而是减少由其产生的可存活后代的数量。
在这些和进一步的实例中，天然核酸可以是靶基因，其产物可以，例如但不限于：涉及代谢过程；涉及生殖过程；和/或涉及胚胎和/或幼虫发育。在一些实例中，借助于包含与靶基因同源的多核苷酸的核酸分子进行靶基因的表达转录后抑制，可导致鞘翅目害虫的存活力、生长和/或生殖的降低。在具体的实例中，选择一种染色质重塑基因作为转录后沉默的靶基因。在具体实例中，可用于转录后抑制的靶基因是本文称为根萤叶甲属(Diabrotica)brahma(SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7)的新型染色质重塑基因。在具体实例中，可用于转录后抑制的靶基因是本文称为根萤叶甲属mi-2(SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:164)的新染色质重塑基因。在具体实例中，可用于转录后抑制的靶基因是本文称为根萤叶甲属iswi-1(SEQ ID NO:81和SEQ ID NO:165)的新染色质重塑基因。在具体实例中，可用于转录后抑制的靶基因是本文称为根萤叶甲属chd1(SEQ ID NO:83)的新染色质重塑基因。在具体实例中，可用于转录后抑制的靶基因是本文称为根萤叶甲属iswi-2(SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:166)的新染色质重塑基因。在具体实例中，可用于转录后抑制的靶基因是本文称为根萤叶甲属iswi30(SEQ ID NO:87)的新染色质重塑基因。在具体实例中，可用于转录后抑制的靶基因是本文称为根萤叶甲属ino80(SEQ ID NO:89)的新型染色质重塑基因。在具体实例中，可用于转录后抑制的靶基因是本文称为根萤叶甲属domino(SEQ ID NO:91)的新染色质重塑基因。
因此，本文公开了分离的核酸分子，其包含：SEQ ID NO:1的多核苷酸；SEQ ID NO:1的互补物；SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:3的互补物；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:5的互补物；SEQID NO:7；SEQ ID NO:7的互补物；SEQ ID NO:79；SEQ ID NO:79的互补物；SEQ ID NO:81；SEQ ID NO:81的互补物；SEQ ID NO:83；SEQ ID NO:83的互补物；SEQ ID NO:85；SEQ IDNO:85的互补物；SEQ ID NO:87；SEQ ID NO:87的互补物；SEQ ID NO:89；SEQ ID NO:89的互补物；SEQ ID NO:91；SEQ ID NO:91的互补物；SEQ ID NO:164；SEQ ID NO:164的互补物；SEQ ID NO:165；SEQ ID NO:165的互补物；SEQ ID NO:166；SEQ ID NO:166的互补物；和/或任何前述的片段(例如，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:101-106)。
还公开了包含编码与靶染色质重塑基因产物内的氨基酸序列(例如brahma、mi-2、iswi-1、chdl、iswi-2、iswi30、ino80或domino基因的产物)至少约85％相同的多肽的多核苷酸的核酸分子。例如，核酸分子可以包含编码与选自下组的多肽至少85％相同的多肽的多核苷酸：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、和SEQ ID NO:9(根萤叶甲属BRAHMA)；根萤叶甲属brahma的产物内的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:9)；SEQ ID NO:80(根萤叶甲属MI-2)；根萤叶甲属mi-2的产物内的氨基酸序列；SEQ ID NO:82(根萤叶甲属ISWI-1)；根萤叶甲属iswi-1的产物内的氨基酸序列；SEQ ID NO:84(根萤叶甲属CHD1)；根萤叶甲属chdl的产物内的氨基酸序列；SEQ ID NO:86(根萤叶甲属ISWI-2)；根萤叶甲属iswi-2的产物内的氨基酸序列；SEQ ID NO:88(根萤叶甲属ISWI30)；根萤叶甲属iswi30的产物内的氨基酸序列；SEQ ID NO:90(根萤叶甲属IΝΟ80)；根萤叶甲属ino80的产物内的氨基酸序列；SEQID NO:92(根萤叶甲属DOMINO)；和根萤叶甲属domino的产物内的氨基酸序列。进一步公开了包含编码这样的多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸是编码与靶染色体重塑基因产物内的氨基酸序列至少85％相同的多肽的多核苷酸的反向互补物。
还公开了用于产生iRNA(例如，dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、和hpRNA)分子的cDNA多核苷酸，所述iRNA与鞘翅目害虫靶基因(例如染色质重塑基因)的全部或部分互补。在特定的实施方案中，dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、和/或hpRNA可以在体外产生，或由遗传修饰的生物(如植物或细菌)在体内产生。在特定的实例中，公开了可用于产生与自根萤叶甲属brahma(SEQ ID NO:l,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7)；根萤叶甲属mi-2(SEQID NO:79和SEQ ID NO:164)；根萤叶甲属iswi-1(SEQ ID NO:81和SEQ ID NO:165)；根萤叶甲属chdl(SEQ ID NO:83)；根萤叶甲属iswi-2(SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:166)；根萤叶甲属iswi30(SEQ ID NO:87)；根萤叶甲属ino80(SEQ ID NO:89)；和/或根萤叶甲属domino(SEQ ID NO:91)转录的mRNA的全部或部分互补的iRNA分子。
进一步公开了用于抑制鞘翅目害虫中必需基因的表达的手段、以及用于保护植物不受害于鞘翅目害虫的手段。用于抑制鞘翅目害虫中必需基因表达的手段是由选自下组的多核苷酸构成的单链或双链RNA分子：SEQ ID NO:141以及SEQ ID NO:142、以及它们的互补物。用于抑制鞘翅目害虫中的必需基因表达的手段的功能等同物包括与自编码ATP依赖性重塑酶的WCR基因转录的mRNA，如包含SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:5；SEQ IDNO:7；SEQ ID NO:79；SEQ ID NO:81；SEQ ID NO:83；SEQ ID NO:85；SEQ ID NO:87；SEQ IDNO:89；SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:165或SEQ ID NO:166的mRNA的全部或部分基本上同源的单链或双链RNA分子。保护植物不受害于鞘翅目害虫的手段是这样的DNA分子，其包含与启动子可操作连接的、编码用于抑制鞘翅目害虫中的必需基因的表达的手段的多核苷酸，其中所述DNA分子能够整合到玉米植物的基因组中。
公开了控制鞘翅目害虫群体的方法，所述方法包括向鞘翅目害虫提供iRNA(例如，dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、和hpRNA)分子，所述iRNA分子在被所述害虫摄取之后发挥作用而抑制该害虫体内的生物功能，其中所述iRNA分子包含选自以下的多核苷酸的全部或部分(例如至少15个连续核苷酸)：SEQ ID NO:135；SEQ ID NO:135的互补物；SEQ ID NO:136；SEQ ID NO:136的互补物；SEQ ID NO:137；SEQ ID NO:137的互补物；SEQ ID NO:138；SEQID NO:138的互补物；SEQ ID NO:139；SEQ ID NO:139的互补物；SEQ ID NO:140；SEQ IDNO:140的互补物；SEQ ID NO:141；SEQ ID NO:141的互补物；SEQ ID NO:142；SEQ ID NO:142的互补物；SEQ ID NO:143；SEQ ID NO:143的互补物；SEQ ID NO:144；SEQ ID NO:144的互补物；SEQ ID NO:145；SEQ ID NO:145的互补物；SEQ ID NO:146；SEQ ID NO:146的互补物；SEQ ID NO:147；SEQ ID NO:147的互补物；SEQ ID NO:148；SEQ ID NO:148的互补物；SEQ ID NO:149；SEQ ID NO:149的互补物；SEQ ID NO:150；SEQ ID NO:150的互补物；SEQID NO:151；SEQ ID NO:151的互补物；SEQ IDΝΟ:152；SEQ ID NO:152的互补物；SEQ IDNO:153；SEQ ID NO:153的互补物；SEQ ID NO:154；SEQ ID NO:154的互补物；SEQ ID NO:155；SEQ ID NO:155的互补物；SEQ ID NO:156；SEQ ID NO:156的互补物；SEQ ID NO:157；SEQ ID NO:157的互补物；SEQ ID NO:158；SEQ ID NO:158的互补物；SEQ ID NO:159；SEQID NO:159的互补物；SEQ ID NO:160；SEQ ID NO:160的互补物；SEQ ID NO:161；SEQ IDNO:161的互补物；SEQ ID NO:162；SEQ ID NO:162的互补物；SEQ ID NO:163；SEQ ID NO:163的互补物；SEQ ID NO:167；SEQ ID NO:167的互补物；SEQ ID NO:168；SEQ ID NO:168的互补物；SEQ ID NO:169；SEQ ID NO:169的互补物；与包含下述任一者的全部或部分的根萤叶甲属生物(例如WCR)的天然编码多核苷酸杂交的多核苷酸：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:166中的任一者；以及与包含下述任一者的全部或部分的根萤叶甲属生物的天然编码多核苷酸杂交的多核苷酸的互补物：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:166中的任一者。
本文中还公开了方法，其中可将dsRNA、miRNA、siRNA、shRNA、和/或hpRNA在基于饵食的测定中(diet-based assay)提供给鞘翅目害虫，或提供在表达dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、和/或hpRNA的遗传修饰的植物细胞中。在这些和另外的实例中，dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、和/或hpRNA可被鞘翅目害虫摄入。然后，本发明的dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、和/或hpRNA的摄入可在该害虫中导致RNAi，进而可导致对于该鞘翅目害虫的代谢过程、生殖过程、和/或幼虫发育必需的基因的沉默。因此，公开了方法，其中给鞘翅目害虫提供的多核苷酸，所述核酸分子包含可用于对鞘翅目害虫的亲代控制的示例性核酸序列。在特定的实例中，通过使用本发明的核酸分子控制的鞘翅目害虫可以是WCR、SCR、NCR、MCR、黄瓜条根萤叶甲、D.undecimpunctata tenella、南美叶甲、或D.u.undecimpunctata。在一些实例中，将核酸分子递送给鞘翅目害虫并不导致害虫的显著死亡，但是可减少由其产生的可存活的后代的数量。在一些实例中，将核酸分子递送到鞘翅目害虫可导致害虫的显著死亡，并且还可减少由其产生的可存活的后代的数量。
参考下文结合附图进行的对若干实施方案的详细说明，前述的特征以及其他特征将会更加自明。
附图简述
图1包括用于使用用单一一对引物从单个转录模板生成dsRNA(图1A)、以及从两个转录模板生成dsRNA(图1B)的策略的描述。
图2包括对来自玉米根萤叶甲(WCR)、英雄美洲蝽(BSB)、果蝇(Drosophila)、人BRAHMA和酿酒酵母SNF2的ATP-依赖性重塑物的ClustalW比对的***发生树表现。比对在Clustal X 2.1中进行，后者是ClustalW多重序列比对程序的windows界面。该***发生图在TreeView(Win 16)1.40软件中给出。
图3包括了玉米根萤叶甲(WCR)、英雄美洲蝽(BSB)、黑腹果蝇(Dme)的ATP依赖性重塑酶的结构域构架的示意图。该图示具有Pfam输出，结构域加有阴影和标记。各蛋白质按家族组织，并就SNF2结构域对齐。为图示的目的，“波纹形的”线代表截短/中断。
图4包括WCR iswi-2dsRNA(查询)对iswi-1转录物(主题)的比对，显示93％的序列同一性。该比对是使用BLAST-2-Seq进行的。
图5包括在不同实验条件下解剖WCR卵以检查胚胎发育的代表性照片。用GFPdsRNA处理的雌性产的卵(图5A)显示正常发育。用brahma、iswi-30和mi-2dsRNA处理的雌性产生的卵(图5B-4D)显示不完全胚胎发育和畸形幼虫。
图6包括：数据汇总，显示收集自在经处理的人工饵食中暴露于dsRNA的WCR雌性的卵中染色质重塑的相对表达；相对于GFP和水对照(图6A)。还显示了在经处理的人工饵食中暴露于dsRNA的雌性成虫中的brahma(图6B),mi-2(图6C)和iswi30(图6D)的相对表达，相对于GFP和水对照，在经处理的人工饵食中暴露于dsRNA的幼虫中的染色质重塑的相对表达。相同字母的条棒没有显著差异(P>0.05；N＝3个生物学重复，每个重复10个卵、幼虫、或成虫，以及每个样品2个技术重复)。
图7包括模型数据的汇总，其显示了对从“避难所缀块”(即，在转基因作物茬中未表达杀虫iRNA或重组蛋白质的缀块)羽化的雌性WCR成虫的pRNAi效应的相对幅度，当避难所植物表达杀虫蛋白和亲代活性iRNA时，对杀虫蛋白(R)和RNAi(Y)的抗性的等位基因频率增加速率的影响。
图8包括模型数据的汇总，其显示了对从“避难所缀块”(即，在转基因作物中未表达杀虫iRNA或重组蛋白质的缀块，所述转基因植物包含对玉米根虫幼虫有活性的干扰dsRNA以及对玉米根虫有活性的杀虫蛋白的组合)羽化的雌性WCR成虫的pRNAi效应的相对幅度，当非避难所植物所述表达杀虫蛋白以及对幼虫活性的iRNA和对亲代活性的iRNA分子二者时，对杀虫蛋白(R)和RNAi(Y)的抗性的等位基因频率增加速率的影响。
图9A示出了显示每个雌虫回收的卵数量的数据的汇总，9B分别显示了在交配前、交配后立即、以及在交配后六天暴露于2μg/μl的brahma或GFP dsRNA 6次后，孵化的幼虫的占总数的百分比的结果。比较用Dunnett检验进行，*表示p<0.1的显著性，**表示p<0.05的显著性，***表示p<0.001的显著性。
图10示出了显示在交配前、交配后立即、以及交配后6天暴露于2μg/μl的brahma或GFP 6次之后，测量的染色质重塑相对表达的数据的总结。比较用Dunnett检验进行，*表示p<0.1的显著性，**表示p<0.05的显著性。
图11A显示数据汇总，其显示暴露持续时间对于暴露于2μg brahma或GFP dsRNA1、2、4或6次(brm-T1,-T2,-T4或-T6)的昆虫的影响。图11B显示首次暴露于2μg的brahma或GFP dsRNA之后第12日测得的相对brahma表达。比较用Dunnett检验进行，*表示p<0.1的显著性，**表示p<0.05的显著性。
序列表中的序列的简述
使用如37C.F.R.§1.822规定的核苷酸碱基的标准字母缩写，示出了所附序列表中标明的核酸序列。所列出的核酸和氨基酸序列定义了具有以所记载的方式排列的核苷酸和氨基酸单体的分子(即分别为多核苷酸和多肽)。每个列出的核酸和氨基酸序列也定义了包含以所记载的方式排列的核苷酸和氨基酸单体的多核苷酸或多肽的类属(genus)。鉴于遗传密码的冗余，可以理解的是，某个包含编码序列的核苷酸序列同样可还描述一个多核苷酸类属，其中的多核苷酸和由参考序列组成的多核苷酸编码相同的多肽。还应当理解，某个氨基酸序列可描述编码该多肽的多核苷酸ORF的类属。
对于每个核酸序列仅显示了一条链，仅显示每个核酸序列的一条链，任何对所展示的链的提述应理解为包括对互补链。由于一级核酸序列的互补物和反向互补物必然被该一级序列所公开，所以对核酸序列的任何提述也包括核酸序列的互补物和反向互补物，但另有明确说明或者从该序列出现的上下文可以明确看出并非如此的除外。此外，如本领域所知，RNA链的核苷酸序列决定于转录该RNA的DNA的序列(除了胸腺嘧啶(T)被尿嘧啶(U)核碱基替换之外)，对于某个RNA序列而言，任何对编码它的DNA序列的提述也包括了该序列。在所附序列表中：
SEQ ID NO:1显示一个示例性的根萤叶甲属染色质重塑DNA，在本文中某些地方称为brahma-c4465rc。
SEQ ID NO:2显示一种由示例性的根萤叶甲属染色质重塑基因DNA编码的根萤叶甲属BRAHMA多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3显示另一个示例性的根萤叶甲属染色质重塑DNA，在本文中某些地方称为brahma-8089。
SEQ ID NO:4显示另一个由示例性的根萤叶甲属染色质重塑基因DNA编码的根萤叶甲属BRAHMA多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5显示另一个示例性的根萤叶甲属染色质重塑DNA，在本文中某些地方称为brahma-525。
SEQ ID NO:6显示另一个由示例性的根萤叶甲属染色质重塑基因DNA编码的根萤叶甲属BRAHMA多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7显示一种示例性的根萤叶甲属染色质重塑基因DNA，在本文中某些地方称为contig[0001]_brahma_949-1126，其含有"brahma变体1"(或"brahma var1")。
SEQ ID NO:8显示一种示例性的根萤叶甲属染色质重塑基因DNA，在本文中某些地方称为brahma reg-352。
SEQ ID NO:9显示一种由示例性的根萤叶甲属染色质重塑基因DNA编码的根萤叶甲属BRAHMA多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10显示一种示例性的根萤叶甲属染色质重塑基因DNA，在本文中某些地方称为brahma变体1(或brahma var1)，在一些实例中被用于产生dsRNA。
SEQ ID NO:11显示示例性的YFP基因的一个区段，其在一些实例中被用于产生dsRNA。
SEQ ID NO:12显示T7噬菌体启动子的核苷酸序列。
SEQ ID NO:13-20显示用于扩增根萤叶甲属brahma基因或YFP基因的基因区域的引物。
SEQ ID NO:21显示膜联蛋白区域1的DNA序列。
SEQ ID NO:22显示膜联蛋白区域2的DNA序列。
SEQ ID NO:23显示β血影蛋白2区域1的DNA序列。
SEQ ID NO:24显示β血影蛋白2区域2的DNA序列。
SEQ ID NO:25显示mtRP-L4区域1的DNA序列。
SEQ ID NO:26显示mtRP-L4区域2的DNA序列。
SEQ ID NO:27-52显示用于扩增膜联蛋白、β血影蛋白2、mtRP-L4、以及YFP的基因区用于dsRNA合成的引物。
SEQ ID NO:53显示了一个示例性GFP基因的区段，其在一些实例中被用于产生dsRNA。
SEQ ID NO:54和55显示用于PCR扩增GFP序列的引物，它们在一些实例中被用于产生dsRNA。
SEQ ID NO:56显示包含ST-LS1内含子的示例性DNA。
SEQ ID NO:57显示一个编码靶向根萤叶甲属染色质重塑基因的发夹形成RNA的示例性DNA；其含有brahma v1有义多核苷酸、包含内含子的环多核苷酸(加有下划线)、以及brahma v1反义多核苷酸(粗体)：
SEQ ID NO:58显示另一个编码靶向根萤叶甲属染色质重塑基因的发夹形成RNA的示例性DNA；其含有brahma v2有义多核苷酸、包含内含子的环多核苷酸(加有下划线)、以及brahma v2反义多核苷酸(粗体)：
SEQ ID NO:59显示T20VN引物寡核苷酸的核苷酸序列。
SEQ ID NO:60-64显示用于dsRNA转录物表达分析的引物和探针。
SEQ ID NO:65显示了用于二元载体骨架检测的SpecR编码区的一部分的核苷酸序列。
SEQ ID NO:66显示用于基因组拷贝数分析的AAD1编码区的核苷酸序列。
SEQ ID NO:67-78显示用于基因拷贝数确定和二元载体骨架检测的DNA寡核苷酸的核苷酸序列。
SEQ ID NO:79显示另一种示例性的根萤叶甲属染色质重塑基因DNA，在本文中某些地方称为mi-2。
SEQ ID NO:80显示一种由示例性的根萤叶甲属染色质重塑基因DNA编码的根萤叶甲属MI-2多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:81显示另一种示例性的根萤叶甲属染色质重塑基因DNA，在本文中某些地方称为iswi-1。
SEQ ID NO:82显示一种由示例性的根萤叶甲属染色质重塑基因DNA编码的根萤叶甲属ISWI-1多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:83显示另一种示例性的根萤叶甲属染色质重塑基因DNA，在本文中某些地方称为chd1。
SEQ ID NO:84显示一种由示例性的根萤叶甲属染色质重塑基因DNA编码的根萤叶甲属CHD1多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:85显示另一种示例性的根萤叶甲属染色质重塑基因DNA，在本文中某些地方称为iswi-2。
SEQ ID NO:86显示一种由示例性的根萤叶甲属染色质重塑基因DNA编码的根萤叶甲属ISWI-2多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:87显示另一种示例性的根萤叶甲属染色质重塑基因DNA，在本文中某些地方称为iswi-30或iswi-3。
SEQ ID NO:88显示一种由示例性的根萤叶甲属染色质重塑基因DNA编码的根萤叶甲属ISWI-30(“ISWI-3”)多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:89显示另一种示例性的根萤叶甲属染色质重塑基因DNA，在本文中某些地方称为ino80。
SEQ ID NO:90显示一种由示例性的根萤叶甲属染色质重塑基因DNA编码的根萤叶甲属INO80多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:91显示另一种示例性的根萤叶甲属染色质重塑基因DNA，在本文中某些地方称为domino。
SEQ ID NO:92显示一种由示例性的根萤叶甲属染色质重塑基因DNA编码的根萤叶甲属DOMINO多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:93-96显示了示例性的DNA，其编码用于靶向昆虫(例如根萤叶甲属、拟谷盗属、英雄美洲蝽、以及黑腹果蝇)染色质重塑基因DNA的SNF2解旋酶区域的dsRNA序列。
SEQ ID NO:97-100显示了示例性的DNA，其编码用于靶向昆虫(例如根萤叶甲属、拟谷盗属、英雄美洲蝽、以及黑腹果蝇)染色质重塑基因DNA的染色质重塑结构域(克罗莫结构域，布罗莫结构域，或HAND-SLIDE区域)的dsRNA序列。
SEQ ID NO:101显示一种示例性的根萤叶甲属染色质重塑基因DNA，在本文中某些地方称为mi-2区域1("mi2_5146")。
SEQ ID NO:102显示一种示例性的根萤叶甲属染色质重塑基因DNA，在本文中某些地方称为iswi-30区域1("iswi_3074")。
SEQ ID NO:103显示一种示例性的根萤叶甲属染色质重塑基因DNA，在本文中某些地方称为iswi-2区域1("SNF2_c1 8929")。
SEQ ID NO:104显示一种示例性的根萤叶甲属染色质重塑基因DNA，在本文中某些地方称为KISMET_2388区域1。
SEQ ID NO:105显示一种示例性的根萤叶甲属染色质重塑基因DNA，在本文中某些地方称为CHD1区域1("解旋酶_16208")。
SEQ ID NO:106显示一种示例性的根萤叶甲属染色质重塑基因DNA，在本文中某些地方称为ETL1区域1("SWI_SNF_Irc2582")。
SEQ ID NO:107-134显示用于扩增染色质重塑基因的基因区域的引物。
SEQ ID NO:135-163显示了从包含示例性的染色质重塑基因多核苷酸及其片段的核酸转录的示例性RNA。
SEQ ID NO:164示出了示例性根萤叶甲属mi-2染色质重塑基因DNA的开放阅读框。
SEQ ID NO:165示出了示例性的根萤叶甲属iswi-1染色质重塑基因DNA的开放阅读框。
SEQ ID NO:166显示了示例性的根萤叶甲属iswi-2染色质重塑基因DNA的开放阅读框。
SEQ ID NO:167-169显示了另外的示例性RNA，其是从包含示例性染色质重塑基因多核苷酸及其片段的核酸转录的。
用于实施发明的模式
I.若干实施方案的概览
开发了RNA干扰(RNAi)作为昆虫害虫管理的工具，使用表达dsRNA的转基因植物的最有可能的靶标害虫物种之一：西方玉米根虫。到目前为止，大多数被建议用作根虫幼虫RNAi靶标的基因没有达到其目的，而已鉴定的有用靶标涉及到在幼虫期致死的靶标。在这里，我们描述了在西方玉米根虫中RNAi介导的染色质基因(例如brahma、mi-2、iswi-1、chd1、iswi-2、iswi30、ino80和domino)的敲低，据显示，例如，当通过给成年雌性喂食靶向染色质重塑基因的dsRNA而递送iRNA分子时，RNAi介导的染色质重塑基因的敲低可破坏胚胎发育。从暴露于靶向染色质重塑的dsRNA的雌性收集的卵几乎完全没有孵化。在本文的实施方案中，通过喂养成年昆虫而递送靶向染色质重塑基因的dsRNA的能力可赋予对昆虫(例如鞘翅目)害虫管理非常有用的pRNAi效应。此外，影响幼虫和成虫根虫的多个目标序列的潜力可能会增加开发涉及RNAi技术的可持续的昆虫害虫管理途径的机会。
本文中公开了用于遗传控制鞘翅目害虫侵染的方法和组合物。还提供了用于鉴定对于鞘翅目害虫的生命周期必需的一个或多个基因(例如对正常的生殖能力和/或胚胎和/或幼虫发育而言必需的基因)，作为靶基因用于RNAi介导的鞘翅目害虫群体控制的方法。可设计编码RNA分子的DNA质粒载体来抑制生长、存活、发育、和/或生殖所必需的靶基因。在一些实施方案中，所述RNA分子可能能够形成dsRNA分子。在一些实施方案中，提供了通过与昆虫害虫中靶基因的编码或非编码序列互补的核酸分子来转录后阻抑靶基因表达或抑制靶基因的方法。在这些和另外的实施方案中，鞘翅目害虫可以摄取一种或多种从与靶基因的编码或非编码序列互补的核酸分子的全部或部分转录的dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、和/或hpRNA分子，由此提供植物保护效果。
一些实施方案涉及使用与靶基因的编码和/或非编码序列互补的dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、和/或hpRNA)对靶基因产物的表达进行序列特异性抑制，以实现对鞘翅目害虫的至少部分控制。公开了一组分离纯化的核酸分子，其包含，例如，如SEQ ID NO:1,SEQID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:79,SEQ ID NO:81,SEQ ID NO:83,SEQ IDNO:85,SEQ ID NO:87,SEQ ID NO:89,SEQ ID NO:91,SEQ ID NO:164,SEQ ID NO:165，或SEQ ID NO:166列出的多核苷酸及其片段。在一些实施方案中，可以从这些多核苷酸、其片段、或包含这些多核苷酸中一种或多种的基因表达稳定化的dsRNA分子，用于靶基因的转录后沉默或抑制。在某些实施方案中，分离和纯化的核酸分子包含SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:79,SEQ ID NO:81,SEQ ID NO:83,SEQ ID NO:85,SEQ ID NO:87,SEQ ID NO:89,SEQ ID NO:91,SEQ ID NO:164,SEQ ID NO:165，以及SEQID NO:166的全部或部分。
一些实施方案涉及在其基因组中具有编码至少一种iRNA(例如，dsRNA)分子的至少一种重组DNA的重组宿主细胞(例如，植物细胞)。在特定的实施方案中，dsRNA分子可以在被鞘翅目害虫摄取时产生，使该害虫或该害虫的后代中的靶基因发生转录后沉默或抑制其表达。重组DNA可以包含，例如：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7,SEQID NO:79,SEQ ID NO:81,SEQ ID NO:83,SEQ ID NO:85,SEQ ID NO:87,SEQ ID NO:89,SEQID NO:91,SEQ ID NO:164,SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:166中任一者；SEQ ID NO:1,SEQID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:79,SEQ ID NO:81,SEQ ID NO:83,SEQ IDNO:85,SEQ ID NO:87,SEQ ID NO:89,SEQ ID NO:91,SEQ ID NO:164,SEQ ID NO:165和SEQID NO:166中任一者的片段(例如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、和SEQ ID NO:101-106)；由包含SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:79,SEQ ID NO:81,SEQ ID NO:83,SEQ ID NO:85,SEQ ID NO:87,SEQ ID NO:89,SEQ ID NO:91,SEQ IDNO:164,SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:166中一者的基因的部分序列组成的多核苷酸；和/或其互补物。
一些实施方案涉及重组宿主细胞，所述细胞在其基因组中具有重组DNA，所述重组DNA具有编码至少一种iRNA(例如，dsRNA)分子，所述iRNA分子包含SEQ ID NO:139-142和167-169中任一者的全部或部分(例如，选自SEQ ID NO:143-146的至少一个多核苷酸)；SEQID NO:147的全部或部分(例如，SEQ ID NO:162)；SEQ ID NO:148的全部或部分；SEQ IDNO:149的全部或部分(例如，SEQ ID NO:166)；SEQ ID NO:150的全部或部分；SEQ ID NO:151的全部或部分(例如，SEQ ID NO:163)；SEQ ID NO:152的全部或部分；SEQ ID NO:153的全部或部分；SEQ ID NO:167的全部或部分；SEQ ID NO:168的全部或部分；以及SEQ ID NO:169的全部或部分。当被鞘翅目害虫摄入时，iRNA分子可以在该害虫或该害虫的后代中沉默或抑制靶染色质重塑基因(例如包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ IDNO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:166的多核苷酸的全部或部分的DNA)的表达，从而导致该害虫的生殖的停止，和/或该害虫的后代中生长、发育和/或进食停止。
在一些实施方案中，在其基因组中具有编码至少一种能够形成dsRNA分子的RNA分子的至少一种重组DNA的重组宿主细胞可以是转化的植物细胞。一些实施方案涉及包含这样的转化的植物细胞的转基因植物。除了这样的转基因植物之外，还提供了任何转基因植物世代的后代植物、转基因种子、和转基因植物产品，它们均包含重组DNA。在特定的实施方案中，可以在转基因植物细胞中表达能够形成dsRNA分子的RNA分子。因此，在这些和其他实施方案中，可以从转基因植物细胞分离dsRNA分子。在特定的实施方案中，转基因植物是选自下组的植物，包括：玉米(Zea mays)和禾本科(Poaceae)的植物。
一些实施方案涉及用于调控鞘翅目害虫细胞中靶基因表达的方法。在这些和其他实施方案中，可以提供核酸分子，其中所述核酸分子包含编码能够形成dsRNA分子的RNA分子的多核苷酸。在特定的实施方案中，编码能够形成dsRNA分子的RNA分子的多核苷酸可与启动子可操作连接，并且还可与转录终止序列可操作连接。在特定的实施方案中，用于调控鞘翅目害虫细胞中靶基因表达的方法可包括：(a)用包含编码能够形成dsRNA分子的RNA分子的多核苷酸的载体转化植物细胞；(b)在足以容许形成包含多个转化的植物细胞的植物细胞培养物的条件下培养所述转化的植物细胞；(c)选择已将载体整合到其基因组中的转化的植物细胞；和(d)确定选择的转化的植物细胞包含由载体的所述多核苷酸序列编码的、能够形成dsRNA分子的RNA分子。可以从基因组中整合有载体、且包含由载体的所述多核苷酸编码的dsRNA分子的植物细胞再生植物。
还公开了在其基因组中整合有载体的转基因植物，所述载体具有编码能够形成dsRNA分子的RNA分子的多核苷酸，其中转基因植物包含由所述载体的所述多核苷酸编码的dsRNA分子。在特定的实施方案中，植物中能够形成dsRNA分子的RNA分子的表达足以调控接触了所述转化的植物或植物细胞(例如通过以转化的植物、植物的一部分(例如，根)或植物细胞为食)的鞘翅目害虫细胞中、或者接触了经转化的植物或植物细胞的鞘翅目害虫的后代(例如通过亲代传播)的细胞中靶基因的表达，使得害虫的生殖被抑制。本文中公开的转基因植物可以展现出对鞘翅目害虫侵染的耐受性和/或保护作用。特定的转基因植物可以展现出对一种或多种选自下组的鞘翅目害虫的保护作用和/或增强的保护作用：WCR、NCR、SCR、MCR、玉米根萤叶甲、南美叶甲、D.u.tenella、和D.u.undecimpunctata Mannerheim。
本文中还公开了用于将控制剂(如iRNA分子等)投送给鞘翅目害虫的方法。这样的控制剂可以直接或间接地阻碍鞘翅目害虫群体进食、生长或以其他方式致害宿主的能力。在一些实施方案中，提供了这样的方法，包括将稳定化的dsRNA分子递送至鞘翅目害虫以抑制该害虫或其后代中的至少一种靶基因，从而导致亲代RNAi并减少或消除害虫宿主中的植物损害。在一些实施方案中，抑制鞘翅目害虫中靶基因表达的方法可以导致害虫中生殖的停止、和/或害虫的后代中生长、发育、和/或进食的停止。在一些实施方案中，该方法可以显著减少侵染中后续的害虫世代的大小，而不直接导致与iRNA分子接触的害虫的死亡。在一些实施方案中，该方法可以显著减少侵染中后续的害虫世代的大小，同时也导致接触iRNA分子的害虫的死亡。
在一些实施方案中，提供了包含iRNA(例如，dsRNA)分子的组合物(例如，局部用组合物)，供用于植物、动物、和/或植物或动物的环境以消除或降低鞘翅目害虫的侵染。在一些实施方案中，提供了包含原核生物的组合物，所述原核生物包含编码iRNA分子的DNA；例如，转化的细菌细胞。在具体实例中，这种转化的细菌细胞可以用作常规的农药制剂。在特定的实施方案中，组合物可以是要喂给鞘翅目害虫的营养组合物或资源，或食物来源。一些实施方案包括使害虫可得到所述营养组合物或食物来源。包含iRNA分子的组合物的摄入可导致所述分子被鞘翅目害虫的一个或多个细胞摄取，进而可导致害虫或其后代的细胞中至少一种靶基因表达的抑制。通过在害虫的宿主中提供一种或多种包含iRNA分子的组合物，可以在任何存在鞘翅目害虫的宿主组织或环境之中或之上限制或消除该害虫侵染对植物或植物细胞的摄入或损伤。
本文中公开的组合物和方法可与针对其他用于控制鞘翅目害虫所示损害的方法和组合物联用。例如，本文中所描述的用于针对鞘翅目害虫保护植物的iRNA分子可以在这样的方法中使用，所述方法包括另外使用一种或多种针对鞘翅目害虫有效的化学剂、针对这样的害虫有效的生物杀虫剂、作物轮作、展现出与RNAi介导的方法和RNAi组合物的特征不同的特征(例如，在植物中重组产生对于鞘翅目害虫有害的蛋白质(例如，Bt毒素))的重组遗传技术、和/或重组表达非亲代iRNA分子(例如可导致摄取该iRNA分子的鞘翅目害虫中生长、发育和/或进食停止的致命性iRNA分子)。
II.缩写
dsRNA 双链核糖核酸
GI 生长抑制
GFP 绿色荧光蛋白
NCBI 美国国家生物技术信息中心
gDNA 基因组脱氧核糖核酸
iRNA 抑制性核糖核酸
ISWI 模仿SWI/模仿开关
ORF 开放阅读框
RNAi 核糖核酸干扰
miRNA 微小核糖核酸
siRNA 小抑制性核糖核酸
hpRNA 发夹核糖核酸
shRNA 短发夹核糖核酸
pRNAi 亲代RNA干扰
UTR 非翻译区
WCR 西方玉米根虫(玉米根萤叶甲)
NCR 北方玉米根虫(巴氏根萤叶甲)
MCR 墨西哥玉米根虫(墨西哥玉米根萤叶甲)
PCR 聚合酶链式反应
qPCR 定量聚合酶链式反应
RISC RNA诱导的沉默复合物
RH 相对湿度
SCR 南方玉米根虫(十一星根萤叶甲)
SEM 均值标准误
YFP 绿色荧光蛋白
III.术语
在以下描述和表中，使用了许多术语。为了提供对说明书和权利要求书的清楚且一致的理解，包括要赋予此类术语的范围，提供了以下定义：
鞘翅目害虫：如本文中使用的，术语“鞘翅目害虫”指以农业作物和作物产品，包括玉米和其它真正的禾本科为食的、属于鞘翅目(Coleoptera)的害虫昆虫，包括属于根萤叶甲属的害虫。在具体的例子中，鞘翅目害虫选自下列清单，包括：玉米根萤叶甲(WCR)；巴氏根萤叶甲(NCR)；十一星根萤叶甲(SCR)；墨西哥玉米根萤叶甲(MCR)；黄瓜条根萤叶甲；D.u.tenella；和D.u.undecimpunctata Mannerheim。
(与生物)接触：如本文中使用的，与生物(例如，鞘翅目害虫)“接触”或被生物“摄取”等术语，就核酸分子而言，包括核酸分子内化到生物中，例如但不限于：生物摄取分子(例如，通过进食)；使生物与包含核酸分子的组合物接触；以及用包含核酸分子的溶液浸泡生物。
重叠群：如本文中使用的，术语“重叠群”指从一组来源于单一遗传来源的重叠DNA区段重建的DNA序列。
玉米植物：如本文中使用的，术语“玉米植物”指物种玉蜀黍(玉米)的植物。术语“玉米植物”和“玉蜀黍”在本文中可互换使用。
表达：如本文中使用的，编码多核苷酸(例如，基因或转基因)的“表达”是指这样的过程，通过该过程，核酸转录单元(包括，例如gDNA或cDNA)的编码信息被转化为细胞的操作部分、非操作部分、或结构部分(常常包括蛋白质的合成)。基因表达可能受到外部信号的影响，例如细胞、组织、或生物暴露于增加或降低基因表达的物质。基因表达也可以在从DNA到RNA再到蛋白质的途径中的任何位置受到调节。例如，通过控制对转录、翻译、RNA运输和加工、中间分子比如mRNA的降解的作用，或通过在特异性蛋白分子已经产生之后的活化、失活、区室化、或降解，或它们的组合，由此发生基因表达的调节。通过本领域已知的任何方法，包括但不限于，Northern印迹、RT-PCR、Western印迹，或体外、原位或体内蛋白活性测定，可以在RNA水平或蛋白质水平测量基因表达。
遗传物质：如本文中使用的，术语“遗传物质”包括所有基因和核酸分子，诸如DNA和RNA。
抑制：如本文中使用的，术语“抑制”在用于描述对编码多核苷酸(例如基因)的影响时是指从编码多核苷酸转录的mRNA和/或编码多核苷酸的肽、多肽、或蛋白质产物的细胞水平的可测量的降低。在一些实例中，抑制编码多核苷酸的表达可以使得表达大致消失。“特异性抑制”是指在实现特异性抑制的细胞中对靶编码多核苷酸的抑制不对其他编码多核苷酸(例如，基因)的表达产生影响。
分离的：“分离的”生物学组分(诸如核酸、肽或蛋白质)是已经从该组分所天然存在的生物细胞中的其他生物学组分(即，其他染色体和染色体外的DNA和RNA、和蛋白质)实质性分开、分开产生、或纯化出来，同时实现组分中的化学或功能变化(例如，核酸可以通过断开将核酸连接到染色体中的其余DNA的化学键而从染色体分离)。已经“分离的”核酸分子和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸分子和蛋白质。该术语还包括通过在宿主细胞内重组表达制备的核酸分子和蛋白质，以及化学合成的核酸分子、蛋白质和肽。
核酸分子：如本文中使用的，术语“核酸分子”可以是指核苷酸的聚合物形式，可包括RNA、cDNA、gDNA的有义和反义链，以及上述情形的合成形式和混合聚合物。核苷酸或核碱基可以是指核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、或这两种类型核苷酸的任一者的修饰形式。如本文中使用的“核酸分子”与“核酸”和“多核苷酸”是同义词。除非另外指明，核酸分子通常在长度上具有至少10个碱基。根据惯例，核酸分子的核苷酸序列从分子的5’至3’端阅读。核酸分子的“互补物”(即互补物)是指具有可以与该核酸分子的核碱基形成碱基对(即，A-T/U，和G-C)的核碱基的多核苷酸。
一些实施方案包括包含转录为RNA分子的模板DNA的核酸，所述RNA分子是mRNA分子的互补物。在这些实施方案中，转录为mRNA分子的核酸的互补物以5'至3'方向存在，使得RNA聚合酶(其以5'至3'方向转录DNA)将从互补物转录出可以与mRNA分子杂交的核酸。因此，除非另有明确说明或者从上下文中可以清楚地看出另有所指，术语“互补物”是指具有可以与特定核苷酸序列的核碱基形成碱基对的从5'至3'的核碱基的多核苷酸。类似地，除非另有明确说明或者从上下文中可以清楚地看出另有所指，核酸的“反向互补物”是指相反取向的互补物。前述内容在以下图示中示出：
ATGATGATG 多核苷酸
TACTACTAC 该多核苷酸的“互补物”
CATCATCAT 该多核苷酸的“反向互补物”
本发明的一些实施方案可包括形成发夹RNA的RNAi分子。在这些RNAi分子中，RNA干扰的靶核酸的互补物和反向互补物可以出现在同一分子中，使得单链RNA分子在包含互补和反向互补的多核苷酸的区域上可以“回折”并与自身杂交。
“核酸分子”包括所有多核苷酸，例如：DNA的单链和双链形式；RNA的单链形式；和RNA的双链形式(dsRNA)。术语“核苷酸序列”或“核酸序列”是指作为个别单链或在双链体中的核酸有义和反义链两者。术语“核糖核酸”(RNA)包括iRNA(抑制性RNA)、dsRNA(双链RNA)、siRNA(小干扰RNA)、shRNA(小发夹RNA)、mRNA(信使RNA)、miRNA(微小RNA)、hpRNA(发夹RNA)、tRNA(转运RNA)(无论是装载还是卸下相应的酰化氨基酸)、和cRNA(互补RNA)。术语“脱氧核糖核酸”(DNA)包括cDNA、gDNA、和DNA-RNA杂交体。术语“多核苷酸”、“核酸”、及其“片段”，如本领域技术人员将理解的，是包括gDNA、核糖体RNA、转运RNA、信使RNA、操纵子、和较小的工程化多核苷酸的术语，其编码或可适用于编码肽、多肽、或蛋白质。
寡核苷酸：寡核苷酸是短的核酸聚合物。寡核苷酸可通过切割较长核酸区段、或通过使单独的核苷酸前体聚合而形成。自动合成仪能够合成长度多达几百个碱基的寡核苷酸。由于寡核苷酸可与互补的核酸结合，因此它们可用作检测DNA或RNA的探针。由DNA(寡脱氧核糖核苷酸)组成的寡核苷酸可以用于PCR，PCR是一种用于扩增DNA的技术。在PCR中，寡核苷酸一般被称为“引物”，其允许DNA聚合酶延伸寡核苷酸并复制互补链。
核酸分子可以包括天然存在的核苷酸和/或修饰核苷酸，它们通过天然存在和/或非天然存在的核苷酸连接而连接在一起。本领域技术人员易于理解，核酸分子可被化学修饰或生物化学修饰，或者可以含有非天然的或衍生化的核苷酸碱基。这些修饰包括，例如，标记物、甲基化、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰(例如，如不带电连接(uncharged linkage)的修饰：例如甲基膦酸盐、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等；带电连接(charged linkage)的修饰：例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等；悬垂部分的修饰：例如肽类；嵌入剂修饰：例如吖啶、补骨脂素等；螯合剂修饰；烷化剂(alkylator)修饰；和修饰的连接：例如α异头核酸等)。术语“核酸分子”还包括任何拓扑结构，包括单链的、双链的、部分双链体的、三链体的、发夹形的(hairpinned)、圆形的、挂锁形的结构。
如本文中使用的，就DNA而言，术语“编码多核苷酸”、“结构多核苷酸”、或“结构核酸分子”是指这样的多核苷酸，当被置于适当的调节元件控制下时，其通过转录和mRNA最终翻译成多肽。就RNA而言，术语“编码多核苷酸”指翻译成肽、多肽或蛋白质的多核苷酸。编码多核苷酸的边界由5’端的翻译起始密码子和3’端的翻译终止密码子所界定。编码多核苷酸包括但不限于：gDNA；cDNA；EST；和重组多核苷酸。
如本文所用的，“转录的非编码多核苷酸”是指mRNA分子的区段，例如不被翻译成肽、多肽或蛋白质的5'UTR、3'UTR和内含子片段。此外，“转录的非编码多核苷酸”是指转录成在细胞中起作用的RNA的核酸，例如结构RNA(例如，核糖体RNA(rRNA)，其实例有5S rRNA、5.8S rRNA、16S rRNA、18S rRNA、23S rRNA和28S rRNA等)；转运RNA(tRNA)；和snRNA诸如U4，U5，U6等。转录的非编码多核苷酸还包括例如但不限于小RNA(sRNA)，该术语通常用于描述小细菌非编码RNA；小核仁RNA(snoRNA)；微RNA；小干扰RNA(siRNA)；Piwi相互作用RNA(piRNA)；和长非编码RNA。此外，“转录的非编码多核苷酸”是指可以在核酸中作为基因内“接头”本身存在并且被转录成RNA分子的多核苷酸。
致死性RNA干扰：如本文所用的，术语“致死性RNA干扰”是指可导致受试者个体死亡或存活力降低的RNA干扰，所述受试者个体被递送了例如dsRNA，miRNA，siRNA，shRNA和/或hpRNA。
亲代RNA干扰：如本文所用，术语“亲代RNA干扰”(pRNAi)是指可以在受试者(例如，鞘翅目害虫)的后代中观察到的RNA干扰表型，所述受试者个体被递送了例如dsRNA、miRNA、siRNA、shRNA和/或hpRNA。在一些实施方案中，pRNAi包括将dsRNA递送至鞘翅目昆虫，其中该害虫产生可存活后代的能力由此被降低。启动pRNAi的核酸可以增加，也可以不增加被递送了该核酸的群体中的死亡发生率。在某些实例中，启动pRNAi的核酸不增加被递送了该核酸的群体中的死亡发生率。例如，某个鞘翅目害虫群体可以被饲以一种或多种启动pRNAi的核酸，其中这些害虫存活并交配，但其产生的卵比未被饲以所述核酸的相同物种的害虫所产的卵相比，孵化出可存活的后代的能力较低。在pRNAi的一种机制中，递送到雌性的亲代RNAi能够敲除雌性后代胚胎中的合子基因表达。Bucher et al.(2002)Curr.Biol.12(3):R85-6。
基因组：如本文中所使用的，术语“基因组”是指存在于细胞核内的染色体DNA，并且也指存在于细胞的亚细胞组成部分内的细胞器DNA。在本发明的一些实施方案中，可以将DNA分子导入植物细胞中，使得DNA分子整合到植物细胞的基因组中。在这些和另外的实施方案中，DNA分子可以整合到植物细胞的核DNA中，或整合到植物细胞的叶绿体或线粒体的DNA中。术语“基因组”在其应用于细菌时，指细菌细胞内的染色体和质粒两者。在本发明的一些实施方案中，可以将DNA分子导入细菌中，使得DNA分子整合到细菌的基因组中。在这些和另外的实施方案中，DNA分子可以整合于染色体，或者作为稳定的质粒定位或位于稳定的质粒中。
序列同一性：如本文中使用的术语“序列同一性”或“同一性”，在两个多核苷酸或多肽的情况下，是指在指定比较窗口上以最大对应性比对时，这两个分子的序列中相同的残基。
如本文中使用的，术语“序列同一性百分比”可以是指通过在比较窗口上比较分子的两个最优比对序列(例如，核酸序列或多肽序列)确定的值，其中为了实现这两个序列的最优比对，该比较窗口中的序列部分相比于参考序列(其不包含添加或缺失)可以包含添加或缺失(即，空位)。通过确定在两个序列中出现相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数目而产生匹配位置数，用该匹配位置数除以比较窗口中位置的总数，将结果乘以100而产生序列同一性的百分比，从而计算出该百分比。每个位置与参考序列相比均相同的序列被认为是与参考序列是100％相同的，反之亦然。
用于比较的序列比对方法是本领域技术人员熟知的。各种程序和比对算法例如描述于Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444；Higgins和Sharp(1988)Gene 73:237-44；Higgins和Sharp(1989)CABIOS 5:151-153；Corpet等人，(1988)Nucleic Acids Res.16:10881-90；Huang等人，(1992)Comp.Appl.Biosci.8:155-65；Pearson等人，(1994)Methods Mol.Biol.24:307-31；Tatiana等人(1999)FEMS Microbiol.Lett.174:247-50。序列比对方法和同源性计算的详细讨论可见于例如，Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215:403-10。
美国国家生物技术信息中心(NCBI)基本局部比对搜索工具(BLASTTM；Altschul等人(1990))可在几个来源访问，包括美国国家生物技术信息中心(Bethesda,MD)、以及在互联网上，其与几种序列分析程序结合使用。怎样使用该程序确定序列同一性的描述可在互联网上BLASTTM的“帮助”部分获得。为了比较核酸序列，可以采用利用默认参数的默认BLOSUM62矩阵集的BLASTTM(Blastn)程序的“Blast 2序列”函数。在用这种方法评估时，与参考多核苷酸的序列具有较大序列相似性的核酸将显示出同一性百分比的增加。
可特异性杂交/特异性互补：如本文中使用的，术语“可特异性杂交”和“特异性互补”是表明互补性的足够程度的术语，该互补性足以使得在核酸分子与靶核酸分子之间发生稳定且特异的结合。在两个核酸分子之间的杂交两种涉及核酸分子的核碱基之间的反平行比对的形成。然后，两个分子能够与相反链上的相应碱基形成氢键以形成双链体分子，如果该双链体分子足够稳定，则可使用本领域中熟知的方法检出。多核苷酸与其可特异性杂交的靶核酸不一定是100％互补的。然而，对于特异性杂交而言必须存在的序列互补性的量依赖所使用的杂交条件而变化。
导致特定严格程度的杂交条件会根据选择的杂交方法的性质和杂交的核酸的组成和长度而变化。通常，杂交的温度和杂交缓冲液的离子强度(尤其是Na+和/或Mg++浓度)将决定杂交严格性，虽然洗涤次数也会影响严格性。关于获得特定严格性程度所需要的杂交条件的计算是本领域普通技术人员已知的，并且论述于例如Sambrook等人(编辑)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd ed.,vol.1-3,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989,chapters 9和11；以及Hames和Higgins(编辑)Nucleic Acid Hybridization,IRL Press,Oxford,1985。关于核酸杂交的进一步详细说明和指导例如可见于Tijssen,"Overview of principles of hybridization和thestrategy of nucleic acid probe assays,"收录于Laboratory Techniques in Biochemistry和Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes,PartI,Chapter 2,Elsevier,NY,1993；以及Ausubel等人编辑，Current Protocols in Molecular Biology,Chapter 2,Greene Publishing和Wiley-Interscience,NY,1995。
如本文中使用的，“严格条件”涵盖仅在杂交分子的序列与靶核酸分子内的同源多核苷酸之间存在的错配小于20％时才发生杂交的条件。“严格条件”包括另外的特定严格性水平。因此，如本文中使用的，“中等严格性”条件为具有超过20％的以上序列错配的分子将不会杂交的条件；“高严格性”条件为具有超过10％的错配的序列将不会杂交的条件；并且“极高严格性”条件为具有超过5％的错配的序列将不会杂交的条件。
以下是代表性的非限制性杂交条件：
高严格性条件(检测出共享至少90％序列同一性的多核苷酸)：在5X SSC缓冲液中在65℃杂交16小时；在2X SSC缓冲液中在室温下洗涤两次，每次15分钟；并且在0.5X SSC缓冲液中在65℃洗涤两次，每次20分钟。
中等严格性条件(检测出共享至少80％序列同一性的多核苷酸)：在5X到6X SSC缓冲液中在65--70℃杂交16-20小时；在2X SSC缓冲液中在室温下洗涤两次，每次5-20分钟；并且在1X SSC缓冲液中在55-70℃洗涤两次，每次30分钟。
非严格对照条件(共享至少50％序列同一性的多核苷酸会杂交)：在6X SSC缓冲液中在室温到55℃杂交16-20小时；在2X到3X SSC缓冲液中在室温到55℃洗涤至少两次，每次20-30分钟。
如本文中使用的，术语“基本上同源”或“实质同源性”就核酸而言是指具有这样的连续核碱基的多核苷酸，所述连续核碱基在严格条件下与参考核酸杂交。例如，与SEQ IDNO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:79,SEQ ID NO:81,SEQ ID NO:86,SEQ ID NO:88,SEQ ID NO:90,SEQ ID NO:92,SEQ IDNO:94,SEQ ID NO:104,SEQ ID NO:105,SEQ ID NO:106,SEQ ID NO:108,SEQ ID NO:164,SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:166中任一个的参考核酸序列基本上同源的序列的核酸是在严格条件(例如，上文列出的中等严格性条件)下与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:104、SEQ IDNO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:165和/或SEQ ID NO:166中任一个的参考核酸杂交的那些核酸。基本上同源的多核苷酸可以具有至少80％序列同一性。例如，基本上同源的多核苷酸可以具有约80％到100％序列同一性，诸如约79％；80％；约81％；约82％；约83％；约84％；约85％；约86％；约87％；约88％；约89％；约90％；约91％；约92％；约93％；约94％；约95％；约96％；约97％；约98％；约98.5％；约99％；约99.5％；和约100％。实质性同源性的特性与特异性杂交紧密相关。例如，当存在足够的互补程度时，核酸分子可特异性地杂交，以便避免核酸在特异性结合是期望的情况下(例如，在严格杂交条件下)与非靶多核苷酸的非特异性结合。
如本文中使用的，术语“直系同源物”是指两种或更多种物种中已经从共同的祖先核酸进化并且可以在所述两种或更多种物种中保留相同功能的基因。
如本文中使用的，当一个多核苷酸以5’至3’方向阅读的每个核苷酸与另一多核苷酸以3’至5’方向阅读时的每个核苷酸序列互补时，两个核酸分子被认为展现出“完全互补性”。与参考多核苷酸互补的多核苷酸将展现出与参考多核苷酸的反向互补物相同的序列。这些术语和描述是本领域中定义明确的，并且是本领域普通技术人员容易理解的。
可操作(地)连接：当第一多核苷酸与第二多核苷酸处于功能性关系中时，则第一多核苷酸与第二多核苷酸是可操作连接的。当以重组方式产生时，可操作连接的多核苷酸通常是连续的，并且在需要将两个蛋白质编码区连接在一起的场合，二者在同一个阅读框内(例如，在翻译融合的ORF中)。然而，可操作连接的核酸不一定是连续的。
在有关调节性遗传元件和编码多核苷酸的语境下使用时，术语“可操作连接”意味着该调节元件影响该连接的编码序列的表达。“调节元件”或“控制元件”是指影响转录的周期和水平/量、RNA加工或稳定性、或相关编码多核苷酸的翻译的多核苷酸。调节元件可以包括启动子；翻译前导；内含子；增强子；茎环结构；阻抑物结合多核苷酸；具有终止序列的多核苷酸；具有多腺苷酸化识别序列的多核苷酸等。特定的调节元件可位于与其可操作连接的编码多核苷酸的上游和/或下游。并且，与编码多核苷酸可操作连接的特定调节序列可位于双链核酸分子的相关互补链上。
启动子：如本文中使用的，术语“启动子”是指可以在转录起始上游的、且可能涉及RNA聚合酶与其他蛋白质的识别和结合而启动转录的DNA区域。启动子可与用于在细胞中表达的编码多核苷酸可操作连接，或者启动子可与编码信号序列的多核苷酸可操作连接，所述多核苷酸可与用于在细胞中表达的编码多核苷酸可操作连接。“植物启动子”可以是能够启动植物细胞转录的启动子。在发育控制下的启动子的实例包括优先启动某些组织中的转录的启动子，所述组织例如叶、根、种子、纤维、木质部导管、管胞、或厚壁组织。这样的启动子称为“组织优先”启动子。仅启动某些组织中的转录的启动子被称为“组织特异性”启动子。“细胞类型特异性”启动子主要驱动一个或多个器官中某些细胞类型(例如，根或叶中的维管细胞)中的表达。“诱导型”启动子可以是可以在环境控制之下的启动子。可通过诱导型启动子启动转录的环境条件的实例包括厌氧条件和光的存在。组织特异性启动子、组织优先启动子、细胞类型特异性启动子、和诱导型启动子构成“非组成型”启动子类别。“组成型”启动子是可在大多数环境条件下或在大多数组织或细胞类型中有活性的启动子。
在本发明的一些实施方案中可以使用任何诱导型启动子。参见Ward等人，(1993)Plant Mol.Biol.22:361-366。利用诱导型启动子，转录速率响应于诱导剂而增加。诱导型启动子的实例包括但不限于：来自响应于铜的ACEI***的启动子；响应于苯磺酰胺除草剂安全剂的来自玉米的In2基因启动子；来自Tn10的Tet阻抑物；和来自类固醇激素基因的诱导型启动子，其转录活性可通过糖皮质激素诱导(Schena等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:0421)。
示例性的组成型启动子包括，但不限于：来自植物病毒的启动子，例如来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子；来自水稻肌动蛋白基因的启动子；泛素启动子；pEMU；MAS；玉米H3组蛋白启动子；和ALS启动子，欧洲油菜ALS3结构基因5'的Xba1/NcoI片段(或与所述Xba1/NcoI片段相似的多核苷酸)(国际PCT公布号美国专利WO96/30530)。
另外，在本发明的一些实施方案中可以利用任何组织特异性或组织优先启动子。用包含与组织特异性启动子可操作连接的编码多核苷酸的核酸分子转化的植物可唯一地或优先地在特异性组织中产生所述编码多核苷酸的产物。示例性的组织特异性或组织优先启动子包括但不限于：种子特异性启动子，如来自菜豆蛋白基因的启动子；叶特异性和光诱导型启动子，如来自cab或rubisco的启动子；花药特异性启动子，如来自LAT52的启动子；花粉特异性启动子，如来自Zm13的启动子；以及小孢子优先启动子，如来自apg的启动子。
转化：如本文中使用的，术语“转化”或“转导”是指将一个或多个核酸分子转移到细胞中。当核酸分子通过核酸分子并入细胞基因组中、或通过附加型复制而由该细胞稳定复制时，细胞被转导到该细胞中的核酸分子“转化”。如本文中使用的，术语“转化”涵盖可将核酸分子导入这种细胞中的所有技术。实例包括但不限于：用病毒载体转染；用质粒载体转化；电穿孔(Fromm等人，(1986)Nature 319:791-3)；脂质体转染(Felgner等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413-7)；显微注射(Mueller等人，(1978)Cell 15:579-85)；土壤杆菌介导的转移(Fraley等人，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4803-7)；直接DNA摄取；和微粒轰击(Klein等人，(1987)Nature 327:70)。
转基因：外源核酸。在一些实例中，转基因可以是编码RNA的DNA，所述RNA能够形成dsRNA分子的一条或两条链，包含与存在于鞘翅目害虫中的核酸分子互补的多核苷酸。在另外的实例中，转基因可以是反义多核苷酸，其中反义多核苷酸的表达抑制靶核酸的表达，从而产生亲代RNAi表型。在又另外的实例中，转基因可以为基因(例如除草剂耐性基因、编码工业或药学上有用的化合物的基因、或编码期望的农业性状的基因)。在这些和其他实例中，转基因可以含有与转基因的编码多核苷酸可操作连接的调节元件(例如，启动子)。
载体：引入到细胞中，例如产生转化的细胞的核酸分子。载体可以包含允许其在宿主细胞中复制的遗传元件，诸如复制起点。载体的实例包括但不限于：质粒；粘粒；噬菌体；和携带外源DNA或RNA进入细胞中的病毒。载体还可包括一种或多种基因、包括产生反义分子的基因、和/或选择标志物基因和本领域已知的其他遗传元件。载体可以转导、转化或感染细胞，由此引起细胞表达核酸分子和/或由该载体编码的蛋白质。任选地，载体包括辅助核酸分子实现进入细胞中的物质(例如脂质体、蛋白质包衣等)。
产量：相对于在相同生长位置在相同时间且在相同条件下生长的检验品种的产量，约100％或更大的稳定化产量。在特定的实施方案中，“提高的产量”或“提高产量”意指相对于在含有相当大密度的对该作物有害的鞘翅目害虫(本申请的组合物和方法以所述害虫为目标)的相同生长位置在相同时间且在相同条件下生长的检验品种的产量，具有105％或更大的稳定化产量的栽培种。
除非特别指明或暗示，如本文中使用的术语“一个”、“一种”和“该”表示“至少一个/种”。
除非另外特别地解释，本文中使用的全部技术术语和科学术语具有与属于本公开的领域之内的普通技术人员通常所理解的相同的含义。可以在以下出版物中找到分子生物学中常见术语的定义：例如，Lewin’s Genes X,Jones&Bartlett Publishers,2009(ISBN100763766321)；Krebs等人(编辑)，The Encyclopedia of Molecular Biology,BlackwellScience Ltd.,1994(ISBN 0-632-02182-9)；和Meyers R.A.(编辑)，Molecular Biology和 Biotechnology:A Comprehensive Desk Reference,VCH Publishers,Inc.,1995(ISBN 1-56081-569-8)。除非另有说明，所有百分比均以重量计，所有溶剂混合物比例以体积计。所有温度以摄氏度计。
IV.包含鞘翅目害虫多核苷酸的核酸分子
A.概述
本文中描述了可用于控制鞘翅目害虫的核酸分子。描述的核酸分子包括靶多核苷酸(例如，天然基因、和非编码多核苷酸)、dsRNA、siRNA、shRNA、hpRNA、和miRNA。例如，在一些实施方案中描述了dsRNA、miRNA、siRNA、shRNA和/或hpRNA分子，其可与鞘翅目害虫中的一种或多种天然核酸的全部或部分特异性地互补。在这些和另外的实施方案中，天然核酸可以是一种或多种靶基因，其产物可以例如但不限于：涉及生殖过程或涉及幼虫发育。本文中描述的核酸分子在导入包含至少一种与该核酸分子特异性互补的天然核酸的细胞中时(例如通过亲代传播)，可以在细胞中启动RNAi，随后降低或消除该天然核酸的表达。在一些实例中，借助于与靶基因特异性互补的核酸分子降低或消除靶基因表达，可导致鞘翅目害虫的生殖停止，和/或该害虫的后代中生长、发育和/或进食停止。这些方法可能显著地减少侵袭中后续害虫世代的大小，例如不导致接触该iRNA分子的害虫的死亡。
在一些实施方案中，可以选择鞘翅目害虫中的至少一种靶基因，其中靶基因包含染色质重塑多核苷酸(例如基因)。在具体的实例中，选择鞘翅目害虫中的此类染色质重塑基因，其中该靶基因包含选自下组的多核苷酸：根萤叶甲属brahma(SEQ ID NO:l、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7)；根萤叶甲属mi-2(SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:164)；根萤叶甲属iswi-1(SEQ ID NO:81和SEQ ID NO:165)；根萤叶甲属chd1(SEQ ID NO:83)；根萤叶甲属iswi-2(SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:166)；根萤叶甲属iswi30(SEQ ID NO:87)；根萤叶甲属ino80(SEQ ID NO:89)；和根萤叶甲属domino(SEQ ID NO:91)。例如，特定实施方案中的靶基因包含选自下组的染色质重塑多核苷酸：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:79；SEQ ID NO:81；SEQ ID NO:83；SEQ ID NO:85；SEQ ID NO:87；SEQ ID NO:89；SEQ ID NO:91；SEQ ID NO:164；SEQ ID NO:165；SEQ ID NO:166；以及前述任一者的片段(例如，SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:10，和SEQ ID NO:101-106)。
在一些实施方案中，染色质重塑多核苷酸编码“ATP依赖性重塑酶”群组的成员，这是一类含有SNF2结构域(非发酵蔗糖，最初在酿酒酵母中鉴定)的ATP酶。ATP依赖性重塑酶包括，例如但不限于BRAHMA及其直向同源物；MI-2及其直向同源物；ISWI-1及其直向同源物；CHD1及其直向同源物；ISWI-2及其直向同源物；ISWI30及其直向同源物；INO80及其直向同源物；和DOMINO及其直向同源物。染色质重塑物(例如，ATP依赖性重塑酶)通过动员核小体并因此改变转录机制对DNA的接近性而发挥持久的表观遗传学效应。
ATP依赖性重塑酶具有相同的功能域和序列水平上的保守性。在Pfam(pfam.sanger.ac.uk)搜索中，ATP依赖性重塑酶可以通过SNF2家族的N-末端与解旋酶保守的C-末端(SNF2-解旋酶)结构域二者的组合来鉴定。因此，RNAi靶位点可以设计在所有染色质重塑物共有的保守的SNF2家族N末端和解旋酶C末端结构域(这里称为SNF2-解旋酶)中，以及在每个家族内保守的染色质结合或其它功能域，其包括但不限于布罗莫结构域(bromodomain)，克罗莫结构域(chromodomain)和HAND-SLIDE结构域。
在一些实施方案中，靶基因可以是包含这样的多核苷酸的核酸分子，该多核苷酸能够在计算机上逆翻译成包含连续氨基酸序列的多肽：所述连续氨基酸序列与染色质重塑基因的蛋白质产物的氨基酸序列至少约85％相同(例如，至少84％、85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约100％、或100％相同)。靶基因可以是鞘翅目害虫中的任何核酸，对该序列的转录后抑制会对该害虫的产生可存活的后代的能力造成有害影响，从而，例如，给植物提供针对该害虫的保护效益。在具体的实例中，靶基因是这样的核酸分子，其包含能够在计算机上反向翻译为多肽的多核苷酸，所述多肽包含与作为brahma、mi-2、iswi-1、chd1、iswi-2、iswi30、ino80或domino基因的计算机翻译产物的氨基酸序列至少约85％相同、约90％相同、约95％相同、约96％相同、约97％相同、约98％相同、约99％相同、约100％相同、或100％相同的连续氨基酸序列。此类翻译产物的实例包括，例如但不限于：SEQID NO:2；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:80；SEQ ID NO:82；SEQ IDNO:84；SEQ ID NO:86；SEQ ID NO:88；SEQ ID NO:90；和SEQ ID NO:92。
依照一些实施方案提供了DNA，其表达生成包含这样的多核苷酸的RNA分子，该多核苷酸与由鞘翅目害虫中的编码多核苷酸编码的天然RNA分子的全部或部分特异性地互补。在一些实施方案中，在鞘翅目害虫摄入表达的RNA分子后，可以获得该害虫细胞中，或该害虫的后代的细胞中编码多核苷酸的下调。在特定的实施方案中，鞘翅目害虫细胞中编码多核苷酸的下调导致该害虫的生殖和/或增殖的减少或停止，和/或该害虫的后代中生长、发育和/或进食的减少或停止。
在一些实施方案中，靶多核苷酸包括转录的非编码性RNA，诸如5’UTR；3’UTR；剪接前导；内含子；末端内含子(outron)(例如，随后在反式剪接中修饰的5'UTR RNA)；donatron(例如，提供反式剪接的供体序列需要的非编码RNA)；和鞘翅目害虫靶基因的其他非编码转录RNA。这样的多核苷酸可以衍生自单顺反子和多顺反子基因两者。
因此，本文中结合一些实施方案还描述了包含至少一种多核苷酸的iRNA分子(例如，dsRNA、miRNA、siRNA、shRNA和hpRNA)，所述多核苷酸与鞘翅目害虫中的靶核酸的全部或部分特异性地互补。在一些实施方案中，iRNA分子可以包含与多个靶核酸，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多个靶核酸的全部或部分互补的多核苷酸。在特定的实施方案中，iRNA分子可以在体外产生，或通过遗传修饰的生物(如植物或细菌)在体内产生。还公开了cDNA，其可以用于产生与鞘翅目害虫中的靶核酸的全部或部分特异性地互补的dsRNA分子、siRNA分子、miRNA分子、shRNA分子、和/或hpRNA分子。进一步描述了在实现特定宿主靶标的稳定转化中使用的重组DNA构建体。转化的宿主靶标可以从重组DNA构建体表达有效水平的dsRNA、siRNA、miRNA分子、shRNA分子、和/或hpRNA分子。因此，还描述了植物转化载体，其包含与在植物细胞中功能性的异源启动子可操作连接的至少一个多核苷酸，其中多核苷酸的表达生成包含与鞘翅目害虫中的靶核酸的全部或部分特异性地互补的连续核碱基串的RNA分子。
在特定实例中，可用于控制鞘翅目害虫的核酸分子可以包括：从根萤叶甲属分离的包含染色质重塑基因(例如SEQ ID NO:l；SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:7；SEQID NO:8；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:79；SEQ ID NO:81；SEQ ID NO:83；SEQ ID NO:85；SEQID NO:87；SEQ ID NO:89；SEQ ID NO:91；SEQ ID NO:101；SEQ ID NO:102；SEQ ID NO:103；SEQ ID NO:104；SEQ ID NO:105；SEQ ID NO:106；SEQ ID NO:164；SEQ ID NO:165；和SEQID NO:166中任一者)的天然核酸的全部或部分；DNA，其在表达时生成这样的RNA分子：所述RNA分子包含与由染色质重塑编码的天然RNA分子的全部或部分特异性地互补的多核苷酸；iRNA分子(例如，dsRNA、miRNA、siRNA、shRNA和hpRNA)，所述iRNA分子包含与染色质重塑基因编码的RNA分子的全部或部分特异性地互补的至少一个多核苷酸；可用于产生dsRNA分子、siRNA分子、miRNA、shRNA和/或hpRNA分子的cDNA，所述分子与染色质重塑编码的RNA分子的全部或部分特异性地互补；以及用于在实现特定宿主靶标的稳定转化中使用的重组DNA构建体，其中转化的宿主靶标包含一种或多种前述的核酸分子。
B.核酸分子
本发明提供了，除其他事项外，抑制鞘翅目害虫的细胞、组织、或器官中的靶基因表达的iRNA(例如，dsRNA、miRNA、siRNA、shRNA和hpRNA)分子；和能够在细胞或微生物中表达为iRNA分子以抑制鞘翅目害虫的细胞、组织、或器官中的靶基因表达的DNA分子。
本发明的一些实施方案提供了分离的核酸分子，其包含至少一个(例如，一个、两个、三个、或更多个)选自下组的多核苷酸：SEQ ID NO:1、3、5和7；SEQ ID NO:1、3、5和7中任一者的互补物；SEQ ID NO:1、3、5和7中任一者的至少15个连续核苷酸(例如至少19个连续核苷酸)的片段(例如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10)；SEQ ID NO:1、3、5和7中任一者的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；根萤叶甲属生物(例如WCR)的包含SEQ ID NO:1、3、5和7中任一者的天然编码多核苷酸；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:1、3、5和7中任一者的天然编码多核苷酸的互补物；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:1、3、5和7中任一者的天然编码多核苷酸的至少15个连续核苷酸的片段，和根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:1、3、5和7中任一者的天然编码多核苷酸的至少15个连续核苷酸的片段的互补物。在特定实施方案中，所述分离的多核苷酸与鞘翅目害虫接触或被所述鞘翅目害虫摄取抑制该害虫的生长、发育、生殖、和/或进食。
在一些实施方案中，本发明的分离的核酸分子可以包含选自以下的至少一种(例如，一种，两种，三种或更多种)多核苷酸：SEQ ID NO:79；SEQ ID NO:164；SEQ ID NO:79的互补物；SEQ ID NO:164的互补物；SEQ ID NO:73的互补物；SEQ ID NO:79或SEQ ID NO:164的至少15个连续核苷酸(例如至少19个连续和核苷酸)的片段(例如SEQ ID NO:104)；SEQID NO:79或SEQ ID NO:164的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；根萤叶甲属生物(例如WCR)的包含SEQ ID NO:79或SEQ ID NO:164的天然编码多核苷酸；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:79或SEQ ID NO:164的天然编码多核苷酸的互补物；根萤叶甲属生物的包含SEQID NO:79或SEQ ID NO:164的天然编码多核苷酸的至少15个连续核苷酸的片段，和根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:79或SEQ ID NO:164的天然编码多核苷酸的至少15个连续核苷酸的片段的互补物。在特定实施方案中，所述分离的多核苷酸与鞘翅目害虫接触或被所述鞘翅目害虫摄取抑制该害虫的生长、发育、生殖、和/或进食。
在一些实施方案中，本发明的分离的核酸分子可以包含选自以下的至少一种(例如，一种，两种，三种或更多种)多核苷酸：SEQ ID NO:81；SEQ ID NO:165；SEQ ID NO:81的互补物；SEQ ID NO:165的互补物；SEQ ID NO:73的互补物；SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:165的至少15个连续核苷酸(例如至少19个连续和核苷酸)的片段；SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:165的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；根萤叶甲属生物(例如WCR)的包含SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:165的天然编码多核苷酸；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:81或SEQ IDNO:165的天然编码多核苷酸的互补物；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:165的天然编码多核苷酸的至少15个连续核苷酸的片段，和根萤叶甲属生物的包含SEQ IDNO:81或SEQ ID NO:165的天然编码多核苷酸的至少15个连续核苷酸的片段的互补物。在特定实施方案中，所述分离的多核苷酸与鞘翅目害虫接触或被所述鞘翅目害虫摄取抑制该害虫的生长、发育、生殖、和/或进食。
在一些实施方案中，本发明的分离的核酸分子可以包含选自以下的至少一种(例如，一种，两种，三种或更多种)多核苷酸：SEQ ID NO:83；SEQ ID NO:83的互补物；SEQ IDNO:73的互补物；SEQ ID NO:83的至少15个连续核苷酸(例如至少19个连续和核苷酸)的片段(例如SEQ ID NO:105)；SEQ ID NO:83的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；根萤叶甲属生物(例如WCR)的包含SEQ ID NO:83的天然编码多核苷酸；根萤叶甲属生物的包含SEQID NO:83的天然编码多核苷酸的互补物；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:83的天然编码多核苷酸的至少15个连续核苷酸的片段，和根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:83的天然编码多核苷酸的至少15个连续核苷酸的片段的互补物。在特定实施方案中，所述分离的多核苷酸与鞘翅目害虫接触或被所述鞘翅目害虫摄取抑制该害虫的生长、发育、生殖、和/或进食。
在一些实施方案中，本发明的分离的核酸分子可以包含选自以下的至少一种(例如，一种，两种，三种或更多种)多核苷酸：SEQ ID NO:85；SEQ ID NO:166；SEQ ID NO:85的互补物；SEQ ID NO:166的互补物；SEQ ID NO:73的互补物；SEQ ID NO:85或SEQ ID NO:166的至少15个连续核苷酸(例如至少19个连续和核苷酸)的片段(例如SEQ ID NO:104)；SEQID NO:85或SEQ ID NO:166的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；根萤叶甲属生物(例如WCR)的包含SEQ ID NO:85或SEQ ID NO:166的天然编码多核苷酸；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:85或SEQ ID NO:166的天然编码多核苷酸的互补物；根萤叶甲属生物的包含SEQID NO:85或SEQ ID NO:166的天然编码多核苷酸的至少15个连续核苷酸的片段，和根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:85或SEQ ID NO:166的天然编码多核苷酸的至少15个连续核苷酸的片段的互补物。在特定实施方案中，所述分离的多核苷酸与鞘翅目害虫接触或被所述鞘翅目害虫摄取抑制该害虫的生长、发育、生殖、和/或进食。
在一些实施方案中，本发明的分离的核酸分子可以包含选自以下的至少一种(例如，一种，两种，三种或更多种)多核苷酸：SEQ ID NO:87；SEQ ID NO:87的互补物；SEQ IDNO:73的互补物；SEQ ID NO:87的至少15个连续核苷酸(例如至少19个连续和核苷酸)的片段(例如SEQ ID NO:102)；SEQ ID NO:87的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；根萤叶甲属生物(例如WCR)的包含SEQ ID NO:87的天然编码多核苷酸；根萤叶甲属生物的包含SEQID NO:87的天然编码多核苷酸的互补物；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:87的天然编码多核苷酸的至少15个连续核苷酸的片段，和根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:87的天然编码多核苷酸的至少15个连续核苷酸的片段的互补物。在特定实施方案中，所述分离的多核苷酸与鞘翅目害虫接触或被所述鞘翅目害虫摄取抑制该害虫的生长、发育、生殖、和/或进食。
在一些实施方案中，本发明的分离的核酸分子可以包含选自以下的至少一种(例如，一种，两种，三种或更多种)多核苷酸：SEQ ID NO:89；SEQ ID NO:89的互补物；SEQ IDNO:73的互补物；SEQ ID NO:89的至少15个连续核苷酸(例如至少19个连续和核苷酸)的片段；SEQ ID NO:89的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；根萤叶甲属生物(例如WCR)的包含SEQ ID NO:89的天然编码多核苷酸；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:89的天然编码多核苷酸的互补物；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:89的天然编码多核苷酸的至少15个连续核苷酸的片段，和根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:89的天然编码多核苷酸的至少15个连续核苷酸的片段的互补物。在特定实施方案中，所述分离的多核苷酸与鞘翅目害虫接触或被所述鞘翅目害虫摄取抑制该害虫的生长、发育、生殖、和/或进食。
在一些实施方案中，本发明的分离的核酸分子可以包含选自以下的至少一种(例如，一种，两种，三种或更多种)多核苷酸：SEQ ID NO:91；SEQ ID NO:91的互补物；SEQ IDNO:73的互补物；SEQ ID NO:91的至少15个连续核苷酸(例如至少19个连续和核苷酸)的片段；SEQ ID NO:91的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；根萤叶甲属生物(例如WCR)的包含SEQ ID NO:91的天然编码多核苷酸；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:91的天然编码多核苷酸的互补物；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:91的天然编码多核苷酸的至少15个连续核苷酸的片段，和根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:91的天然编码多核苷酸的至少15个连续核苷酸的片段的互补物。在特定实施方案中，所述分离的多核苷酸与鞘翅目害虫接触或被所述鞘翅目害虫摄取抑制该害虫的生长、发育、生殖、和/或进食。
在一些实施方案中，本发明的分离的核酸分子可以包含选自以下的至少一种(例如，一种，两种，三种或更多种)多核苷酸：SEQ ID NO:139；SEQ ID NO:139的互补物；SEQ IDNO:140；SEQ ID NO:140的互补物；SEQ ID NO:141；SEQ ID NO:141的互补物；SEQ ID NO:142；SEQ ID NO:142的互补物；SEQ ID NO:143；SEQ ID NO:143的互补物；SEQ ID NO:144；SEQ ID NO:144的互补物；SEQ ID NO:145；SEQ ID NO:145的互补物；SEQ ID NO:146；SEQID NO:146的互补物；SEQ ID NO:147；SEQ ID NO:147的互补物；SEQ ID NO:]48；SEQ IDNO:148的互补物；SEQ ID NO:149；SEQ ID NO:149的互补物；SEQ ID NO:150；SEQ ID NO:150的互补物；SEQ ID NO:151；SEQ ID NO:151的互补物；SEQ ID NO:152；SEQ ID NO:152的互补物；SEQ ID NO:153；SEQ ID NO:153的互补物；SEQ ID NO:154；SEQ ID NO:154的互补物；SEQ ID NO:1 55；SEQ ID NO:155的互补物；SEQ ID NO:156；SEQ ID NO:156的互补物；SEQ ID NO:157；SEQ ID NO:157的互补物；SEQ ID NO:158；SEQ ID NO:158的互补物；SEQID NO:159；SEQ ID NO:1 5的互补物9；SEQ ID NO:160；SEQ ID NO:160的互补物；SEQ IDNO:161；SEQ ID NO:161的互补物；SEQ ID NO:162；SEQ ID NO:162的互补物；SEQ ID NO:163；SEQ ID NO:163的互补物；SEQ ID NO:167；SEQ ID NO:167的互补物；SEQ ID NO:168；SEQ ID NO:168的互补物；SEQ ID NO:169；SEQ ID NO:169的互补物；根萤叶甲属生物中自包含SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:79,SEQ ID NO:81,SEQ ID NO:83,SEQ ID NO:85,SEQ ID NO:87,SEQ ID NO:89,SEQ ID NO:91,SEQ ID NO:101,SEQ ID NO:102,SEQ ID NO:103,SEQ ID NO:104,SEQID NO:105,SEQ ID NO:106,SEQ ID NO:164,SEQ ID NO:165或SEQ ID NO:166的基因转录的天然多核糖核苷酸；根萤叶甲属生物中自包含SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:79,SEQ ID NO:81,SEQ ID NO:83,SEQ ID NO:85,SEQ ID NO:87,SEQ ID NO:89,SEQ ID NO:91,SEQ ID NO:101,SEQ ID NO:102,SEQ ID NO:103,SEQ ID NO:104,SEQ ID NO:105,SEQ ID NO:106,SEQ ID NO:164,SEQID NO:165或SEQ ID NO:166的基因转录的天然多核糖核苷酸的互补物；根萤叶甲属生物中自包含SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:79,SEQ ID NO:81,SEQ ID NO:83,SEQ ID NO:85,SEQ ID NO:87,SEQ IDNO:89,SEQ ID NO:91,SEQ ID NO:101,SEQ ID NO:102,SEQ ID NO:103,SEQ ID NO:104,SEQ ID NO:105,SEQ ID NO:106,SEQ ID NO:164,SEQ ID NO:165或SEQ ID NO:166的基因转录的天然多核糖核苷酸的至少15个连续核苷酸的片段；以及根萤叶甲属生物中自包含SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:10,SEQID NO:79,SEQ ID NO:81,SEQ ID NO:83,SEQ ID NO:85,SEQ ID NO:87,SEQ ID NO:89,SEQID NO:91,SEQ ID NO:101,SEQ ID NO:102,SEQ ID NO:103,SEQ ID NO:104,SEQ ID NO:105,SEQ ID NO:106,SEQ ID NO:164,SEQ ID NO:165或SEQ ID NO:166的基因转录的天然多核糖核苷酸的至少15个连续核苷酸的片段的互补物。在具体实施方案中，鞘翅目害虫接触或摄取分离的多核苷酸抑制该害虫的生长，发育，生殖和/或进食。在一些实施方案中，昆虫的接触或摄取通过摄食包含iRNA的植物材料或诱饵而发生。在一些实施方案中，昆虫的接触或摄取通过用包含该iRNA的组合物喷洒包含昆虫的植物而发生。
在其他实施方案中，本发明的核酸分子可以包含至少一个(例如，一个、两个、三个、或更多个)DNA，其能够在细胞或微生物中表达为iRNA分子以抑制鞘翅目害虫的细胞、组织、或器官中的靶基因表达。这样的DNA可以与在包含该DNA分子的细胞中具备功能的启动子可操作连接，以启动或增强编码的能够形成dsRNA分子的RNA的转录。在一个实施方案中，所述至少一个(例如，一个、两个、三个、或更多个)DNA可衍生自SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:79；SEQ ID NO:81；SEQ ID NO:83；SEQ ID NO:85；SEQ ID NO:87；SEQ ID NO:89；SEQ ID NO:91,SEQ ID NO:164,SEQ ID NO:165或SEQ IDNO:166的多核苷酸。SEQ ID NO:l,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:79,SEQ ID NO:81,SEQ ID NO:83,SEQ ID NO:85,SEQ ID NO:87,SEQ ID NO:89,SEQ IDNO:91,SEQ ID NO:164,SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:166的衍生物包括这些多核苷酸的片段。在一些实施方案中，这样的片段可包含例如SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:79,SEQ ID NO:81,SEQ ID NO:83,SEQ ID NO:85,SEQ ID NO:87,SEQ ID NO:89,SEQ ID NO:91,SEQ ID NO:164,SEQ ID NO:165或SEQ ID NO:166的至少约15个连续核苷酸，或其互补物。因此，这样的片段可包括，例如，SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:79,SEQ ID NO:81,SEQ ID NO:83,SEQ ID NO:85,SEQ ID NO:87,SEQ ID NO:89,SEQ ID NO:91,SEQ ID NO:164,SEQ ID NO:165，或SEQ IDNO:166的15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,40,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140,150,160,170,180,190,200或更多个连续核苷酸，或其互补物。在一些实例中，这样的片段可包含，例如，SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:79,SEQ ID NO:81,SEQ ID NO:83,SEQ ID NO:85,SEQ ID NO:87,SEQ ID NO:89,SEQ ID NO:91,SEQ ID NO:164,SEQ ID NO:165，或SEQ ID NO:166的至少19个连续核苷酸(例如，19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个连续核苷酸)，或其互补物。
一些实施方案包括将部分或完全稳定化的dsRNA分子导入鞘翅目害虫中以抑制鞘翅目害虫的细胞、组织或器官中靶基因的表达。当表达为iRNA分子(例如，dsRNA、miRNA、siRNA、shRNA、和hpRNA)并被鞘翅目害虫摄取时，包含SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ IDNO:5,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:79,SEQ ID NO:81,SEQ ID NO:83,SEQ ID NO:85,SEQ IDNO:87,SEQ ID NO:89,SEQ ID NO:91,SEQ ID NO:164,SEQ ID NO:165，或SEQ ID NO:166的一个或多个片段的多核苷酸可以引起下列一项或多项：鞘翅目害虫的死亡、发育停止、生长抑制、性别比变化、产卵量(brood size)减少、感染停止、和/或进食停止。在具体实例中，包含SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:79,SEQ ID NO:81,SEQ ID NO:83,SEQ ID NO:85,SEQ ID NO:87,SEQ ID NO:89,SEQ ID NO:91,SEQ ID NO:164,SEQ ID NO:165，或SEQ ID NO:166中任一者的一个或多个片段(例如，包括约15至约300个核苷酸的多核苷酸)及其互补物的多核苷酸导致害虫的现有世代产生下一代害虫的能力降低。
在某些实施方案中，本发明提供的dsRNA分子包含与来自包含SEQ ID NO:1,SEQID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:79,SEQ ID NO:81,SEQ ID NO:83,SEQ IDNO:85,SEQ ID NO:87,SEQ ID NO:89,SEQ ID NO:91,SEQ ID NO:164,SEQ ID NO:165，和/或SEQ ID NO:166的靶基因的转录物互补的多核苷酸，和/或与SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:79,SEQ ID NO:81,SEQ ID NO:83,SEQ ID NO:85,SEQ ID NO:87,SEQ ID NO:89,SEQ ID NO:91,SEQ ID NO:164,SEQ ID NO:165，和/或SEQID NO:166的片段互补的多核苷酸，所述靶基因在鞘翅目害虫中的抑制导致对于该害虫或该害虫的后代的生长、发育、或其他生物学功能必需的蛋白质或多核苷酸物质的减少或消除。选择的核苷酸序列可以与下列各项展现出约80％到约100％序列同一性：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:79,SEQ ID NO:81,SEQ ID NO:83,SEQ ID NO:85,SEQ ID NO:87,SEQ ID NO:89,SEQ ID NO:91,SEQ ID NO:164,SEQ ID NO:165，和/或SEQ ID NO:166；SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7,SEQ IDNO:79,SEQ ID NO:81,SEQ ID NO:83,SEQ ID NO:85,SEQ ID NO:87,SEQ ID NO:89,SEQ IDNO:91,SEQ ID NO:164,SEQ ID NO:165，和/或SEQ ID NO:166的连续片段；或前述任一者的互补物。例如，选定的多核苷酸可以与下列任一项展现出79％、80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约98.5％、约99％、约99.5％、或约100％的序列同一性：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:79,SEQ ID NO:81,SEQ ID NO:83,SEQ ID NO:85,SEQ ID NO:87,SEQ ID NO:89,SEQ ID NO:91,SEQ ID NO:164,SEQ ID NO:165，和/或SEQ ID NO:166；SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQID NO:7,SEQ ID NO:79,SEQ ID NO:81,SEQ ID NO:83,SEQ ID NO:85,SEQ ID NO:87,SEQID NO:89,SEQ ID NO:91,SEQ ID NO:164,SEQ ID NO:165，和/或SEQ ID NO:166的连续片段；和前述任一者的互补物。
在一些实施方案中，能够在细胞或微生物中表达为iRNA分子以抑制靶基因表达的DNA分子可以包含与存在于一个或多个靶鞘翅目害虫物种(例如鞘翅目或半翅目害虫物种)中的天然多核苷酸的全部或部分特异性地互补的单个多核苷酸，或者DNA分子可以是从多个这样的特异性互补多核苷酸构建而成的嵌合体。
在某些实施方案中，核酸分子可以包含以“接头”分开的第一和第二多核苷酸。接头可以是任何包含促进第一和第二多核苷酸之间的二级结构形成(在期望的情况下)的核苷酸序列的区域。在一个实施方案中，接头是mRNA的有义或反义编码多核苷酸的一部分。或者，接头可以包含能够与核酸分子可操作连接的核苷酸或其同源物的任何组合。在一些实例中，接头可以包含内含子(例如作为ST-LS1内含子)。
例如，在一些实施方案中，DNA分子可以包含编码一个或多个不同RNA分子的多核苷酸，其中每个不同RNA分子分别包含第一多核苷酸和第二多核苷酸，其中第一和第二多核苷酸彼此互补。第一和第二多核苷酸在RNA分子内可以通过间隔物连接。接头可以构成第一多核苷酸或第二多核苷酸的一部分。包含第一和第二多核苷酸的RNA分子的表达可以通过第一和第二多核苷酸的特异性分子内碱基配对而导致本发明的dsRNA分子的形成。第一多核苷酸或第二多核苷酸可以与对于鞘翅目害虫而言天然的多核苷酸(例如，靶基因、或转录的非编码多核苷酸)、其衍生物、或其互补多核苷酸基本上相同。
dsRNA核酸分子包含聚合核糖核苷酸的双链，并且可以包含对磷酸-糖主链或核苷的修饰。可以适宜调整RNA结构的修饰以使得特异性抑制能够发生。在一个实施方案中，可以通过普遍存在的酶促过程来修饰dsRNA分子，以便能够生成siRNA分子。此酶促过程可以利用体外或体内的RNA酶III酶，如真核生物中的切丁酶。参见Elbashir等人，(2001)Nature411:494-8；以及Hamilton和Baulcombe(1999)Science 286(5441):950-2。切丁酶或功能等效的RNA酶III酶将较大的dsRNA链和/或hpRNA分子切割成较小的寡核苷酸(例如，siRNA)，每个所述寡核苷酸长度为约19-25个核苷酸。由这些酶生成的siRNA分子具有2到3个核苷酸3’突出物、和5’磷酸和3’羟基末端。由RNA酶III酶生成的siRNA分子在细胞中解旋，并分成单链RNA。然后，siRNA分子与从靶基因转录的RNA特异性地杂交，并且这两种RNA分子随后通过固有的细胞RNA降解机制而被降解。这个过程可以导致由靶生物中的靶基因编码的RNA的有效降解或消除。结果导致靶向基因的转录后沉默。在一些实施方案中，通过内源RNA酶III酶从异源核酸分子产生的siRNA分子可以高效地介导鞘翅目害虫中靶基因的下调。
在一些实施方案中，本发明的核酸分子可以包括至少一种可被转录成单链RNA分子的非天然存在的多核苷酸，所述单链RNA分子能够在体内通过分子间杂交形成dsRNA分子。这样的dsRNA常常进行自组装，并且可以在鞘翅目害虫的营养来源中提供，以实现靶基因的转录后抑制。在这些和另外的实施方案中，本发明的核酸分子可以包含两种不同的非天然存在的核苷酸序列，其中每种序列与鞘翅目害虫中的不同靶基因特异性地互补。当向鞘翅目害虫以dsRNA分子的形式提供这样的核酸分子时，dsRNA分子抑制害虫中至少两种不同靶基因的表达。
C.获得核酸分子
可以使用鞘翅目害虫中的多种多核苷酸作为靶标来设计本发明的核酸分子，如iRNA和编码iRNA的DNA分子。然而，天然多核苷酸的选择并非是直截了当的过程。鞘翅目害虫的天然多核苷酸中仅有少数会是有效的靶标。例如，特定的天然多核苷酸是否可以被本发明的核酸分子有效下调，抑或特定的天然多核苷酸的下调是否会对鞘翅目害虫的生长、存活力、增殖、和/或生殖具有有害影响，都是无法肯定地预测的。绝大多数的鞘翅目害虫天然多核苷酸，如自这些害虫分离的EST(例如，如美国专利7,612,194中所列出的鞘翅目害虫多核苷酸)，对害虫的生长、存活力、增殖、和/或生殖没有有害影响。同样无法预测的是，在可以对害虫具有有害影响的天然多核苷酸中哪些能够在重组技术中使用，从而在宿主植物中表达与这样的天然多核苷酸互补的核酸分子，并且在进食后对害虫造成有害影响，同时不对宿主植物引起损害。
在一些实施方案中，本发明的核酸分子(例如，要在鞘翅目害虫的宿主植物中提供的dsRNA分子)被选择为靶向这样的cDNA，其编码对于鞘翅目害虫生殖和/或发育必需的蛋白质或蛋白质部分(如涉及代谢或分解代谢生物化学途径、细胞***、生殖、能量代谢、胚胎发育、幼虫发育、转录调控等的多肽)。如本文中描述的，靶生物摄入含有一种或多种dsRNA——所述dsRNA的至少一个区段与靶害虫生物细胞中产生的RNA的至少一个基本上相同的区段特异地互补——的组合物，可以导致交配、产卵、或产生可存活后代的失败或能力降低。可以使用从鞘翅目害虫衍生的多核苷酸(DNA或RNA)来构建对该害虫侵染有抗性的植物细胞。例如，可以转化鞘翅目害虫的宿主植物(例如，玉米)，使其含有从鞘翅目害虫衍生的如本文中提供的多核苷酸中的一种或多种。转化到宿主中的多核苷酸可以编码一种或多种RNA，其在转化的宿主内的细胞或生物学流体中形成dsRNA结构，这样，如果/当害虫与转基因宿主形成营养关系时，就有dsRNA可用。这可以导致害虫细胞中一种或多种基因表达的阻抑，最终导致生殖和/或发育的抑制。
因此，在某些实施方案中，靶向实质参与鞘翅目害虫的生长、发育和生殖的基因。本发明中使用的其他靶基因可以包括例如那些在鞘翅目害虫的存活力、运动、迁移、生长、发育、感染性、和进食位置的建立中发挥重要作用的靶基因。因此，靶基因可以是管家基因或转录因子。另外，本发明中使用的天然鞘翅目害虫多核苷酸也可以从植物、病毒、细菌或昆虫基因的同源物(例如，直系同源物)衍生，所述同源物的功能对于本领域技术人员是已知的，且其多核苷酸与害虫的基因组中的靶基因可特异性地杂交。通过杂交鉴定已知核苷酸序列的基因同源物的方法是本领域技术人员已知的。
在一些实施方案中，本发明提供了用于获得包含用于产生iRNA(例如，dsRNA、miRNA、siRNA、shRNA、和hpRNA)分子的多核苷酸的核酸分子的方法。一种这样的实施方案包括：(a)对一种或多种靶基因分析其在鞘翅目害虫中在dsRNA介导的基因阻抑后的表达、功能和表型；(b)用探针探查cDNA或gDNA文库，所述探针包含来自靶向的鞘翅目害虫的多核苷酸的全部或部分或其同源物，所述靶向的鞘翅目害虫在dsRNA介导的阻抑分析中展现出改变的(例如，降低的)生殖或发育表型；(c)鉴定与探针特异性杂交的DNA克隆；(d)分离步骤(b)中鉴定的DNA克隆；(e)对包含步骤(d)中分离的克隆的cDNA或gDNA片段测序，其中测序的核酸分子包含RNA的全部或大部分或其同源物；和(f)化学合成基因的全部或大部分、miRNA、siRNA、hpRNA、mRNA、shRNA、或dsRNA。
在另外的实施方案中，用于获得包含用于产生大部分的iRNA(例如，dsRNA、miRNA、siRNA、shRNA、和hpRNA)分子的多核苷酸的核酸片段的方法包括：(a)合成第一和第二寡核苷酸引物，其与来自靶向的鞘翅目害虫的天然多核苷酸的一部分特异性地互补；和(b)使用步骤(a)的第一和第二寡核苷酸引物扩增克隆载体中存在的cDNA或gDNA***物，其中扩增的核酸分子包含miRNA、siRNA、mRNA、hpRNA、shRNA或dsRNA分子的大部分。
本发明的核酸可以通过多种途径分离、扩增、或产生。例如，可以通过PCR扩增从gDNA或cDNA文库衍生的靶多核苷酸(例如，靶基因或靶转录的非编码多核苷酸)、或其部分而获得iRNA(例如，dsRNA、miRNA、siRNA、shRNA、和hpRNA)分子。可以从靶生物提取DNA或RNA，并且可以使用本领域普通技术人员已知的方法从其制备核酸文库。可使用自靶生物生成的gDNA或cDNA文库进行靶基因的PCR扩增和测序。可以使用确认的PCR产物作为体外转录的模板以在最低限度的启动子的情况下生成有义和反义RNA。或者，可以使用标准化学，如亚磷酰胺化学，通过许多技术(参见，例如Ozaki等人，(1992)Nucleic Acids Research,20:5205-5214；和Agrawal等人，(1990)Nucleic Acids Research,18:5419-5423)，包括使用自动化DNA合成仪(例如，P.E.Biosystems,Inc.(Foster City,Calif.)392或394型DNA/RNA合成仪)的任一者来合成核酸分子。参见，例如，Beaucage等人，(1992)Tetrahedron,48:2223-2311；美国专利4,980,460、4,725,677、4,415,732、4,458,066、和4,973,679。也可以采用备选化学，其生成非天然主链基团，如硫代磷酸酯、氨基磷酸酯，等等。
本发明的RNA、dsRNA、miRNA、siRNA、shRNA、或hpRNA分子可以由本领域技术人员可以通过手动或自动反应以化学或酶促方式产生，或者在包含含有编码RNA、dsRNA、miRNA、siRNA、shRNA、或hpRNA分子的多核苷酸的核酸分子的细胞中体内产生。还可以通过部分或完全有机合成产生RNA，可以通过体外酶促或有机合成引入任何经修饰的核糖核苷酸。可以通过细胞RNA聚合酶或噬菌体RNA聚合酶(例如，T3RNA聚合酶、T7RNA聚合酶、和SP6RNA聚合酶)合成RNA分子。可用于克隆和表达多核苷酸的表达构建体是本领域中已知的。参见，例如，国际PCT公布号WO97/32016；及美国专利5,593,874、5,698,425、5,712,135、5,789,214、和5,804,693。可以在导入细胞中之前纯化化学合成或通过体外酶促合成合成的RNA分子。例如，可以通过用溶剂或树脂提取、沉淀、电泳、色谱法、或其组合从混合物纯化RNA分子。或者，可以在不纯化或最小程度纯化的情况下使用化学合成或通过体外酶促合成而合成的RNA分子，例如，以避免由于样品加工所致的损失。可以将RNA分子干燥贮存或溶解在水溶液中。溶液可以含有缓冲剂或盐以促进dsRNA分子双链体链的退火和/或稳定化。
在实施方案中，可以通过单一自身互补的RNA链或者从两条互补RNA链形成dsRNA分子。dsRNA分子可以在体内或在体外合成。细胞的内源RNA聚合酶可以在体内介导一条或两条RNA链的转录，或者可以使用克隆的RNA聚合酶在体内或在体外介导转录。通过宿主器官、组织、或细胞类型中的特异性转录(例如，通过使用组织特异性启动子进行)；刺激宿主中的环境条件(例如，通过使用响应于感染、胁迫、温度、和/或化学诱导物的诱导型启动子)；和/或在宿主的某个发育阶段或年龄人工造成转录(例如，通过使用发育阶段特异性启动子)，在鞘翅目害虫中靶基因的转录后抑制可以是宿主靶向性的。形成dsRNA分子的RNA链(不论是体外还是体内转录的)可以也可以不是多聚腺苷酸化的，并且可以能够也可以不能被细胞翻译机制翻译成多肽。
D.重组载体和宿主细胞转化
在一些实施方案中，本发明还提供了用于导入细胞(例如，细菌细胞、酵母细胞、或植物细胞)中的DNA分子，其中DNA分子包含这样的多核苷酸，该多核苷酸在表达为RNA并被鞘翅目害虫摄取后，可实现对害虫的细胞、组织或器官中靶基因的阻抑。因此，一些实施方案提供了重组核酸分子，其包含能够在植物细胞中表达为iRNA(例如，dsRNA、miRNA、siRNA、shRNA、和hpRNA)分子以抑制鞘翅目害虫中靶基因表达的多核苷酸。为了启动或增强表达，这样的重组核酸分子可以包含一种或多种调节元件，所述调节元件可以与能够表达为iRNA的多核苷酸可操作连接。在植物中表达基因阻抑分子的方法是已知的，并且可以用于表达本发明的多核苷酸。参见，例如，国际PCT公开号WO06/073727；和美国专利公开号2006/0200878A1)。
在具体的实施方案中，本发明的重组DNA分子可以包含编码可形成dsRNA分子的RNA的多核苷酸。这样的重组DNA分子可以编码可形成dsRNA分子的RNA，其被摄取后能够抑制鞘翅目害虫细胞中内源靶基因的表达。在许多实施方案中，转录的RNA可以形成dsRNA分子，所述dsRNA分子可以以稳定化形式提供；例如，以发夹和茎和环结构的形式提供。
在某些实施方案中，dsRNA分子的一条链可以通过从与RNA基本上同源的多核苷酸转录而形成，所述RNA由选自下组的多核苷酸编码：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:166；SEQID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ IDNO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:164、SEQID NO:165或SEQ ID NO:166的互补物；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ IDNO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:165或SEQ ID NO:166的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:79、SEQID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQID NO:164、SEQ ID NO:165或SEQ ID NO:166的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；根萤叶甲属生物(例如WCR)的包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQID NO:91、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:165或SEQ ID NO:166的天然编码多核苷酸；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:165或SEQ ID NO:166的天然编码多核苷酸的互补物；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:165或SEQ ID NO:166的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；及根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:165或SEQ ID NO:166的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补物。
在特定的实施方案中，编码可形成dsRNA分子的重组DNA分子可包含编码区，其中至少两个多核苷酸如此排列，使得相对于至少一个启动子，一个多核苷酸处于有义取向，另一多核苷酸处于反义取向，其中该有义多核苷酸和该反义多核苷酸通过接头连接或联接，所述接头具有，例如，约5个(～5)至约一千个(～1000)核苷酸。接头可以在有义和反义多核苷酸之间形成环。有义多核苷酸或反义多核苷酸可以与由靶基因(例如，包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:166的染色质重塑基因)或其片段编码的RNA基本上同源。然而，在一些实施方案中，重组DNA分子可以编码可以形成没有接头的dsRNA分子的RNA。在实施方案中，有义编码多核苷酸和反义编码多核苷酸可以是不同的长度。
鉴定为对鞘翅目害虫具有有害影响或者针对该害虫的植物保护效果的多核苷酸可以通过在本发明的重组核酸分子中创建适当的表达盒而容易地将掺入表达的dsRNA分子中。例如，可以通过如下步骤将这样的多核苷酸表达为具有茎和环结构的发夹：采用对应于由靶基因多核苷酸(例如，包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQID NO:91、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:166的染色质重塑基因，或其片段)编码的RNA的第一区段；将此多核苷酸与第二区段接头区连接，所述第二区段接头区与第一区段不是同源或互补的；并将这与第三区段连接，其中第三区段的至少一部分与第一区段基本上互补。这样的构建体通过第一区段与第三区段的分子内碱基配对而形成茎和环结构，其中环结构形式包含第二区段。参见，例如，美国专利公开文本2002/0048814和2003/0018993；以及国际PCT公开文本WO94/01550和WO98/05770。可以例如以双链结构诸如茎环结构(例如，发夹)形式生成dsRNA分子，由此通过共表达靶基因的片段(例如在另外的植物表达盒上的靶基因的片段)增强靶向天然鞘翅目害虫序列的siRNA的产生，这可导致siRNA产生增强，或者降低甲基化以防止dsRNA发夹启动子的转录基因沉默。
本发明的实施方案包括将本发明的重组核酸分子导入植物中(即，转化)以实现一种或多种iRNA分子的鞘翅目害虫保护水平的表达。重组DNA分子可以例如是载体，如线性或闭合环状质粒。载体***可以是单一载体或质粒，或者共同含有要导入宿主基因组中的总DNA的两个或更多个载体或质粒。另外，载体可以是表达载体。可以例如将本发明的核酸适当地***载体中，在一种或多种宿主中发挥功能以驱动连接的编码多核苷酸或其他DNA元件表达的合适启动子控制下。许多载体可用于此目的，适当载体的选择主要将取决于要***载体中的核酸的大小和要用载体转化的特定宿主细胞。每种载体含有不同的组分，根据其功能(例如，DNA扩增或DNA表达)及与其相容的特定宿主细胞而定。
为了对转基因植物赋予对鞘翅目害虫的保护，例如可以在重组植物的组织或流体内将重组DNA转录成iRNA分子(例如，形成dsRNA分子的RNA分子)。iRNA分子可包含与可引起宿主植物物种损害的鞘翅目害虫内的相应转录多核苷酸基本上同源且可特异性杂交的多核苷酸。例如，鞘翅目害虫可以通过摄取包含iRNA分子的转基因宿主植物的细胞或流体而接触在转基因宿主植物细胞中转录的iRNA分子。因此，靶基因的表达在侵染转基因宿主植物的鞘翅目害虫内受到iRNA分子阻抑。在一些实施方案中，对靶鞘翅目害虫中靶基因表达的阻抑可以导致植物对害虫攻击有耐性。
为了使iRNA分子能够被投送给与已经用本发明的重组核酸分子转化的植物细胞存在营养关系的鞘翅目害虫，需要在植物细胞中表达(即，转录)iRNA分子。因此，重组核酸分子可以包含与一种或多种调节元件(诸如在宿主细胞中发挥功能的异源启动子元件)可操作连接的本发明的多核苷酸，所述宿主细胞诸如其中要扩增核酸分子的细菌细胞，或其中要表达核酸分子的植物细胞。
适合于用于本发明的核酸分子的启动子包括诱导型、病毒的、合成的、或组成型的那些启动子，它们都是本领域中熟知的。描述这样的启动子的非限制性实例包括美国专利6,437,217(玉米RS81启动子)；5,641,876(水稻肌动蛋白启动子)；6,426,446(玉米RS324启动子)；6,429,362(玉米PR-1启动子)；6,232,526(玉米A3启动子)；6,177,611(组成型玉米启动子)；5,322,938、5,352,605、5,359,142、和5,530,196(CaMV 35S启动子)；6,433,252(玉米L3油质蛋白启动子)；6,429,357(水稻肌动蛋白2启动子和稻肌动蛋白2内含子)；6,294,714(光诱导型启动子)；6,140,078(盐诱导型启动子)；6,252,138(病原体诱导型启动子)；6,175,060(磷缺乏诱导型启动子)；6,388,170(双向启动子)；6,635,806(γ薏苡辛(coixin)启动子)；及美国专利公开号2009/757,089(玉米叶绿体醛缩酶启动子)。其他启动子包括胆脂碱合酶(NOS)启动子(Ebert等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(16):5745-9)和章鱼碱合酶(OCS)启动子(两者都在根癌土壤杆菌的肿瘤诱导质粒上携带)；花椰菜花叶病毒组(caulimovirus)启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S启动子(Lawton等人，(1987)Plant Mol.Biol.9:315-24)；CaMV35S启动子(Odell等人，(1985)Nature 313:810-2；玄参花叶病毒35S启动子(Walker等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(19):6624-8)；蔗糖合酶启动子(Yang和Russell(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:4144-8)；R基因复合物启动子(Chandler等人，(1989)Plant Cell 1:1175-83)；叶绿素a/b结合蛋白基因启动子；CaMV 35S(美国专利5,322,938、5,352,605、5,359,142、和5,530,196)；FMV 35S(美国专利6,051,753和5,378,619)；PClSV启动子(美国专利5,850,019)；SCP1启动子(美国专利6,677,503)；和AGRtu.nos启动子(登录号V00087；Depicker等人，(1982)J.Mol.Appl.Genet.1:561-573；Bevan等人，(1983)Nature 304:184-7)。
在特定的实施方案中，本发明的核酸分子包含组织特异性启动子，如根特异性启动子。根特异性启动子驱动专门或优先在根组织中表达可操作连接的编码多核苷酸。根特异性启动子的实例是本领域中已知的。参见，例如，美国专利5,110,732；5,459,252和5,837,848；Opperman等人，(1994)Science 263:221-3；和Hirel等人，(1992)PlantMol.Biol.20:207-18。在一些实施方案中，可以在两个根特异性启动子之间克隆依照本发明的用于鞘翅目害虫控制的多核苷酸或片段，所述根特异性启动子相对于所述多核苷酸或片段以相反的转录方向排布，在转基因植物细胞中可操作，并且在转基因植物细胞中表达以在转基因植物细胞中产生RNA分子，RNA分子随后可形成dsRNA分子，如上文所述。鞘翅目害虫可以摄取植物组织中表达的iRNA分子，从而实现对靶基因表达的阻抑。
其他可任选地与感兴趣的核酸分子可操作连接的调节元件包括5'UTR，5'UTR作为位于启动子元件和编码多核苷酸之间的翻译前导元件发挥功能。翻译前导元件存在于完全加工的mRNA中，并且其可以影响初级转录物的加工和/或RNA的稳定性。翻译前导元件的例子包括玉米和矮牵牛热休克蛋白前导物(美国专利No.5,362,865)、植物病毒外壳蛋白前导序列、植物rubisco前导序列等。参见，例如，Turner和Foster(1995)Molecular Biotech.3(3):225-36。5'UTR的非限制性实例包括GmHsp(美国专利No.5,659,122)；PhDnaK(美国专利5,362,865)；AtAnt1；TEV(Carrington和Freed(1990)J.Virol.64:1590-7)；和AGRtunos(登录号V00087；和Bevan等人，(1983)Nature 304:184-7)。
其他任选地与感兴趣的核酸分子可操作连接的调节元件还包括3'非翻译元件、3'转录终止区、或多腺苷酸化区。这些是位于多核苷酸下游的遗传元件，并且包括提供多腺苷酸化信号的多核苷酸、和/或能够影响转录或mRNA加工的其他调节信号。多腺苷酸化信号在植物中发挥功能，导致多腺苷酸化的核苷酸被添加至mRNA前体的3'端。多腺苷酸化元件可以源自多种植物基因或T-DNA基因。3'转录终止区的一个非限制性实例是胆脂碱合酶3'区(nos 3'；Fraley等人，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4803-7)。在Ingelbrecht等人，(1989)Plant Cell 1:671-80中提供了使用不同3'非翻译区的实例。多腺苷酸化信号的非限制性实例包括来自豌豆RbcS2基因的信号(Ps.RbcS2-E9；Coruzzi等人，(1984)EMBO J.3:1671-9)和AGRtu.nos(登录号E01312)。
一些实施方案可以包括植物转化载体，该植物转化载体包含分离纯化的DNA分子，该DNA分子包含与本发明的一种或多种多核苷酸可操作连接的至少一种上文描述的调节元件。在表达时，一种或多种多核苷酸生成一种或多种包含多核苷酸的RNA分子，所述多核苷酸与鞘翅目害虫中的天然RNA分子的全部或部分特异性地互补。因此，多核苷酸可以包含编码靶向的鞘翅目害虫RNA转录物内存在的多核糖核苷酸的全部或部分的区段，并且可以包含被靶向的害虫转录物的全部或部分的反向重复。植物转化载体可以含有与超过一种靶多核苷酸特异性互补的多核苷酸，由此容许产生超过一种dsRNA以抑制靶鞘翅目害虫的一个或多个群体或物种的细胞中两种或更多种基因的表达。可以将与不同基因中存在的多核苷酸特异性互补的多核苷酸区段组合成单一复合核酸分子，以便在转基因植物中表达。这样的区段可以是连续的或者由接头分开。
在一些实施方案中，可以通过在同一质粒中依次***另外的多核苷酸来修饰已经含有本发明的至少一个多核苷酸的本发明质粒，其中所述另外的多核苷酸与原有的至少一个多核苷酸可操作连接于相同的调节元件。在一些实施方案中，核酸分子可以设计为抑制多种靶基因。在一些实施方案中，要抑制的多种基因可以获自相同的鞘翅目害虫物种，这样做可以增强核酸分子的有效性。在其他实施方案中，基因可以来自不同的昆虫(例如鞘翅目)害虫，这样可以拓宽药剂有效的害虫的范围。当靶向多种基因以实现阻抑、或表达和阻抑的组合时，可以工程化多顺反子DNA元件。
本发明的重组核酸分子或载体可以包含赋予转化的细胞，诸如植物细胞可选择表型的选择标志物。也可以使用选择标志物来选择包含本发明的重组核酸分子的植物或植物细胞。标志物可以编码杀生物剂抗性、抗生素抗性(例如，卡那霉素、遗传霉素(G418)、博来霉素、潮霉素，等等)、或除草剂耐性(例如，草甘膦等)。选择标志物的实例包括但不限于编码卡那霉素抗性并且可以使用卡那霉素、G418等选择的neo基因；编码双丙氨磷抗性的bar基因；编码草甘膦耐性的突变体EPSP合酶基因；赋予对溴苯腈的抗性的腈水解酶基因；赋予咪唑啉酮或磺酰脲耐性的突变体乙酰乳酸合酶基因(ALS)；和甲氨蝶呤抗性DHFR基因。可用多种选择标志物，其赋予对氨苄青霉素、博来霉素、氯霉素、庆大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、甲氨蝶呤、膦丝菌素、嘌呤霉素、大观霉素、利福平、链霉素和四环素等的抗性。这样的选择标志物的实例展示于，例如美国专利5,550,318；5,633,435；5,780,708和6,118,047。
本发明的重组核酸分子或载体还可以包含可筛选标志物。可以使用可筛选标志物来监测表达。示例性筛选标志物包括β-葡糖醛酸糖苷酶或uidA基因(GUS)，其编码已知的多种生色底物的酶(Jefferson等人，(1987)Plant Mol.Biol.Rep.5:387-405)；R基因座基因，其编码调节植物组织中花色素苷色素(红色)产生的产物(Dellaporta等人，(1988)"Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac."收录于18th Stadler Genetics Symposium,P.Gustafson和R.Appels编辑，(New York:Plenum),pp.263-82)；β-内酰胺酶基因(Sutcliffe等人，(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:3737-41)；编码已知多种生色底物的酶(例如，PADAC，一种生色头孢菌素)的基因；萤光素酶基因(Ow等人，(1986)Science 234:856-9)；xylE基因,其编码能转化生色儿茶酚的儿茶酚双加氧酶(Zukowski等人，(1983)Gene 46(2-3):247-55)；淀粉酶基因(Ikatu等人，(1990)Bio/Technol.8:241-2)；酪氨酸酶基因，其编码能够将酪氨酸氧化为DOPA和多巴醌(dopaquinone)(其继而缩合成黑色素)的酶(Katz等人，(1983)J.Gen.Microbiol.129:2703-14))；和α-半乳糖苷酶。
在一些实施方案中，在用于创建转基因植物和在植物中表达异源核酸的方法中，可以使用如上文所描述的重组核酸分子来制备表现出对鞘翅目害虫的易感性降低的转基因植物。例如，可以通过将编码iRNA分子的核酸分子***植物转化载体中，并将这些导入植物中来制备植物转化载体。
用于宿主细胞转化的适合方法包括任何能将DNA导入细胞中的方法，如通过原生质体转化(参见，例如，美国专利5,508,184)，通过干燥/抑制介导的DNA摄取(参见，例如，Potrykus等人.(1985)Mol.Gen.Genet.199:183-8)，通过电穿孔(参见，例如，美国专利5,384,253)，通过用碳化硅纤维搅拌(参见，例如，美国专利5,302,523和5,464,765)，通过土壤杆菌介导的转化(参见，例如，美国专利5,563,055；5,591,616；5,693,512；5,824,877；5,981,840；和6,384,301)，以及通过加速DNA包被的颗粒(参见，例如，美国专利5,015,580、5,550,318、5,538,880、6,160,208、6,399,861、和6,403,865)，等。特别可用于转化玉米的技术描述于例如美国专利7,060,876和5,591,616；以及国际PCT公布WO95/06722中。通过应用诸如此类的这些技术，几乎任何物种的细胞都可被稳定转化。在一些实施方案中，转化DNA被整合到宿主细胞的基因组中。在多细胞物种的情况下，转基因细胞可再生为转基因生物。可以使用任何这些技术来产生转基因植物，例如在转基因植物的基因组中包含编码一种或多种iRNA分子的一种或多种核酸。
用于将表达载体导入植物中的广泛使用的方法是基于土壤杆菌的天然转化***。根癌土壤杆菌和发根土壤杆菌是将植物细胞遗传转化的植物致病性土壤细菌。根癌土壤杆菌和发根土壤杆菌的Ti和Ri质粒分别携带负责植物遗传转化的基因。Ti(诱导肿瘤)-质粒含有被称为T-DNA的大片段，其被转移到转化的植物中。Ti质粒的另一个片段，Vir区，负责T-DNA的转移。T-DNA区的边界为末端重复序列。在修饰的二元载体中，肿瘤诱导基因已缺失，Vir区的功能用于转移以T-DNA边界元件为界的外来DNA。T区还可含有用于转基因细胞和植物有效恢复的选择标志物、以及***用于转移诸如编码核酸的dsRNA之类多核苷酸的多克隆位点。
因此，在一些实施方案中，植物转化载体来源于根癌土壤杆菌的Ti质粒(参见，例如，美国专利4,536,475、4,693,977、4,886,937、和5,501,967；以及欧洲专利No.EP 0 122791)或发根土壤杆菌的Ri质粒。其他的植物转化载体包括，例如但不限于，由Herrera-Estrella等人，(1983)Nature 303:209-13；Bevan等人，(1983)Nature 304:184-7；Klee等人，(1985)Bio/Technol.3:637-42；以及在欧洲专利No.EP 0 120 516中所描述的那些载体，以及从任何前述文献来源的那些载体。可以修饰天然地与植物相互作用的其他细菌，如中华根瘤菌属、根瘤菌属、和中慢生根瘤菌属，以介导到许多各种各样的植物中的基因转移。通过获取卸甲Ti质粒和适合的二元载体，可以使这些植物相关的共生细菌能够胜任基因转移。
在提供外源DNA到受体细胞的递送之后，通常鉴定出转化的细胞用于进一步培养和植物再生。为了提高鉴定转化细胞的能力，人们可能期望采用如前提出的选择或筛选标志物基因，与用来再生转化体的转化载体一道使用。在采用选择标志物的情况下，通过使细胞暴露于选择剂或药剂，鉴定出在潜在转化的细胞群中的转化细胞。在采用筛选标志物的情况下，可针对期望的标志物基因性状来筛选细胞。
暴露于选择剂后存活的细胞、或者在筛选测定中已被评分为阳性的细胞，可以在支持植物再生的介质中进行培养。在一些实施方案中，可通过包含其他物质，如生长调节剂来改良任何适合的植物组织培养基(例如，MS和N6培养基)。可将组织维持在具有生长调节剂的基本培养基上，直到可得到足够的组织用于启动植物再生工作时为止，或者在重复多轮的手动选择之后，直到组织形态适合于再生时为止(例如，至少2周)，然后转移到有助于芽形成的介质中。定期转移培养物，直到已经出现充分的芽形成时为止。一旦形成芽，将它们转移到有助于根形成的介质中。一旦形成足够的根，可将植物转移到土壤中，以便进一步生长和成熟。
为了证实再生植物中感兴趣核酸分子(例如，编码一种或多种iRNA分子的DNA，所述iRNA分子抑制鞘翅目害虫中的靶基因表达)的存在，可以进行多种测定法。这样的测定法例如包括：分子生物学测定，如Southern和northern印迹、PCR、和核酸测序；生物化学测定，如检测蛋白质产物的存在，例如通过免疫学手段(ELISA和/或western印迹)或借助于酶功能；植物部分测定，如叶或根测定；和再生的全植物的表型分析。
可例如通过使用对感兴趣核酸分子特异的寡核苷酸引物进行PCR扩增来分析整合事件。PCR基因分型应当理解为包括但不限于，来源于分离的宿主植物愈伤组织的gDNA的聚合酶链反应(PCR)扩增，所述愈伤组织预期含有整合到基因组中的感兴趣核酸分子，然后进行标准克隆和PCR扩增产物的序列分析。PCR基因分型方法已被很好地描述(例如Rios,G等人，(2002)Plant J.32:243-53)，并可应用于来源于任何植物物种(例如，玉米)或组织类型(包括细胞培养物)的gDNA。
采用依赖于土壤杆菌的转化方法形成的转基因植物一般含有***一个染色体中的单个重组DNA。该单个重组DNA的多核苷酸被称为“转基因事件”或“整合事件”。这样的转基因植物对于***的外源多核苷酸而言是杂合的。在一些实施方案中，通过含有单个外源基因的独立分离的转基因植物与自身(例如T0植物)有***配(自交)以产生Tl种子，可获得相对于转基因为纯合的转基因植物。所产生的Tl种子的四分之一相对于所述转基因是纯合的。萌发Tl种子产生的植物可用于测试杂合性，所述测试一般使用SNP测定或热扩增测定，使得允许在杂合子和纯合子之间进行区分(即，接合型测定)。
在特定的实施方案中，在植物细胞中产生具有鞘翅目害虫保护效果的至少2、3、4、5、6、7、8、9种或10种或更多种不同iRNA分子。可以从引入不同转化事件中的多种核酸、或从引入单一转化事件中的单一核酸表达iRNA分子(例如，dsRNA分子)。在一些实施方案中，在单一启动子的控制下表达多个iRNA分子。在其他实施方案中，在多个启动子的控制下表达多个iRNA分子。可以表达包含多个多核苷酸的单一iRNA分子，所述多核苷酸各自与在相同鞘翅目害虫物种的不同群体中或在不同的鞘翅目害虫物种中的一个或多个鞘翅目害虫内的不同基因座(例如由SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:79,SEQ ID NO:81,SEQ ID NO:83,SEQ ID NO:85,SEQ ID NO:87,SEQ ID NO:89,SEQ IDNO:91,SEQ ID NO:164,SEQ ID NO:165,和SEQ ID NO:166定义的基因座)同源。
除了用重组核酸分子直接转化植物之外，可通过使具有至少一个转基因事件的第一植物与缺乏这种事件的第二植物杂交来制造转基因植物。例如，可将包含编码iRNA分子的多核苷酸的重组核酸分子导入易于转化的第一植物品系中而产生转基因植物，其中转基因植物可与第二植物品系杂交而使编码iRNA分子的多核苷酸渗入到第二植物品系中。
本发明还包括含有本发明的一种或多种多核苷酸的商业产品。具体的实施方案包括自含有本发明一种或多种多核苷酸的重组植物或种子产生的商业产品。包含本发明的一种或多种多核苷酸的商业产品意在包括，但不限于：植物的粕、油类、碾碎的或完整的籽粒或种子，或包含含有本发明的一种或多种多核苷酸的重组植物或种子的任何粕、油、或碾碎的或完整的籽粒的任何食物产品。在一种或多种商品或商业产品中的检出本发明的一种或多种多核苷酸，事实上证明该商品或商业产品是由为了利用dsRNA介导的基因阻遏方法来控制害虫的目的而设计为表达本发明的一种或多种多核苷酸的转基因植物生产的。
在一些方面，包括由自转化的植物细胞衍生的转基因植物产生的种子和商业产品，其中种子或商业产品包含可检出量的本发明的核酸。在一些实施方案中，例如，可以通过获得转基因植物并从它们制备食物或饲料来生产这样的商业产品。包含本发明的一种或多种多核苷酸的商业产品包括例如但不限于：植物的粕、油类、碾碎的或完整的籽粒或种子，和包含含有本发明的一种或多种核酸的重组植物或种子的任何粕、油、或碾碎的或完整的籽粒的任何食物产品。在一种或多种商品或商业产品中的检出本发明的一种或多种核酸，事实上证明该商品或商业产品是由为了控制鞘翅目害虫的目的，设计为表达本发明的一种或多种iRNA分子的转基因植物生产的。
在某些实施方案中，包含本发明的核酸分子的转基因植物或种子也可在其基因组中包含至少一个其他的转基因事件，包括但不限于：自其转录靶向鞘翅目害虫中与由SEQID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:79,SEQ ID NO:81,SEQ IDNO:83,SEQ ID NO:85,SEQ ID NO:87,SEQ ID NO:89,SEQ ID NO:91,SEQ ID NO:164,SEQID NO:165,和SEQ ID NO:166定义的基因座不同的基因座的iRNA分子的转基因事件；自其转录靶向与鞘翅目害虫不同的生物(例如，植物寄生性线虫)中的基因的iRNA分子的转基因事件；编码杀虫蛋白(例如，苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白)的基因；除草剂耐性基因(例如提供对草甘膦耐性的基因)；以及促成转基因植物中的期望表型的基因，所述期望表型例如产量增加、脂肪酸代谢改变、或细胞质雄性不育的恢复。在特定的实施方案中，可以在植物中将编码本发明iRNA分子的多核苷酸与其他昆虫控制和疾病性状组合以实现增强的植物疾病和昆虫损害的期望性状。例如，由于对所述性状的抗性的概率在田间将发生降低，组合采用独特作用模式的昆虫控制性状可以对受保护的转基因植物提供优越的持久性，该持久性优于含有单一控制性状的植物。
V.鞘翅目害虫中的靶基因阻抑
A.概述
在本发明的一些实施方案中，可以对鞘翅目害虫提供至少一种可用于控制鞘翅目害虫的核酸分子，其中所述核酸分子在害虫中导致RNAi介导的基因沉默。在特定的实施方案中，可以对鞘翅目害虫提供iRNA分子(例如，dsRNA、miRNA、siRNA、shRNA、和hpRNA)。在一些实施方案中，可以通过使核酸分子与害虫接触来对鞘翅目害虫提供可用于控制鞘翅目害虫的核酸分子。在这些和另外的实施方案中，可以在鞘翅目害虫的进食基质，例如营养组合物中提供可用于控制鞘翅目害虫的核酸分子。在这些和另外的实施方案中，可以通过摄取被鞘翅目害虫摄取的包含核酸分子的植物材料来提供可用于控制鞘翅目害虫的核酸分子。在某些实施方案中，核酸分子通过表达导入植物材料中的重组核酸而存在于植物材料中，所述导入例如通过用包含重组核酸的载体转化植物细胞，并从转化的植物细胞再生植物材料或全植物来进行。
B.RNA介导的靶基因阻抑
在具体实施方案中，本发明提供了iRNA分子(例如，dsRNA、miRNA、siRNA、shRNA、和hpRNA)，可以设计此类分子使之靶向鞘翅目害虫(例如WCR或NCR)的转录组中的必需天然多核苷酸(例如，必需基因)，例如设计有至少一条链包含与靶多核苷酸特异性互补的多核苷酸的iRNA分子。如此设计的iRNA分子的序列可以与靶多核苷酸相同，或者可以含有不会阻止iRNA分子与其靶多核苷酸之间的特异性杂交的错配。
本发明的iRNA分子可以在用于鞘翅目害虫中基因阻抑的方法中使用，由此降低由害虫对植物(例如，包含iRNA分子的受保护的转化植物)引起的损害水平或发生率。如本文中使用的，术语“基因阻抑”是指用于降低由于基因转录成mRNA及随后mRNA翻译而产生的蛋白质水平，包括降低基因或编码多核苷酸的蛋白质表达，包括任何公知的转录后抑制表达和转录阻抑表达的方法。通过从靶向阻抑的基因转录的mRNA的全部或部分与用于阻抑的相应iRNA分子之间的特异性同源性而介导转录后抑制。另外，转录后抑制是指通过核糖体结合的细胞中可用的mRNA量的实质性且可测量的降低。
在其中RNAi分子是dsRNA分子的实施方案中，切丁酶这种酶可以将dsRNA分子切割成短siRNA分子(大约20个核苷酸长)。借助于切丁酶对dsRNA分子的活性而生成的双链siRNA分子可以分成两个单链siRNA：“乘客链”和“引导链”。乘客链可以被降解，而引导链可以掺入RISC中。通过引导链与mRNA分子的特异性互补多核苷酸的特异性杂交，随后通过酶Argonaute(RISC复合物的催化组分)切割而发生转录后抑制。
在本发明的实施方案中，可以使用任何形式的iRNA分子。本领域技术人员会理解的是，在制备过程中及在对细胞提供iRNA分子的步骤过程中，dsRNA分子一般比单链RNA分子更稳定，并且一般在细胞中也是更稳定的。因此，例如，虽然在一些实施方案中siRNA和miRNA分子可能是同等有效的，但是dsRNA分子可以由于其稳定性而被选用。
在特定的实施方案中，提供了包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸可以在体外表达以产生iRNA分子，所述iRNA分子与由鞘翅目害虫基因组内的多核苷酸编码的核酸分子基本上同源。在某些实施方案中，体外转录的iRNA分子可以是包含茎环结构的稳定化的dsRNA分子。在鞘翅目害虫接触体外转录的iRNA分子后，可以发生对该鞘翅目害虫中靶基因(例如，必需基因)的转录后抑制。
在本发明的一些实施方案中，在用于对鞘翅目害虫中靶基因的转录后抑制的方法中利用自包含多核苷酸的至少15个连续核苷酸(例如至少19个连续核苷酸)的核酸分子的iRNA表达，其中所述多核苷酸选自下组：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:1的互补物；SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:3的互补物；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:5的互补物；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:7的互补物；SEQ ID NO:79；SEQ ID NO:79的互补物；SEQ ID NO:81；SEQ ID NO:81的互补物；SEQ ID NO:83；SEQ ID NO:83的互补物；SEQ ID NO:85；SEQ ID NO:85的互补物；SEQ IDNO:87；SEQ ID NO:87的互补物；SEQ ID NO:89；SEQ ID NO:89的互补物；SEQ ID NO:91；SEQID NO:91的互补物；SEQ ID NO:164；SEQ ID NO:164的互补物；SEQ ID NO:165；SEQ ID NO:165的互补物；SEQ ID NO:166,SEQ ID NO:166的互补物；SEQ ID NO:1的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:1的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；SEQ ID NO:3的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:3的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；SEQ ID NO:5的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:5的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；SEQ IDNO:7的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:7的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；SEQ ID NO:79的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:79的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；SEQ ID NO:81的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:81的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；SEQ ID NO:83的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:83的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；SEQ ID NO:85的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ IDNO:85的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；SEQ ID NO:87的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:87的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；SEQ ID NO:89的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:89的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；SEQ ID NO:91的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:91的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；SEQ IDNO:164的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:164的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；SEQ ID NO:165的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:165的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；SEQ ID NO:166的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:166的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:1的天然编码多核苷酸；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:1的天然编码多核苷酸的互补物；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:3的天然编码多核苷酸；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:3的天然编码多核苷酸的互补物；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:5的天然编码多核苷酸；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:5的天然编码多核苷酸的互补物；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:7的天然编码多核苷酸；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:7的天然编码多核苷酸的互补物；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:79的天然编码多核苷酸；根萤叶甲属生物的包含SEQ IDNO:79的天然编码多核苷酸的互补物；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:81的天然编码多核苷酸；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:81的天然编码多核苷酸的互补物；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:83的天然编码多核苷酸；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:83的天然编码多核苷酸的互补物；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:85的天然编码多核苷酸；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:85的天然编码多核苷酸的互补物；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:87的天然编码多核苷酸；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:87的天然编码多核苷酸的互补物；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:89的天然编码多核苷酸；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:89的天然编码多核苷酸的互补物；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:91的天然编码多核苷酸；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:91的天然编码多核苷酸的互补物；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:164的天然编码多核苷酸；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:164的天然编码多核苷酸的互补物；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:165的天然编码多核苷酸；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:165的天然编码多核苷酸的互补物；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:166的天然编码多核苷酸；根萤叶甲属生物的包含SEQ IDNO:166的天然编码多核苷酸的互补物；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:1的天然编码多核苷酸的至少15个连续多核苷酸的片段；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:1的天然编码多核苷酸的至少15个连续多核苷酸的片段的互补物；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:3的天然编码多核苷酸的至少15个连续多核苷酸的片段；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:3的天然编码多核苷酸的至少15个连续多核苷酸的片段的互补物；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:5的天然编码多核苷酸的至少15个连续多核苷酸的片段；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:5的天然编码多核苷酸的至少15个连续多核苷酸的片段的互补物；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:7的天然编码多核苷酸的至少15个连续多核苷酸的片段；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:7的天然编码多核苷酸的至少15个连续多核苷酸的片段的互补物；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:79的天然编码多核苷酸的至少15个连续多核苷酸的片段；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:79的天然编码多核苷酸的至少15个连续多核苷酸的片段的互补物；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:81的天然编码多核苷酸的至少15个连续多核苷酸的片段；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:81的天然编码多核苷酸的至少15个连续多核苷酸的片段的互补物；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:83的天然编码多核苷酸的至少15个连续多核苷酸的片段；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:83的天然编码多核苷酸的至少15个连续多核苷酸的片段的互补物；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:85的天然编码多核苷酸的至少15个连续多核苷酸的片段；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:85的天然编码多核苷酸的至少15个连续多核苷酸的片段的互补物；根萤叶甲属生物的包含SEQ IDNO:87的天然编码多核苷酸的至少15个连续多核苷酸的片段；根萤叶甲属生物的包含SEQID NO:87的天然编码多核苷酸的至少15个连续多核苷酸的片段的互补物；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:89的天然编码多核苷酸的至少15个连续多核苷酸的片段；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:89的天然编码多核苷酸的至少15个连续多核苷酸的片段的互补物；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:91的天然编码多核苷酸的至少15个连续多核苷酸的片段；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:91的天然编码多核苷酸的至少15个连续多核苷酸的片段的互补物；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:164的天然编码多核苷酸的至少15个连续多核苷酸的片段；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:164的天然编码多核苷酸的至少15个连续多核苷酸的片段的互补物；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:165的天然编码多核苷酸的至少15个连续多核苷酸的片段；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:165的天然编码多核苷酸的至少15个连续多核苷酸的片段的互补物；根萤叶甲属生物的包含SEQ ID NO:166的天然编码多核苷酸的至少15个连续多核苷酸的片段；和根萤叶甲属生物的包含SEQ IDNO:166的天然编码多核苷酸的至少15个连续多核苷酸的片段的互补物。在某些实施方案中，可以使用与前述任一项至少约80％相同(例如，79％，约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约100％、和100％)的核酸分子的表达。在这些和进一步的实施方案中，可以表达与在鞘翅目害虫的至少一个细胞中存在的RNA分子特异性杂交的核酸分子。
本发明的一些实施方案的重要特征在于，RNAi转录后抑制***能够容忍靶基因中预期由于遗传突变、株系多态性、或进化趋异而可能发生的序列变异。导入的核酸分子可以不必与靶基因的初级转录产物或完全加工的mRNA绝对同源，只要导入的核酸分子与靶基因的初级转录产物或完全加工的mRNA可特异性杂交即可。而且，相对于靶基因的初级转录产物或完全加工的mRNA，导入的核酸分子可以不必是全长的。
使用本文的iRNA技术抑制靶基因是序列特异性的；即，靶向与iRNA分子基本上同源的多核苷酸进行遗传抑制。在一些实施方案中，可以使用包含具有与靶基因的一部分相同的核苷酸序列的多核苷酸的RNA分子进行抑制。在这些和另外的实施方案中，可以使用包含相对于靶多核苷酸具有一个或多个***、缺失和/或点突变的多核苷酸的RNA分子。在特定的实施方案中，iRNA分子和靶基因的一部分可以共享例如至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约100％、和100％的序列同一性。或者，dsRNA分子的双链体区可以与靶基因转录物的一部分可特异性地杂交。在可特异性杂交的分子中，展现出较大同源性的小于全长的多核苷酸可补偿较长的、同源性较低的多核苷酸。dsRNA分子的双链体区中与靶基因转录物的一部分相同的多核苷酸的长度可以是至少约15、25、50、100、200、300、400、500个、或至少约1000个碱基。在一些实施方案中，可以使用大于20个到100个核苷酸的多核苷酸；例如，可以使用100-200或300-500个核苷酸的多核苷酸。在特定的实施方案中，可以使用大于约200个到300个核苷酸的多核苷酸。在特定的实施方案中，根据靶基因的大小，可以使用大于约500个到1000个核苷酸的多核苷酸。
在某些实施方案中，可以将鞘翅目害虫中靶基因的表达在害虫细胞内抑制至少10％；至少33％；至少50％；或至少80％，使得发生显著抑制。显著抑制是指高于阈值的抑制，所述抑制导致可检出的表型(例如，生长、生殖、进食、发育等的停止)，或与所抑制的靶基因对应的RNA和/或基因产物的可检出降低。虽然在本发明的某些实施方案中，在害虫的基本上所有细胞中均发生抑制，但在其他实施方案中，仅在表达靶基因的细胞的一个子集中发生抑制。
在一些实施方案中，细胞中的转录阻抑由细胞中展现出与启动子DNA或其互补物的实质性序列同一性的dsRNA分子的存在所介导，从而产生所谓的“启动子反式阻抑”。基因阻抑可以在可以摄取或接触此类dsRNA分子的鞘翅目害虫中针对靶基因发挥效果，例如通过害虫摄取或接触含有dsRNA分子的植物材料。在启动子反式阻抑中使用的dsRNA分子可以特异性地设计为抑制或阻抑鞘翅目害虫细胞中一种或多种同源或互补多核苷酸的表达。美国专利5,107,065；5,759,829；5,283,184；和5,231,020中公开了通过反义或有义取向的RNA进行转录后基因阻抑以调节植物细胞中的基因表达。
C.对鞘翅目害虫提供的iRNA分子的表达
可以许多体外或体内形式的任一种进行表达用于在鞘翅目害虫中RNAi介导的基因抑制的iRNA分子。然后，可以对鞘翅目害虫提供iRNA分子，例如通过使iRNA分子与害虫接触，或通过引起害虫摄取或以别的方式内在化iRNA分子。本发明的一些实施方案包括鞘翅目害虫的经转化的宿主植物、经转化的植物细胞、和经转化的植物的后代。经转化的植物细胞和经转化的植物可以工程化改造为，例如，在异源启动子控制下表达一种或多种iRNA分子，以提供害虫保护效果。因此，当在鞘翅目害虫在进食期间食用转基因植物或植物细胞时，害虫可以摄取转基因植物或细胞中表达的iRNA分子。也可以将本发明的多核苷酸导入广泛而多样的原核和真核微生物宿主中以产生iRNA分子。术语“微生物”包括原核和真核物种，如细菌和真菌。
基因表达的调变可以包括对此类表达的部分或完全阻抑。在另一个实施方案中，用于阻抑鞘翅目害虫中基因表达的方法包括在害虫宿主的组织中提供基因阻抑量的至少一种如本文中所描述的多核苷酸在转录后形成的dsRNA分子，其至少一个区段与害虫细胞内的mRNA互补。鞘翅目害虫所摄取的依照本发明的dsRNA分子，包括其修饰的形式，如miRNA、siRNA、shRNA、或hpRNA分子，可以与自染色质重塑DNA分子(例如包含选自SEQ IDNO:SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:79；SEQ ID NO:81；SEQ ID NO:83；SEQ ID NO:85；SEQ ID NO:87；SEQ ID NO:89；SEQ ID NO:91；SEQ ID NO:164；SEQ ID NO:165；和SEQ ID NO:166的多核苷酸的染色质重塑基因DNA分子)转录的RNA分子至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或约100％相同。因此，提供了用于提供本发明的dsRNA分子的分离的且基本上纯化的核酸分子，包括但不限于非天然存在的多核苷酸和重组DNA构建体，其在导入鞘翅目害虫时阻抑或抑制其中的内源编码多核苷酸或靶编码多核苷酸的表达。
特定的实施方案提供了用于递送iRNA分子以转录后抑制鞘翅目植物害虫中的一种或多种靶基因并控制该植物害虫群体的递送***。在一些实施方案中，所述递送***涉及包括对宿主转基因植物细胞或包含在宿主细胞中转录的RNA分子的宿主细胞内容物的摄取。在这些和另外的实施方案中，创建转基因植物细胞或转基因植物，其含有可提供本发明的稳定化dsRNA分子的重组DNA构建体。包含编码特定iRNA分子的核酸的转基因植物细胞和转基因植物可以如下产生：采用重组DNA技术(这些基础技术是本领域中熟知的)构建包含编码本发明的iRNA分子(例如，稳定化的dsRNA分子)的多核苷酸的植物转化载体；以此转化植物细胞或植物；并以此生成含有转录的iRNA分子的转基因植物细胞或转基因植物。
为了对转基因植物赋予针对鞘翅目害虫的保护，可以例如将重组DNA分子转录成iRNA分子，如dsRNA分子、siRNA分子、shRNA分子、miRNA分子、或hpRNA分子。在一些实施方案中，从重组DNA分子转录的RNA分子可以在重组植物的组织或流体内形成dsRNA分子。这样的dsRNA分子可以包含在多核苷酸的一部分中，所述多核苷酸与可侵染宿主植物的类型的鞘翅目害虫内的DNA转录的相应多核苷酸相同。鞘翅目害虫内靶基因的表达被所述dsRNA分子所阻抑，并且该害虫中靶基因表达的阻抑导致该转基因植物对该害虫有抗性。已经显示dsRNA分子的调控作用可适用于害虫中表达的多种基因，包括例如负责细胞***、染色体重塑、以及细胞代谢或细胞转化的内源基因，包括管家基因；转录因子；蜕皮相关基因；和编码涉及细胞代谢或正常生长和发育的多肽的其他基因。
为了从体内转基因或表达构建体转录，可以在一些实施方案中使用调节区(例如，启动子、增强子、沉默子、和多聚腺苷酸化信号)以转录一条或多条RNA链。因此，在一些实施方案中，如上文提出的，在产生iRNA分子中使用的多核苷酸可以与在植物宿主细胞中有功能的一种或多种启动子元件可操作连接。启动子可以是通常驻留于宿主基因组中的内源启动子。在可操作连接的启动子元件控制下的本发明的多核苷酸可以进一步被其他有利地影响其转录和/或所得转录物的稳定性的元件所侧翼。这样的元件可以位于可操作连接启动子的上游、表达构建体3'端的下游、并且可以同时存在于启动子的上游和表达构建体3'端的下游。
在实施方案中，靶基因(例如，染色质重塑基因)的抑制导致亲代RNAi表型；在与iRNA分子接触的受试者(例如，鞘翅目害虫)的后代中可观察到的表型。在一些实施方案中，pRNAi表型包括害虫产生可存活的后代的能力被降低。在pRNAi的具体实例中，启动pRNAi的核酸不增加被递送该核酸的群体中死亡的发生率。在pRNAi的其它实例中，启动pRNAi的核酸也增加被递送该核酸的群体中的死亡的发生率。
在一些实施方案中，令鞘翅目害虫群体与iRNA分子接触，从而导致pRNAi，其中害虫存活并交配，但是所产生的卵孵化出可存活后代的能力小于未被提供该核酸的相同物种的害虫产生的卵。在某些例子中，这样的害虫不产卵，或者其产卵少于未与该iRNA分子接触的相同物种的害虫中可观察到的产卵。在一些实例中，由这样的害虫产卵不能孵化，或者孵化的速率显著低于未与该iRNA分子接触的相同物种的害虫中可观察到的速率。在一些实例中，从这样的害虫产的卵孵化的幼虫的存活力低于从未与该iRNA分子接触的相同物种的害虫中可观察到的存活力。
产生可保护其免受昆虫摄食的物质的转基因作物易于遭到目标昆虫种群的适应，从而难以持久受益于昆虫保护物质。传统上，通过下述手段实现对转基因作物的虫害适应的延迟：(1)种植“避难所”(不包含杀虫物质的作物，因此允许对杀虫物质敏感的昆虫的存活)，和/或(2)将杀虫物质与针对目标害虫的多种作用方式相结合，使得对一种作用模式有抗性的个体被另一种作用模式杀死。
在一些实例中，iRNA分子(例如，从宿主植物中的转基因表达的)提供新的作用模式，以供与苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白技术昆虫和/或致死RNAi技术组合成为昆虫抗性管理基因金字塔(Insect Resistance Management gene pyramids)，以减轻昆虫群体对这两种控制技术中任一者发生抗性。
亲代RNAi在某些实施方案中可以导致一种类型的害虫控制，此类型不同于通过致死性RNAi获得的控制，并且可以与致死性RNAi组合以产生协同性的害虫控制。因此，在具体实施方案中，用于在鞘翅目植物害虫中的一个或多个靶基因的转录后抑制的iRNA分子可以与其他iRNA分子组合以提供冗余的RNAi靶向和协同的RNAi效应。
导致卵死亡或卵活力丧失的亲代RNAi(pRNAi)有可能为利用RNAi和其他机制进行昆虫保护的转基因作物带来更多的耐久性益处。pRNAi可防止暴露的昆虫产生后代，因此可防止它们将其携带的任何赋予对杀虫物质的抗性的等位基因传递到下一代。pRNAi当与一种或多种可提供对相同害虫种群的保护的其他杀虫物质组合时，对于延长受保护的转基因作物的耐久性特别有用。此类另外的杀虫物质在一些实施方案中可以包括例如：dsRNA；对幼虫有活性的dsRNA；杀虫蛋白(如来自苏云金芽孢杆菌或其他生物的那些)；和其他杀虫物质。这种益处的产生是因为，在转基因作物中对杀虫物质具有抗性的昆虫在群体中出现的比例高于避难所作物中。如果当pRNAi存在时，传递给下一代的抗性等位基因与易感等位基因的比例比pRNAi不存在时低，则抗性的演化将会延迟。
例如，pRNAi可能不会减少对表达iRNA分子的植物造成损害的第一害虫世代中的个体数量。然而，这样的害虫维持后续世代侵染的能力可能会降低。相反，致死性RNAi可能会杀死已经正在侵染植物的害虫。当pRNAi与致死性RNAi组合时，与亲代iRNA分子接触的害虫可以来自***外部的未与iRNA接触的害虫繁育，然而，这种交配的后代可能无法存活或存活力低，因此可能无法侵染植物。同时，与致死性iRNA分子接触的害虫也可能直接受到影响。这两种效应的结合可能是协同性的；即pRNAi和致死性RNAi的组合效应可以大于pRNAi和致死性RNAi的独立效应之和。pRNAi可例如通过如下方式与致死性RNAi组合：提供表达致死性iRNA分子和亲代iRNA分子的植物；通过在同一位置提供表达致死性iRNA分子的第一植物和表达亲代iRNA分子的第二植物；和/或通过使雌性和/或雄性害虫与pRNAi分子接触，随后将接触过的害虫释放到植物环境中，使得它们可以与植物害虫交配而没有后代。
一些实施方案提供了用于降低由以植物为食的鞘翅目害虫引起的对宿主植物(例如，玉米植物)的损害的方法，其中所述方法包括在宿主植物中提供表达本发明的至少一种核酸分子的转化植物细胞，其中所述核酸分子在被害虫摄取后发挥功能以抑制该害虫内靶多核苷酸的表达，该表达抑制除了导致该害虫死亡和/或生长降低之外，还例如导致该害虫生殖降低，由此降低由该害虫引起的对宿主植物的损害。在一些实施方案中，核酸分子包含dsRNA分子。在这些和另外的实施方案中，核酸分子包含dsRNA分子，所述dsRNA分子各自包含超过一种与鞘翅目害虫细胞中表达的核酸分子可特异性地杂交的多核苷酸。在一些实施方案中，核酸分子由一种多核苷酸组成，所述多核苷酸与鞘翅目害虫细胞中表达的核酸分子可特异性地杂交。
在其他实施方案中，提供了用于提高玉米作物产量的方法，其中所述方法包括将本发明的至少一种核酸分子导入玉米植物中；并栽培玉米植物以容许表达包含核酸的iRNA分子，其中包含所述核酸的iRNA分子的表达可抑制鞘翅目害虫损害和/或生长，由此降低或消除由于鞘翅目害虫侵染所致的产量损失。在一些实施方案中，iRNA分子是dsRNA分子。在这些和另外的实施方案中，核酸分子包含dsRNA分子，所述dsRNA分子各自包含超过一种与鞘翅目害虫细胞中表达的核酸分子特异性可杂交的多核苷酸。在一些实施方案中，所述核酸分子包含与鞘翅目害虫细胞中表达的核酸分子可特异性地杂交的多核苷酸。
在一些实施方案中，提供了用于提高植物作物产量的方法，其中所述方法包括将至少一种本发明的核酸分子引入雌性鞘翅目害虫(例如通过注射、通过摄取、喷雾和通过自DNA表达)；并将该雌性害虫释放到作物中，其中包括该雌性害虫的配对(mating pair)无法产生可存活的后代或产生可存活后代的能力降低，从而减少或消除由于鞘翅目害虫侵袭引起的产量损失。在具体实施方案中，这种方法提供对所述害虫的后续世代的控制。在类似的实施方案中，该方法包括将本发明的核酸分子引入雄性鞘翅目昆虫，并将该雄性害虫释放到作物中(例如，其中pRNAi雄性害虫比未处理的对照产生的***少)。例如，鉴于WCR雌性通常只交配一次，可以用这些pRNAi雌性和/或雄性进行竞争，以在求偶时对天然WCR昆虫形成压倒性优势。在一些实施方案中，核酸分子是表达产生iRNA分子的DNA分子。在一些实施方案中，核酸分子是dsRNA分子。在这些和进一步的实施方案中，核酸分子包含dsRNA分子，每个dsRNA分子包含多于一个与在鞘翅目有害生物细胞中表达的核酸分子可特异性杂交的的多核苷酸。在一些实施方案中，核酸分子由与鞘翅目害虫细胞中表达的核酸分子可特异性杂交的一个多核苷酸组成。
在一些实施方案中，提供了用于调变鞘翅目害虫中靶基因表达的方法，所述方法包括：用包含编码本发明的至少一种iRNA分子的多核苷酸的载体转化植物细胞，其中所述多核苷酸与启动子和转录终止元件可操作连接；在足以容许形成包含多个转化植物细胞的植物细胞培养物的条件下培养经转化的植物细胞；选择已经将核酸分子整合到其基因组中的转化植物细胞；对转化植物细胞筛选由整合的核酸分子编码的iRNA分子的表达；选择表达iRNA分子的转基因植物细胞；并且用选择的转基因植物细胞喂养鞘翅目害虫。也可以从表达由整合的核酸分子编码的iRNA分子的转化植物细胞再生植物。在一些实施方案中，iRNA分子是dsRNA分子。在这些和另外的实施方案中，核酸分子包含dsRNA分子，所述dsRNA分子各自包含超过一种与鞘翅目害虫细胞中表达的核酸分子可特异性地杂交的多核苷酸。在一些实例中，核酸分子由与鞘翅目害虫细胞中表达的核酸分子可特异性地杂交的多核苷酸组成。
可以将本发明的iRNA分子作为来自掺入植物细胞基因组中的重组基因的表达产物、或者掺入应用于种植前种子的包衣或种子处理中而掺入植物物种(例如，玉米)的种子之内。包含重组基因的植物细胞被视为转基因事件。本发明的实施方案中还包括用于将iRNA分子投送给鞘翅目害虫的递送***。例如，可以将本发明的iRNA分子直接导入害虫的细胞中。用于导入的方法可以包括将iRNA直接混合到鞘翅目害虫的饵食中(例如通过与该害虫的宿主的植物组织混合)，以及对宿主植物组织应用包含本发明的iRNA分子的组合物。例如，可将iRNA分子喷雾到植物表面上。或者，可以通过微生物表达iRNA分子，并且可以将微生物施加到植物表面上，或通过物理手段诸如注射导入根或茎中。如上文论述的，也可以对转基因植物进行遗传工程改造，使其以足以杀死已知侵染植物的鞘翅目害虫的量表达至少一种iRNA分子。通过化学或酶促合成产生的iRNA分子也可以以符合常见农业实践的方式配制，并且作为喷雾或诱饵产品使用以控制鞘翅目害虫所致的植物损害。配制剂可以包含有效的叶覆盖需要的适当辅料(例如粘着剂(sticker)和湿润剂)，以及保护iRNA分子(例如，dsRNA分子)免于UV损伤的UV保护剂。这样的添加剂通常在生物杀虫剂产业中使用，并且是本领域技术人员熟知的。这样的应用可以与其他喷雾杀虫剂应用(基于生物学的或其他方面)组合以增强针对害虫的植物保护。
本文中所讨论的所有参考文献，包括本文引用的出版物，专利和专利申请，均通过引用并入本文，只要与本公开的明确细节不冲突，如同单独地和具体地明示将每篇参考文献通过引用并入本文一样。本文所讨论的参考文献仅为其在本申请的申请日之前的公开内容而提供。本文中任何内容不应被解释为承认发明人无权凭借在先发明而先于这些公开。
提供以下实施例以展示某些具体特征和/或方面。这些实施例不应被理解为将本公开限于本文中描述的具体特征或方面。
实施例
实施例1：材料和方法
用于根萤叶甲属幼虫进食测定的样品制备和生物测定
用于dsRNA的模板制备，包括RNA提取、cDNA合成、以及使用含T7的引物的PCR，包括在实施例4中。在使用饲喂人工昆虫饵食的新生虫的生物测定中测试样品的活性。WCR卵获自CROP CHARACTERISTICS，INC(Farmington，MN)。
生物测定在特别为昆虫生物测定设计的128孔塑料托盘(C-D INTERNATIONAL，Pitman，NJ)中进行。每个孔含有约1.0mL设计用于鞘翅目昆虫生长的饵食。通过移液管将60μL等份的dsRNA样品递送到每个孔的1.5cm2饵食表面(40μL/cm2)。dsRNA样品浓度作为孔中每平方厘米(ng/cm2)表面积的dsRNA量来计算。将处理的托盘保持在通风橱中，直到饵食表面上的液体蒸发或吸收到饵食中。
在破壳后的几个小时内，用湿润的骆驼毛刷拾取幼虫个体，并且将其放置在处理的饵食(每孔一个或两个幼虫)上。然后用透明塑料贴片密封128孔塑料托盘上带虫的孔，塑料贴片通有气孔以允许气体交换。将生物测定盘在受控环境条件(28℃，～40％相对湿度，16:8(光照:黑暗))下保持9天，而后记录暴露于每个样品的昆虫总数、死亡的昆虫数、和存活昆虫的重量。计算每个处理的百分比死亡率、平均生存重量、以及生长抑制。生长受阻(stunting)定义为平均生存重量的减少。生长抑制(GI)计算如下:
GI＝[1-(TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)]，
其中TWIT是处理中活昆虫的总重量；
TNIT是处理中的昆虫总数；
TWIBC是背景检查中的活昆虫的总重量(缓冲液对照)；和
TNIBC是背景检查中的昆虫总数(缓冲液对照)。
GI50规定为GI值为50％时饵食中样品的浓度。LC50(50％致死浓度)作为50％的测试昆虫被杀死时的样品浓度记录。统计学分析使用软件(SAS,Cary,NC)进行。
实施例2：来自根萤叶甲属的候选靶基因的鉴定
选择来自WCR(玉米根萤叶甲)的多个发育期的昆虫进行汇集的转录组分析，以提供通过RNAi转基因植物保护技术控制的候选靶基因序列。
在一个范例中，从约0.9gm的完整第一龄WCR幼虫(孵化后4到5天；保持在16℃)分离总RNA，并使用下述基于苯酚/TRI-的方法(MOLECULAR RESEARCH CENTER,Cincinnati,OH)进行纯化。
将幼虫于室温在具有10mL TRI的15mL匀浆器中均质化，直到获得均匀的悬浮液时为止。在室温温育5分钟后，将匀浆分配到1.5mL微量离心管中(每管1mL)，添加200μL氯仿，并将混合物强力振摇15秒。在室温提取10分钟之后，通过在4℃以12,000x g离心分离各个相。将上层相(包含约0.6mL)小心转移到另一个无菌的1.5mL管中，并添加等体积的室温异丙醇。在室温温育5到10分钟之后，将混合物在12,000x g(4℃或25℃)离心8分钟。
将上清液小心取出并弃去，并将RNA离心沉淀通过用75％乙醇涡旋振荡洗涤两次，在每次洗涤后通过在7,500x g(4℃或25℃)离心5分钟回收。小心去除乙醇，让离心沉淀风干3至5分钟，然后溶解在无核酸酶的无菌水中。通过在260nm和280nm测量吸光度(A)测定RNA浓度。从约0.9gm幼虫的典型提取产生超过1mg的总RNA，其中A260/A280比为1.9。如此提取的RNA在-80℃贮存，直到进一步处理。
通过使等份跑1％琼脂糖凝胶确定RNA质量。在经高温灭菌的容器中，使用经DEPC(焦碳酸二乙酯)处理的水稀释的高温灭菌的10X TAE缓冲液(Tris乙酸盐EDTA；1X浓度为0.04M Tris乙酸盐，1mM EDTA(乙二胺四乙酸钠盐，pH 8.0)制成琼脂糖凝胶溶液。使用1xTAE作为运行缓冲液。在使用前，用RNASE(INVITROGEN INC.,Carlsbad,CA)清洁电泳槽和造孔梳。将2μL RNA样品与8μL TE缓冲液(10mM Tris HCl pH 7.0；1mM EDTA)和10μL RNA样品缓冲液(目录号70606；EMD4Bioscience,Gibbstown,NJ)混合。将样品于70℃加热3分钟，冷却至室温，每孔上样5μL(含有1μg到2μg RNA)。将市售的RNA分子量标记物在分离的孔中同时运行以进行分子大小比较。在60伏特下跑胶2小时。
由服务提供商(EUROFINS MWG Operon,Huntsville,AL)利用随机引发从完整幼虫的总RNA制备标准化的cDNA文库。在EUROFINS MWG Operon通过GS FLX 454TitaniumTM系列化学以1/2板的规模对标准化的幼虫cDNA文库进行测序，其产生具有平均读段长度348bp的超过600,000个读段。将350,000个读段装配成超过50,000个重叠群。使用公众可访问的程序F0RMATDB(可在NCBI访问)将未装配的读段和重叠群两者都转换成可BLAST的数据库。
类似地从其他WCR发育期收获的材料制备了总RNA和标准化的cDNA文库。合并代表各个发育期的cDNA文库成员，构建了用于靶基因筛选的汇集的转录组文库。
利用其他昆虫如果蝇属(Drosophila)和拟谷盗属(Tribolium)中特定基因的致死作用的有关信息来选择用于RNAi靶向的候选基因。例如，基于果蝇属brahma基因的遗传分析选择了brahma基因(ATP依赖性解旋酶brm)。Brizuela et al.(1994)Genet.137:803-13。一旦鉴定了序列，则使用独立的BLAST算法搜索现存的转录组序列，以鉴定与brahma基因显示显著相似性的西方玉米根虫序列。对西方玉米根虫brahma样序列的更完整表征揭示了许多染色质重塑蛋白特征的结构域。因此，从现有的转录组资源中搜索了具有相似的结构域和活性的序列。这些基因(mi-2、iswi-1、iswi-2、iswi-30、chd1、ino80和domino)据假说对鞘翅目昆虫的存活和生长至关重要。如下文所述，在转录组序列数据库中鉴定了选定的靶基因同源物。通过PCR扩增靶基因的全长或部分序列，制备模板以供如下所述的双链RNA(dsRNA)产生。
使用候选蛋白质编码多核苷酸针对含有未装配的根萤叶甲属序列读段或已装配的重叠群的可BLAST数据库进行TBLASTN搜索。对于与根萤叶甲属序列的显著命中(定义为：对于重叠群同源性，好于e-20；对于未装配的序列读段同源性，好于e-10)，使用BLASTX针对NCBI非冗余数据库加以确认。此BLASTX搜索的结果确认，在TBLASTN搜索中鉴定的根萤叶甲属同源物候选基因序列确实包含根萤叶甲属基因，或者是在根萤叶甲属序列中可用的对非根萤叶甲属候选基因序列的最佳命中。在大多数情况下，被注释为编码蛋白质的拟谷盗属候选基因呈现出明确的与根萤叶甲属转录物组序列中的一种或多种序列的序列同源性。在少数情况下可明显看出，某些基于与非根萤叶甲属候选基因的同源性选择的根萤叶甲属重叠群或未装配的序列读段有重叠，而且重叠群的装配未能连接起这些重叠。在这些情况下，使用v4.9(GENE CODES CORPORATION,Ann Arbor,MI)将序列装配成更长的重叠群。
玉米根萤叶甲的其他转录组测序先前已经有描述。Eyun et al.(2014)PLoS One9(4):e94052。在另一个示例中，使用配对末端和454Titanium测序技术，从由卵制备的cDNA(15,162,017个经过滤的末端配对读段)、由新生虫制备的cDNA(721,697,288个经过滤的末端配对读段)和由三龄幼虫的中肠制备的cDNA(44,852,488个末端配对读段和415,742个Roche 454读段，两者都经过过滤)测序了总共约700吉碱基(gigabases)。使用Trinity(Grabherr et al.(2011)Nat.Biotechnol.29(7):644-52)对三个样品中的每一个，以及对汇集的数据集进行了从头转录组装配。汇集组合产生了163,871个重叠群，平均长度为914bp。使用BRAHMA的氨基酸序列作为查询序列，用tBLASTN以10-5的截止E值搜索根虫转录组和基因组数据库(未发表)。将推导的氨基酸序列用ClustalXTM比对并用GENEDOCTM软件编辑。
鉴定了一个可能导致鞘翅目害虫死亡，或WCR中的生长、发育或生殖抑制的候选靶基因，其包括brahma转录物SEQ ID NO:1(具有子序列SEQ ID NO:8)；brahma转录物SEQ IDNO:3(具有子序列SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10)；brahma转录物SEQ ID NO:5(具有子序列SEQ ID NO:10)；brahma转录物SEQ ID NO:7(具有子序列SEQ ID NO:10)；mi-2转录物SEQID NO:79(具有子序列SEQ ID NO:104)；mi-2开放阅读框SEQ ID NO:164；iswi-1转录物SEQID NO:81；iswi-1开放阅读框SEQ ID NO:165；chd1转录物SEQ ID NO:83(具有子序列SEQID NO:105)；iswi-2转录物SEQ ID NO:85(具有子序列SEQ ID NO:103)；iswi-2开放阅读框SEQ ID NO:166；iswi30转录物SEQ ID NO:87(具有子序列SEQ ID NO:102)；ino80转录物SEQ ID NO:89；和domino转录物SEQ ID NO:91.这些基因编码SNF2型染色质重塑物蛋白，这些蛋白是在核小体动员中起全局性作用的染色质重塑复合物的亚单位。参见例如Brizuela等人(同上)；Kal et al.(2000)Genes Devel.14:058-71；和Tamkun等人，(1992)Cell 68:561-72。尽管它们具有相同的SNF2-解旋酶结构域，但每个物种内的大部分染色质重组体都具有非冗余功能，这些功能由它们包含的其他结构域所赋予。这些特征使得染色质重塑ATP酶成为多世代/亲代RNAi的有吸引力的靶标。
ATP依赖性重塑酶的SWI2/SNF2(交配型开关/蔗糖非发酵)家族含有可结合乙酰化组蛋白的布罗莫结构域。虽然酵母和脊椎动物含有几种SW12/SNF2蛋白，但在果蝇中仅鉴定出一种SWI2/SNF2蛋白——BRAHMA。BRAHMA与其他昆虫的含有SNF2的蛋白质保守，但又与它们不同，其推定的WCR直系同源物在***发育树上与其他染色质重塑复合物密切聚类。图2。人BRAHMA(BRM)以及酿酒酵母SNF2蛋白与昆虫BRAHMA聚类到一起。此外，果蝇BRAHMA的WCR与英雄美洲蝽(BSB)直向同源物均保持整体蛋白质结构域保守，包括SNF2ATP酶/解旋酶、布罗莫结构域、以及其他结构域：保守的Gin、Leu、Gln基序结构域(QLQ)，DNA结合性HSA域，和BRK(brahma和kismet)域。图3A。
已知BRAHMA可以被纳入BAP(Brahma相关蛋白)和PBAP(Polybromo相关BAP)染色质重塑复合物。果蝇brahma的丧失可损害RNA聚合酶II(Pol II)作用下的总体转录，提示BRAHMA复合物具有广泛的功能。在果蝇中，母体对brahma的贡献是早期胚胎发生必需的，而合子的brahma表达对于晚期胚胎发育是必需的。除了胚胎发生外，果蝇brahma也参与配子发生。
ISWI(模仿SWI/模仿开关)系列由组蛋白结合结构域所定义，这些结构域包含HAND、SANT和SLIDE域，呈现HAND-SANT-SLIDE架构。在果蝇中，ISWI家族的ATP依赖性重塑酶只有一个成员，即ISWI。果蝇ISWI可以通过整合到各种包括ATP依赖性染色质组装和重塑因子(ACF)、核小体重塑因子(NURF)和染色质可及性复合物(CHRAC)的复合物中来赋予多种功能。果蝇中ISWI的丢失可导致显著的染色体凝聚缺陷。
本文公开了WCR中的iswi直系同源物，以及其他具有部分序列的iswi同源物。完整的WCR ISWI蛋白质含有SNF2ATP酶/解旋酶，HAND-SANT-SLIDE(由Pfam鉴定为HAND和SLIDE)和DNA结合结构域(DBINO)。图3B。WCR ISWI的部分序列——ISWI-2，仅由SNF2结构域组成。图3B。该序列与其他ISWI蛋白质具有高同源性；在ISWI-2的整个长度上与WCR ISWI-1具有91％的同一性，并且在靶向iswi-2的dsRNA的整个区域具有93％的同一性。图3；图4。因此，WCR iswi-2的亲代RNAi效应可归因于完整的iswi-2序列的功能，或者归因于靶向的iswi-2dsRNA(图4)“敲低”iswi-1的能力。表1。
表1.来自Brahma样序列的dsRNA对摄入人工饵食11天后WCR的产卵总数和卵存活力的影响。各平均值使用Dunnett检验是分离的。
*表示p值<0.05的显著性
SEM均值标准误
属于ATP依赖性重塑酶的CHD(染色体域解旋酶DNA结合性)家族的蛋白质含有两个氨基末端染色体域[染色质组织修饰物]。图3C。果蝇CHD蛋白包括CHD1，MI2，CHD3和KISMET。CHD家族进一步细分为三个亚家族，在这里被称为亚家族I、II和III。果蝇CHD1属于CHD亚家族I，该亚家族具有C末端DNA结合结构域。图3C(DUF4208)。在果蝇中，CHD1蛋白显示出与BRAHMA相似的分布模式，但是chd1突变体蝇是能成活的。有趣的是，果蝇chd1是配子形成所必需的。经受chd1RNAi的WCR雌性显示后代存活力降低。表1。
MI-2和CHD3属于亚家族II。CHD亚家族II的酶没有DNA结合结构域，但具有锌指样结构域，称为PHD(植物同源异形域)手指。MI-2的WCR直向同源物的结构域安排与果蝇结构完全相同，并且包括SNF2ATP酶/解旋酶结构域，双克罗莫结构域，PHD指、和与含有PHD手指克罗莫结构域解旋酶的相关联的CHDNT结构域，以及其他未知功能的保守结构域，DUF1087和DUF1086。图3D。已知果蝇MI-2与NuRD(核小体重构脱乙酰酶)和dMec(果蝇的含有MEP 1的复合物)复合物关联。mi-2的母本表达是配子形成所必需的。Mi-2RNAi处理的雌性WCR不产生有活力的卵。表1。
CHD蛋白的第三个亚家族在果蝇中由KISMET代表；在人类中，该亚家族包括CHD5-98。与其他CHD蛋白一样，KISMET含有SNF2结构域和克罗莫结构域。图3E。与其他CHD亚家族不同，KISMET具有CHD和SWI2/SNF2蛋白二者的特征，具体而言是它具有BRAHMA和KISMET共同的BRK结构域。虽然BRK是果蝇KISMET的一个公认特征，但标准的Pfam分析并未在果蝇中鉴定该结构域。图3E。母本或合子的kismet功能丧失会导致果蝇胚胎发生过程中的缺陷，昆虫在早期幼虫阶段即死亡，而卵子发生不受影响。果蝇kismet的推定的WCR直系同源物不会响应于亲本RNAi而产生产卵或孵化缺陷。表1。
果蝇中有其他的含有SNF2的基因；其中大部分功能尚未定义。例如，WCR转录组含有etl1样转录本。图3F。Etl1(增强子陷阱基因座1)含SNF2基因首先是在小鼠中描述的。小鼠etl1已经被描述为具有发育作用，但不是必需的。以WCR etl1为目标的亲本RNAi未显示产卵或卵存活缺陷。表1。
鉴定的多核苷酸及其编码的多肽是新的。这些序列未提供在公共数据库中，且未在WO/2011/025860；美国专利申请20070124836；美国专利申请20090306189；美国专利申请US20070050860；美国专利申请号20100192265；或美国专利7,612,194中公开。根萤叶甲属brahma(SEQ ID NO:1)与来自西方盲走螨(Metaseiulus occidentalis)的一条序列的片段(登录号XM_003742362.1)有亲缘(72％同一性)。根萤叶甲属BRAHMA氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的最接近的同源物是登录号为ENN80791.1的中欧山松大小蠹(Dendroctonus ponderosae)蛋白(86％相似；在同源区上为75％相同)。根萤叶甲属brahma(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5)与来自丽蝇蛹集金小蜂(Nasonia vitripennis)(登录号XM_001607119.3)的序列的片段有一些亲缘(74％同一性)。根萤叶甲属BRAHMA氨基酸序列(SEQ ID NO:4)的最接近的同系物是登录号为ENN80791.1的中欧山松大小蠹蛋白(86％相似；同源区78％相同)。根萤叶甲属BRAHMA氨基酸序列(SEQ ID NO:6)最接近的同源物是登录号为ENN80791.1的中欧山松大小蠹蛋白(86％相似；在同源区上为75％相同)。在中对根萤叶甲属brahma(SEQ ID NO:7)检索没有发现有重要的同源核苷酸序列。在中对根萤叶甲属brahma(SEQ ID NO:8)检索没有发现显著的同源核苷酸序列。根萤叶甲属BRAHMA氨基酸序列(SEQ ID NO:9)最接近的同源物是登录号为ENN80791.1的中欧山松大小蠹蛋白(95％相似；在同源区上92％相同)。根萤叶甲属mi-2(SEQ ID NO:79)与来自埃及伊蚊的序列的片段(登录号XM_001663273.1)有一些近缘(72％同一性)。根萤叶甲属MI-2氨基酸序列(SEQ ID NO:80)的最接近的同源物是登录号为XP_001812556.1的赤拟谷盗(Tribolium castaneum)蛋白(85％相似；同源区上77％相同)。根萤叶甲属iswi-1(SEQ ID NO:81)与来自缅甸蟒(Python bivittatus)的序列(登录号XM_007428840.1)的片段有一些近缘(73％的同一性)。根萤叶甲属ISWI-1氨基酸序列(SEQ ID NO:82)最接近的同系物是登录号为ENN80673.1的中欧山松大小蠹蛋白(95％相似；在同源区上89％相同)。根萤叶甲属chd1(SEQ ID NO:83)与来自人体虱(Pediculus humanus corporis)的序列(登录号XM_002428164.1)的片段有一定近缘(74％同一性)。根萤叶甲属CHD-1氨基酸序列(SEQ ID NO:84)最接近的同系物是登录号为XP_970343.3的赤拟谷盗蛋白(82％相似；同源区上73％相同)。根萤叶甲属iswi-2(SEQ ID NO:85)与来自Tetrapisispora blattae的序列(GENBANK登录号XM_004179654.1)的片段有一些近缘(75％同一性)。根萤叶甲属ISWI-2氨基酸序列(SEQ ID NO:86)最接近的同源物是登录号为ERL83291.1的中欧山松大小蠹蛋白(95％相似；同源区上88％相同)。根萤叶甲属iswi-30(SEQ ID NO:87)与来自缅甸蟒的序列(登录号XM_007428840.1)的片段有一定近缘(73％同一性)。根萤叶甲属ISWI-30氨基酸序列(SEQ ID NO:88)最接近的同源物是登录号为ENN80673.1的中欧山松大小蠹蛋白(95％相似；在同源区上89％相同)。根萤叶甲属ino80(SEQ ID NO:89)与牦牛(Bos mutus)序列(登录号XM_005903961.1)的片段有一定近缘(77％同一性)。根萤叶甲属domino(SEQ ID NO:91)与碗豆蚜(Acyrthosiphon pisum)的序列片段(登录号XM_008181422.1)有一定近缘(76％同一性)。
利用根萤叶甲属含有SNF2基因的候选染色质重塑基因的全长序列或部分克隆产生PCR扩增子用于dsRNA合成。还从一个包含黄色荧光蛋白(YFP)编码区(SEQ ID NO:10；Shagin et al.(2004)Mol.Biol.Evol.21:841-850)的DNA克隆中扩增了dsRNA。
实施例3：来自根萤叶甲属的靶基因的扩增
设计引物来通过PCR扩增每个靶基因的编码区部分。参见表2。在适当的情况下，将T7噬菌体启动子元件(TAATACGACTCACTATAGGG；SEQ ID NO:12)引入扩增的有义或反义链的5'端。参见表2。从WCR提取总DNA，并使用相反向的引物，使用第一链cDNA作为模板进行PCR反应，引物的位置可扩增天然靶基因序列的全部或部分。
表2.用于扩增示例性含有SNF2靶基因的染色质重塑物和YFP靶基因的编码区部分的引物和引物对
实施例4：RNAi构建体
通过PCR制备模板和dsRNA合成
用于为含有SNF2靶基因的染色质重塑物dsRNA产生提供特定模板的策略如图1A和图1B所示。分别通过使用引物对1和引物对2(表2)和(作为PCR模板的)由总RNA制备的第一链cDNA，通过PCR制备了准备用于dsRNA合成的模板DNA。对于选定的靶基因区域，进行了两个分别的PCR扩增。图1。第一个PCR扩增在扩增出的有义链的5'末端引入T7启动子序列。第二个反应将T7启动子序列纳入反义链的5'末端。然后将目标基因的每个区域的两个PCR扩增片段以大约相等的量混合，并将该混合物用作dsRNA产生的转录模板。图1。
对于YFP阴性对照，进行单次PCR扩增。图1B。PCR扩增在扩增出的有义链和反义链的5'端引入T7启动子序列。然后将目标基因的每个区域的两个PCR扩增片段以大约相等的量混合，并将该混合物用作dsRNA产生的转录模板。图1B。使用引物对10(表2)和YFP编码区的DNA克隆作为模板产生阴性对照YFP编码区的dsRNA(SEQ ID NO:11)。使用引物对11(表2)从pIZT/V5-His表达载体(Invitrogen)扩增了GFP阴性对照。使用高产转录试剂盒(Applied Biosystems Inc.，Foster City，CA)，将为含有SNF2靶基因的染色质重塑物和GFP而扩增的PCR产物用作体外合成dsRNA的模板。使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)或RNAi试剂盒，大体上按制造商的说明书规定纯化合成的dsRNA。使用8000分光光度计(THERMO SCIENTIFIC，Wilmington，DE)或等效手段定量dsRNA制备物，并通过凝胶电泳分析以确定纯度。
实施例5：在根萤叶甲属幼虫中筛选候选靶基因
重复的生物测定表明，在基于饵食的测定中，在实施例2中鉴定的来源于brahma-Var1靶基因序列的合成dsRNA制备物的摄取导致了西方玉米根虫幼虫的死亡和生长抑制。表3和表4。
表3.暴露于单剂量dsRNA 9天后的WCR幼虫的基于饵食的进食生物测定结果。方差分析发现平均％死亡率(Mort.)有一些显著差异。使用Tukey-Kramer检验，各平均值是分离的。
*SEM-均值标准误。括号中的字母指示统计学水平。不连接相同字母的水平是显著差异的(p<0.05)。**TE-Tris HCl(1mM)加EDTA(1mM)缓冲液，pH7.2。
***YFP-黄色荧光蛋白
表4.WCR幼虫在暴露于一定范围剂量的dsRNA 9日后的基于饵食的进食生物测定的结果
以前曾经有人提出，根萤叶甲属某些物种的某些基因可用于RNAi介导的昆虫控制。参见美国专利公开号2007/0124836，其中公开了906个序列，和美国专利7,614,924，其中公开了9,112个序列。然而，许多被建议用于RNAi介导的昆虫控制的基因被确定在控制根萤叶甲属方面是无效的。还确定了，与其他被建议可用于RNAi介导的昆虫控制的基因相比，brahma-Var1提供了对根萤叶甲属的惊人和意想不到的控制。
例如，美国专利7,614,924中提出了膜联蛋白、β血影蛋白2和mtRP-L4，以在RNAi介导的昆虫控制中有效。SEQ ID NO:21是膜联蛋白区域1的DNA序列，SEQ ID NO:22是膜联蛋白区域2的DNA序列。SEQ ID NO:23是β血影蛋白2区域1的DNA序列，SEQ ID NO:24是β血影蛋白2区域2的DNA序列，SEQ ID NO:25是mtRP-L4区域1的DNA序列，SEQ ID NO:26是mtRP-L4区域2的DNA序列。
通过实施例4(图1)的双引物对方法，将上述每个序列用于产生dsRNA，并且将这些dsRNA分别通过上述基于饵食的生物测定法加以测试。YFP序列(SEQ ID NO:11)也用于产生dsRNA作为阴性对照。表5列出了用于产生膜联蛋白、β血影蛋白2、mtRP-L4和YFP dsRNA分子的引物序列。表6显示了暴露于这些dsRNA分子9天后WCR幼虫基于饵食的进食生物测定的结果。重复的生物测定表明摄入这些dsRNA导致西方玉米根虫幼虫的死亡或生长抑制高于TE缓冲液、YFP dsRNA或水等对照样品所见。
表5.用于扩增基因的编码区的部分的引物和引物对
表6.西方玉米根虫幼虫获得的饵食进食测定的结果
实施例6：用于根萤叶甲属成虫进食测定的样品制备和生物测定法
通过将对应于含有SNF2靶基因的染色质重塑物区段的dsRNA加入到妊娠成年雌性中，进行西方玉米根虫的亲本RNA干扰(RNAi)。成虫根虫(羽化后<48小时)获自CROPCHARACTERISTICS，Inc.(Farmington，MN)。成虫饲养在23±1℃，相对湿度>75％，所有生物测定的光:暗周期为8小时：16小时。昆虫饲养饵食借鉴自Branson和Jackson(1988),J.Kansas Entomol.Soc.61:353-35)。向包含2.9％琼脂和5.6mL甘油的双蒸水的溶液中加入干成分(48gm/100mL)。此外，每100mL饵食中加入0.5mL含有47％丙酸和6％磷酸溶液的混合物以抑制微生物生长。将琼脂溶于沸水中，加入干成分、甘油和丙酸/磷酸溶液，充分混合，倒至约2mm的深度。用1号软木凿子从饵食中切下固化的饵食小栓(直径约4mm，高2mm；25.12mm3)。6个雄性和雌性成虫(24至48小时龄)用未经处理的人工饵食维持，并在带排气盖的16孔盘(5.1cm长×3.8cm宽×2.9高)中令它们交配4天。
在第五天，将雄性从容器中取出，并将雌性饲养在用3μL代表不同染色质重塑物的基因特异性SNF2dsRNA(2μg/饵食小栓；约79.6ng/mm3)处理的人工饵食小栓表面上。对照处理由暴露于用相同浓度的GFP dsRNA(SEQ ID NO:53)或相同体积水处理的饵食的妊娠雌性组成。如上所述使用在其5'末端具有T7启动子序列(SEQ ID NO:54和55)的相反引物产生GFP dsRNA。在整个实验中每隔一天提供用dsRNA处理的新鲜人工饵食。在第11天，将雌性转移到产卵笼(7.5cm×5.5cm×5.5cm)(ShowMan箱，Althor Products，Wilton，CT)中，笼中有60目筛子过筛的高压灭菌的粉质粘土壤土(Jackson(1986)Rearing和handling ofDiabrotica virgifera and Diabrotica undecimpunctata howardi.收录于L.Krysan和T.A.Miller,eds.Methods for the study of pest Diabrotica.Springer-Verlag,NewYork，第25-47页)。允许雌性产卵4天，卵在产卵箱内土壤中27℃孵化10天，然后通过用60目筛网清洗产卵土壤将卵取出。用甲醛(500μL甲醛在5mL双蒸水中)和甲基-(丁氨基甲酰)-2-苯并咪唑氨基甲酸酯(0.025g在50mL双蒸水中)的溶液处理卵以防止真菌生长。从产卵箱中取出的雌性和每次处理的卵的子样品(subsamples)在液氮中快速冷冻，用于后续通过定量RT-PCR进行表达分析(见实施例7)。用Dino-Lite Pro数字显微镜(Torrance，CA)拍摄各皿，并使用Image J软件的细胞计数器功能计数总卵数(Schneider等(2012)Nat.Methods 9：671-5)。将收获的卵保持在培养皿中28℃的湿滤纸上，并监测15天以确定卵活力。分别在不同的日子运行六个重复，每个包含三到六个雌性。每天记录每次处理的幼虫孵化次数，直至不再观察到孵化。
WCR雌性成虫摄取brahma Reg-352dsRNA分子证明对卵活力有惊人的、剧烈的、可重复的影响。暴露于brahma dsRNA的经交配的雌性所产的卵数低于暴露于未处理的饵食或用GFP dsRNA处理的饵食的雌性产的卵数。表7。然而，从暴露于brahma dsRNA的雌性中收集的卵是无存活力的。表7。从暴露于brahma dsRNA的雌性成虫收集的卵没有孵化。证明WCR雌性成虫摄取brahma Reg-352dsRNA分子对卵的产生和存活力都有剧烈的、可重复的影响。
表7.在摄入经处理的人工饵食11天后，brahma dsRNA对WCR产卵和卵活力的影响。使用Dunnett检验，各平均值是分离的。
±SEM-均值标准误
**表示p值<0.05的显著性
证明WCR雌性成虫摄食mi-2(SEQ ID NO:101)、iswi-30(SEQ ID NO:102)和iswi-2(SEQ ID NO:103)dsRNA分子后，对卵的存活力产生了惊人的、剧烈的且可重现的影响。与暴露于未处理的饵食或用GFP dsRNA处理的饵食的经交配的雌性相比，暴露于iswi-30和mi-2的经交配的雌性产生的卵数量较少。表8和表9。然而，从暴露于mi-2、iswi-30和iswi-2dsRNA的雌性收集的卵没有存活力。表8和表9。所有暴露于mi 2dsRNA的雌性成虫没有卵孵化。
表8.来自靶基因序列的dsRNA和对照在人工饵食摄入11天后对WCR产卵和卵活力的影响。使用Dunnett检验，均值是分离的。
**表示p值<0.05的显著性
SEM–均值标准误
表9.来自靶基因序列的iswi-30dsRNA(7个重复)和mi-2dsRNA(6个重复)和对照在人工饵食摄入11天后对WCR产卵和卵活力的影响。对GFP和水对照完成了总共7个重复(由35只雌性组成)。使用Dunnett检验，均值是分离的。
**表示p值≤0.05的显著性
SEM–均值标准误
解剖未孵化的卵，以检查胚胎发育并确定亲代RNAi(pRNAi)的表型反应。用GFPdsRNA处理的WCR雌性产的卵显示正常发育。图5A。相比之下，用brahma Reg-352、mi-2和iswi-30dsRNA处理的雌性产的卵在卵内显示出没有胚胎发育，而且当被解剖时，没有幼虫发育的迹象。图5B。因此，本发明的一个意想不到且令人惊奇的发现是，摄入的brahma、mi-2和iswi-30dsRNA对WCR卵和幼虫具有致死或生长抑制作用。进一步令人惊讶和意想不到的是，妊娠WCR雌性成虫摄取brahma、mi-2和iswi-30dsRNA显著地影响了卵生产和卵活力，而对雌性成虫本身没有可觉察的影响。
Brahma及其直向同源物，以及mi-2和其他染色质重塑物及其直向同源物，具有相同的功能域和序列水平上的保守性。在下述结构域内设计了RNAi靶位点：保守的SNF2家族N末端和解旋酶C末端结构域(这里称为SNF2解旋酶)，它们是所有染色质重组物共有的；以及每个家族内保守的染色质结合域和其他功能结构域(包括布罗莫结构域，克罗莫结构域和HAND-SLIDE结构域)。设计了玉米根萤叶甲、英雄美洲蝽、赤拟谷盗、和黑腹果蝇的常见RNAi靶序列。DNA核苷酸和RNAi核苷酸根据标准IUPAC代码列出：
A＝腺嘌呤
C＝胞嘧啶
G＝鸟嘌呤
T＝胸腺嘧啶
R＝A或G
Y＝C或T
S＝G或C
W＝A或T
K＝G或T
M＝A或C
B＝C或G或T
D＝A或G或T
H＝A或C或T
V＝A或C或G
N＝A或C或G或T
通过使用Vector NTI Align X(Invitrogen，Grand Island，NY)比对分别来自玉米根萤叶甲、英雄美洲蝽、赤拟谷盗和黑腹果蝇等四个物种的靶蛋白的氨基酸序列，设计了靶向SNF2解旋酶区(SEQ ID NO:93-96)和染色质重塑结构域(SEQ ID NO:97-101)的dsRNA编码序列。选择了氨基酸序列的高度同源区，它们包含SNF2结构域内的至少8个氨基酸的序列或者对每个靶蛋白而言为特异性的染色质重塑区。然后使用Align X程序对来自每个靶的每个物种的相应核苷酸序列进行比对。如果在四种物种之间存在错误对齐(misalignment)，则用如上所示的核苷酸替代核苷酸。最后，将该序列与来自欧洲蜜蜂(Apis melifera)的核苷酸序列进行比对，以确定该序列是否也将靶定该物种。如果序列也可以靶向来自欧洲蜜蜂的蛋白质，则选择新的区域或将序列缩短至至少21个碱基，后者未靶向欧洲蜜蜂蛋白。
实验证明，WCR雌性成虫摄取编码靶向SNF2解旋酶区域(SEQ ID NO:93-96)和染色质重塑结构域(SEQ ID NO:97-101)的序列的dsRNA分子，对蛋卵产生了惊人的、显著的、和可重现的影响。暴露于dsRNA的经交配的雌性所产的卵数少于暴露于未处理的饵食或用GFPdsRNA处理的饵食的雌性。
上述结果清楚地记录了西方玉米根虫幼虫和成虫中RNAi的全身性质，以及实现亲代效应的潜力，在该亲代效应中，在暴露于dsRNA的雌性的卵中，与合子和/或胚胎发育相关的基因被敲低。重要的是，这是西方玉米根虫中摄入dsRNA的pRNAi应答的首例报道。根据在消化道(dsRNA的暴露和摄取正在此处发生)以外的组织中的观察到敲低现象，提示应答是全身性的。由于一般而言昆虫——具体说是根虫——缺乏与植物和线虫中的全身性反应相关的RNA依赖性RNA聚合酶，我们的结果证实dsRNA可以被肠组织吸收并转运到其他组织(例如，发育中的卵巢管)。
敲除涉及胚胎发育的基因的表达而使得卵不孵化的能力，为实现和改善西方玉米根虫的控制提供了独特的机会。因为成虫容易取食地上生殖组织(如玉米丝和玉米缨)，根虫成虫可以通过dsRNA的转基因表达暴露于iRNA控制剂，以通过防止卵孵化而在下一代获得根保护。通过在玉米植物中通过dsRNA的转基因表达或通过与表面施加的iRNA的接触来递送dsRNA，为直接靶向幼虫并提高害虫管理策略的总体耐久性的其他转基因方法提供了重要的堆叠伙伴。
实施例7：实时PCR分析
使用RNeasy mini Kit(Qiagen，Valencia，CA)，根据制造商的建议，从成年雌性、雄性、和卵的全体分离总RNA。在转录反应开始之前，使用Quantitech逆转录试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)用DNA酶处理总RNA，以去除任何gDNA。总RNA(500ng)用于合成第一链cDNA作为实时定量PCR(qPCR)模板。通过分光光度法在260nm定量RNA，并通过琼脂糖凝胶电泳评估纯度。用于qPCR分析的引物使用Beacon设计软件(Premier BiosoftInternational，Palo Alto，CA)设计。使用5倍连续稀释度(1：1/5：1/25：1/125：1/625)一式三份地评价引物对的效率。对于本研究中使用的所有qPCR引物对，扩增效率均高于96.1％。本研究中使用的所有引物组合显示cDNA模板量与PCR产物量之间呈线性相关。所有相关系数均大于0.99。用7500Fast System SDS v2.0.6软件(Applied Biosystems)确定斜率、相关系数和效能。使用三个生物复制，每个具有两个技术重复，用于qPCR分析。使用SYBRgreen试剂盒(Applied Biosystems Inc.，Foster City，CA)和7500Fast System实时PCR检测***(Applied Biosystems Inc.，Foster City，CA)进行qPCR。qPCR循环参数包括40个循环，每个循环由95℃3秒、58℃30秒组成，如制造商的方案(Applied Biosystems Inc.，Foster City，CA)所述。在每个PCR反应结束时，产生熔融曲线以确认单峰，并排除引物二聚体和非特异性产物形成的可能性。使用比较2-ΔΔCT方法计算转录物的相对定量，并将其对β-肌动卵白归一化。
图6A显示从暴露于经处理的人工饵食的雌性收集的卵中brahma相对于GFP和水对照的相对表达。图6B显示了暴露于经处理的人工饵食的雌性成虫中brahma相对于GFP和水对照的相对表达。在雌性成虫和卵中有转录本水平的降低。图6C显示了显示了暴露于经处理的人工饵食的雌性成虫中mi-2相对于GFP和水对照的相对表达。在雌性成虫和卵中有转录本水平的降低。图6D.暴露于经处理的人工饵食的雌性成虫中iswi-30相对于GFP和水对照的相对表达。
实施例8：植物转化载体的构建
使用化学合成片段的组合(DNA2.0，Menlo Park，CA)和标准分子克隆方法组装入门载体，入门载体包含用于dsRNA发夹形成的靶基因构建体，其包含brahma-c4465rc(SEQID NO:1)、brahma-8089(SEQ ID NO:3)、brahma-525(SEQ ID NO:5),Contig[0001]_brahma_949-1126(SEQ ID NO:7),mi-2(SEQ ID NO:79),iswi-1(SEQ ID NO:81),chd1(SEQID NO:83),iswi-2(SEQ ID NO:85),iswi30(SEQ ID NO:87),ino80(SEQ ID NO:89),domino(SEQ ID NO:91),mi-2(SEQ ID NO:164),iswi-1(SEQ ID NO:165)，和/或iswi-2(SEQ ID NO:166)的区段。通过在彼此相反取向的两个拷贝的靶基因片段(在单个转录单位内)布置两个片段，两个区段由ST-LS1内含子序列(SEQ ID NO:56；Vancanneyt等人(1990)Mol.Gen.Genet.220：245-250))分隔，帮助RNA初级转录物的分子内发夹形成。因此，初级mRNA转录物包含两个brahma基因区段序列，二者彼此是对方的大反向重复，由内含子序列分开。一个拷贝的玉米泛素1启动子(美国专利5,510,474)用于驱动初级mRNA发夹转录物的产生，并利用包含来自玉米过氧化物酶5基因(ZmPer5 3'UTR v2；美国专利6,699,984)的3'非翻译区的片段来终止发夹RNA表达基因的转录。
一种入门载体包括brahma v1发夹RNA构建体(SEQ ID NO:57)，其包含brahma-8089(SEQ ID NO:3)和brahma-525(SEQ ID NO:5)的区段。
一种入门载体包含brahma v2发夹RNA构建体(SEQ ID NO:58)，其包含不同于上述者的brahma-c4465rc(SEQ ID NO:1)和brahma-8089(SEQ ID NO:3)的区段。
将如上所述的入门载体与典型的二元目的载体一起进行标准重组反应，产生brahma发夹RNA表达转化载体，以供用于土壤杆菌介导的玉米胚转化。
阴性对照二元载体包含表达YFP发夹dsRNA的基因，它是用典型的二元目的载体和入门载体通过标准的重组反应构建的。入门载体包含在玉米泛素1启动子(如上)的表达控制下的YFP发夹序列(SEQ ID NO:138)和包含来自玉米过氧化物酶5基因的3'非翻译区的片段(如上所述)。
二元目的载体包含在甘蔗杆菌病毒(ScBV)启动子(Schenk et al.(1999)PlantMolec.Biol.39:1221-30)调控下的除草剂耐受性基因(芳氧基链烷酸酯双加氧酶；(AAD-1v3，美国专利7,838,733和Wright等人(2010)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 107：20240-5))。在SCBV启动子区段的3'端和AAD-1编码区的起始密码子之间有一合成的5'UTR序列，其由来自玉米条纹病毒(MSV)外壳蛋白基因5'UTR和来自玉米醇脱氢酶1(ADH1)基因的内含子6组成。包含来自玉米脂肪酶基因(ZmLip 3'UTR；美国专利7,179,902)的3'非翻译区的片段用于终止AAD-1mRNA的转录。
另一个阴性对照二元载体，其包含表达YFP蛋白的基因，是通过与典型的二元目的载体和入门载体的标准重组反应构建的。所述二元目的载体包含在玉米泛素1启动子(如上)的表达调节下的除草剂耐受性基因(芳氧基亚乙酰双加氧酶；AAD-1v3)(如上所述)和包含来自玉米脂肪酶基因的3'非翻译区的片段(ZmLip 3'UTR；如上)。入门载体包含玉米泛素1启动子(如上)的表达控制下的YFP编码区和包含来自玉米过氧化物酶5基因的3'非翻译区的片段(如上所述)。
SEQ ID NO:57显示了一种brahma v1发夹形成序列。
SEQ ID NO:58显示了一种brahma v2发夹形成序列。
实施例9：包含杀虫dsRNA的转基因玉米组织
土壤杆菌介导的转化.在土壤杆菌介导的转化之后，制成了通过表达稳定地整合到植物基因组中的嵌合基因而产生一种或多种杀虫dsRNA分子(例如，至少一种dsRNA分子，其包含靶向包含brahma-c4465rc(SEQ ID NO:1),brahma-8089(SEQ ID NO:3),brahma-525(SEQ ID NO:5),Contig[0001]_brahma_949-1126(SEQ ID NO:7),mi-2(SEQ ID NO:79andSEQ ID NO:164),iswi-1(SEQ ID NO:81and SEQ ID NO:165),chd1(SEQ ID NO:83),iswi-2(SEQ ID NO:85and SEQ ID NO:166),iswi30(SEQ ID NO:87),ino80(SEQ ID NO:89)、和/或domino(SEQ ID NO:91)的转基因玉米细胞、组织、和植物。采用超二元或二元转化载体的玉米转化方法是本领域中已知的，正如例如美国专利号8,304,604中(在此通过提述并入其全部内容)所描述。通过转化的组织在含吡氟氯禾灵的培养基上生长的能力选择它们，并视情况适宜筛选其dsRNA产生。可以将一部分这样的转化的组织培养物提供给新生玉米根虫幼虫以进行生物测定，基本上如实施例1中所描述。
土壤杆菌培养启动.将包含上述(实施例7)的二元转化载体的土壤杆菌菌株DAt13192细胞(WO 2012/016222A2)的甘油储划线接种在含有适当抗生素的AB基本培养基平板(Watson等人，(1975)J.Bacteriol.123:255-264)上，并在20℃培养3天。然后将培养物划线接种在含有相同抗生素的YEP平板(g/L:酵母提取物10；蛋白胨10；NaCl 5)上，并在20℃温育1天。
土壤杆菌培养.在实验当天，以适合于实验中的构建体数目的体积制备接种培养基和乙酰丁香酮的储液，并将其移液到无菌的一次性250mL烧瓶中。接种培养基(Frame等人，(2011)Genetic Transformation Using Maize Immature Zygotic Embryos.收录于Plant Embryo Culture Methods和Protocols: Methods in Molecular Biology.T.A.Thorpe和E.C.Yeung,(Eds),Springer Science和Business Media,LLC.pp327-341)含有：2.2gm/L MS盐；1X ISU改良的MS维生素(Frame等人，(2011))；68.4gm/L蔗糖；36gm/L葡萄糖；115mg/L脯氨酸；和100mg/L肌醇；pH为5.4)。将乙酰丁香酮以200μM的终浓度(从100％二甲亚砜中的1M储液)添加到含有接种培养基的烧瓶中，并充分混合溶液。
对于每种构建体，来自YEP平板的1或2个满接种环的土壤杆菌悬浮在一次性50mL无菌离心管内15mL的接种培养基/乙酰丁香酮储液中，在分光光度计中在550nm(OD550)处测量溶液的光密度。然后使用另外的接种培养基/乙酰丁香酮混合物将悬液稀释到0.3到0.4的OD550。然后将土壤杆菌悬液的管水平放置在设置为在室温下约75rpm的平台摇床上，并在进行胚切开的同时振摇1到4小时。
玉米棒消毒和胚分离.未成熟玉米胚从玉米近交系B104(Hallauer等人，(1997)Crop Science 37:1405-1406)植物获得，所述植物在温室中培养，并进行自花授粉或近亲授粉以产生玉米棒。在授粉后大约10到12天收获玉米棒。在实验当天，将玉米棒脱壳，并通过浸没在20％市售漂白剂(ULTRAGERMICIDAL BLEACH，6.15％次氯酸钠；加两滴吐温TM 20)的溶液中并振摇20到30分钟进行表面消毒，随后在层流罩内在无菌去离子水中冲洗三次。从每个玉米棒无菌切下未成熟合子胚(1.8到2.2mm长)并随机分配到微量离心管中，每根微量离心管含有2.0mL的液体接种培养基中的适当土壤杆菌细胞的悬液，其中含200μM乙酰丁香酮，并添加了2μL的10％S233表面活性剂(EVONIKINDUSTRIES；Essen,Germany)。对于一套给定的实验，每次转化均使用来自汇集的玉米棒的胚。
土壤杆菌共培养.在分离之后，将胚在摇动平台上放置5分钟。然后将管的内容物倾倒到共培养基的平板上，所述培养基含有4.33gm/L MS盐；1X ISU改良的MS维生素；30gm/L蔗糖；700mg/L L-脯氨酸；在KOH中的3.3mg/L的麦草畏(3,6-二氯-o-茴香酸或3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸)；100mg/L肌醇(myo-inositol)；100mg/L酪蛋白酶水解物；15mg/L AgNO3；200μM溶于DMSO中的乙酰丁香酮；和3gm/L GELZANTM，pH为5.8。用无菌一次性移液管移除液态土壤杆菌悬液。然后借助于显微镜，使用无菌镊子使胚定向为盾片面向朝上。盖上平板，用医用胶带密封，并放置在具有大约60μmol m-2s-1的光合有效辐射(PAR)的连续光照的25℃培养箱中。
愈伤组织选择和转基因事件的再生.在共培养期之后，将胚转移到静息培养基上，静息培养基的组成为：4.33gm/L MS盐；1X ISU改良的MS维生素；30gm/L蔗糖；700mg/L L-脯氨酸；溶于KOH中的3.3mg/L的麦草畏；100mg/L肌醇；100mg/L酪蛋白酶水解物；15mg/LAgNO3；0.5g/L MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸一水合物；PHYTOTECHNOLOGIES LABR.；Lenexa,KS)；250mg/L羧苄青霉素；和2.3gm/L GELZANTM；pH为5.8。将不超过36个胚移到每个平板上。将平板放置在透明的塑料盒中，在27℃下在大约50μmol m-2s-1PAR的连续光照下温育7到10天。然后将愈伤的胚转移(<18个/板)到选择培养基I上，所述培养基由具有100nM吡氟氯禾灵酸(R-Haloxyfop acid)(0.0362mg/L；用于选择包含AAD-1基因的愈伤组织)的静息培养基(上文)构成。将平板返回到透明盒中，在27℃下在大约50μmol m-2s-1PAR的连续光照下温育7天。然后将愈伤的胚转移(<12个/板)到选择培养基II上，所述培养基由具有500nM吡氟氯禾灵酸(0.181mg/L)的静息培养基组成。将平板返回到透明盒中，在27℃下在大约50μmolm-2s-1PAR的连续光照下温育14天。这一选择步骤允许转基因愈伤组织进一步增殖和分化。
将增殖中的胚性愈伤组织转移到(<9个/板)预再生培养基上。预再生培养基含有4.33g/L MS盐；1X ISU改良的MS维生素；45gm/L蔗糖；350mg/L L-脯氨酸；100mg/L肌醇；50mg/L酪蛋白酶水解物；1.0mg/L AgNO3；0.25gm/L MES；溶于NaOH中的0.5mg/L萘乙酸；溶于乙醇中的2.5mg/L脱落酸；1mg/L 6-苄氨基嘌呤；250mg/L羧苄青霉素；2.5gm/L GELZANTM；和0.181mg/L吡氟氯禾灵酸；pH为5.8。将平板保存在透明盒中，在27℃下在大约50μmol m- 2s-1PAR的连续光照下温育7天。然后将再生中的愈伤组织转移到(<6个/板)PHYTATRAYSTM(SIGMA-ALDRICH)中的再生培养基上，在28℃以每天16小时光照/8小时黑暗(以大约160μmol m-2s-1PAR)温育14天，直到发出芽和根为止。再生培养基含有4.33gm/L MS盐；1X ISU改良的MS维生素；60gm/L蔗糖；100mg/L肌醇；125mg/L羧苄青霉素；3gm/L GELLANTM胶；和0.181mg/L吡氟氯禾灵酸；pH为5.8。然后分离具有主根的小芽，并不经选择直接转移到伸长培养基上。伸长培养基含有4.33gm/L MS盐；1X ISU改良的MS维生素；30gm/L蔗糖；和3.5gm/LpH为5.8。
通过它们在含有吡氟氯禾灵的培养基上生长的能力而选择出转化植物芽，将所述芽从PHYTATRAYSTM移栽到填充有生长培养基(PROMIX BX；PREMIER TECH HORTICULTURE)的小盆中，小盆用杯子或HUMI-DOMES(ARCO PLASTICS)覆盖，然后在生长室中炼苗(27℃昼/24℃夜，16小时光周期，50-70％RH，200μmol m-2s-1PAR)。在一些情况下，分析推定的转基因小植物的转基因相对拷贝数，这使用设计用于检测整合到玉米基因组中的AAD1除草剂耐受基因的引物通过定量实时PCR测定来完成。此外，利用RNA qPCR测定来检测在推定的转化体表达的dsRNA中接头序列的存在。然后将选定的转化小植物移动到温室中，以便进一步生长和测试。
转移T0植物和在温室中定植以进行生物测定和产生种子.当植物达到V3-V4期时，将其移栽到IE CUSTOM BLEND(PROFILE/METRO MIX 160)土壤混合物中，在温室中(光曝露类型：光或同化作用；高光限值：1200PAR；16-小时昼长；27℃昼/24℃夜)培植至开花。
将要用于昆虫生物测定的植物从小盆移栽到TINUSTM350-4(SPENCER-LEMAIRE INDUSTRIES,Acheson,Alberta,Canada)(每每事件一个植物)。在移栽到约四天后，将植物用于生物测定。
通过对T0转基因植物的穗丝授粉，其中花粉从非转基因良种近交系B104或其他适当的花粉供体采集而来，并种植所得的种子而获得T1代植物。在可能时进行互交。
实施例10：成体根萤叶甲属植物进食生物测定
将表达用于亲代RNAi靶标和GFP对照的dsRNA的转基因玉米叶(V3-4)冻干，并用研钵和杵研磨成细粉，并过600μM筛，以便在将其掺入人工饵食之前达到均匀的粒度。人工饵食与之前用于亲代RNAi实验的饵食是相同的，只是水量加倍(20mL ddH2O，0.40g琼脂，6.0g饵食预混物，700μL甘油，27.5μL霉菌抑制剂)。在固化之前，以40mg/ml饵食的速率将冻干的玉米叶组织掺入饵食中，并充分混合。然后将饵食倒在塑料培养皿的表面上至约4mm的深度并使其固化。从饵食中切下饵食小栓，并用与前面描述的亲代RNAi实验相同的方法利用这些小栓暴露西方玉米根虫成虫。
为了进行植物进食测定，令pRNAi T0或T1事件在温室中生长，直到植物产生穗轴、穗和丝。每株植物上总共释放25只新羽化的根虫成虫，并给整株植物加罩，以防止成虫逃逸。释放两周后，从每株植物中回收雌性成虫，并维持在实验室内以收集卵。根据亲代RNAi靶标和预期表型，记录每个雌虫的卵数、卵孵化率和幼虫死亡率等参数，并与对照植物进行比较。
实施例11：转基因玉米的根萤叶甲属幼虫进食生物测定
昆虫生物测定.通过生物测定方法来证实在植物细胞中产生的本主题发明的dsRNA的生物活性。人们能够例如通过在受控的饲喂环境下给靶昆虫喂食来源于产生杀虫dsRNA的植物的各种植物组织或组织片来证实效力。或者，从来源于产生杀虫dsRNA的植物的各种植物组织制备提取物，并将提取的核酸分配在用于如以前在本文中描述的生物测定的人工饵食上面。将这样的饲喂测定的结果与类似方式进行的采用来自不产生杀虫dsRNA的宿主植物的适当对照组织、或其他对照样品的生物测定进行比较。
关于转基因玉米事件的昆虫生物测定.选择从经洗涤的卵孵化的两条西方玉米根虫幼虫(1到3日龄)并将其置于生物测定托盘的每个孔中。然后将这些孔用“拉-揭”(PULLN’PEEL)护盖(BIO-CV-16,BIO-SERV)覆盖，并置于具有18小时/6小时光照/黑暗周期的28℃培养箱中。在初始侵染9日之后，评估幼虫死亡率，其按照死亡昆虫占的每次处理中昆虫总数的百分比来计算。将昆虫样品在-20℃冷冻两天，然后汇集来自每个处理的昆虫幼虫并称重。生长抑制百分比按照实验处理的平均重量除以两个对照孔处理的平均重量的均值来计算。数据表示为(阴性对照的)生长抑制百分比。将超过对照平均重量的平均重量归一化为零。
温室中的昆虫生物测定.从CROP CHARACTERISTICS(Farmington,MN)收到带有西方玉米根虫(WCR，玉米根萤叶甲)卵的土壤。在28℃温育WCR卵10到11天。洗掉卵上的土壤，将卵置于0.15％琼脂溶液中，浓度调节至每0.25mL等份大约75个到100个卵。将一份卵悬浮液加入培养皿中以设置孵化平板，用于监测孵化速率。
用150到200个WCR卵侵染中生长的玉米植物周围的土壤。允许昆虫摄食2周，在这段时间之后，对每个植物给出“根评级”。利用一个节损伤量表进行分级，大体上如Oleson等人，(2005,J.Econ.Entomol.98:1-8)所述。将通过了这个生物测定的植物移栽到5加仑的盆中供产生种子。用杀虫剂处理移植物以防止进一步根虫损害和昆虫释放到温室中。将植物人工授粉以产生种子。保存由这些植物产生的种子以评估植物的T1和后续世代。
温室生物测定包括两种阴性对照植物。转基因阴性对照植物通过用包含设计为产生黄色荧光蛋白(YFP)的基因或YFP发夹dsRNA的载体转化而生成(参见实施例4)。非转化的阴性对照植物从品系B104的种子培植而来。在两个不同的日期进行生物测定，其中每一组植物材料中均包括阴性对照。
实施例12：转基因玉米组织的分子分析
对来自叶和根的样品进行玉米组织的分子分析(例如RNA qPCR)，所述样品在评估根进食损伤的同一天从温室生长的植物收集。
用于Per5 3'UTR的RNA qPCR测定的结果用于验证发夹转基因的表达。(预期在非转化的玉米植物中会检测到低水平的Per5 3'UTR，因为内源性Per5基因通常在玉米组织中表达)。针对重复序列之间的***序列(其对于形成dsRNA发夹分子是不可缺的)的RNA qPCR测定结果用于验证发夹转录物的存在。测量转基因RNA相对于内源玉米基因的RNA水平的表达水平。
通过DNA qPCR分析检测gDNA中AAD1编码区的一部分，用来估计转基因***拷贝数。用于这些分析的样品是从在环境室中生长的植物中收集的。将结果与设计用于检测单拷贝天然基因的一部分的测定的DNA qPCR结果进行比较，并且将简单事件(具有一个或两个拷贝的转基因)推进用于在温室中进一步研究。
另外，设计用于检测一部分壮观霉素抗性基因(SpecR，位于T-DNA外的二元载体质粒上)的qPCR测定法，用于确定转基因植物是否含有外来整合的质粒骨架序列。
发夹RNA转录物表达水平：Per5 3'UTR qPCR.通过实时定量PCR(qPCR)分析愈伤组织细胞事件或转基因植物的Per 5 3'UTR序列，以确定全长发夹转录物与内部玉米基因(例如，GENBANK登录号BT069734)的转录水平相比的相对表达水平，所述内部玉米基因编码TIP41样蛋白(即GENBANK登录号AT4G34270的玉米同系物；具有74％同一性的tBLASTX得分)。使用RNAEASYTM96试剂盒(QIAGEN，Valencia，CA)分离RNA。洗脱后，根据试剂盒的建议方案对总RNA进行DNase1处理。然后在8000分光光度计(THERMOSCIENTIFIC)上定量RNA，并将浓度归一化至25ng/μL。使用HIGH CAPACITY cDNA SYNTHESISKIT(INVITROGEN)，基本上根据制造商推荐的方案，在具有5μL变性RNA的10μL反应体积中制备第一链cDNA。该方案稍微修改为包括加入10μL的100μM T20VN寡核苷酸(IDT)(TTTTTTTTTTTTTTTTTTTNN，其中V为A，C或G，N为A，C，G或T；SEQ ID NO:59)到1mL随机引物储液预混物管中，以制备混合有随机引物和寡聚dT的工作储液。
cDNA合成后，样品用无核酸酶水1:3稀释，保存在-20℃直至测定。
在10μL反应体积中，在480(ROCHE DIAGNOSTICS，Indianapolis，IN)上各别进行Per5 3'UTR和TIP41样转录物的实时PCR测定。对于Per5 3'UTR测定，使用引物P5U76S(F)(SEQ ID NO:60)和P5U76A(R)(SEQ ID NO:61)和ROCHEUNIVERSAL PROBETM(UPL76；目录号4889960001；用FAM标记)。对于TIP41样参考基因测定，使用用HEX(六氯荧光素)标记的引物TIPmxF(SEQ ID NO:62)和TIPmxR(SEQ ID NO:63)和探针HXTIP(SEQ ID NO:64)。
所有测定包括无模板的阴性对照(仅预混物)。对于标准曲线，来源板中还包括一个空白(来源孔中的水)，以检查样品交叉污染。引物和探针序列列于表10中。表11中公开了检测各种转录物的反应组分配方，PCR反应条件总结在表12中。在465nm激发FAM(6-羧基荧光素亚磷酰胺)的荧光部分，在510nm测量荧光；HEX(六氯荧光素)荧光部分的相应值为533nm和580nm。
表10.用于转基因玉米转录水平分子分析的寡核苷酸序列。
*TIP41样蛋白
**NAv序列无法从供应商获得
表11.用于转录物检测的PCR反应配方
表12.RNA qPCR的热循环仪条件
使用软件v1.5，通过使用二阶导数最大算法进行相对量化来分析数据，以根据供应商的建议计算Cq值。对于表达分析，使用ΔΔCt方法(即2-(Cq靶-Cq参比))计算表达值，其依赖于两个目标之间的Cq值的差异的比较，基于对于优化的PCR反应，每个周期产物加倍这一假设，选择基础值为2。
发夹转录物大小和完整性：Northern印迹测定。在某些情况下，通过使用Northern印迹(RNA印迹)分析来确定转基因植物表达brahma发夹dsRNA的brahma发夹RNA的分子大小，可获得对转基因植物的更多分子表征。
所有材料和设备在使用前用RNaseZAP(AMBION/INVITROGEN)进行处理。将组织样品(100mg至500mg)收集在2mL SAFELOCK EPPENDORF管中，利用KLECKOTM组织粉碎机(GARCIAMANUFACTURING，Visalia，CA)，在1mL TRIZOL(INVITROGEN)中用三个钨珠破碎5分钟，然后在室温(RT)下温育10分钟。任选地，将样品在4℃以11,000rpm离心10分钟，并将上清液转移到新的2mL SAFELOCK EPPENDORF管中。将200μL氯仿加入到匀浆中，通过颠倒混合2至5分钟，在室温下温育10分钟，并在4℃下以12,000xg离心15分钟。将顶层转移到无菌的1.5mLEPPENDORF管中，加入600μL的100％异丙醇，然后在室温下温育10分钟至2小时，然后在4℃至25℃下以12,000xg离心10分钟。弃去上清液，将RNA沉淀用1mL 70％乙醇洗涤两次，各次洗涤之间在4℃至25℃以7,500×g离心10分钟。弃去乙醇，将沉淀短暂空气干燥3至5分钟，然后重新悬浮于50μL无核酸酶的水中。
使用(THERMO-FISHER)定量总RNA，样品标准化至5μg/10μL。然后将10μL乙二醛(AMBION/INVITROGEN)加入到每个样品中。将5至14ng的DIG RNA标准预混物(ROCHE APPLIED SCIENCE，Indianapolis，IN)分配并加入到等体积的乙二醛中。将样品和标记RNA在50℃变性45分钟并储存在冰上，直到加载到NORTHERNMAX 10X乙二醛运行缓冲液(AMBION/INVITROGEN)中的1.25％SEAKEM GOLD琼脂糖(LONZA，Allendale，NJ)凝胶上。RNA通过65伏特/30mA的电泳分离2小时15分钟。
电泳后，将凝胶在2×SSC中漂洗5分钟，并在GEL DOC工作站(BIORAD，Hercules，CA)上成像，然后将RNA在室温下过夜被动地转移到尼龙膜(MILLIPORE)，使用10X SSC作为转移缓冲液(20X SSC由3M氯化钠和300mM柠檬酸三钠组成，pH7.0)。转移后，将膜在2×SSC中漂洗5分钟，将RNA与膜(AGILENT/STRATAGENE)UV交联，并将膜在室温下干燥最多2天。
将膜在ULTRAHYB缓冲液(AMBION/INVITROGEN)中预杂交1至2小时。探针由通过ROCHE APPLIED SCIENCE DIG程序用地高辛标记的含有感兴趣序列(例如，视情况，SEQ IDNO:57或SEQ ID NO:58的反义序列部分)的PCR扩增产物组成。在杂交管中的推荐的缓冲液中在60℃的温度下杂交过夜。杂交后，将印迹进行DIG洗涤，包裹，暴露于胶片1至30分钟，然后通过DIG试剂盒供应商推荐的方法显影该胶片。
转基因拷贝数确定.在96孔收集板(QIAGEN)中收集大约相当于2个叶冲孔块的玉米叶片。使用KLECKOTM组织粉碎机(GARCIA MANUFACTURING，Visalia，CA)在含有一个不锈钢珠的BIOSPRINT96AP1裂解缓冲液(由BIOSPRINT96PLANT KIT；QIAGEN提供)中进行组织破坏。在组织浸渍后，使用BIOSPRINT96PLANT KIT和BIOSPRINT96提取机器人以高通量模式分离gDNA。在设置qPCR反应之前，将gDNA以2:3DNA:水稀释。
qPCR分析.水解探针测定法转基因检测通过使用480***的实时PCR来进行。使用探针设计软件2.0来设计在水解探针测定中要用来检测接头序列(例如ST-LS1；SEQ ID NO:56)或检测SpecR基因的一部分(即，携带于二元载体质粒的壮观霉素抗性基因；SEQ ID NO:65；表13中的SPC1寡核苷酸)的寡核苷酸。此外，使用PRIMER EXPRESS软件(APPLIED BIOSYSTEMS)设计用于检测AAD-1除草剂耐受基因的区段(SEQ ID NO:66；表13中的GAAD1寡核苷酸)的水解探针测定中使用的寡核苷酸。表13显示了引物和探针的序列。测定中加入用于内源性玉米染色体基因(转化酶；GENBANK登录号：U16123；本文称为IVR1)的试剂，其用作内部参考序列以确保每个测定中存在gDNA。为了扩增，在含有0.4μM每种引物和0.2μM每种探针的10μL体积多重反应中，以1x最终浓度制备480探针MASTER预混物(ROCHE APPLIED SCIENCE)(表14)。如表15所示进行两步扩增反应。FAM-和HEX-标记的探针的荧光团活化和发射如上所述；CY5缀合物在650nm处最大激发，并且在670nm处最大地发荧光。
使用拟合点算法(SOFTWARE版本1.5)和相对Quant模块(基于ΔΔCt方法)从实时PCR数据确定Cp得分(荧光信号跨越背景阈值的点)。数据如前所述(上文；RNA qPCR)处理。
表13.用于基因拷贝数确定和二元载体质粒骨架检测的引物和探针(带荧光缀合物)的序列。
CY5＝花青-5
表14.用于基因拷贝数分析和质粒骨架检测的反应组分
组分 量(μL) 储液 终浓度
2x缓冲液 5.0 2x 1x
合适的正向引物 0.4 10μM 0.4
合适的反向引物 0.4 10μM 0.4
合适的探针 0.4 5μM 0.2
IVR1-正向引物 0.4 10μM 0.4
IVR1-反向引物 0.4 10μM 0.4
IVR1-探针 0.4 5μM 0.2
H2O 0.6 NA* NA
gDNA 2.0 ND** ND
总量 10.0
*NA＝不适用
**ND＝未测定
表15.用于qPCR的热循环仪条件
实施例13：包含鞘翅目害虫序列的转基因玉米
如实施例8中所述生成10个到20个转基因T0玉米植物。获得另外的10--20个表达针对RNAi构建体的发夹dsRNA的T1玉米独立品系用于玉米根虫攻击。表达形成发夹dsRNA的多核苷酸的DNA可自SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:79；SEQ ID NO:81；SEQ ID NO:83；SEQ ID NO:85；SEQ ID NO:87；SEQ ID NO:89；SEQ IDNO:91；SEQ ID NO:164；SEQ ID NO:165；SEQ ID NO:166；以及前述者的片段(例如SEQ IDNO:8,SEQ ID NO:10,和SEQ ID NO:101-106)所示的序列衍生。更多的发夹dsRNA衍生自例如鞘翅目害虫序列，例如像Caf1-180(美国专利申请公开号2012/0174258)、VatpaseC(美国专利申请公开号2012/0174259)、Rho1(美国专利申请公开号2012/0174260)、VatpaseH(美国专利申请公开号2012/0198586)、PPI-87B(美国专利申请公开号2013/0091600)、RPA70(美国专利申请公开号2013/0091601)、RPS6(美国专利申请公开号2013/0097730)，Brahma(USSN),和Kruppel(USSN)。这些通过RT-PCR或其他分子分析方法得以证实。来自选定的独立T1系的总RNA制备物任选地用于RT-PCR，其中引物被设计为在每个RNAi构建体中的发夹表达盒的接头中结合。另外，用于RNAi构建体中每个靶基因的特异性引物任选地用于扩增在植物内siRNA产生所需要的预加工mRNA，并用于确认所述预加工mRNA的产生。对于每个靶基因的期望条带的扩增可确认每个转基因玉米植物中发夹RNA的表达。随后任选地利用RNA印迹杂交在独立转基因系中确认靶基因的dsRNA发夹加工成siRNA。
而且，与靶基因具有80％以上序列同一性、具有错配序列的RNAi分子对玉米根虫的影响类似于与靶基因具有100％序列同一性的RNAi分子。错配序列与天然序列的配对在同一个RNAi构建体中形成发夹dsRNA，由此产生出能够影响摄食中的鞘翅目害虫的生长、发育和生存力的植物加工的siRNA。
对应于靶基因的dsRNA、siRNA、或miRNA的植物体内递送以及被鞘翅目害虫进食后的摄取，导致鞘翅目害虫中的靶基因由于RNA介导的基因沉默而下调。当靶基因在发育的一个或多个阶段发挥重要作用的时候，鞘翅目害虫的生长、发育和生殖受到影响，而且在WCR、NCR、SCR、MCR、黄瓜条根萤叶甲、D.u.tenella、和D.u.undecimpunctata Mannerheim的至少一者的情况下，会导致鞘翅目害虫无法成功侵染、进食、发育、和/或生殖，或导致其死亡。然后通过靶基因的选择和RNAi的成功应用来控制鞘翅目害虫。
转基因RNAi品系和非转化玉米的表型比较.选用于创建发夹dsRNA的靶鞘翅目害虫基因或序列与任何已知的植物基因BN序列都没有相似性。因此不期望靶向这些鞘翅目害虫基因或序列的构建体的(全身性)RNAi的产生或活化对转基因植物会有任何有害影响。然而，将转基因系的发育和形态特征与非转化植物、以及用没有发夹表达基因的“空”载体转化的那些转基因系进行比较。比较了植物根、芽、叶和生殖特征。转基因植物和非转化植物在根长和生长模式上没有可观察到的差异。植物地上部特征，诸如高度、叶数和大小、开花时间、花大小和外观之类，是相似的。总的来说，在体外以及在温室土壤中培养时，在转基因系和没有表达靶iRNA分子的那些株系之间没有可观察的形态差异。
实施例14：包含鞘翅目害虫序列和另外的RNAi构建体的转基因玉米
转基因玉米植物在其基因组中包含异源编码多核苷酸，所述异源编码多核苷酸被转录成靶向鞘翅目害虫之外的生物的iRNA分子，对这样的转基因植物通过土壤杆菌或WHISKERSTM方法(参见Petolino和Arnold(2009)Methods Mol.Biol.526:59-67)进行二次转化，以产生一种或多种杀虫dsRNA分子[例如，至少一种dsRNA分子，包括靶向包含SEQ IDNO:1；SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:79；SEQ ID NO:81；SEQ ID NO:83；SEQ ID NO:85；SEQ ID NO:87；SEQ ID NO:89；SEQ ID NO:91；SEQ ID NO:164；SEQ IDNO:165；SEQ ID NO:166；以及前述任一者的片段(例如，SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:10和SEQID NO:101-106))的基因的dsRNA分子]。基本上如实施例7中所述制备植物转化质粒载体，经由土壤杆菌或WHISKERSTM-介导的转化方法递送到获自转基因Hi II或B104玉米植物的玉米悬浮细胞或未成熟玉米胚中，所述玉米植物在其基因组中包含异源编码多核苷酸，所述异源编码多核苷酸被转录成靶向鞘翅目害虫之外的生物的iRNA分子。
实施例15：包含RNAi构建体和另外的鞘翅目害虫控制序列的转基因玉米
转基因玉米植物在其基因组中包含被转录成靶向鞘翅目害虫生物的iRNA分子的异源编码多核苷酸(例如，至少一种dsRNA分子，包括靶向包含SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:79；SEQ ID NO:81；SEQ ID NO:83；SEQ ID NO:85；SEQ ID NO:87；SEQ ID NO:89；SEQ ID NO:91；SEQ ID NO:164；SEQ ID NO:165；SEQ ID NO:166；以及前述任一者的片段(例如，SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:101-106))的基因的dsRNA分子)，对于这样的转基因玉米植物，通过土壤杆菌或WHISKERSTM方法(参见Petolino和Arnold(2009)Methods Mol.Biol.526:59-67)进行二次转化以产生一种或多种杀虫蛋白分子，例如，Cry1B、Cry1I、Cry2A、Cry3、Cry7A、Cry8、Cry9D、Cry14、Cry18、Cry22、Cry23、Cry34、Cry35、Cry36、Cry37、Cry43、Cry55、Cyt1A和Cyt2C杀虫蛋白。基本上如实施例7中所述制备植物转化质粒载体，经由土壤杆菌或WHISKERSTM-介导的转化方法递送到获自转基因B104玉米植物的玉米悬浮细胞或未成熟玉米胚中，所述玉米植物在其基因组中包含被转录成靶向鞘翅目害虫生物的iRNA分子的异源编码多核苷酸。获得产生用于控制鞘翅目害虫的iRNA分子和杀虫蛋白的双重转化植物。
实施例16：pRNAi介导的昆虫保护
可导致卵死亡或卵存活力丧失的亲代RNAi为使用RNAi和其他昆虫保护机制的转基因作物带来更多的耐久性益处。使用基本的双缀块模型(two-patch model)来演示这一用处。
一个缀块含有表达杀虫成分的转基因作物，另一个缀块含有不表达杀虫成分的避难所作物。将卵根据其相对比例产卵在两个模型的缀块中。在这个例子中，转基因缀块占景观的95％，避难所缀块占5％。转基因作物表达对玉米根虫幼虫有活性的杀虫蛋白质。
玉米根虫对杀虫蛋白质的抗性被模拟为单基因，具有两个可能的等位基因：一个等位基因(S)赋予敏感性，另一个等位基因(R)赋予抗性。杀虫蛋白质根据模型推导可导致以其为食的纯合易感(SS)玉米根虫幼虫的死亡率达到97％。假定对抗性等位基因(RR)为纯合的玉米根虫幼虫没有死亡。假定对杀虫蛋白质的抗性是不完全隐性的，因而功能优势(functional dominance)为0.3(以该转基因作物为食的、对该蛋白质的抗性为杂合子(RS)的幼虫的死亡率为67.9％)。
转基因作物还表达了亲代活性dsRNA，这些dsRNA通过RNA干扰作用(pRNAi)可导致暴露于转基因作物的成年雌性玉米根虫的卵无存活力。玉米根虫对pRNAi的抗性也被认为是单基因性的，具有两个可能的等位基因：一个(X)赋予成年雌性对RNAi的易感性，另一个(Y)赋予成年雌性对RNAi的抗性。假设有高水平的dsRNAs暴露，pRNAi根据模型推导可导致纯合易感(XX)雌性产生的99.9％的卵无存活力。该模型假定pRNAi对由纯合抗性(YY)雌性产生的卵的存活力没有影响。假定对dsRNA的抗性是隐性的，由此功能优势是0.01(对于dsRNA的抗性为杂合子(XY)的雌性产生的卵98.9％是无存活力的)。
在该模型中，在两个缀块中存活下来的成虫之间都有根据其相对比例的随机交配以及随机产卵。可存活的后代的基因型频率遵循两基因座遗传***的孟德尔遗传学。
pRNAi的作用需要成年雌性以表达亲代活性dsRNA的植物组织为食。从避难所作物羽化的成年雌性与从转基因作物羽化的成年雌性相比，卵发育所受的干扰可能较低；预计玉米根虫经过幼虫发育后在某个缀块中羽化，它们就会在那个缀块中更广泛地进食。因此，就从避难所缀块羽化的雌性玉米根虫成虫而言，作用于其上的pRNAi效应的相对幅度是变化的，其中pRNAi效应的比例为0(pRNAi对从避难所缀块羽化的成年雌性没有影响)至1(pRNAi对从避难所缀块羽化的成年雌性的影响与从转基因缀块羽化的成年雌性的影响相同)不等。
当pRNAi效应(还)通过以表达亲代活性dsRNA的植物组织喂养成年雄性来实现时，可以容易地调整该模型来演示这种情形。
计算各个世代中的两种抗性等位基因的频率。两个抗性等位基因(R和Y)的初始频率假定为0.005。结果以每个抗性等位基因的频率达到0.05所需的昆虫世代数表示。为了检查由pRNAi引起的抗性延迟，将包含pRNAi的模拟与不包括pRNAi的模拟进行比较，但是其他所有方面都相同。图7。
还修改了该模型以包括对玉米根虫幼虫有活性的干扰dsRNA与转基因作物中玉米根虫活性杀虫蛋白质的组合。其中，给幼虫RNAi赋予导致纯合RNAi敏感玉米根虫幼虫(基因型XX)97％的幼虫死亡率的效力，而对纯合RNAi抗性(YY)的玉米根虫幼虫没有效力。对RNAi抗性(XY)为杂合的玉米根虫幼虫死亡率为67.9％。假设同一抗性机制适用于玉米根虫中的幼虫活性RNAi和pRNAi二者。如前所述，对从避难所缀块羽化的成年雌性的pRNAi效应相对于对从转基因缀块羽化的成年雌性的pRNAi效应从0到1变化。如前所述，为了检查由pRNAi引起的抗性延迟，将包括pRNAi的模拟与不包括pRNAi的模拟进行比较，但是所有其他方面(包括幼虫RNAi)相同。图8。
当pRNAi对从避难所缀块羽化的雌性玉米根虫成虫的卵存活力的影响的幅度相对于pRNAi对从转基因缀块羽化的成虫的卵存活力的影响的幅度降低时，观察到pRNAi的明显的抗性管理益处。与仅产生杀虫蛋白质的转基因作物相比，除了杀虫蛋白质之外还产生亲代活性dsRNA的转基因作物更耐久。类似地，与仅产生杀虫蛋白质和幼虫活性dsRNA的转基因作物相比，除了杀虫蛋白质和幼虫活性dsRNA之外还产生亲代活性dsRNA的转基因作物更耐久。在后一种情况下，耐久性益处对于杀虫蛋白质和杀虫干扰dsRNA都成立。
实施例17：亲代RNAi对WCR雄性的影响
将自CROP CHARACTERISTIC(Farmington，MN)收到的新羽化的未交配过的WCR雄性暴露于以pRNAi dsRNA(brahma)处理过的人工饵食历时7天，期间连续喂食dsRNA。然后将存活的雄性与未交配过的雌性配对，并允许它们交配4天。将雌性分离到产卵室中，用未经处理的饵食维持，以基于卵的活力确定交配是否成功。此外，在产卵10天后解剖雌性以确定***细胞的存在。包括GFP dsRNA和水的对照。
每个处理进行三个重复，每个重复10个雄性和10个雌性。各个重复在3个不同日期用新羽化的成虫完成。每次处理的每次处理含有10个雄性/处理/重复，并放置在托盘的一个孔中。每个孔包括用水或dsRNA(GFP或brahma)或染色质重塑(SEQ ID NO:3))处理的12个饵食小栓。每个饵食小栓在3μL水中用2μgdsRNA处理。将托盘转移到温度为23±1℃、相对湿度>80％，L：D 16:8的生长室中。在第3、5、7天，将雄性转移到新托盘中，新托盘的每个孔中加有12个经处理的饵食小栓。在第7天，如实施例7所述，将每个处理的每个复制的三只雄性快速冷冻用于qPCR分析。在第8天，将十只雌性和十只处理的雄性一起放在一个容器中以允许交配。每个容器包括22个未经处理的饵食小栓。在第10天，将昆虫转移到具有22个未处理的饵食小栓的新托盘中。在第12天将雄性移出并使用荧光染色技术测量***活力。每隔一天将雌性转移到一个放有12个未经处理的饵食小栓的新托盘，直到第22天。在第16天，将雌性转移到含有高压消毒土壤的卵笼中以供产卵。在第22天，将所有的雌性从土壤笼中取出并冷冻以检查***的存在。将土壤笼转移到温度为27±1℃、相对湿度>80％，24小时黑暗的新生长室。在第28天，使用#60筛洗涤土壤以从每个笼子中收集卵。用甲醛(500μL甲醛在5mL双蒸水中)和甲基-(丁基氨基甲酰基)-2-苯并咪唑氨基甲酸酯(0.025g在50mL双蒸水中)的溶液处理卵以防止真菌污染，并置于放有滤纸的培养皿中。对每个培养皿拍摄照片，以供使用ImageJ软件的细胞计数器功能(Schneider等人(2012)Nat.Methods 9:671-5)进行卵计数。将带卵的培养皿转移到温度为27±1℃，相对湿度>80％，黑暗24小时的小生长室。从第29-42天，每天监测幼虫的孵化。
***活力.将未交配过的西部玉米根虫雄性暴露于用亲代RNAi基因brahma的dsRNA处理过的人工饵食7天。每隔一天提供经处理的饵食。每次重复每次处理使用四只雄性来检测***活力，***活力的检测使用荧光技术，以便区分活***和死***，如Collins和Donoghue(1999)所述。Live Dead Sperm Viability KitTM(Life Technologies，Carlsbad CA)含有SYBR14，一种膜透性核酸染色剂，以及碘化丙啶，后者可染色死细胞。
将WCR雄性在冰上麻醉，剖出睾丸和精囊，置于10μL缓冲液(HEPES 10mM，NaCl150mM，BSA 10％，pH 7.4)中，并用高压消毒的牙签粉碎。立即用Live Dead SpermViability KitTM评估***活力。加入1μL体积的SYBR 14(0.1mM，在DMSO中)，在室温下温育10分钟，然后加入1μL碘化丙啶(2.4mM)，并在室温下再次温育10分钟。将10μL体积的***染色的溶液转移到玻璃微玻片中并用盖玻片覆盖。使用配备A1共聚焦和NIS-Elements软件的Eclipse 90i显微镜对样品进行评估。以10X可视化样品，以488激发，对于活***(SYBR14)500-550nm带通，对死***(碘化丙锭)663-738nm带通同时进行。每个样品记录五个视野的数字图像。使用ImageJ软件(Schneider等人(2012)Nat.Methods 9：671-5)的细胞计数器功能评估活(绿)和死(红)***的数量。
喂食brahma dsRNA 7天的雄性产生的总***、活***和死***均少于仅摄取GFPdsRNA或水的雄性。表16。各处理之间活***的平均数有显著差异。在已经同摄入了dsRNA处理的雄***配的雌性的卵孵化率方面没有统计学差异。表17。
表16.染色质重塑dsRNA对WCR成年雄性***生产和摄入7天后对经处理的人工饵食的活力的影响。使用Dunnett检验，各平均值是分离的。
SEM-均值标准误
*表明p值<0.1的显著性.
**表明p值<0.05的显著性.
表17.仅雄性摄入dsRNA处理过的人工饵食7日后brahma RNA对WCR卵产生和卵存活力的影响。使用Dunnett检验，均值是分离的。
*表示p值≤0.1的显著性
SEM-均值标准误.
对未交配过的雄性，除了将dsRNA的暴露增加至总共6次以外，如上所述进行处理。在第3、5、7、9和11天，将雄性转移到每个孔中有12个经处理的饵食小栓的新托盘。然后将存活的雄性与未交配过的雌性配对，并允许其交配4天。将雌性分离到产卵室中，并用未经处理的饵食维持，以基于卵活力确定交配是否成功。
表18.仅由雄性摄入dsRNA处理的人工饵食brahma dsRNA对摄入7天后的WCR卵产量和卵活力的影响。使用Dunnett检验，各平均值是分离的。
*表示p值≤0.1的显著性
SEM-均值标准误.
雄性中的相对表达如实施例7中所述确定。
表19.暴露于经处理的人工饵食中的dsRNA的成年雄性中brahma相对于GFP和水对照的相对表达。雄性成虫中转录物的水平有降低。使用Dunnett检验，各平均值是分离的。
SEM-均值标准误.
实施例18：有效浓度
将交配后的雌性暴露于4种暴露条件的染色质重塑dsRNA以确定有效浓度。从CROPCHARACTERISTICS(Farmington，MN)收到新羽化的(<48小时)的成年雄性和雌性。处理包括每个饵食小栓的2、0.2、0.02、和0.002μg的brahma dsRNA。2μg的GFP和水作为对照。将10只雄性和10只雌性放在一个含有20粒未经处理的人工饵食的孔中。将托盘转移到生长室，并保持在23±1℃，相对湿度>80％和16:8L:D光周期。在第5天将雄性从实验中移除。每隔一天提供新鲜处理的饵食至第13天。在第14天，将雌性转移到含有高压灭菌土壤的卵笼中，并提供新的经处理的人工饵食(每笼11个小栓)。将卵笼放回生长室。在第16天，如上所述提供新的经处理的饵食。将所有雌性在第18天从土壤笼中取出，并迅速冷冻用于qPCR。将土壤笼转移到新生长室，其中温度为27±1℃，相对湿度>80％，24小时黑暗。在第24天，使用#60筛子洗涤土壤以从每个笼子中收集卵。用甲醛(500μl甲醛在5ml双蒸水中)和甲基-(丁基氨基甲酰)-2-苯并咪唑氨基甲酸酯(0.025g在50ml双蒸水中)的溶液处理卵以防止真菌污染，并置于含滤纸的小培养皿中。对每个培养皿拍摄照片，用于使用ImageJ软件的细胞计数器功能(Schneider等人(2012)Nat.Methods 9：671-5)进行卵计数。将带卵的培养皿转移到温度为27±1℃，相对湿度>80％，黑暗24小时的小生长室。每天监测幼虫孵化历时15天。每天计数幼虫并将它们从培养皿中取出。
在2和0.2μg/饵食小栓处理中，卵孵化率显著降低(表20)，但是在测试的任何剂量和对照之间，每个雌性产卵数量没有差异。
表20.brahma dsRNA浓度对摄入经处理的人造饵食后WCR产卵和卵存活力的影响。各平均值使用Dunnett检验是分离的。
SEM-均值标准误。
**表示(p值<0.05)的显著性。
实施例19：暴露时间
以3个不同时间开始将雌性暴露于2μg的brahma dsRNA 6次，以确定产生亲代RNAi效应所必需的暴露时间。雌性在交配前暴露于dsRNA 6次，交配后立即暴露6次，以及在交配后6天暴露。对于每个暴露时间，完成三个重复，每个重复10只雌性和10只雌性。从CROPCHARACTERISTICS(Farmington，MN)收到WCR成虫。
交配前的dsRNA喂食：将10只雌性放在一个孔中，其中有11粒经处理的人工饵食(每粒2μg dsRNA)。将托盘转移到温度为23±1℃、相对湿度>80％、和16:8L:D光周期的生长室。每隔一天将雌性转移到含有新鲜的经处理饵食的托盘中，历时10天。在第12天，将雌性与10只雄性配对，并提供22个未经处理的饵食的小栓。4天后，移出雄性。每隔一天提供新鲜的未经处理的饵食，历时8天。在第22天，将雌性转移到含有11个未经处理的人工饵食小栓的高压灭菌土壤的卵笼中。将卵笼放回生长室，并在第24天更换饵食。第26天，从土壤笼中取出雌性，并快速冷冻用于qPCR。将土壤笼转移到温度为27±1℃，相对湿度>80％，24小时黑暗的生长室中。4天后，使用#60筛洗涤土壤，以从每个笼子中收集卵。用甲醛(500μl甲醛在5ml双蒸水中)和甲基-(丁基氨基甲酰基)-2-苯并咪唑氨基甲酸酯(0.025g在50ml双蒸水中)的溶液处理卵，以防止真菌污染，并将卵置于放有滤纸的小培养皿中。对每个培养皿拍照，以便使用ImageJ软件((Schneider et al.(2012)Nat.Methods 9:671-5))的细胞计数器功能进行卵计数。将带卵的培养皿转移到温度27±1℃，相对湿度>80％，24小时黑暗的小生长室。每天监测幼虫孵出情况，历时15天。孵出的总幼虫百分比的结果如图9B所示。图9A中示出了孵化的总幼虫的百分比。在接受6次dsRNA后测量雌性的相对brahma表达，如图10所示。
在交配后立即喂食dsRNA：使用类似于上述方法的方法，除了在研究开始时，将10只雄性和10只雌性与22粒未处理的人工饵食颗粒放在一个孔中。将托盘如上所述转移到生长室。在第3天提供新鲜的未处理的饵食，并且在第5天取出雄性。然后将雌性转移到经处理的人工饵食并保持在生长室中。每隔一天提供新鲜处理的饵食历时6天。在第12天，将雌性转移到含有11个经处理的人工饵食小栓的高压灭菌土壤的卵笼中。将卵笼放回生长室，并在第14天提供新鲜处理的饵食。在第16天，将所有雌性从土壤笼中取出并快速冷冻用于qPCR。在6天后如上所述进行土壤笼和卵洗涤。拍摄每只培养皿的照片用于卵计数。每天监测幼虫孵出，历时15天。每只雌性的卵的结果如图9A所示。图9B示出了孵化的总幼虫百分比的结果。在接受6次dsRNA后测量雌性的相对染色质重塑表达，如图10所示。
交配后6日的dsRNA喂养:方法与交配后立即进行dsRNA喂养的方法类似，不同之处是昆虫每隔一天接受未经处理的人工饵食直到第11天，在第11天将雌性转为经处理的饵食。在第12天，将雌性转移到含有11个经处理的人工饵食小栓的高压灭菌土壤的卵笼中。将卵笼放回生长室。从12-20天开始每隔一天提供新鲜的经处理的饵食。在第22天，将所有雌性从土壤笼中取出，并迅速冷冻用于qPCR。如上所述，在6天后进行土壤笼和卵的清洗。拍摄每只培养皿的照片用于卵计数。每天监测幼虫孵出，历时15天。每天从培养皿中计数并取出幼虫。每只雌性的卵的结果如图9A所示，孵化的总幼虫百分比的结果示于图9B。测量相对brahma表达，如图10所示。
在整个研究中，对于所有处理，每隔一天记录雌性死亡率。
实施例20：暴露持续时间
使用未经处理的饵食令未交配过的雄性和雌性配对4天，之后令交配过的雌性暴露于2μg的brahma dsRNA。为了评估暴露持续时间的影响，使昆虫暴露于brahma或GFPdsRNA 1，2，4或6次(在图11A和11B中显示为brm-T1，T2，T4或T6)。每次处理完成了四个重复，每个重复10只雌性和10只雌性。成年雌性和雌性从CROP CHARACTERISTICS(Farmington，MN)收到。将10只雌性和10只雌性与20粒未经处理的人工饵食放在一个孔中。将托盘保持在温度为23±1℃，相对湿度>80％和16:8L:D光周期的生长室中。在第3天提供新的未处理的人工饵食。在第5天移除雄性，并将雌性转移到每个孔含有11个饵食小栓的新盘中，并进行相应的处理。在第7天，将雌性转移到具有新的处理的人工饵食的托盘中，并记录死亡率。将来自第1次(T1)暴露处理的雌性转移到未经处理的饵食。在第10天和第12天，雌性被转移到具有新的经处理的人工饵食的新托盘，记录死亡率。将来自T1和T2的雌性转移到未经处理的饵食。在第14天，将雌性转移到含有高压灭菌土壤的卵笼中，并提供新的经处理的人工饵食。对来自T1，T2和T4的雌性提供未经处理的饵食。在第16天，除去旧的饵食，加入新的经处理饵食(每笼11个小塞)。对来自1次、2次和4次暴露的雌性提供未经处理的饵食。18天后，将所有雌性从土壤笼中取出，并迅速冷冻用于qPCR。将土壤笼子转移到生长室，温度为27±1℃，相对湿度>80％，24小时黑暗。洗涤卵，并根据暴露的时间指示对每只培养皿拍摄照片。计数孵出的幼虫，每天从每个培养皿中取出孵出的幼虫，历时15天。孵出的总幼虫百分比的结果如图11A所示。测量雌性的相对染色质重塑表达，如图11B所示。
实施例21：卵巢发育
在如暴露时间所示的交配之前和交配后立即暴露于用brahma dsRNA处理的人工饵食的雌性中，对玉米根萤叶甲卵巢发育进行评估。雌性暴露于2μg的brahma或GFP dsRNA或水6次。每个处理在最后一次dsRNA暴露后一天收集五只雌性，并储存在70％乙醇中用于随后的卵巢解剖。所有存活雌性的子宫解剖均在立体显微镜下进行。使用Olympus SZX16显微镜，Olympus SDF PLAPO 2X PFC镜头和Olympus CellSens Dimensions软件(日本东京)获取图像。
玉米根萤叶甲卵巢解剖显示，用水、GFP或brahma dsRNA处理的雌性相互之间卵巢发育没有明显的差异；对于未交配的雌性以及交配后立即被解剖的雌性都是如此。
序列表
<110> 美国陶氏益农公司
K·E·纳尔瓦
K·阿罗拉
S·E·沃登
B·齐格弗里德
C·卡朱里亚
E·菲什里维奇
N·P·斯托勒
M·弗雷
R·哈姆
A·M·威莱斯阿朗戈
<120> 用于控制鞘翅目害虫染色质重塑基因亲代RNAI抑制
<130> 2971-P12201.3US (74496-US-PSP)
<150> 62/092,768
<151> 2014-12-16
<150> 62/170,076
<151> 2015-06-02
<160> 169
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 4768
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 1
caagtggcca tggcatgcca cagggtcccc ctggacaacc aggtcagcaa caccaaggcc 60
gaactgctga taatttacat gccttacaaa aagcaataga tacaatggaa gaaaaaggta 120
tgcaagaaga tcagaggtat tcacagttac tggcgttacg tgctagatcc agtggtcaac 180
catctaacgg agttcttaca ccgctgcaaa tgaatcaact tagaaatcaa attatggcat 240
acaggtgcct agcgaggagc caaccaattc ctccttcaat aatgttgggg ctgcaaggaa 300
agaggcctga cggttcacca cagtttccta cacctccgtc aagtccgttt caaccacaag 360
gacctggtgc accccctggt ccggaacaac caccagctaa tgcagaaaac gtagcagagc 420
cagcagcacc agtaggaccg caaggtgcac aaggacctcc taaccaacag agagctcaaa 480
ctagccagtt agtccccaat aagcaaactc gtttcactac catgcccaaa ccatctggac 540
tagatccact agttcttctt caagagaggg aaactagggt ggcagctaga atcgctgcta 600
gaatagaaca atgtagtaac ttacctacca atctttcaga caaagtccgc atgcaagcac 660
agatagaatt gagagctttg cggtgcctta atttccaaag gcaactaaga agcgaaattt 720
tgaactgtat taggagagat ataacgcttg aatctgctgt aaattttaaa gcatataaaa 780
gaacgaagcg acagggtcta aaagaatcga gagctacaga gaagttagaa aaacaacaga 840
agttagaagc agaaagaaag agaagacaga agaaccaaga atttttgaat gctgtattga 900
acaatggaaa agaattcaag gaattccaca agcagaatca agcgaaatta gctaagatta 960
ataaagctgt tattaattat cacgctaatg ctgaaagaga gcaaaagaaa gaagcagaaa 1020
ggagagagaa ggaacgtatg atcagattga tggcagaaga tgaagaaggt tatagacagt 1080
tgatcgatca aaagaaagac aaacgtctag cgttcttgct ttcccaaaca gatgaatata 1140
tcagtaactt aacagagatg gtgaaaatgc acaaagtcga acaaagtaac aagaagcggg 1200
aagaagaacg acggaagaga aggcaagaca aaatgcagca gcctgacagg aaagtcacag 1260
ttatcgaaat ggctactggg aataaggtta gtggagaaaa cgctccgact gtccaggaac 1320
ttcctgaatg gttacagact catcctggtt gggagatgat agatacagaa gacgaggacg 1380
agaatgacga atatagaatg gacgattatg aagaaaataa tcaagtcgat gctacagaaa 1440
tcattcagaa agccaaggtt gaggatgacg aatatcacaa gaatgccaca gaggaacaga 1500
cgtactacgg tattgcacat acagtgagcg agtcagtatc agaacaggcc tccattatga 1560
taaacggtga actgaaagag taccaggtca aaggactgga atggatggta tccttgtaca 1620
acaacaatct taatggtatc ctagcagacg agatgggttt gggtaagact attcaaacca 1680
ttggcctgat cacctacttg atggagaaaa aaaagttgaa tgggccattt ttgatcattg 1740
tgccgttatc cactatatct aattggatgt tggagttcga aaaatgggct ccttctgttg 1800
tggtcgtctc ctacaaaggc tcacctggtc acaggaaatt gcttcagggt cagatgaagt 1860
cagcaaaatt caatgttctt cttactactt atgaatatat cattaaagat aagggaattc 1920
tttcaaaagt accgtttaag tatatgatcg tggacgaggg tcacagaatg aagaaccatc 1980
attgcaagtt gacccagact ttgaacactc actacgcagc tcctttccgc cttctcttaa 2040
ccggtactcc tctacaaaac aaactaccag aactgtgggc gttgcttaac ttcttacttc 2100
cgtctatttt caagagttgt tccactttcg agcaatggtt caacgcccct ttcgcaacca 2160
cgggagaaaa ggttgaactt aacgaagaag aaaccatcct tatcatccga cgtcttcaca 2220
aagtcctgcg acctttcctc ttaagacgtc tcaaaaagga agtagagtct cagcttcccg 2280
acaaagtcga atacattatc aaatgcgaga tgtccggttt gcaaaaagtg ttgtaccaac 2340
acatgcagag caagggagtt ctgctcaccg acgggtccga aaagggtaat aggggccgag 2400
gtggagctaa ggctatcatg aataccatca tgcaactgcg gaagctgtgt aatcatcctt 2460
tcatgttcca aatgatcgaa gaaaagtatt gtgaatatgt aggcatgggt gggggactca 2520
catcagggcc ggatatatac agatcttctg gtaaatttga acttctggat cgggtattgc 2580
caaagctcaa ggcgactgac cacagagtcc tactgttctg tcaaatgacg acgttgatga 2640
acatcatgga agactacttc atttggagag gttacaaata tcttcgtctg gatggtatgg 2700
taaaagcgga agatcgggcg gaactactca agaagttcaa tgacaaacaa agcgaatatt 2760
ttgtgtttct attgtcaaca agagcaggag gtcttggact caacttgcaa agtgctgata 2820
ctgttatcat ctttgattct gactggaatc ctcaccagga tttacaagct caagatcgtg 2880
cccatcgtat aggccagcaa aatgaagtca gggtcctacg tttaatgaca gttaattcag 2940
tggaagaaag aatcttagct gcagctaaat acaaacttat aatggacgag aaagtaatcc 3000
aagctggtat gttcgatcag aagtctacag gctcagagag acatcagttt ttgcagagta 3060
ttttacacca tgacggaagc gacgaagaag aggaaaacga agttcctgat gacgaaacag 3120
tgaaccagat gttggcccga agggaaaacg aatttcagct tttccagaag atggatcagg 3180
aaagaaagga agaagatgaa aagaccggaa agtcgcgact tattcaagaa agcgaattgc 3240
ccgaatggct gttgaagcaa gacgatgaaa tctactcgtg gggccttgat gatccagatg 3300
ctgttttagg aaggggtagt aggcaaagaa aagaagttga ttatgttgac agcctgacgg 3360
agaaagagtg gcttaaggct attgacgaag agggagaatt tgaggaagaa caagaaggtg 3420
ataaagaagg tctcagaaag aaaagaggga ggaagaggaa gaagcgcgat gatgacgaag 3480
aggcaagcca aattaagaga agaaaggtgc atctagccga gatcaagatg aagaaaaaga 3540
tgaagaggct tatggaagtt gttgtgaact acagggatag ggatggtaga gtattgagcg 3600
aaccgtttat gaaacttcca tcaaagaagg agttacctga atattacgat acgattaaga 3660
aacctattga tattgaaaaa gtcgttgcca acgtagaaga aggaaaatat ttcacgatgc 3720
acgatttgga aagagatttc gacttgctgt gccaaaacgc ccaacaatac aacgaagaag 3780
actccatgat ctacgaggac agcctcgttc ttcgacaggt gtttagaagc gcgagggaaa 3840
agatcgacgg tacctcagac cacgacgaca acgccgatgg accggcggtg gctcagatca 3900
aacgacctcg tggtagacct cgaaaacaca agagacccga agagatcgag gccgaagcgg 3960
cggctcagaa agctatggag gaggcatcga agctgagagc tcaagctgag gcggaagagc 4020
ttagatctaa ggtggaggag gcatctcaga gagccaaaga ggaagcgaaa gcaagggagg 4080
aagccaaagc tagggaagaa gccgaaatcg agaacatgga ggagattccc acaagcacat 4140
gatctataga gcaaccggaa acaaaaaggc aaaaaagaaa tattatatag aaaagatgta 4200
catgttcaat ggagatacat tttcgctgag ttacaacggg taatgctttt acaacggata 4260
ttttgacgta tgaatgttga cgttcagatg aagtatattt ataaaataat ccagaccttt 4320
acgttttggt tgatttgttt tctgtattgt tcagtttatt gaacaaccat taatagcagc 4380
ttacctaaat gatttagaaa agcatctgag ttatttagat aagttttgag attatattta 4440
ttaactttaa tattactatc tttattatag catattgtaa ttattttttc ctgtccttct 4500
ttcgttgtgt ggtagataat ccgagagtca acagttataa gcaaatgaaa ttcagttaaa 4560
cctcaaatgt acaaaatgat caaattaatg tttacaattt atttttttac cacgcacatc 4620
cactattact attgtcagtc attgagatat cattttatat agctccatgt ctgtcttcct 4680
caatttacag agaagcaatt agacaagtaa tgacataata tggtgctgaa ataatgtgct 4740
tgatagtgat gttgaaaaag taactatt 4768
<210> 2
<211> 1375
<212> PRT
<213> Diabrotica virgifera
<400> 2
Met Pro Gln Gly Pro Pro Gly Gln Pro Gly Gln Gln His Gln Gly Arg
1 5 10 15
Thr Ala Asp Asn Leu His Ala Leu Gln Lys Ala Ile Asp Thr Met Glu
20 25 30
Glu Lys Gly Met Gln Glu Asp Gln Arg Tyr Ser Gln Leu Leu Ala Leu
35 40 45
Arg Ala Arg Ser Ser Gly Gln Pro Ser Asn Gly Val Leu Thr Pro Leu
50 55 60
Gln Met Asn Gln Leu Arg Asn Gln Ile Met Ala Tyr Arg Cys Leu Ala
65 70 75 80
Arg Ser Gln Pro Ile Pro Pro Ser Ile Met Leu Gly Leu Gln Gly Lys
85 90 95
Arg Pro Asp Gly Ser Pro Gln Phe Pro Thr Pro Pro Ser Ser Pro Phe
100 105 110
Gln Pro Gln Gly Pro Gly Ala Pro Pro Gly Pro Glu Gln Pro Pro Ala
115 120 125
Asn Ala Glu Asn Val Ala Glu Pro Ala Ala Pro Val Gly Pro Gln Gly
130 135 140
Ala Gln Gly Pro Pro Asn Gln Gln Arg Ala Gln Thr Ser Gln Leu Val
145 150 155 160
Pro Asn Lys Gln Thr Arg Phe Thr Thr Met Pro Lys Pro Ser Gly Leu
165 170 175
Asp Pro Leu Val Leu Leu Gln Glu Arg Glu Thr Arg Val Ala Ala Arg
180 185 190
Ile Ala Ala Arg Ile Glu Gln Cys Ser Asn Leu Pro Thr Asn Leu Ser
195 200 205
Asp Lys Val Arg Met Gln Ala Gln Ile Glu Leu Arg Ala Leu Arg Cys
210 215 220
Leu Asn Phe Gln Arg Gln Leu Arg Ser Glu Ile Leu Asn Cys Ile Arg
225 230 235 240
Arg Asp Ile Thr Leu Glu Ser Ala Val Asn Phe Lys Ala Tyr Lys Arg
245 250 255
Thr Lys Arg Gln Gly Leu Lys Glu Ser Arg Ala Thr Glu Lys Leu Glu
260 265 270
Lys Gln Gln Lys Leu Glu Ala Glu Arg Lys Arg Arg Gln Lys Asn Gln
275 280 285
Glu Phe Leu Asn Ala Val Leu Asn Asn Gly Lys Glu Phe Lys Glu Phe
290 295 300
His Lys Gln Asn Gln Ala Lys Leu Ala Lys Ile Asn Lys Ala Val Ile
305 310 315 320
Asn Tyr His Ala Asn Ala Glu Arg Glu Gln Lys Lys Glu Ala Glu Arg
325 330 335
Arg Glu Lys Glu Arg Met Ile Arg Leu Met Ala Glu Asp Glu Glu Gly
340 345 350
Tyr Arg Gln Leu Ile Asp Gln Lys Lys Asp Lys Arg Leu Ala Phe Leu
355 360 365
Leu Ser Gln Thr Asp Glu Tyr Ile Ser Asn Leu Thr Glu Met Val Lys
370 375 380
Met His Lys Val Glu Gln Ser Asn Lys Lys Arg Glu Glu Glu Arg Arg
385 390 395 400
Lys Arg Arg Gln Asp Lys Met Gln Gln Pro Asp Arg Lys Val Thr Val
405 410 415
Ile Glu Met Ala Thr Gly Asn Lys Val Ser Gly Glu Asn Ala Pro Thr
420 425 430
Val Gln Glu Leu Pro Glu Trp Leu Gln Thr His Pro Gly Trp Glu Met
435 440 445
Ile Asp Thr Glu Asp Glu Asp Glu Asn Asp Glu Tyr Arg Met Asp Asp
450 455 460
Tyr Glu Glu Asn Asn Gln Val Asp Ala Thr Glu Ile Ile Gln Lys Ala
465 470 475 480
Lys Val Glu Asp Asp Glu Tyr His Lys Asn Ala Thr Glu Glu Gln Thr
485 490 495
Tyr Tyr Gly Ile Ala His Thr Val Ser Glu Ser Val Ser Glu Gln Ala
500 505 510
Ser Ile Met Ile Asn Gly Glu Leu Lys Glu Tyr Gln Val Lys Gly Leu
515 520 525
Glu Trp Met Val Ser Leu Tyr Asn Asn Asn Leu Asn Gly Ile Leu Ala
530 535 540
Asp Glu Met Gly Leu Gly Lys Thr Ile Gln Thr Ile Gly Leu Ile Thr
545 550 555 560
Tyr Leu Met Glu Lys Lys Lys Leu Asn Gly Pro Phe Leu Ile Ile Val
565 570 575
Pro Leu Ser Thr Ile Ser Asn Trp Met Leu Glu Phe Glu Lys Trp Ala
580 585 590
Pro Ser Val Val Val Val Ser Tyr Lys Gly Ser Pro Gly His Arg Lys
595 600 605
Leu Leu Gln Gly Gln Met Lys Ser Ala Lys Phe Asn Val Leu Leu Thr
610 615 620
Thr Tyr Glu Tyr Ile Ile Lys Asp Lys Gly Ile Leu Ser Lys Val Pro
625 630 635 640
Phe Lys Tyr Met Ile Val Asp Glu Gly His Arg Met Lys Asn His His
645 650 655
Cys Lys Leu Thr Gln Thr Leu Asn Thr His Tyr Ala Ala Pro Phe Arg
660 665 670
Leu Leu Leu Thr Gly Thr Pro Leu Gln Asn Lys Leu Pro Glu Leu Trp
675 680 685
Ala Leu Leu Asn Phe Leu Leu Pro Ser Ile Phe Lys Ser Cys Ser Thr
690 695 700
Phe Glu Gln Trp Phe Asn Ala Pro Phe Ala Thr Thr Gly Glu Lys Val
705 710 715 720
Glu Leu Asn Glu Glu Glu Thr Ile Leu Ile Ile Arg Arg Leu His Lys
725 730 735
Val Leu Arg Pro Phe Leu Leu Arg Arg Leu Lys Lys Glu Val Glu Ser
740 745 750
Gln Leu Pro Asp Lys Val Glu Tyr Ile Ile Lys Cys Glu Met Ser Gly
755 760 765
Leu Gln Lys Val Leu Tyr Gln His Met Gln Ser Lys Gly Val Leu Leu
770 775 780
Thr Asp Gly Ser Glu Lys Gly Asn Arg Gly Arg Gly Gly Ala Lys Ala
785 790 795 800
Ile Met Asn Thr Ile Met Gln Leu Arg Lys Leu Cys Asn His Pro Phe
805 810 815
Met Phe Gln Met Ile Glu Glu Lys Tyr Cys Glu Tyr Val Gly Met Gly
820 825 830
Gly Gly Leu Thr Ser Gly Pro Asp Ile Tyr Arg Ser Ser Gly Lys Phe
835 840 845
Glu Leu Leu Asp Arg Val Leu Pro Lys Leu Lys Ala Thr Asp His Arg
850 855 860
Val Leu Leu Phe Cys Gln Met Thr Thr Leu Met Asn Ile Met Glu Asp
865 870 875 880
Tyr Phe Ile Trp Arg Gly Tyr Lys Tyr Leu Arg Leu Asp Gly Met Val
885 890 895
Lys Ala Glu Asp Arg Ala Glu Leu Leu Lys Lys Phe Asn Asp Lys Gln
900 905 910
Ser Glu Tyr Phe Val Phe Leu Leu Ser Thr Arg Ala Gly Gly Leu Gly
915 920 925
Leu Asn Leu Gln Ser Ala Asp Thr Val Ile Ile Phe Asp Ser Asp Trp
930 935 940
Asn Pro His Gln Asp Leu Gln Ala Gln Asp Arg Ala His Arg Ile Gly
945 950 955 960
Gln Gln Asn Glu Val Arg Val Leu Arg Leu Met Thr Val Asn Ser Val
965 970 975
Glu Glu Arg Ile Leu Ala Ala Ala Lys Tyr Lys Leu Ile Met Asp Glu
980 985 990
Lys Val Ile Gln Ala Gly Met Phe Asp Gln Lys Ser Thr Gly Ser Glu
995 1000 1005
Arg His Gln Phe Leu Gln Ser Ile Leu His His Asp Gly Ser Asp
1010 1015 1020
Glu Glu Glu Glu Asn Glu Val Pro Asp Asp Glu Thr Val Asn Gln
1025 1030 1035
Met Leu Ala Arg Arg Glu Asn Glu Phe Gln Leu Phe Gln Lys Met
1040 1045 1050
Asp Gln Glu Arg Lys Glu Glu Asp Glu Lys Thr Gly Lys Ser Arg
1055 1060 1065
Leu Ile Gln Glu Ser Glu Leu Pro Glu Trp Leu Leu Lys Gln Asp
1070 1075 1080
Asp Glu Ile Tyr Ser Trp Gly Leu Asp Asp Pro Asp Ala Val Leu
1085 1090 1095
Gly Arg Gly Ser Arg Gln Arg Lys Glu Val Asp Tyr Val Asp Ser
1100 1105 1110
Leu Thr Glu Lys Glu Trp Leu Lys Ala Ile Asp Glu Glu Gly Glu
1115 1120 1125
Phe Glu Glu Glu Gln Glu Gly Asp Lys Glu Gly Leu Arg Lys Lys
1130 1135 1140
Arg Gly Arg Lys Arg Lys Lys Arg Asp Asp Asp Glu Glu Ala Ser
1145 1150 1155
Gln Ile Lys Arg Arg Lys Val His Leu Ala Glu Ile Lys Met Lys
1160 1165 1170
Lys Lys Met Lys Arg Leu Met Glu Val Val Val Asn Tyr Arg Asp
1175 1180 1185
Arg Asp Gly Arg Val Leu Ser Glu Pro Phe Met Lys Leu Pro Ser
1190 1195 1200
Lys Lys Glu Leu Pro Glu Tyr Tyr Asp Thr Ile Lys Lys Pro Ile
1205 1210 1215
Asp Ile Glu Lys Val Val Ala Asn Val Glu Glu Gly Lys Tyr Phe
1220 1225 1230
Thr Met His Asp Leu Glu Arg Asp Phe Asp Leu Leu Cys Gln Asn
1235 1240 1245
Ala Gln Gln Tyr Asn Glu Glu Asp Ser Met Ile Tyr Glu Asp Ser
1250 1255 1260
Leu Val Leu Arg Gln Val Phe Arg Ser Ala Arg Glu Lys Ile Asp
1265 1270 1275
Gly Thr Ser Asp His Asp Asp Asn Ala Asp Gly Pro Ala Val Ala
1280 1285 1290
Gln Ile Lys Arg Pro Arg Gly Arg Pro Arg Lys His Lys Arg Pro
1295 1300 1305
Glu Glu Ile Glu Ala Glu Ala Ala Ala Gln Lys Ala Met Glu Glu
1310 1315 1320
Ala Ser Lys Leu Arg Ala Gln Ala Glu Ala Glu Glu Leu Arg Ser
1325 1330 1335
Lys Val Glu Glu Ala Ser Gln Arg Ala Lys Glu Glu Ala Lys Ala
1340 1345 1350
Arg Glu Glu Ala Lys Ala Arg Glu Glu Ala Glu Ile Glu Asn Met
1355 1360 1365
Glu Glu Ile Pro Thr Ser Thr
1370 1375
<210> 3
<211> 5147
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 3
tcacgtgcct ccacaaggcc atgttcctcc acagggtcac gtgcctccac aaggccatgt 60
tcctccacag ggacatcttc ctccacaggg ccatattcca ccacagggtc atggtccaac 120
gcagggccac atacctcctc aggggcatgt tccaccacaa ggacatatac ctcctcaagg 180
gcatgcaccc ccacaaggac atgcaccacc acaggggcat cctggcgttc ctcctggtca 240
tcagagtcat cctcaagggc atccacaaac accagggcat cctggacctg gacatatacc 300
acctggtgga gcaatgcacc cagggcatta tccaagtggc catggcatgc cacagggtcc 360
ccctggacaa ccaggtcagc aacaccaagg ccgaactgct gataatttac atgccttaca 420
aaaagcaata gatacaatgg aagaaaaagg tatgcaagaa gatcagaggt attcacagtt 480
actggcgtta cgtgctagat ccagtggtca accatctaac ggagttctta caccgctgca 540
aatgaatcaa cttagaaatc aaattatggc atacaggtgc ctagcgagga gccaaccaat 600
tcctccttca ataatgttgg ggctgcaagg aaagaggcct gacggttcac cacagtttcc 660
tacacctccg tcaagtccgt ttcaaccaca aggacctggt gcaccccctg gtccggaaca 720
accaccagct aatgcagaaa acgtagcaga gccagcagca ccagtaggac cgcaaggtgc 780
acaaggacct cctaaccaac agagagctca aactagccag ttagtcccca ataagcaaac 840
tcgtttcact accatgccca aaccatctgg actagatcca ctagttcttc ttcaagagag 900
ggaaactagg gtggcagcta gaatcgctgc tagaatagaa caatgtagta acttacctac 960
caatctttca gacaaagtcc gcatgcaagc acagatagaa ttgagagctt tgcggtgcct 1020
caatttccaa aggcaactaa gaagcgaaat tttgaactgt attaggagag atataacgct 1080
tgaatctgct gtaaatttta aagcatataa aagaacgaag cgacagggtc taaaagaatc 1140
gagagctaca gagaagttag aaaaacaaca gaagttagaa gcagaaagaa agagaagaca 1200
gaagaaccaa gaatttttga atgctgtatt gaacaatgga aaagaattca aggaattcca 1260
caagcagaat caagcgaaat tagctaagat taataaagct gttattaatt atcacgctaa 1320
tgctgaaaga gagcaaaaga aagaagcaga aaggagagag aaggaacgta tgatcagatt 1380
gatggcagaa gatgaagaag gttatagaaa gctcattgat caaaagaaag acaaacgtct 1440
agcgttcttg ctttcgcaaa cagatgagta tataactaac ctcacggaga tggtaaagca 1500
acacaagttg gaacaaacca ataaaaagaa agaggaggaa aaacgcaaga agaagcagca 1560
gaaaatgcaa caaccagata ggaaagttac agttctggaa actgcaacag gtaaaaaagt 1620
aacaggagag gctgctccta cactgcgaca agttcaagaa tggttaatcc aacatcctgg 1680
atgggagatg gtcgatacag atgatgagga tgatgaaaac ggggagaaga gggatgatga 1740
ctatgatgaa aatcaagaag tggatgatgc aaaagaagtt attaaaaaag ctaaagttga 1800
agatgacgaa tatcacaaaa acacaaaaga agaacagact tactacagta ttgctcacac 1860
tgttcatgaa gtggtaacag aacaagcatc cattctggtt aatggaaagc ttaaggaata 1920
tcaaattaga gggttagaat ggatggtgtc tttgtacaat aacaatctga atggtattct 1980
agcagatgag atgggtctag gtaaaaccat tcaaacgatt ggcttgttga cctatttgat 2040
ggaaaaaaag aagataaatg gaccgttttt gatcatagtg ccactttcaa ccatttctaa 2100
ttggatgttg gaatttcaaa agtgggcccc tactgtagtt gtcatttcat acaaaggctc 2160
tcctgtggtt agaaaagtga tccagagcca gttaaaagct gctaaattca atgtgcttct 2220
cactacctac gagtacatta ttaaggacaa gggtgtatta gcaaaaatcc catttaaata 2280
tatgatcata gatgagggtc atcgtatgaa aaaccaccac tgcaaattga ctcaagtcct 2340
gaatacgcac tatttggcgc cctacagact cctgcttact ggtactcccc tacaaaataa 2400
attaccagaa ttatgggcct tgttgaattt cttgttgcct tcgattttca agagttgctc 2460
cacttttgaa caatggttca atgcgccatt cgcaacaaca ggagaaaagg ttgagttaaa 2520
cgaagaagaa actatcctta tcatccgtcg tcttcacaaa gtactcaggc cgtttctcct 2580
gagacgtctc aagaaagaag tcgaatctca gcttccagac aaagtggaat atatcataaa 2640
gtgtgacatg tcgggcctac aaaaggttct ctatgcacac atgcagagca agggtgtgtt 2700
acttaccgat ggttccgaga agggcagtaa aggaagggga tctaaggcac tgatgaacac 2760
cattatgcag ctgaggaaac tgtgcaatca tccgtttatg ttccaaaata tcgaagagaa 2820
atattgtgat catgttggta ttgctggtgg agtggtttct ggacccgaca cttatagggt 2880
atctggtaag tttgagctct tggacagaat attgcccaaa atgaaagcaa ctaaccatag 2940
gattcttctt ttctgtcaaa tgactcaatt aatgaccatc atggaagatt atctaaattg 3000
gagaggattc aaatatcttc gtcttgatgg tacaatcaaa tcagaagatc gcggggacct 3060
attatcgaaa tttaatgata aaaatagtga atattttttg tttttgctat ctacacgggc 3120
tggaggtctg ggacttaatt tgcagacagc tgatactgtg attatcttcg attccgattg 3180
gaatcctcat caggatttac aagctcagga tcgagctcat cgtattggac agcaaaatga 3240
ggtccgagtt ttgcgtttga tgactgttaa ctctgttgag gaacgaattt tagctgcagc 3300
taaatacaag cttactatgg acgaaaaggt cattcaagct ggtatgttcg atcagaagtc 3360
tacgggatct gaaaggcagc agtttcttca gagtatttta cacaatgatg gtagtgatga 3420
agaagaggaa aatgaagtgc ctgatgacga aaccgtcaac caaatgatag ctaggacaga 3480
ggatgagttt cagctcttcc aaaaaatgga tacggaaaga aaagaggaga atgaaaaact 3540
tggtcagcat aaaaagtcgc gattggttca agaatgtgaa cttccggatt ggctgacaaa 3600
gccagatgaa gatgatggct ggggtgatga ttatactgaa gcgctattgg gcagaggaac 3660
caggcagcga aaggaagttg attatgctga tagtttaaca gaaaaggaat ggttaaaggc 3720
tatcgatgaa gacggagact acgatgaaga agaagaggaa gaaaaagtac aaaagaagag 3780
gggtaggaag agaaggaagc gtgacgattc tgacgatgac accagcagtt ctacgagaag 3840
gcgtaagcta ccccaaagtc aggtagaagc taggctaaag agaaaaatga aaaagttgat 3900
gaacatagtt acaaattata aagacaggga tggacgacag cttagcgatc aattcattaa 3960
attgcctcca aggaaagagt atccagacta ttatactatt attaaaaagc ctatagatat 4020
tagcaagata ttaaattata tagatgatgg aaagtactct gatttctccg atctggaacg 4080
agacttcatg cttctctgcc agaatgctca aatctataac gaagaagcgt cgttgattca 4140
cgaagacagc atcgtactgc agtcggtctt ttcgagtgcc aagcagaaga tcgaagcctc 4200
cccggattcg gacgacgaaa aagatgacaa taattccgat gtagaaactc ctaagaataa 4260
aaataaacct ggtaaaggca agagacgacc cggcaggcct aggaggtcgg cgaaaaaata 4320
catttcggac gacgatgacg acgactgaag agtttaggtg taagagaaat gagaatgaaa 4380
ttcttattgc aaaagttgta catatgaagg tgttgttatt ctttaccaaa gctggtaaat 4440
gtttgattta aagggaaact ggaacttttc tcttggtttt agatagtact atagataggt 4500
tttgataggg aataacaggt tcaagattcg ccccagttga aatttgctta aatgatcaaa 4560
gagtacttaa gtataatgaa tcacgattgt ttaaatttta acttgcactt agtgacaaaa 4620
aaataacagc ttataaataa atttacgtag caagaatgat cctattgatt aagaatgaat 4680
gagcctctcc aaagatagtc caaaaagtgt ttcagggtga aaaggagttg tgaaaaatac 4740
aagatggtct gctaagcaac cttctttgta acaaaaatca tgtttttcca gaaatttttt 4800
tttattttat taatatagtc ctcttttatc tcaatacaac gcgattccag cgattttcca 4860
aacttcttta tgccgtcgga ataaggcccc acctagattg gatccgtatt tctcctatca 4920
gatccgatcc gacgtcggat tgaaagcaaa ctcaaggtat taaggtatgg ctgcacttac 4980
attggatccc catcctccga tccgatatag ggcgattgat aggagaagct acagcagaga 5040
agcagttcga cgtcggccga tatcggatcg gtcttctcac tacagtgtag gcactgcgct 5100
ttaatacctt ccctaataac actaaacatt ccatgtatgt tcctaga 5147
<210> 4
<211> 1344
<212> PRT
<213> Diabrotica virgifera
<400> 4
Met His Pro Gly His Tyr Pro Ser Gly His Gly Met Pro Gln Gly Pro
1 5 10 15
Pro Gly Gln Pro Gly Gln Gln His Gln Gly Arg Thr Ala Asp Asn Leu
20 25 30
His Ala Leu Gln Lys Ala Ile Asp Thr Met Glu Glu Lys Gly Met Gln
35 40 45
Glu Asp Gln Arg Tyr Ser Gln Leu Leu Ala Leu Arg Ala Arg Ser Ser
50 55 60
Gly Gln Pro Ser Asn Gly Val Leu Thr Pro Leu Gln Met Asn Gln Leu
65 70 75 80
Arg Asn Gln Ile Met Ala Tyr Arg Cys Leu Ala Arg Ser Gln Pro Ile
85 90 95
Pro Pro Ser Ile Met Leu Gly Leu Gln Gly Lys Arg Pro Asp Gly Ser
100 105 110
Pro Gln Phe Pro Thr Pro Pro Ser Ser Pro Phe Gln Pro Gln Gly Pro
115 120 125
Gly Ala Pro Pro Gly Pro Glu Gln Pro Pro Ala Asn Ala Glu Asn Val
130 135 140
Ala Glu Pro Ala Ala Pro Val Gly Pro Gln Gly Ala Gln Gly Pro Pro
145 150 155 160
Asn Gln Gln Arg Ala Gln Thr Ser Gln Leu Val Pro Asn Lys Gln Thr
165 170 175
Arg Phe Thr Thr Met Pro Lys Pro Ser Gly Leu Asp Pro Leu Val Leu
180 185 190
Leu Gln Glu Arg Glu Thr Arg Val Ala Ala Arg Ile Ala Ala Arg Ile
195 200 205
Glu Gln Cys Ser Asn Leu Pro Thr Asn Leu Ser Asp Lys Val Arg Met
210 215 220
Gln Ala Gln Ile Glu Leu Arg Ala Leu Arg Cys Leu Asn Phe Gln Arg
225 230 235 240
Gln Leu Arg Ser Glu Ile Leu Asn Cys Ile Arg Arg Asp Ile Thr Leu
245 250 255
Glu Ser Ala Val Asn Phe Lys Ala Tyr Lys Arg Thr Lys Arg Gln Gly
260 265 270
Leu Lys Glu Ser Arg Ala Thr Glu Lys Leu Glu Lys Gln Gln Lys Leu
275 280 285
Glu Ala Glu Arg Lys Arg Arg Gln Lys Asn Gln Glu Phe Leu Asn Ala
290 295 300
Val Leu Asn Asn Gly Lys Glu Phe Lys Glu Phe His Lys Gln Asn Gln
305 310 315 320
Ala Lys Leu Ala Lys Ile Asn Lys Ala Val Ile Asn Tyr His Ala Asn
325 330 335
Ala Glu Arg Glu Gln Lys Lys Glu Ala Glu Arg Arg Glu Lys Glu Arg
340 345 350
Met Ile Arg Leu Met Ala Glu Asp Glu Glu Gly Tyr Arg Lys Leu Ile
355 360 365
Asp Gln Lys Lys Asp Lys Arg Leu Ala Phe Leu Leu Ser Gln Thr Asp
370 375 380
Glu Tyr Ile Thr Asn Leu Thr Glu Met Val Lys Gln His Lys Leu Glu
385 390 395 400
Gln Thr Asn Lys Lys Lys Glu Glu Glu Lys Arg Lys Lys Lys Gln Gln
405 410 415
Lys Met Gln Gln Pro Asp Arg Lys Val Thr Val Leu Glu Thr Ala Thr
420 425 430
Gly Lys Lys Val Thr Gly Glu Ala Ala Pro Thr Leu Arg Gln Val Gln
435 440 445
Glu Trp Leu Ile Gln His Pro Gly Trp Glu Met Val Asp Thr Asp Asp
450 455 460
Glu Asp Asp Glu Asn Gly Glu Lys Arg Asp Asp Asp Tyr Asp Glu Asn
465 470 475 480
Gln Glu Val Asp Asp Ala Lys Glu Val Ile Lys Lys Ala Lys Val Glu
485 490 495
Asp Asp Glu Tyr His Lys Asn Thr Lys Glu Glu Gln Thr Tyr Tyr Ser
500 505 510
Ile Ala His Thr Val His Glu Val Val Thr Glu Gln Ala Ser Ile Leu
515 520 525
Val Asn Gly Lys Leu Lys Glu Tyr Gln Ile Arg Gly Leu Glu Trp Met
530 535 540
Val Ser Leu Tyr Asn Asn Asn Leu Asn Gly Ile Leu Ala Asp Glu Met
545 550 555 560
Gly Leu Gly Lys Thr Ile Gln Thr Ile Gly Leu Leu Thr Tyr Leu Met
565 570 575
Glu Lys Lys Lys Ile Asn Gly Pro Phe Leu Ile Ile Val Pro Leu Ser
580 585 590
Thr Ile Ser Asn Trp Met Leu Glu Phe Gln Lys Trp Ala Pro Thr Val
595 600 605
Val Val Ile Ser Tyr Lys Gly Ser Pro Val Val Arg Lys Val Ile Gln
610 615 620
Ser Gln Leu Lys Ala Ala Lys Phe Asn Val Leu Leu Thr Thr Tyr Glu
625 630 635 640
Tyr Ile Ile Lys Asp Lys Gly Val Leu Ala Lys Ile Pro Phe Lys Tyr
645 650 655
Met Ile Ile Asp Glu Gly His Arg Met Lys Asn His His Cys Lys Leu
660 665 670
Thr Gln Val Leu Asn Thr His Tyr Leu Ala Pro Tyr Arg Leu Leu Leu
675 680 685
Thr Gly Thr Pro Leu Gln Asn Lys Leu Pro Glu Leu Trp Ala Leu Leu
690 695 700
Asn Phe Leu Leu Pro Ser Ile Phe Lys Ser Cys Ser Thr Phe Glu Gln
705 710 715 720
Trp Phe Asn Ala Pro Phe Ala Thr Thr Gly Glu Lys Val Glu Leu Asn
725 730 735
Glu Glu Glu Thr Ile Leu Ile Ile Arg Arg Leu His Lys Val Leu Arg
740 745 750
Pro Phe Leu Leu Arg Arg Leu Lys Lys Glu Val Glu Ser Gln Leu Pro
755 760 765
Asp Lys Val Glu Tyr Ile Ile Lys Cys Asp Met Ser Gly Leu Gln Lys
770 775 780
Val Leu Tyr Ala His Met Gln Ser Lys Gly Val Leu Leu Thr Asp Gly
785 790 795 800
Ser Glu Lys Gly Ser Lys Gly Arg Gly Ser Lys Ala Leu Met Asn Thr
805 810 815
Ile Met Gln Leu Arg Lys Leu Cys Asn His Pro Phe Met Phe Gln Asn
820 825 830
Ile Glu Glu Lys Tyr Cys Asp His Val Gly Ile Ala Gly Gly Val Val
835 840 845
Ser Gly Pro Asp Thr Tyr Arg Val Ser Gly Lys Phe Glu Leu Leu Asp
850 855 860
Arg Ile Leu Pro Lys Met Lys Ala Thr Asn His Arg Ile Leu Leu Phe
865 870 875 880
Cys Gln Met Thr Gln Leu Met Thr Ile Met Glu Asp Tyr Leu Asn Trp
885 890 895
Arg Gly Phe Lys Tyr Leu Arg Leu Asp Gly Thr Ile Lys Ser Glu Asp
900 905 910
Arg Gly Asp Leu Leu Ser Lys Phe Asn Asp Lys Asn Ser Glu Tyr Phe
915 920 925
Leu Phe Leu Leu Ser Thr Arg Ala Gly Gly Leu Gly Leu Asn Leu Gln
930 935 940
Thr Ala Asp Thr Val Ile Ile Phe Asp Ser Asp Trp Asn Pro His Gln
945 950 955 960
Asp Leu Gln Ala Gln Asp Arg Ala His Arg Ile Gly Gln Gln Asn Glu
965 970 975
Val Arg Val Leu Arg Leu Met Thr Val Asn Ser Val Glu Glu Arg Ile
980 985 990
Leu Ala Ala Ala Lys Tyr Lys Leu Thr Met Asp Glu Lys Val Ile Gln
995 1000 1005
Ala Gly Met Phe Asp Gln Lys Ser Thr Gly Ser Glu Arg Gln Gln
1010 1015 1020
Phe Leu Gln Ser Ile Leu His Asn Asp Gly Ser Asp Glu Glu Glu
1025 1030 1035
Glu Asn Glu Val Pro Asp Asp Glu Thr Val Asn Gln Met Ile Ala
1040 1045 1050
Arg Thr Glu Asp Glu Phe Gln Leu Phe Gln Lys Met Asp Thr Glu
1055 1060 1065
Arg Lys Glu Glu Asn Glu Lys Leu Gly Gln His Lys Lys Ser Arg
1070 1075 1080
Leu Val Gln Glu Cys Glu Leu Pro Asp Trp Leu Thr Lys Pro Asp
1085 1090 1095
Glu Asp Asp Gly Trp Gly Asp Asp Tyr Thr Glu Ala Leu Leu Gly
1100 1105 1110
Arg Gly Thr Arg Gln Arg Lys Glu Val Asp Tyr Ala Asp Ser Leu
1115 1120 1125
Thr Glu Lys Glu Trp Leu Lys Ala Ile Asp Glu Asp Gly Asp Tyr
1130 1135 1140
Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Lys Val Gln Lys Lys Arg Gly Arg
1145 1150 1155
Lys Arg Arg Lys Arg Asp Asp Ser Asp Asp Asp Thr Ser Ser Ser
1160 1165 1170
Thr Arg Arg Arg Lys Leu Pro Gln Ser Gln Val Glu Ala Arg Leu
1175 1180 1185
Lys Arg Lys Met Lys Lys Leu Met Asn Ile Val Thr Asn Tyr Lys
1190 1195 1200
Asp Arg Asp Gly Arg Gln Leu Ser Asp Gln Phe Ile Lys Leu Pro
1205 1210 1215
Pro Arg Lys Glu Tyr Pro Asp Tyr Tyr Thr Ile Ile Lys Lys Pro
1220 1225 1230
Ile Asp Ile Ser Lys Ile Leu Asn Tyr Ile Asp Asp Gly Lys Tyr
1235 1240 1245
Ser Asp Phe Ser Asp Leu Glu Arg Asp Phe Met Leu Leu Cys Gln
1250 1255 1260
Asn Ala Gln Ile Tyr Asn Glu Glu Ala Ser Leu Ile His Glu Asp
1265 1270 1275
Ser Ile Val Leu Gln Ser Val Phe Ser Ser Ala Lys Gln Lys Ile
1280 1285 1290
Glu Ala Ser Pro Asp Ser Asp Asp Glu Lys Asp Asp Asn Asn Ser
1295 1300 1305
Asp Val Glu Thr Pro Lys Asn Lys Asn Lys Pro Gly Lys Gly Lys
1310 1315 1320
Arg Arg Pro Gly Arg Pro Arg Arg Ser Ala Lys Lys Tyr Ile Ser
1325 1330 1335
Asp Asp Asp Asp Asp Asp
1340
<210> 5
<211> 5134
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 5
acagttaaat attgaaaatg gcctggtgtt ttgataaaac ggaagaggcg aatttctagt 60
agcattttaa ggtttcattt gcatttaaaa caaattcatg tattataaaa tgtaggatac 120
gtttcctcgt atccatctac ttaatttagg ataacaataa agggtgtgag acagttaaat 180
attgaaaatg gccagtgctt cattattacc caaaactttc acttctattg gtggcaaagc 240
cctacctacc aactcacaac aaaacattca gtcaaaattt aaagagatta cagttccacc 300
aggaaatact cctcaagatg ttaaagaagg ccccagtcac caatcaaatc caaaccattt 360
ggcttctctt caaaaggcca ttgaaactat ggaagagaag ggcttacaag ctgatcctag 420
atattcacag ttacttgcat tgcgagctag cattcctggg gcagaagaaa atggttctcc 480
cttctcaaac aaccaaatca agcaattaag aaaccaaata atggcttaca ggtgtttggc 540
aagaaatcaa cctgttccaa acaatttagt attaggtttg catggaaaaa ctcctgaaaa 600
agttccacat attgtacctc caccgcaacc tcaagaagta cctaatgggg gcgatccagg 660
accttcaaca agttctgctg ctgctgtagc tcctagaaca ccacaaaagc tgccagcaaa 720
accaattgag gctcagcttg tcaacagaga accaagagtc actactttat ctaaaccatc 780
ttccatagac cctgttgttc tattacaaga acgagaaaac agggtagcag ctcgtatagc 840
agcgaggatt gaacaagtca gtaatctgcc gactgatatg tctgaggcat tacgtattcg 900
ggcacaaata gaactcagag ctttgagatg tctaaacctc cagagacaac ttcgtagtga 960
ggttttgagc tgtattcgac gggacacaac attagaaaca gcagtaaatg taaaagcgtt 1020
taaacggacc aaacgtcaag gtcttcgaga agctagagca acagaaaaac ttgagaaaca 1080
acaaaagctg gaagcagaga gaaagaaacg ccagaagaac caagagttct taaacaatgt 1140
gatggcacac gctaaagatt tcaaagaatt ccacaggcag aaccaagcaa aactttctaa 1200
acttaataaa gctattctta cttatcacgc taatgcggag agagaacaaa agaaggaaca 1260
agagagaaga gaaaaggaac gtatgaagaa attgatggca gaagatgaag aaggttatag 1320
acagttgatc gatcaaaaga aagacaaacg tctagcgttc ttgctttcgc aaacagatga 1380
gtatataact aacctcacgg agatggtaaa gcaacacaag ttggaacaaa ccaataaaaa 1440
gaaagaggag gaaaaacgca agaagaagca gcagaaaatg caacaaccag ataggaaagt 1500
tacagttctg gaaactgcaa caggtaaaaa agtaacagga gaggctgctc ctacactgcg 1560
acaagttcag gaatggttaa tccaacatcc tggatgggag atggtcgata cagatgatga 1620
ggatgatgaa aacggggaga agagggatga tgactatgat gaaaatcaag aagtggatga 1680
tgcaaaagaa gttattaaaa aagctaaagt tgaagatgac gaatatcaca aaaacacaaa 1740
agaagaacag acttactaca gtattgctca cactgttcat gaagtggtaa cagaacaagc 1800
atccattctg gttaatggaa agcttaagga atatcaaatt agagggttag aatggatggt 1860
gtctttgtac aataacaatc tgaatggtat tctagcagat gagatgggtc taggtaaaac 1920
cattcaaacg attggcttgt tgacctattt gatggaaaaa aagaagataa atggaccgtt 1980
tttgatcata gtgccacttt caaccatttc taattggatg ttggaatttc aaaagtgggc 2040
ccctactgta gttgtcattt catacaaagg ctctcctgtg gttagaaaag tgatccagag 2100
ccagttaaaa gctgctaaat tcaatgtgct tctcactacc tacgagtaca ttattaagga 2160
caagggtgta ttagcaaaaa tcccatttaa atatatgatc atagatgagg gtcatcgtat 2220
gaaaaaccac cactgcaaat tgactcaagt cctgaatacg cactatttgg cgccctacag 2280
actcctgctt actggtactc ccctacaaaa taaattacca gaattatggg ccttgttgaa 2340
tttcttgttg ccttcgattt tcaagagttg ctccactttt gaacaatggt tcaatgcgcc 2400
attcgcaaca acaggagaaa aggttgagtt aaacgaagaa gaaactatcc ttatcatccg 2460
tcgtcttcac aaagtactca ggccgtttct cctgagacgt ctcaagaaag aagtcgaatc 2520
tcagcttcca gacaaagtgg aatatatcat aaagtgtgac atgtcgggcc tacaaaaggt 2580
tctctatgca cacatgcaga gcaagggtgt gttacttacc gatggttccg agaagggcag 2640
taaaggaagg ggatctaagg cactgatgaa caccattatg cagctgagga aactgtgcaa 2700
tcatccgttt atgttccaaa atatcgaaga gaaatattgt gatcatgttg gtattgctgg 2760
tggagtggtt tctggacccg acacttatag ggtatctggt aagtttgagc tcttggacag 2820
aatattgccc aaaatgaaag caactaacca taggattctt cttttctgtc aaatgactca 2880
attaatgacc atcatggaag attatctaaa ttggagagga ttcaaatatc ttcgtcttga 2940
tggtacaatc aaatcagaag atcgcgggga cctattatcg aaatttaatg ataaaaatag 3000
tgaatatttt ttgtttttgc tatctacacg ggctggaggt ctgggactta atttgcagac 3060
agctgatact gtgattatct tcgattccga ttggaatcct catcaggatt tacaagctca 3120
ggatcgagct catcgtattg gacagcaaaa tgaggtccga gttttgcgtt tgatgactgt 3180
taactctgtt gaggaacgaa ttttagctgc agctaaatac aagcttacta tggacgaaaa 3240
ggtcattcaa gctggtatgt tcgatcagaa gtctacaggc tcagagagac atcagttttt 3300
gcagagtatt ttacaccatg acggaagcga cgaagaagag gaaaacgaag ttcctgatga 3360
cgaaacagtg aaccagatgt tggcccgaag ggaaaacgaa tttcagcttt tccagaagat 3420
ggatcaggaa agaaaggaag aagatgaaaa gaccggaaag tcgcgactta ttcaagaaag 3480
cgaattgccc gaatggctgt tgaagcaaga cgatgaaatc tactcgtggg gccttgatga 3540
tccagatgct gttttaggaa ggggtagtag gcaaagaaaa gaagttgatt atgttgacag 3600
cctgacggag aaagagtggc ttaaggctat tgacgaagag ggagaatttg aggaagaaca 3660
agaaggtgat aaagaaggtc tcagaaagaa aagagggagg aagaggaaga agcgcgatga 3720
tgacgaagag gcaagccaaa ttaagagaag aaaggtgcat ctagccgaga tcaagatgaa 3780
gaaaaagatg aagaggctta tggaagttgt tgtgaactac agggacaggg atggtagagt 3840
attgagcgaa ccgtttatga aacttccatc aaagaaggag ttacctgagt attacgatac 3900
gattaagaaa cctattgata ttgaaaaagt cgttgccaac gtagaagaag gaaaatattt 3960
cacgatgcac gatttggaaa gagatttcga cttgctgtgc caaaacgccc aacaatacaa 4020
cgaagaagac tccatgatct acgaggacag cctcgttctt cgacaggtgt ttagaagcgc 4080
gagggaaaag atcgacggta cctcagacca cgacgacaac gccgatggac cggcggtggc 4140
tcagatcaaa cgacctcgtg gtagacctcg aaaacacaag agacccgaag agatcgaggc 4200
cgaagcggcg gctcagaaag ctatggagga ggcatcgaag ctgagagctc aagctgaggc 4260
ggaagagctt agatctaagg tggaggaggc atctcagaga gccaaagagg aagcgaaagc 4320
aagggaggaa gccaaagcta gggaagaagc cgaaatcgag aacatggagg agattcccac 4380
aagcacatga tctatagagc aaccggaaac aaaaaggcaa aaaagaaata ttatatagaa 4440
aagatgtaca tgttcaatgg agatacattt tcgccgagtt acaacgggta atgcttttac 4500
aacggatatt ttgacgtatg aatgttgacg ttcagatgaa gtatatttat aaaataatcc 4560
agacctttac gttttggttg atttgttttc tgtattgttc agtttattga acaaccatta 4620
atagcagctt acctaaatga tttagaaaag catctgagtt atttagataa gttttgagat 4680
tatatttatt aactttaata ttactatctt tattatagca tattgtaatt attttttcct 4740
gtccttcttt cgttgtgtgg tagataatcc gagagtcaac agttataagc aaatgaaatt 4800
cagttaaacc tcaaatgtac aaaatgatca aattaatgtt tacaatttat ttttttacca 4860
cgcacattca ctattactat tgtcagtcat tgagatatca ttttatatag ctccatgtct 4920
gtcttcctca atttacagag aagcaattag acaagtaatg acataatatg gtgctgaaat 4980
aatgtgcttg atagtgatgt tcacaaagta actattcgtt acaaagtact cgttacttac 5040
aaataccgaa actaacgatt actatacaga gaggcaaatc gttactttga ttacactgat 5100
tacttcgtat caatcgtatc agagcgagta acga 5134
<210> 6
<211> 1400
<212> PRT
<213> Diabrotica virgifera
<400> 6
Met Ala Ser Ala Ser Leu Leu Pro Lys Thr Phe Thr Ser Ile Gly Gly
1 5 10 15
Lys Ala Leu Pro Thr Asn Ser Gln Gln Asn Ile Gln Ser Lys Phe Lys
20 25 30
Glu Ile Thr Val Pro Pro Gly Asn Thr Pro Gln Asp Val Lys Glu Gly
35 40 45
Pro Ser His Gln Ser Asn Pro Asn His Leu Ala Ser Leu Gln Lys Ala
50 55 60
Ile Glu Thr Met Glu Glu Lys Gly Leu Gln Ala Asp Pro Arg Tyr Ser
65 70 75 80
Gln Leu Leu Ala Leu Arg Ala Ser Ile Pro Gly Ala Glu Glu Asn Gly
85 90 95
Ser Pro Phe Ser Asn Asn Gln Ile Lys Gln Leu Arg Asn Gln Ile Met
100 105 110
Ala Tyr Arg Cys Leu Ala Arg Asn Gln Pro Val Pro Asn Asn Leu Val
115 120 125
Leu Gly Leu His Gly Lys Thr Pro Glu Lys Val Pro His Ile Val Pro
130 135 140
Pro Pro Gln Pro Gln Glu Val Pro Asn Gly Gly Asp Pro Gly Pro Ser
145 150 155 160
Thr Ser Ser Ala Ala Ala Val Ala Pro Arg Thr Pro Gln Lys Leu Pro
165 170 175
Ala Lys Pro Ile Glu Ala Gln Leu Val Asn Arg Glu Pro Arg Val Thr
180 185 190
Thr Leu Ser Lys Pro Ser Ser Ile Asp Pro Val Val Leu Leu Gln Glu
195 200 205
Arg Glu Asn Arg Val Ala Ala Arg Ile Ala Ala Arg Ile Glu Gln Val
210 215 220
Ser Asn Leu Pro Thr Asp Met Ser Glu Ala Leu Arg Ile Arg Ala Gln
225 230 235 240
Ile Glu Leu Arg Ala Leu Arg Cys Leu Asn Leu Gln Arg Gln Leu Arg
245 250 255
Ser Glu Val Leu Ser Cys Ile Arg Arg Asp Thr Thr Leu Glu Thr Ala
260 265 270
Val Asn Val Lys Ala Phe Lys Arg Thr Lys Arg Gln Gly Leu Arg Glu
275 280 285
Ala Arg Ala Thr Glu Lys Leu Glu Lys Gln Gln Lys Leu Glu Ala Glu
290 295 300
Arg Lys Lys Arg Gln Lys Asn Gln Glu Phe Leu Asn Asn Val Met Ala
305 310 315 320
His Ala Lys Asp Phe Lys Glu Phe His Arg Gln Asn Gln Ala Lys Leu
325 330 335
Ser Lys Leu Asn Lys Ala Ile Leu Thr Tyr His Ala Asn Ala Glu Arg
340 345 350
Glu Gln Lys Lys Glu Gln Glu Arg Arg Glu Lys Glu Arg Met Lys Lys
355 360 365
Leu Met Ala Glu Asp Glu Glu Gly Tyr Arg Gln Leu Ile Asp Gln Lys
370 375 380
Lys Asp Lys Arg Leu Ala Phe Leu Leu Ser Gln Thr Asp Glu Tyr Ile
385 390 395 400
Thr Asn Leu Thr Glu Met Val Lys Gln His Lys Leu Glu Gln Thr Asn
405 410 415
Lys Lys Lys Glu Glu Glu Lys Arg Lys Lys Lys Gln Gln Lys Met Gln
420 425 430
Gln Pro Asp Arg Lys Val Thr Val Leu Glu Thr Ala Thr Gly Lys Lys
435 440 445
Val Thr Gly Glu Ala Ala Pro Thr Leu Arg Gln Val Gln Glu Trp Leu
450 455 460
Ile Gln His Pro Gly Trp Glu Met Val Asp Thr Asp Asp Glu Asp Asp
465 470 475 480
Glu Asn Gly Glu Lys Arg Asp Asp Asp Tyr Asp Glu Asn Gln Glu Val
485 490 495
Asp Asp Ala Lys Glu Val Ile Lys Lys Ala Lys Val Glu Asp Asp Glu
500 505 510
Tyr His Lys Asn Thr Lys Glu Glu Gln Thr Tyr Tyr Ser Ile Ala His
515 520 525
Thr Val His Glu Val Val Thr Glu Gln Ala Ser Ile Leu Val Asn Gly
530 535 540
Lys Leu Lys Glu Tyr Gln Ile Arg Gly Leu Glu Trp Met Val Ser Leu
545 550 555 560
Tyr Asn Asn Asn Leu Asn Gly Ile Leu Ala Asp Glu Met Gly Leu Gly
565 570 575
Lys Thr Ile Gln Thr Ile Gly Leu Leu Thr Tyr Leu Met Glu Lys Lys
580 585 590
Lys Ile Asn Gly Pro Phe Leu Ile Ile Val Pro Leu Ser Thr Ile Ser
595 600 605
Asn Trp Met Leu Glu Phe Gln Lys Trp Ala Pro Thr Val Val Val Ile
610 615 620
Ser Tyr Lys Gly Ser Pro Val Val Arg Lys Val Ile Gln Ser Gln Leu
625 630 635 640
Lys Ala Ala Lys Phe Asn Val Leu Leu Thr Thr Tyr Glu Tyr Ile Ile
645 650 655
Lys Asp Lys Gly Val Leu Ala Lys Ile Pro Phe Lys Tyr Met Ile Ile
660 665 670
Asp Glu Gly His Arg Met Lys Asn His His Cys Lys Leu Thr Gln Val
675 680 685
Leu Asn Thr His Tyr Leu Ala Pro Tyr Arg Leu Leu Leu Thr Gly Thr
690 695 700
Pro Leu Gln Asn Lys Leu Pro Glu Leu Trp Ala Leu Leu Asn Phe Leu
705 710 715 720
Leu Pro Ser Ile Phe Lys Ser Cys Ser Thr Phe Glu Gln Trp Phe Asn
725 730 735
Ala Pro Phe Ala Thr Thr Gly Glu Lys Val Glu Leu Asn Glu Glu Glu
740 745 750
Thr Ile Leu Ile Ile Arg Arg Leu His Lys Val Leu Arg Pro Phe Leu
755 760 765
Leu Arg Arg Leu Lys Lys Glu Val Glu Ser Gln Leu Pro Asp Lys Val
770 775 780
Glu Tyr Ile Ile Lys Cys Asp Met Ser Gly Leu Gln Lys Val Leu Tyr
785 790 795 800
Ala His Met Gln Ser Lys Gly Val Leu Leu Thr Asp Gly Ser Glu Lys
805 810 815
Gly Ser Lys Gly Arg Gly Ser Lys Ala Leu Met Asn Thr Ile Met Gln
820 825 830
Leu Arg Lys Leu Cys Asn His Pro Phe Met Phe Gln Asn Ile Glu Glu
835 840 845
Lys Tyr Cys Asp His Val Gly Ile Ala Gly Gly Val Val Ser Gly Pro
850 855 860
Asp Thr Tyr Arg Val Ser Gly Lys Phe Glu Leu Leu Asp Arg Ile Leu
865 870 875 880
Pro Lys Met Lys Ala Thr Asn His Arg Ile Leu Leu Phe Cys Gln Met
885 890 895
Thr Gln Leu Met Thr Ile Met Glu Asp Tyr Leu Asn Trp Arg Gly Phe
900 905 910
Lys Tyr Leu Arg Leu Asp Gly Thr Ile Lys Ser Glu Asp Arg Gly Asp
915 920 925
Leu Leu Ser Lys Phe Asn Asp Lys Asn Ser Glu Tyr Phe Leu Phe Leu
930 935 940
Leu Ser Thr Arg Ala Gly Gly Leu Gly Leu Asn Leu Gln Thr Ala Asp
945 950 955 960
Thr Val Ile Ile Phe Asp Ser Asp Trp Asn Pro His Gln Asp Leu Gln
965 970 975
Ala Gln Asp Arg Ala His Arg Ile Gly Gln Gln Asn Glu Val Arg Val
980 985 990
Leu Arg Leu Met Thr Val Asn Ser Val Glu Glu Arg Ile Leu Ala Ala
995 1000 1005
Ala Lys Tyr Lys Leu Thr Met Asp Glu Lys Val Ile Gln Ala Gly
1010 1015 1020
Met Phe Asp Gln Lys Ser Thr Gly Ser Glu Arg His Gln Phe Leu
1025 1030 1035
Gln Ser Ile Leu His His Asp Gly Ser Asp Glu Glu Glu Glu Asn
1040 1045 1050
Glu Val Pro Asp Asp Glu Thr Val Asn Gln Met Leu Ala Arg Arg
1055 1060 1065
Glu Asn Glu Phe Gln Leu Phe Gln Lys Met Asp Gln Glu Arg Lys
1070 1075 1080
Glu Glu Asp Glu Lys Thr Gly Lys Ser Arg Leu Ile Gln Glu Ser
1085 1090 1095
Glu Leu Pro Glu Trp Leu Leu Lys Gln Asp Asp Glu Ile Tyr Ser
1100 1105 1110
Trp Gly Leu Asp Asp Pro Asp Ala Val Leu Gly Arg Gly Ser Arg
1115 1120 1125
Gln Arg Lys Glu Val Asp Tyr Val Asp Ser Leu Thr Glu Lys Glu
1130 1135 1140
Trp Leu Lys Ala Ile Asp Glu Glu Gly Glu Phe Glu Glu Glu Gln
1145 1150 1155
Glu Gly Asp Lys Glu Gly Leu Arg Lys Lys Arg Gly Arg Lys Arg
1160 1165 1170
Lys Lys Arg Asp Asp Asp Glu Glu Ala Ser Gln Ile Lys Arg Arg
1175 1180 1185
Lys Val His Leu Ala Glu Ile Lys Met Lys Lys Lys Met Lys Arg
1190 1195 1200
Leu Met Glu Val Val Val Asn Tyr Arg Asp Arg Asp Gly Arg Val
1205 1210 1215
Leu Ser Glu Pro Phe Met Lys Leu Pro Ser Lys Lys Glu Leu Pro
1220 1225 1230
Glu Tyr Tyr Asp Thr Ile Lys Lys Pro Ile Asp Ile Glu Lys Val
1235 1240 1245
Val Ala Asn Val Glu Glu Gly Lys Tyr Phe Thr Met His Asp Leu
1250 1255 1260
Glu Arg Asp Phe Asp Leu Leu Cys Gln Asn Ala Gln Gln Tyr Asn
1265 1270 1275
Glu Glu Asp Ser Met Ile Tyr Glu Asp Ser Leu Val Leu Arg Gln
1280 1285 1290
Val Phe Arg Ser Ala Arg Glu Lys Ile Asp Gly Thr Ser Asp His
1295 1300 1305
Asp Asp Asn Ala Asp Gly Pro Ala Val Ala Gln Ile Lys Arg Pro
1310 1315 1320
Arg Gly Arg Pro Arg Lys His Lys Arg Pro Glu Glu Ile Glu Ala
1325 1330 1335
Glu Ala Ala Ala Gln Lys Ala Met Glu Glu Ala Ser Lys Leu Arg
1340 1345 1350
Ala Gln Ala Glu Ala Glu Glu Leu Arg Ser Lys Val Glu Glu Ala
1355 1360 1365
Ser Gln Arg Ala Lys Glu Glu Ala Lys Ala Arg Glu Glu Ala Lys
1370 1375 1380
Ala Arg Glu Glu Ala Glu Ile Glu Asn Met Glu Glu Ile Pro Thr
1385 1390 1395
Ser Thr
1400
<210> 7
<211> 538
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 7
agtgtattag caaaaatccc atttaaatat atgatcatag atgagggtca tcgtatgaaa 60
aaccaccact gcaaattgac tcaagtcctg aatacgcact atttggcgcc ctacagactc 120
ctgcttactg gtactcccct acaaaataaa ttaccagaat tatgggcctt gttgaatttc 180
ttgttgcctt cgattttcaa gagttgctcc acttttgaac aatggttcaa tgcgccattc 240
gcaacaacag gagaaaaggt tgagttaaac gaagaagaaa ctatccttat catccgtcgt 300
cttcacaaag tactcaggcc gtttctcctg agacgtctca agaaagaagt cgaatctcag 360
cttccagaca aagtggaata tatcataaag tgtgacatgt cgggcctaca aaaggttctc 420
tatgcacaca tgcagagcaa gggtgtgtta cttaccgatg gttccgagaa gggcagtaaa 480
ggaaggggat ctaaggacaa ctagatgaac accattatgc agctgaggaa actgtgct 538
<210> 8
<211> 352
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 8
ttgaactgta ttaggagaga tataacgctt gaatctgctg taaattttaa agcatataaa 60
agaacgaagc gacagggtct aaaagaatcg agagctacag agaagttaga aaaacaacag 120
aagttagaag cagaaagaaa gagaagacag aagaaccaag aatttttgaa tgctgtattg 180
aacaatggaa aagaattcaa ggaattccac aagcagaatc aagcgaaatt agctaagatt 240
aataaagctg ttattaatta tcacgctaat gctgaaagag agcaaaagaa agaagcagaa 300
aggagagaga aggaacgtat gatcagattg atggcagaag atgaagaagg tt 352
<210> 9
<211> 178
<212> PRT
<213> Diabrotica virgifera
<400> 9
Ser Val Leu Ala Lys Ile Pro Phe Lys Tyr Met Ile Ile Asp Glu Gly
1 5 10 15
His Arg Met Lys Asn His His Cys Lys Leu Thr Gln Val Leu Asn Thr
20 25 30
His Tyr Leu Ala Pro Tyr Arg Leu Leu Leu Thr Gly Thr Pro Leu Gln
35 40 45
Asn Lys Leu Pro Glu Leu Trp Ala Leu Leu Asn Phe Leu Leu Pro Ser
50 55 60
Ile Phe Lys Ser Cys Ser Thr Phe Glu Gln Trp Phe Asn Ala Pro Phe
65 70 75 80
Ala Thr Thr Gly Glu Lys Val Glu Leu Asn Glu Glu Glu Thr Ile Leu
85 90 95
Ile Ile Arg Arg Leu His Lys Val Leu Arg Pro Phe Leu Leu Arg Arg
100 105 110
Leu Lys Lys Glu Val Glu Ser Gln Leu Pro Asp Lys Val Glu Tyr Ile
115 120 125
Ile Lys Cys Asp Met Ser Gly Leu Gln Lys Val Leu Tyr Ala His Met
130 135 140
Gln Ser Lys Gly Val Leu Leu Thr Asp Gly Ser Glu Lys Gly Ser Lys
145 150 155 160
Gly Arg Gly Ser Lys Asp Asn Met Asn Thr Ile Met Gln Leu Arg Lys
165 170 175
Leu Cys
<210> 10
<211> 459
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 10
atgagggtca tcgtatgaaa aaccaccact gcaaattgac tcaagtcctg aatacgcact 60
atttggcgcc ctacagactc ctgcttactg gtactcccct acaaaataaa ttaccagaat 120
tatgggcctt gttgaatttc ttgttgcctt cgattttcaa gagttgctcc acttttgaac 180
aatggttcaa tgcgccattc gcaacaacag gagaaaaggt tgagttaaac gaagaagaaa 240
ctatccttat catccgtcgt cttcacaaag tactcaggcc gtttctcctg agacgtctca 300
agaaagaagt cgaatctcag cttccagaca aagtggaata tatcataaag tgtgacatgt 360
cgggcctaca aaaggttctc tatgcacaca tgcagagcaa gggtgtgtta cttaccgatg 420
gttccgagaa gggcagtaaa ggaaggggat ctaaggaca 459
<210> 11
<211> 503
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> YFP coding region
<400> 11
caccatgggc tccagcggcg ccctgctgtt ccacggcaag atcccctacg tggtggagat 60
ggagggcaat gtggatggcc acaccttcag catccgcggc aagggctacg gcgatgccag 120
cgtgggcaag gtggatgccc agttcatctg caccaccggc gatgtgcccg tgccctggag 180
caccctggtg accaccctga cctacggcgc ccagtgcttc gccaagtacg gccccgagct 240
gaaggatttc tacaagagct gcatgcccga tggctacgtg caggagcgca ccatcacctt 300
cgagggcgat ggcaatttca agacccgcgc cgaggtgacc ttcgagaatg gcagcgtgta 360
caatcgcgtg aagctgaatg gccagggctt caagaaggat ggccacgtgc tgggcaagaa 420
tctggagttc aatttcaccc cccactgcct gtacatctgg ggcgatcagg ccaatcacgg 480
cctgaagagc gccttcaaga tct 503
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T7噬菌体启动子
<400> 12
taatacgact cactataggg 20
<210> 13
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物BrahmaVar2_FT7
<400> 13
ttaatacgac tcactatagg gagaatgagg gtcatcgtat gaaaaacc 48
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物BrahmaVar2_R
<400> 14
tgtccttaga tccccttcct ttac 24
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物BrahmaVar2_F
<400> 15
atgagggtca tcgtatgaaa aacc 24
<210> 16
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物BrahmaVar2_RT7
<400> 16
ttaatacgac tcactatagg gagatgtcct tagatcccct tcctttac 48
<210> 17
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Brahma352_FT7
<400> 17
taatacgact cactataggg aaccttcttc atcttctg 38
<210> 18
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Brahma352_RT7
<400> 18
taatacgact cactataggg ttgaactgta ttaggagag 39
<210> 19
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物YFP-F_T7
<400> 19
ttaatacgac tcactatagg gagacaccat gggctccagc ggcgccc 47
<210> 20
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物YFP-R_T7
<400> 20
ttaatacgac tcactatagg gagaagatct tgaaggcgct cttcagg 47
<210> 21
<211> 218
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 21
tagctctgat gacagagccc atcgagtttc aagccaaaca gttgcataaa gctatcagcg 60
gattgggaac tgatgaaagt acaatmgtmg aaattttaag tgtmcacaac aacgatgaga 120
ttataagaat ttcccaggcc tatgaaggat tgtaccaacg mtcattggaa tctgatatca 180
aaggagatac ctcaggaaca ttaaaaaaga attattag 218
<210> 22
<211> 424
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<220>
<221> misc_feature
<222> (393)..(395)
<223> n为a、c、g或t
<400> 22
ttgttacaag ctggagaact tctctttgct ggaaccgaag agtcagtatt taatgctgta 60
ttctgtcaaa gaaataaacc acaattgaat ttgatattcg acaaatatga agaaattgtt 120
gggcatccca ttgaaaaagc cattgaaaac gagttttcag gaaatgctaa acaagccatg 180
ttacacctta tccagagcgt aagagatcaa gttgcatatt tggtaaccag gctgcatgat 240
tcaatggcag gcgtcggtac tgacgataga actttaatca gaattgttgt ttcgagatct 300
gaaatcgatc tagaggaaat caaacaatgc tatgaagaaa tctacagtaa aaccttggct 360
gataggatag cggatgacac atctggcgac tannnaaaag ccttattagc cgttgttggt 420
taag 424
<210> 23
<211> 397
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 23
agatgttggc tgcatctaga gaattacaca agttcttcca tgattgcaag gatgtactga 60
gcagaatagt ggaaaaacag gtatccatgt ctgatgaatt gggaagggac gcaggagctg 120
tcaatgccct tcaacgcaaa caccagaact tcctccaaga cctacaaaca ctccaatcga 180
acgtccaaca aatccaagaa gaatcagcta aacttcaagc tagctatgcc ggtgatagag 240
ctaaagaaat caccaacagg gagcaggaag tggtagcagc ctgggcagcc ttgcagatcg 300
cttgcgatca gagacacgga aaattgagcg atactggtga tctattcaaa ttctttaact 360
tggtacgaac gttgatgcag tggatggacg aatggac 397
<210> 24
<211> 490
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 24
gcagatgaac accagcgaga aaccaagaga tgttagtggt gttgaattgt tgatgaacaa 60
ccatcagaca ctcaaggctg agatcgaagc cagagaagac aactttacgg cttgtatttc 120
tttaggaaag gaattgttga gccgtaatca ctatgctagt gctgatatta aggataaatt 180
ggtcgcgttg acgaatcaaa ggaatgctgt actacagagg tgggaagaaa gatgggagaa 240
cttgcaactc atcctcgagg tataccaatt cgccagagat gcggccgtcg ccgaagcatg 300
gttgatcgca caagaacctt acttgatgag ccaagaacta ggacacacca ttgacgacgt 360
tgaaaacttg ataaagaaac acgaagcgtt cgaaaaatcg gcagcggcgc aagaagagag 420
attcagtgct ttggagagac tgacgacgtt cgaattgaga gaaataaaga ggaaacaaga 480
agctgcccag 490
<210> 25
<211> 330
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 25
agtgaaatgt tagcaaatat aacatccaag tttcgtaatt gtacttgctc agttagaaaa 60
tattctgtag tttcactatc ttcaaccgaa aatagaataa atgtagaacc tcgcgaactt 120
gcctttcctc caaaatatca agaacctcga caagtttggt tggagagttt agatacgata 180
gacgacaaaa aattgggtat tcttgagctg catcctgatg tttttgctac taatccaaga 240
atagatatta tacatcaaaa tgttagatgg caaagtttat atagatatgt aagctatgct 300
catacaaagt caagatttga agtgagaggt 330
<210> 26
<211> 320
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 26
caaagtcaag atttgaagtg agaggtggag gtcgaaaacc gtggccgcaa aagggattgg 60
gacgtgctcg acatggttca attagaagtc cactttggag aggtggagga gttgttcatg 120
gaccaaaatc tccaacccct catttttaca tgattccatt ctacacccgt ttgctgggtt 180
tgactagcgc actttcagta aaatttgccc aagatgactt gcacgttgtg gatagtctag 240
atctgccaac tgacgaacaa agttatatag aagagctggt caaaagccgc ttttgggggt 300
ccttcttgtt ttatttgtag 320
<210> 27
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Ann-F1_T7
<400> 27
ttaatacgac tcactatagg gagagctcca acagtggttc cttatc 46
<210> 28
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Ann-R1
<400> 28
ctaataattc ttttttaatg ttcctgagg 29
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Ann-F1
<400> 29
gctccaacag tggttcctta tc 22
<210> 30
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Ann-R1_T7
<400> 30
ttaatacgac tcactatagg gagactaata attctttttt aatgttcctg agg 53
<210> 31
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Ann-F2_T7
<400> 31
ttaatacgac tcactatagg gagattgtta caagctggag aacttctc 48
<210> 32
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Ann-R2
<400> 32
cttaaccaac aacggctaat aagg 24
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Ann-F2
<400> 33
ttgttacaag ctggagaact tctc 24
<210> 34
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Ann-R2T7
<400> 34
ttaatacgac tcactatagg gagacttaac caacaacggc taataagg 48
<210> 35
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Betasp2-F1_T7
<400> 35
ttaatacgac tcactatagg gagaagatgt tggctgcatc tagagaa 47
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Betasp2-R1
<400> 36
gtccattcgt ccatccactg ca 22
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Betasp2-F1
<400> 37
agatgttggc tgcatctaga gaa 23
<210> 38
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Betasp-R1_T7
<400> 38
ttaatacgac tcactatagg gagagtccat tcgtccatcc actgca 46
<210> 39
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Betasp2-F2_T7
<400> 39
ttaatacgac tcactatagg gagagcagat gaacaccagc gagaaa 46
<210> 40
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Betasp2-R2
<400> 40
ctgggcagct tcttgtttcc tc 22
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Betasp2-F2
<400> 41
gcagatgaac accagcgaga aa 22
<210> 42
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Betasp2-R2_T7
<400> 42
ttaatacgac tcactatagg gagactgggc agcttcttgt ttcctc 46
<210> 43
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物L4-F1_T7
<400> 43
ttaatacgac tcactatagg gagaagtgaa atgttagcaa atataacatc c 51
<210> 44
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物L4-R1
<400> 44
acctctcact tcaaatcttg actttg 26
<210> 45
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物L4-F1
<400> 45
agtgaaatgt tagcaaatat aacatcc 27
<210> 46
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物L4-R1_T7
<400> 46
ttaatacgac tcactatagg gagaacctct cacttcaaat cttgactttg 50
<210> 47
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物L4-F2_T7
<400> 47
ttaatacgac tcactatagg gagacaaagt caagatttga agtgagaggt 50
<210> 48
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物L4-R2
<400> 48
ctacaaataa aacaagaagg acccc 25
<210> 49
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物L4-F2
<400> 49
caaagtcaag atttgaagtg agaggt 26
<210> 50
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物L4-R2_T7
<400> 50
ttaatacgac tcactatagg gagactacaa ataaaacaag aaggacccc 49
<210> 51
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物YFP-R
<400> 51
agatcttgaa ggcgctcttc agg 23
<210> 52
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物YFP-F
<400> 52
caccatgggc tccagcggcg ccc 23
<210> 53
<211> 370
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GFP部分编码区
<400> 53
aagtgatgct acatacggaa agcttaccct taaatttatt tgcactactg gaaaactacc 60
tgttccatgg ccaacacttg tcactacttt ctcttatggt gttcaatgct tttcccgtta 120
tccggatcat atgaaacggc atgacttttt caagagtgcc atgcccgaag gttatgtaca 180
ggaacgcact atatctttca aagatgacgg gaactacaag acgcgtgctg aagtcaagtt 240
tgaaggtgat acccttgtta atcgtatcga gttaaaaggt attgatttta aagaagatgg 300
aaacattctc ggacacaaac tcgagtacaa ctataactca cacaatgtat acatcacggc 360
agacaaacaa 370
<210> 54
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物GFP_T7F
<400> 54
taatacgact cactataggg aaggtgatgc tacatacgga aag 43
<210> 55
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物GFP_T7R
<400> 55
taatacgact cactataggg ttgtttgtct gccgtgat 38
<210> 56
<211> 222
<212> DNA
<213> Solanum tuberosum
<400> 56
gactagtacc ggttgggaaa ggtatgtttc tgcttctacc tttgatatat atataataat 60
tatcactaat tagtagtaat atagtatttc aagtattttt ttcaaaataa aagaatgtag 120
tatatagcta ttgcttttct gtagtttata agtgtgtata ttttaattta taacttttct 180
aatatatgac caaaacatgg tgatgtgcag gttgatccgc gg 222
<210> 57
<211> 812
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Brahma v1 hpRNA编码序列
<400> 57
gcgccctaca gactcctgct tactggtact cccctacaaa ataaattacc agaattatgg 60
gccttgttga atttcttgtt gccttcgatt ttcaagagtt gctccacttt tgaacaatgg 120
ttcaatgcgc cattcgcaac aacaggagaa aaggttgagt taaacgaaga agaaactatc 180
cttatcatcc gtcgtcttca caaagtactc aggccgtttc tcctgagacg tctcaagaaa 240
gaagtcgaat ctcagcttcc agacaaagtg gaatatatca taaagtgtga catgtgacta 300
gtaccggttg ggaaaggtat gtttctgctt ctacctttga tatatatata ataattatca 360
ctaattagta gtaatatagt atttcaagta tttttttcaa aataaaagaa tgtagtatat 420
agctattgct tttctgtagt ttataagtgt gtatatttta atttataact tttctaatat 480
atgaccaaaa catggtgatg tgcaggttga tccgcggaca tgtcacactt tatgatatat 540
tccactttgt ctggaagctg agattcgact tctttcttga gacgtctcag gagaaacggc 600
ctgagtactt tgtgaagacg acggatgata aggatagttt cttcttcgtt taactcaacc 660
ttttctcctg ttgttgcgaa tggcgcattg aaccattgtt caaaagtgga gcaactcttg 720
aaaatcgaag gcaacaagaa attcaacaag gcccataatt ctggtaattt attttgtagg 780
ggagtaccag taagcaggag tctgtagggc gc 812
<210> 58
<211> 822
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Brahma v2 hpRNA编码序列
<400> 58
catataaaag aacgaagcga cagggtctaa aagaatcgag agctacagag aagttagaaa 60
aacaacagaa gttagaagca gaaagaaaga gaagacagaa gaaccaagaa tttttgaatg 120
ctgtattgaa caatggaaaa gaattcaagg aattccacaa gcagaatcaa gcgaaattag 180
ctaagattaa taaagctgtt attaattatc acgctaatgc tgaaagagag caaaagaaag 240
aagcagaaag gagagagaag gaacgtatga tcagattgat ggcagaagat gaagaaggtt 300
gactagtacc ggttgggaaa ggtatgtttc tgcttctacc tttgatatat atataataat 360
tatcactaat tagtagtaat atagtatttc aagtattttt ttcaaaataa aagaatgtag 420
tatatagcta ttgcttttct gtagtttata agtgtgtata ttttaattta taacttttct 480
aatatatgac caaaacatgg tgatgtgcag gttgatccgc ggaaccttct tcatcttctg 540
ccatcaatct gatcatacgt tccttctctc tcctttctgc ttctttcttt tgctctcttt 600
cagcattagc gtgataatta ataacagctt tattaatctt agctaatttc gcttgattct 660
gcttgtggaa ttccttgaat tcttttccat tgttcaatac agcattcaaa aattcttggt 720
tcttctgtct tctctttctt tctgcttcta acttctgttg tttttctaac ttctctgtag 780
ctctcgattc ttttagaccc tgtcgcttcg ttcttttata tg 822
<210> 59
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T20VN primer
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> n为a、c、g或t
<400> 59
tttttttttt tttttttttt vn 22
<210> 60
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P5U76S(F)
<400> 60
tgtgatgttg gtggcgtat 19
<210> 61
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P5U76A(R)
<400> 61
tgttaaataa aaccccaaag atcg 24
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物TIPmxF
<400> 62
gagggtaatg ccaactggtt 20
<210> 63
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物TIPmxR
<400> 63
gcaatgtaac cgagtgtctc tcaa 24
<210> 64
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物HXTIP
<400> 64
tttttggctt agagttgatg gtgtactgat ga 32
<210> 65
<211> 151
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 65
gaccgtaagg cttgatgaaa caacgcggcg agctttgatc aacgaccttt tggaaacttc 60
ggcttcccct ggagagagcg agattctccg cgctgtagaa gtcaccattg ttgtgcacga 120
cgacatcatt ccgtggcgtt atccagctaa g 151
<210> 66
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AAD1部分编码区
<400> 66
tgttcggttc cctctaccaa gcacagaacc gtcgcttcag caacacctca gtcaaggtga 60
tggatgttg 69
<210> 67
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物ST-LS1-F
<400> 67
gtatgtttct gcttctacct ttgat 25
<210> 68
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物ST-LS1-R
<400> 68
ccatgttttg gtcatatatt agaaaagtt 29
<210> 69
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针ST-LS1-P
<400> 69
agtaatatag tatttcaagt atttttttca aaat 34
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物GAAD1-F
<400> 70
tgttcggttc cctctaccaa 20
<210> 71
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物GAAD1-R
<400> 71
caacatccat caccttgact ga 22
<210> 72
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针GAAD1-P
<400> 72
cacagaaccg tcgcttcagc aaca 24
<210> 73
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物IVR1-F
<400> 73
tggcggacga cgacttgt 18
<210> 74
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物IVR1-R
<400> 74
aaagtttgga ggctgccgt 19
<210> 75
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针IVR1-P
<400> 75
cgagcagacc gccgtgtact tctacc 26
<210> 76
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物SPC1A
<400> 76
cttagctgga taacgccac 19
<210> 77
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物SPC1S
<400> 77
gaccgtaagg cttgatgaa 19
<210> 78
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针TQSPEC
<400> 78
cgagattctc cgcgctgtag a 21
<210> 79
<211> 5146
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 79
ttgagaacga gaacacgaac gagtgtatcg tcgtgtttct ttttctttgg ttattgtgta 60
aattaattac aaacgtgtta aaatttactt aaagttagtg atttgtgtat ttatagtttg 120
taagtgatgg catcagatga agaagtggag gattctttcg ccggggagga agatgccccc 180
gacgatacgg ctgaacaaat agataacgat cctgattctg aagatggtgt tcctaaagga 240
ggggaagaag atgatgatta tgaaccagaa gattccagaa agaaaaagaa gggaaagaaa 300
agaaaagcca ggggagaaga aaagaaaggc aagaaaaaga agaaaaagcg aaagaatgat 360
agtggggatg aaagtgactt tggagaagat gataatggag gtggggactc agattatgca 420
agcagtagta aaagaggaag gaaaaagggt tctactaaac actcttctgc atcatcaaca 480
ccaacaccag ctagtgactc tggcacagga ggcatgccca ccatcgagca agtttgttca 540
acatttggtt taactgatgt cgagcttgac tattcagatg ctgatatgca aaacttgacc 600
acctataagt tgttccaaca gcatgtgaga ccgctccttg ctaaggaaaa tccaaaggtt 660
cctatgtcaa agttgatgat gttggttgct gcaaaatggc gcgaattttc taattcaaac 720
cccaatctgc aaagcgaaaa tgaaccgtct gctgcaactt caaccacatc tgaagaaagt 780
tatccaaaaa ctaatcgttc gagagcatcc aaggaagcag cacaaaagat agtagaggct 840
gactctgagc catatgatga cgaatttgat gacgaagacg aggaggaaaa agaagagaaa 900
ggaaagaaaa aaaagagtaa tagaggaagg cctagtaaaa agaaggctac taaagtacca 960
actttaaaga ttaaactagg aaagaggaag cgtggaagtt cggatgaaga gggcgatctt 1020
agtggaggtg gctctgatcg cgattctgat gctgagtttg agcagatgct acaagaagct 1080
gaagaaccaa aatccaacaa atctaccact ggtgaagaat ccgcacagcc atcagaatca 1140
cctgcagatg aaaatccacc accaaaacgc aaagcgaaaa ccaaaattgg ttgcaaaaca 1200
aagagaaaga agaaaacaaa gagtggtaaa cctgaagatg aaaattatga acatcaagat 1260
tactgcgagg tatgtcaaca aggtggagaa attatcctct gtgatacttg ccctagagct 1320
taccacttgg tttgcctgga acctgaatta gaagaagccc ctgaaggaaa gtggagttgc 1380
cctcattgtg agaatgaagg tccggctgaa caagatgatg acgagcatca agaattctgc 1440
agggtttgca aagatggtgg cgaacttttg tgttgcgatt cctgtacatc tgcgtaccac 1500
acgcactgtc ttaacccgcc acttcccgaa atacctgacg gcgattggaa atgtcctagg 1560
tgcggttgtc cgcctcttgt gggcaaagtt gcgaaaattc ttacgtggaa atgggttgat 1620
gatcctccta aaaagaagga caatggtgaa gaggagcctc ctacacgaca tagagagtac 1680
tttgttaagt ggcatgagct atcatattgg cattgtagtt ggataaccga gcttcaattg 1740
gatgtatatc atcctctcat gtttcgaagt tattcaagaa agtgggacat ggaagagcct 1800
cctaaacttg aagaacctat ggatgaagct gacactagat gtagcagatt cctgaaaatg 1860
ggtggaaaca acaacgacga tgaactcgaa gagaagtatt acagatacgg aataaaacca 1920
gaatggctaa tagtccatcg tgtcatcaac caccgtacga tgcgagacgg aagaactttg 1980
tacttagtaa aatggcgaga gctaacttac gatcaagcta cctgggaaga agattctgac 2040
gatatcccag ccctaaagtc tgccatcgaa tattacacag attcaagagc tgctaattta 2100
tccggagctg gaggtaagct aaagaagaaa gttggaagga agccgaaagc taaagaactt 2160
atcgatgacg acgatagaaa cggtcctcgc agatatactc caccgccaga taagccctgc 2220
agtgatctga agaagaaact agacaaacaa ccctcatatt tggacgagag tggattgctt 2280
cacgagtacc aactagaggg tcttaactgg cttcgttatt cgtgggccaa cggtatagac 2340
actatcttag ccgacgagat gggtctcggt aaaaccattc aaaccattgt cttcttgtat 2400
tcgctctaca aggaaggtca ctgcaaaggt ccgtttctaa ttagtgtccc actttcaacg 2460
atcatcaatt gggagagaga attcgaaaat tgggcacctg atttttattg tattacatat 2520
gttggtgaca aggactgcag agccgtgatt cgtgagaacg aactcagttt cgaagatggt 2580
gctgtcagag gaggtcgagc ttcgagaatc agagccggtt ccatcaagtt taacgttttg 2640
ttgaccagct acgaattaat ttcgatcgat tcggcatgtc tcggttctat cgaatgggcc 2700
gttttggtag tcgatgaagc tcatagattg aaaagcaatc aatcaaaatt cttcaaaatc 2760
ttaaacgctt ataatatagc ttataaactc ctcttgaccg gaacaccgct tcaaaacaac 2820
ctcgaagaat tgttccattt gttgaacttc ctcaacggtc agaaattcaa cgatctccaa 2880
aacttccaag ccgaattcgc cgacatttcg aaagaagacc aagtgaagaa attgcacgag 2940
atgttgggac ctcatatgct gcgtcgtctc aaggccgatg tgctgaagag catgccttcg 3000
aaatctgaat ttatcgtcag agtcgaatta tcgcccatgc agaagaaata ttataaatat 3060
attttgacga ggaactttga agctttaaat cctaaaggag gcggacagtc ggtatcttta 3120
cttaacatta tgatggatct caagaaatgt tgcaaccatc cctatctttt cccagccgcc 3180
tcggaagaag ctccgctggg tccccatggt aattgggatg taggtcattt gattaaggct 3240
tcaggaaagt tggtgctatt agcgaagatg ttgaagatcc ttagagaaca gggtcacaga 3300
gtgttgatct tctcgcaaat gacgaagatg ttggatataa tggaagattt tcttgaagga 3360
gaagggtata aatacgaacg tattgatggg gctattactg gtaatctccg tcaagaagct 3420
atcgataggt ttaacgctcc aggtgctccc cagtttgttt tccttttgtc cactaaagct 3480
ggtggtttgg gcatcaatct tgctacagca gatactgtaa tcatctatga ttccgattgg 3540
aatccccaca atgatattca ggcattctcc agagctcatc gtatcggtca agccaacaag 3600
gtgatgatct accgttttgt aacacgtaac agtgtggaag aacgtgttac gcaagtagcc 3660
aagcggaaaa tgatgttaac tcacttggta gtcagacctg gaatgggcgg aaaaggtgcc 3720
aactttacta agcaagagtt ggacgatatt ctcagattcg gtactgaaga attgtttaaa 3780
gaaagtgaag gcaaagaaga cgaagccatt cactacgacg acaaagctgt gggagaattg 3840
ctggatcgtt ctaaagaagg catagaacag aaagagagtt gggcgaacga atatctcagt 3900
tcatttaaag tggctagtta tgttacaaaa gaaggggaag ttgaggaaga agttgacact 3960
gagattatta aacaagaagc ggaaaatacc gatccggcct actggatcaa gctgcttaga 4020
catcattatg agcaacaaca ggaagatata gctaggacgt taggaaaagg caaaagagtg 4080
aggaaacagg ttaattataa tgacggagga atgacaactg acacacgaga agatacgaca 4140
tggcaagaaa atctctctga ttaccattct gacttttctg cgggatcgga tgaggataag 4200
gaagacgata aggaagacga tgattcgatg agaagaacga cgccgattta agcagaagga 4260
gtcgaagaaa gatggaaagg aaagacgaga aggatcgtcc tttaccaccg ttactagcca 4320
gagttggcgg caatattgaa gtactcggtt ttaatgccag gcagcgtaaa gcgttcctta 4380
atgctattat gcgctacgga atgccaccac aagacgcttt caattcacag tggctggtga 4440
gagatcttcg aggaaaatct gagaagatat tcaaggctta cgtgtctctc tttatgaggc 4500
atctttgcga acctggtgca gataatgctg atacgtttgc ggacggtgtg ccgagggaag 4560
gactgagtag gcaacatgtt ttgacaagga ttggtgtgat gtcacttata agaaagaagg 4620
ttcaggagtt cgaacacatc aacggcgagt atagcatgcc ggaagtaatc aaaaagagca 4680
ttatggatca aaataaaatc aatgccgccg gcaccgccac cacaagcgaa gcagaaacgc 4740
ctaaaagtgc tactaccagt actagtgcta cgccagctac aagtgctgct cccagtcccg 4800
ctcccacaca aggagaagat aaagataagg ataaagattc cgttcagagt gacgaaaata 4860
aagataaaga agtggttaat aaaacggaaa ccgaagatga agagaagaaa acgggagaat 4920
cttcaacaga aaagccgaaa actgaaccgg aagaagtgaa agaagcttct ccgaaaaccg 4980
aaattcctga agctagttcc gaagctgata aatctgagat caaatccgaa gtcgatacct 5040
cgtctgtaac cagcgaggaa aagaaagaag agaaagagga agaggccaaa aaagaagaac 5100
ccgaagagac caaaatggaa atacaggagg aggaacttgt taaaga 5146
<210> 80
<211> 1974
<212> PRT
<213> Diabrotica virgifera
<400> 80
Met Ala Ser Asp Glu Glu Val Glu Asp Ser Phe Ala Gly Glu Glu Asp
1 5 10 15
Ala Pro Asp Asp Thr Ala Glu Gln Ile Asp Asn Asp Pro Asp Ser Glu
20 25 30
Asp Gly Val Pro Lys Gly Gly Glu Glu Asp Asp Asp Tyr Glu Pro Glu
35 40 45
Asp Ser Arg Lys Lys Lys Lys Gly Lys Lys Arg Lys Ala Arg Gly Glu
50 55 60
Glu Lys Lys Gly Lys Lys Lys Lys Lys Lys Arg Lys Asn Asp Ser Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ser Asp Phe Gly Glu Asp Asp Asn Gly Gly Gly Asp Ser Asp
85 90 95
Tyr Ala Ser Ser Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Gly Ser Thr Lys His
100 105 110
Ser Ser Ala Ser Ser Thr Pro Thr Pro Ala Ser Asp Ser Gly Thr Gly
115 120 125
Gly Met Pro Thr Ile Glu Gln Val Cys Ser Thr Phe Gly Leu Thr Asp
130 135 140
Val Glu Leu Asp Tyr Ser Asp Ala Asp Met Gln Asn Leu Thr Thr Tyr
145 150 155 160
Lys Leu Phe Gln Gln His Val Arg Pro Leu Leu Ala Lys Glu Asn Pro
165 170 175
Lys Val Pro Met Ser Lys Leu Met Met Leu Val Ala Ala Lys Trp Arg
180 185 190
Glu Phe Ser Asn Ser Asn Pro Asn Leu Gln Ser Glu Asn Glu Pro Ser
195 200 205
Ala Ala Thr Ser Thr Thr Ser Glu Glu Ser Tyr Pro Lys Thr Asn Arg
210 215 220
Ser Arg Ala Ser Lys Glu Ala Ala Gln Lys Ile Val Glu Ala Asp Ser
225 230 235 240
Glu Pro Tyr Asp Asp Glu Phe Asp Asp Glu Asp Glu Glu Glu Lys Glu
245 250 255
Glu Lys Gly Lys Lys Lys Lys Ser Asn Arg Gly Arg Pro Ser Lys Lys
260 265 270
Lys Ala Thr Lys Val Pro Thr Leu Lys Ile Lys Leu Gly Lys Arg Lys
275 280 285
Arg Gly Ser Ser Asp Glu Glu Gly Asp Leu Ser Gly Gly Gly Ser Asp
290 295 300
Arg Asp Ser Asp Ala Glu Phe Glu Gln Met Leu Gln Glu Ala Glu Glu
305 310 315 320
Pro Lys Ser Asn Lys Ser Thr Thr Gly Glu Glu Ser Ala Gln Pro Ser
325 330 335
Glu Ser Pro Ala Asp Glu Asn Pro Pro Pro Lys Arg Lys Ala Lys Thr
340 345 350
Lys Ile Gly Cys Lys Thr Lys Arg Lys Lys Lys Thr Lys Ser Gly Lys
355 360 365
Pro Glu Asp Glu Asn Tyr Glu His Gln Asp Tyr Cys Glu Val Cys Gln
370 375 380
Gln Gly Gly Glu Ile Ile Leu Cys Asp Thr Cys Pro Arg Ala Tyr His
385 390 395 400
Leu Val Cys Leu Glu Pro Glu Leu Glu Glu Ala Pro Glu Gly Lys Trp
405 410 415
Ser Cys Pro His Cys Glu Asn Glu Gly Pro Ala Glu Gln Asp Asp Asp
420 425 430
Glu His Gln Glu Phe Cys Arg Val Cys Lys Asp Gly Gly Glu Leu Leu
435 440 445
Cys Cys Asp Ser Cys Thr Ser Ala Tyr His Thr His Cys Leu Asn Pro
450 455 460
Pro Leu Pro Glu Ile Pro Asp Gly Asp Trp Lys Cys Pro Arg Cys Gly
465 470 475 480
Cys Pro Pro Leu Val Gly Lys Val Ala Lys Ile Leu Thr Trp Lys Trp
485 490 495
Val Asp Asp Pro Pro Lys Lys Lys Asp Asn Gly Glu Glu Glu Pro Pro
500 505 510
Thr Arg His Arg Glu Tyr Phe Val Lys Trp His Glu Leu Ser Tyr Trp
515 520 525
His Cys Ser Trp Ile Thr Glu Leu Gln Leu Asp Val Tyr His Pro Leu
530 535 540
Met Phe Arg Ser Tyr Ser Arg Lys Trp Asp Met Glu Glu Pro Pro Lys
545 550 555 560
Leu Glu Glu Pro Met Asp Glu Ala Asp Thr Arg Cys Ser Arg Phe Leu
565 570 575
Lys Met Gly Gly Asn Asn Asn Asp Asp Glu Leu Glu Glu Lys Tyr Tyr
580 585 590
Arg Tyr Gly Ile Lys Pro Glu Trp Leu Ile Val His Arg Val Ile Asn
595 600 605
His Arg Thr Met Arg Asp Gly Arg Thr Leu Tyr Leu Val Lys Trp Arg
610 615 620
Glu Leu Thr Tyr Asp Gln Ala Thr Trp Glu Glu Asp Ser Asp Asp Ile
625 630 635 640
Pro Ala Leu Lys Ser Ala Ile Glu Tyr Tyr Thr Asp Ser Arg Ala Ala
645 650 655
Asn Leu Ser Gly Ala Gly Gly Lys Leu Lys Lys Lys Val Gly Arg Lys
660 665 670
Pro Lys Ala Lys Glu Leu Ile Asp Asp Asp Asp Arg Asn Gly Pro Arg
675 680 685
Arg Tyr Thr Pro Pro Pro Asp Lys Pro Cys Ser Asp Leu Lys Lys Lys
690 695 700
Leu Asp Lys Gln Pro Ser Tyr Leu Asp Glu Ser Gly Leu Leu His Glu
705 710 715 720
Tyr Gln Leu Glu Gly Leu Asn Trp Leu Arg Tyr Ser Trp Ala Asn Gly
725 730 735
Ile Asp Thr Ile Leu Ala Asp Glu Met Gly Leu Gly Lys Thr Ile Gln
740 745 750
Thr Ile Val Phe Leu Tyr Ser Leu Tyr Lys Glu Gly His Cys Lys Gly
755 760 765
Pro Phe Leu Ile Ser Val Pro Leu Ser Thr Ile Ile Asn Trp Glu Arg
770 775 780
Glu Phe Glu Asn Trp Ala Pro Asp Phe Tyr Cys Ile Thr Tyr Val Gly
785 790 795 800
Asp Lys Asp Cys Arg Ala Val Ile Arg Glu Asn Glu Leu Ser Phe Glu
805 810 815
Asp Gly Ala Val Arg Gly Gly Arg Ala Ser Arg Ile Arg Ala Gly Ser
820 825 830
Ile Lys Phe Asn Val Leu Leu Thr Ser Tyr Glu Leu Ile Ser Ile Asp
835 840 845
Ser Ala Cys Leu Gly Ser Ile Glu Trp Ala Val Leu Val Val Asp Glu
850 855 860
Ala His Arg Leu Lys Ser Asn Gln Ser Lys Phe Phe Lys Ile Leu Asn
865 870 875 880
Ala Tyr Asn Ile Ala Tyr Lys Leu Leu Leu Thr Gly Thr Pro Leu Gln
885 890 895
Asn Asn Leu Glu Glu Leu Phe His Leu Leu Asn Phe Leu Asn Gly Gln
900 905 910
Lys Phe Asn Asp Leu Gln Asn Phe Gln Ala Glu Phe Ala Asp Ile Ser
915 920 925
Lys Glu Asp Gln Val Lys Lys Leu His Glu Met Leu Gly Pro His Met
930 935 940
Leu Arg Arg Leu Lys Ala Asp Val Leu Lys Ser Met Pro Ser Lys Ser
945 950 955 960
Glu Phe Ile Val Arg Val Glu Leu Ser Pro Met Gln Lys Lys Tyr Tyr
965 970 975
Lys Tyr Ile Leu Thr Arg Asn Phe Glu Ala Leu Asn Pro Lys Gly Gly
980 985 990
Gly Gln Ser Val Ser Leu Leu Asn Ile Met Met Asp Leu Lys Lys Cys
995 1000 1005
Cys Asn His Pro Tyr Leu Phe Pro Ala Ala Ser Glu Glu Ala Pro
1010 1015 1020
Leu Gly Pro His Gly Asn Trp Asp Val Gly His Leu Ile Lys Ala
1025 1030 1035
Ser Gly Lys Leu Val Leu Leu Ala Lys Met Leu Lys Ile Leu Arg
1040 1045 1050
Glu Gln Gly His Arg Val Leu Ile Phe Ser Gln Met Thr Lys Met
1055 1060 1065
Leu Asp Ile Met Glu Asp Phe Leu Glu Gly Glu Gly Tyr Lys Tyr
1070 1075 1080
Glu Arg Ile Asp Gly Ala Ile Thr Gly Asn Leu Arg Gln Glu Ala
1085 1090 1095
Ile Asp Arg Phe Asn Ala Pro Gly Ala Pro Gln Phe Val Phe Leu
1100 1105 1110
Leu Ser Thr Lys Ala Gly Gly Leu Gly Ile Asn Leu Ala Thr Ala
1115 1120 1125
Asp Thr Val Ile Ile Tyr Asp Ser Asp Trp Asn Pro His Asn Asp
1130 1135 1140
Ile Gln Ala Phe Ser Arg Ala His Arg Ile Gly Gln Ala Asn Lys
1145 1150 1155
Val Met Ile Tyr Arg Phe Val Thr Arg Asn Ser Val Glu Glu Arg
1160 1165 1170
Val Thr Gln Val Ala Lys Arg Lys Met Met Leu Thr His Leu Val
1175 1180 1185
Val Arg Pro Gly Met Gly Gly Lys Gly Ala Asn Phe Thr Lys Gln
1190 1195 1200
Glu Leu Asp Asp Ile Leu Arg Phe Gly Thr Glu Glu Leu Phe Lys
1205 1210 1215
Glu Ser Glu Gly Lys Glu Asp Glu Ala Ile His Tyr Asp Asp Lys
1220 1225 1230
Ala Val Gly Glu Leu Leu Asp Arg Ser Lys Glu Gly Ile Glu Gln
1235 1240 1245
Lys Glu Ser Trp Ala Asn Glu Tyr Leu Ser Ser Phe Lys Val Ala
1250 1255 1260
Ser Tyr Val Thr Lys Glu Gly Glu Val Glu Glu Glu Val Asp Thr
1265 1270 1275
Glu Ile Ile Lys Gln Glu Ala Glu Asn Thr Asp Pro Ala Tyr Trp
1280 1285 1290
Ile Lys Leu Leu Arg His His Tyr Glu Gln Gln Gln Glu Asp Ile
1295 1300 1305
Ala Arg Thr Leu Gly Lys Gly Lys Arg Val Arg Lys Gln Val Asn
1310 1315 1320
Tyr Asn Asp Gly Gly Met Thr Thr Asp Thr Arg Glu Asp Thr Thr
1325 1330 1335
Trp Gln Glu Asn Leu Ser Asp Tyr His Ser Asp Phe Ser Ala Gly
1340 1345 1350
Ser Asp Glu Asp Lys Glu Asp Asp Asp Phe Asp Glu Lys Asn Asp
1355 1360 1365
Ala Asp Leu Ser Arg Arg Ser Arg Arg Lys Met Glu Arg Lys Asp
1370 1375 1380
Glu Lys Asp Arg Pro Leu Pro Pro Leu Leu Ala Arg Val Gly Gly
1385 1390 1395
Asn Ile Glu Val Leu Gly Phe Asn Ala Arg Gln Arg Lys Ala Phe
1400 1405 1410
Leu Asn Ala Ile Met Arg Tyr Gly Met Pro Pro Gln Asp Ala Phe
1415 1420 1425
Asn Ser Gln Trp Leu Val Arg Asp Leu Arg Gly Lys Ser Glu Lys
1430 1435 1440
Ile Phe Lys Ala Tyr Val Ser Leu Phe Met Arg His Leu Cys Glu
1445 1450 1455
Pro Gly Ala Asp Asn Ala Asp Thr Phe Ala Asp Gly Val Pro Arg
1460 1465 1470
Glu Gly Leu Ser Arg Gln His Val Leu Thr Arg Ile Gly Val Met
1475 1480 1485
Ser Leu Ile Arg Lys Lys Val Gln Glu Phe Glu His Ile Asn Gly
1490 1495 1500
Glu Tyr Ser Met Pro Glu Val Ile Lys Lys Ser Ile Met Asp Gln
1505 1510 1515
Asn Lys Ile Asn Ala Ala Gly Thr Ala Thr Thr Ser Glu Ala Glu
1520 1525 1530
Thr Pro Lys Ser Ala Thr Thr Ser Thr Ser Ala Thr Pro Ala Thr
1535 1540 1545
Ser Ala Ala Pro Ser Pro Ala Pro Thr Gln Gly Glu Asp Lys Asp
1550 1555 1560
Lys Asp Lys Asp Ser Val Gln Ser Asp Glu Asn Lys Asp Lys Glu
1565 1570 1575
Val Val Asn Lys Thr Glu Thr Glu Asp Glu Glu Lys Lys Thr Gly
1580 1585 1590
Glu Ser Ser Thr Glu Lys Pro Lys Thr Glu Pro Glu Glu Val Lys
1595 1600 1605
Glu Ala Ser Pro Lys Thr Glu Thr Pro Glu Ala Ser Ser Glu Ala
1610 1615 1620
Asp Lys Ser Glu Ile Lys Ser Glu Val Asp Thr Ser Ser Val Thr
1625 1630 1635
Ser Glu Glu Lys Lys Glu Glu Lys Glu Glu Glu Ala Lys Lys Glu
1640 1645 1650
Glu Pro Glu Glu Thr Lys Met Glu Ile Gln Glu Glu Glu Leu Val
1655 1660 1665
Lys Glu Glu Lys Lys Glu Glu Glu Asp Asp Lys Lys Lys Glu Glu
1670 1675 1680
Val Lys Lys Glu Val Glu Lys Lys Glu Glu Asp Asp Val Met Val
1685 1690 1695
Ile Asp Asp Asp Lys Asp Lys Lys Asp Lys Lys Glu Ile Asp Leu
1700 1705 1710
Glu Ala Lys Lys Arg Phe Met Phe Asn Ile Ala Asp Gly Gly Phe
1715 1720 1725
Thr Glu Leu His Thr Leu Trp Leu Asn Glu Glu Lys Ala Ala Ser
1730 1735 1740
Pro Gly Arg Glu Tyr Glu Ile Trp His Arg Arg His Asp Tyr Trp
1745 1750 1755
Leu Leu Ala Gly Ile Val Thr His Gly Tyr Gly Arg Trp Gln Asp
1760 1765 1770
Ile Gln Ala Asp Ala Arg Phe Ala Ile Ile Asn Glu Pro Phe Lys
1775 1780 1785
Met Asp Val Gly Lys Gly Asn Phe Leu Glu Ile Lys Asn Lys Phe
1790 1795 1800
Leu Ala Arg Arg Phe Lys Leu Leu Glu Gln Ala Leu Val Ile Glu
1805 1810 1815
Glu Gln Leu Arg Arg Ala Ala Tyr Leu Asn Leu Thr Gln Asp Pro
1820 1825 1830
Asn His Pro Ala Met Ser Leu Asn Ala Arg Phe Ala Glu Val Glu
1835 1840 1845
Cys Leu Ala Glu Ser His Gln His Leu Ser Lys Glu Ser Leu Ala
1850 1855 1860
Gly Asn Lys Pro Ala Asn Ala Val Leu His Lys Val Leu Asn Gln
1865 1870 1875
Leu Glu Glu Leu Leu Ser Asp Met Lys Ser Asp Val Ser Arg Leu
1880 1885 1890
Pro Ala Thr Leu Ala Arg Ile Pro Pro Val Ala Gln Arg Leu Gln
1895 1900 1905
Met Ser Glu Arg Ser Ile Leu Ser Arg Leu Ala Ala Thr Ser Ser
1910 1915 1920
Ser Asn Thr Gln Ser Thr Thr Gln Val Met Ser Gln Phe Pro Pro
1925 1930 1935
Gly Phe Ser Ala Gly Ser Leu Pro Gly Phe Thr Gly Ser Thr Gly
1940 1945 1950
Asn Phe Ser Asn Phe Arg Pro Gln Tyr Ser Val Pro Gly Gln Pro
1955 1960 1965
Pro Ala Gly Phe Pro Ser
1970
<210> 81
<211> 3076
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 81
agcggcggca gcacgcagca ggcaacactg gcaacagcag tttttttaac gcgcggtggc 60
tgagaattga gaatgctgtt gtaaatttct ttgttaatca aataaaactt tgtttcaaca 120
tattgcaaaa ttcatctaaa cgttcaacat gtcacaaact gaaggctcga cagaggcgag 180
cgtaagtgcc tcagaaccaa tggaagaagc agagaactcg gaattggctc aaaatgaaga 240
atcttcttca gatactacct ctaagggtga agagttcgag gtcaaagtgg cttctgacag 300
aggaaaaaga tttgactact tgttgaaaca gactgaaatc ttttcacatt ttatgaacca 360
aacaaaatct cccagtaaac caaaaactgg gaggcctaaa aaagagaaga gtgatacatc 420
tgatttaaga catcgtaaaa ctgaacaaga agaagatgaa gaacttttag cagaaaccaa 480
ccttaaaaca aagactacaa ctcgttttga tgcctcacca ccctacatca aacatgggga 540
aatgagagat tatcaagtcc gtggtttgaa ctggatgatt tctttgtatg aacatggcat 600
caatggtatt ttagcagatg agatgggttt gggtaaaact ttacaaacca tatctctgct 660
tggatatatg aagcactata aaagtacacc tggtcctcat attgtcattg ttcctaaatc 720
taccttatca aactggatga atgagttcga gaagtggtgt ccaaccttga gagccgtttg 780
tctcattggt gatcaagagg ctaggagctc atttatcaga gatacgatga tgcctggtga 840
atgggatgtt tgtgtaacct cgtacgaaat gtgtattaaa gaaaaatctg tatttaaaaa 900
gttcaactgg agatatatgg tcattgacga agctcatcgt ataaaaaatg aaaaatctaa 960
gctttccgaa attctcaggg agttcaagac tactaacagg ctactgctaa caggtactcc 1020
attacaaaac aatttacacg aactctgggc tcttctcaac ttcttactgc cagatgtttt 1080
caactcatcg gatgatttcg atgcctggtt caacaccagt caatgtctgg gagacaacgc 1140
cttggtcgag agattgcatg ctgtattaaa accattcttg cttagaagat tgaaagctga 1200
agtggagaaa cggctaaaac ccaagaagga gttaaaagtg tatgtaggat tgagcaagat 1260
gcaacgagaa tggtatacca aagtgctgat gaaggatatt gatatagtga atggtgcagg 1320
aaaggtagaa aaaatgcgac tacagaatat tctcatgcag ttaagaaaat gcacaaatca 1380
cccctacctt tttgatggcg ctgagcccgg accaccttac acaaccgatg aacatctcgt 1440
gtacaattgc ggtaaaatgg tgttgctgga taaactgctt cccaaattga aggaacagga 1500
atctcgtgta cttatcttct ctcagatgac ccgtatgttg gatatacttg aagattattg 1560
tcattggcga cagtaccaat attgtcgttt ggatggtcaa accccacacg aagacagaca 1620
gagacaaatc aacgagtata acgaagacaa tagccaaaag tttatcttta tgttgtcaac 1680
tagagccggt ggattgggta tcaatttggc cacagctgat gtagttatta tatatgattc 1740
ggattggaat ccccagatgg atctgcaagc catggacaga gcgcatagaa ttggtcagaa 1800
gaaacaagtc agagttttca ggtttattac cgaaaacact gtggaagaaa aaatcgtcga 1860
aagagctgaa gtaaaattac gtttagacaa attagttatc cagcagggtc gtttagccga 1920
ttccaaagca cagactctaa acaaagacga aatgttgaac atgatccggc acggtgccaa 1980
ccacgtattt gcttctaagg attccgaaat aacagatgaa gatatcgata gtatattgga 2040
aaagggagaa atgaagaccg ctcagctagc tcagaagatg gaaaccatgg gcgaatcgtc 2100
acttcgcaac ttcacagtcg aaacacccac tgaatcagtc taccaattcg aaggagaaga 2160
ttatcgtgag aagcagaaaa ccatcggctt gagcaactgg atagaacctc ccaaaagaga 2220
aaggaaggcc aactatgccg tcgatgctta cttcagagaa gctttaaggg tttctgagcc 2280
taaagcgcct aaggctccaa gaccaccaaa acagcccatc gtacaagatt tccagttttt 2340
cccgccgaga ttattcgaac ttttggacca ggagatctac ttttacagga aatctttggg 2400
atataaggtt ccgaaaaact tagaacttgg acctgacgcg tccaagcaac agaaagaaga 2460
gcaaagaaaa atagatgagt cagaaccgct caccgaagac gaacagcaag aaaaagaaaa 2520
cttgttaacg caaggtttca ccaattggag taaacgcgat ttcaatcagt tcatcaaagc 2580
caacgagaaa tatggtaggg acgatattga gaacatcgcc aaggatgttg aaggcaaaac 2640
gcctgaagaa gttatggaat attctgcggt gttttgggaa agatgtcatg aattacagga 2700
tattgataga ataatggccc agattgagag aggagaaact aaaatacaaa gaagagctag 2760
tattaagaag gcacttgatg ctaaaatggc aagatatcgt gcaccattcc atcagctgag 2820
aatttcttac ggcaccaaca aaggcaagaa ctacatggag gacgaagaca ggtttttggt 2880
gtgtatgttg cacaagttgg gtttcgatag agaaaacgtt tatgaagagt taagagcagc 2940
tgtacgtgcg tcaccacaat tcagatttga ttggttctta aaatcgagaa ctgccatgga 3000
gctgcaaagg agatgcaaca cattgataac gttaatagaa agagaaaatg ctgaattgga 3060
ggaaagagaa aaaatt 3076
<210> 82
<211> 976
<212> PRT
<213> Diabrotica virgifera
<400> 82
Met Ser Gln Thr Glu Gly Ser Thr Glu Ala Ser Val Ser Ala Ser Glu
1 5 10 15
Pro Met Glu Glu Ala Glu Asn Ser Glu Leu Ala Gln Asn Glu Glu Ser
20 25 30
Ser Ser Asp Thr Thr Ser Lys Gly Glu Glu Phe Glu Val Lys Val Ala
35 40 45
Ser Asp Arg Gly Lys Arg Phe Asp Tyr Leu Leu Lys Gln Thr Glu Ile
50 55 60
Phe Ser His Phe Met Asn Gln Thr Lys Ser Pro Ser Lys Pro Lys Thr
65 70 75 80
Gly Arg Pro Lys Lys Glu Lys Ser Asp Thr Ser Asp Leu Arg His Arg
85 90 95
Lys Thr Glu Gln Glu Glu Asp Glu Glu Leu Leu Ala Glu Thr Asn Leu
100 105 110
Lys Thr Lys Thr Thr Thr Arg Phe Asp Ala Ser Pro Pro Tyr Ile Lys
115 120 125
His Gly Glu Met Arg Asp Tyr Gln Val Arg Gly Leu Asn Trp Met Ile
130 135 140
Ser Leu Tyr Glu His Gly Ile Asn Gly Ile Leu Ala Asp Glu Met Gly
145 150 155 160
Leu Gly Lys Thr Leu Gln Thr Ile Ser Leu Leu Gly Tyr Met Lys His
165 170 175
Tyr Lys Ser Thr Pro Gly Pro His Ile Val Ile Val Pro Lys Ser Thr
180 185 190
Leu Ser Asn Trp Met Asn Glu Phe Glu Lys Trp Cys Pro Thr Leu Arg
195 200 205
Ala Val Cys Leu Ile Gly Asp Gln Glu Ala Arg Ser Ser Phe Ile Arg
210 215 220
Asp Thr Met Met Pro Gly Glu Trp Asp Val Cys Val Thr Ser Tyr Glu
225 230 235 240
Met Cys Ile Lys Glu Lys Ser Val Phe Lys Lys Phe Asn Trp Arg Tyr
245 250 255
Met Val Ile Asp Glu Ala His Arg Ile Lys Asn Glu Lys Ser Lys Leu
260 265 270
Ser Glu Ile Leu Arg Glu Phe Lys Thr Thr Asn Arg Leu Leu Leu Thr
275 280 285
Gly Thr Pro Leu Gln Asn Asn Leu His Glu Leu Trp Ala Leu Leu Asn
290 295 300
Phe Leu Leu Pro Asp Val Phe Asn Ser Ser Asp Asp Phe Asp Ala Trp
305 310 315 320
Phe Asn Thr Ser Gln Cys Leu Gly Asp Asn Ala Leu Val Glu Arg Leu
325 330 335
His Ala Val Leu Lys Pro Phe Leu Leu Arg Arg Leu Lys Ala Glu Val
340 345 350
Glu Lys Arg Leu Lys Pro Lys Lys Glu Leu Lys Val Tyr Val Gly Leu
355 360 365
Ser Lys Met Gln Arg Glu Trp Tyr Thr Lys Val Leu Met Lys Asp Ile
370 375 380
Asp Ile Val Asn Gly Ala Gly Lys Val Glu Lys Met Arg Leu Gln Asn
385 390 395 400
Ile Leu Met Gln Leu Arg Lys Cys Thr Asn His Pro Tyr Leu Phe Asp
405 410 415
Gly Ala Glu Pro Gly Pro Pro Tyr Thr Thr Asp Glu His Leu Val Tyr
420 425 430
Asn Cys Gly Lys Met Val Leu Leu Asp Lys Leu Leu Pro Lys Leu Lys
435 440 445
Glu Gln Glu Ser Arg Val Leu Ile Phe Ser Gln Met Thr Arg Met Leu
450 455 460
Asp Ile Leu Glu Asp Tyr Cys His Trp Arg Gln Tyr Gln Tyr Cys Arg
465 470 475 480
Leu Asp Gly Gln Thr Pro His Glu Asp Arg Gln Arg Gln Ile Asn Glu
485 490 495
Tyr Asn Glu Asp Asn Ser Gln Lys Phe Ile Phe Met Leu Ser Thr Arg
500 505 510
Ala Gly Gly Leu Gly Ile Asn Leu Ala Thr Ala Asp Val Val Ile Ile
515 520 525
Tyr Asp Ser Asp Trp Asn Pro Gln Met Asp Leu Gln Ala Met Asp Arg
530 535 540
Ala His Arg Ile Gly Gln Lys Lys Gln Val Arg Val Phe Arg Phe Ile
545 550 555 560
Thr Glu Asn Thr Val Glu Glu Lys Ile Val Glu Arg Ala Glu Val Lys
565 570 575
Leu Arg Leu Asp Lys Leu Val Ile Gln Gln Gly Arg Leu Ala Asp Ser
580 585 590
Lys Ala Gln Thr Leu Asn Lys Asp Glu Met Leu Asn Met Ile Arg His
595 600 605
Gly Ala Asn His Val Phe Ala Ser Lys Asp Ser Glu Ile Thr Asp Glu
610 615 620
Asp Ile Asp Ser Ile Leu Glu Lys Gly Glu Met Lys Thr Ala Gln Leu
625 630 635 640
Ala Gln Lys Met Glu Thr Met Gly Glu Ser Ser Leu Arg Asn Phe Thr
645 650 655
Val Glu Thr Pro Thr Glu Ser Val Tyr Gln Phe Glu Gly Glu Asp Tyr
660 665 670
Arg Glu Lys Gln Lys Thr Ile Gly Leu Ser Asn Trp Ile Glu Pro Pro
675 680 685
Lys Arg Glu Arg Lys Ala Asn Tyr Ala Val Asp Ala Tyr Phe Arg Glu
690 695 700
Ala Leu Arg Val Ser Glu Pro Lys Ala Pro Lys Ala Pro Arg Pro Pro
705 710 715 720
Lys Gln Pro Ile Val Gln Asp Phe Gln Phe Phe Pro Pro Arg Leu Phe
725 730 735
Glu Leu Leu Asp Gln Glu Ile Tyr Phe Tyr Arg Lys Ser Leu Gly Tyr
740 745 750
Lys Val Pro Lys Asn Leu Glu Leu Gly Pro Asp Ala Ser Lys Gln Gln
755 760 765
Lys Glu Glu Gln Arg Lys Ile Asp Glu Ser Glu Pro Leu Thr Glu Asp
770 775 780
Glu Gln Gln Glu Lys Glu Asn Leu Leu Thr Gln Gly Phe Thr Asn Trp
785 790 795 800
Ser Lys Arg Asp Phe Asn Gln Phe Ile Lys Ala Asn Glu Lys Tyr Gly
805 810 815
Arg Asp Asp Ile Glu Asn Ile Ala Lys Asp Val Glu Gly Lys Thr Pro
820 825 830
Glu Glu Val Met Glu Tyr Ser Ala Val Phe Trp Glu Arg Cys His Glu
835 840 845
Leu Gln Asp Ile Asp Arg Ile Met Ala Gln Ile Glu Arg Gly Glu Thr
850 855 860
Lys Ile Gln Arg Arg Ala Ser Ile Lys Lys Ala Leu Asp Ala Lys Met
865 870 875 880
Ala Arg Tyr Arg Ala Pro Phe His Gln Leu Arg Ile Ser Tyr Gly Thr
885 890 895
Asn Lys Gly Lys Asn Tyr Met Glu Asp Glu Asp Arg Phe Leu Val Cys
900 905 910
Met Leu His Lys Leu Gly Phe Asp Arg Glu Asn Val Tyr Glu Glu Leu
915 920 925
Arg Ala Ala Val Arg Ala Ser Pro Gln Phe Arg Phe Asp Trp Phe Leu
930 935 940
Lys Ser Arg Thr Ala Met Glu Leu Gln Arg Arg Cys Asn Thr Leu Ile
945 950 955 960
Thr Leu Ile Glu Arg Glu Asn Ala Glu Leu Glu Glu Arg Glu Lys Ile
965 970 975
<210> 83
<211> 4137
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 83
atggaaggct cagagtcgga aaattcagct tctggttccg gttcagaaaa tgagagcaaa 60
agtgattcca gtaacaactc tggaagcgct tctggtagtt cttcttcgga cggttccgat 120
acaggcgaag aaactgtaga aaatggatcg gccaataaaa gtagtagtaa aagtgacgga 180
gaagaagtac ttgaagaaag taacgggtgt agccaagatt caaactctat acctcctgct 240
agtccagata gttcgagtaa attcgatact accaaagatt taagttctga taggagttcg 300
gatccctcta gcatcagacg atcagttagg tcgcgaagag agccggaaag acttcagagt 360
aaagacagtg atagggcttc gagtgataaa agcaacaaaa gtgctgaaga ttggaaatac 420
aatgacgcta gttcgtcaga gtctgaacca gaagtaaaag aacgcccccc acctagtaaa 480
cgcgtaggtg ccagagcgcg aacgactgtg ataaaaaaga aaaagtccaa gaaaagaagc 540
caatacagtt cagaagatga ggaaacgagc gacgaaagcg atgaggatag taggagagct 600
gtgtccagaa ggaaggctac tacagttagt tacaaggaag aaagtgagga tgagaaaacg 660
gattccgagg atttgctaga agttgataat aatgaaccgg tagaacctgt cccggaagaa 720
aaatgtgaaa caatagaaag aattttggca acgagaagag gaaaaattgg agttaccgga 780
aacattacta cagtctacta tgtagaagaa aatggtgatc cgaatgaagg agttgatgaa 840
aaggatttag atagtacaga agatcagtat ctaatcaaat ggaaagattg ggctcatatt 900
cacaacacat gggaatcaga caaaagttta cgagaacaga aagtaaaggg gatgaaaaaa 960
ttggaaaatt atatcaaaaa agaagtcgaa attcaacagt ggcttaaata ttctactcct 1020
gaggatgtgg aatattatga atgtcaaatg gagttatctc aggatctttt gaagagtttc 1080
aacgaggtcg agaggataat agcaaagtac aataagcctg atgggggtaa agattattat 1140
attaaatggc aaagtcttcc atatgctgaa tcgacttggg aagattcagt tctaattcaa 1200
cgaaaatggc ctgaccaaat aaatgaattc gaagctaggg agcaatcaag tatgacccca 1260
acgagacact gtaaagtact caaacataga cccaaattcc acgaagtcaa gacccagcct 1320
gaatatatga tgggcaaaga acagactttg atactgcgtg attaccaaat acatggtctc 1380
aactggatga tacattcctg gtcaaaagaa aactctgtta tattagcaga cgagatgggg 1440
ctcggtaaaa cgattcagac aatttgcttt ctatactatc tcttcaatac tcaccacctc 1500
cacggaccat ttttgtgtgt tgtgcccctt tctacaatga cgtcgtggca gagggaaatg 1560
acacagtggg cacccgactt gaactttgtc acatacttgg gagatgttca gtccagagat 1620
acgattcgcc aatatgaatg gtgctttgaa gggtcaaaaa ggctaaagtt caatgcaatt 1680
ctcacaacgt atgaaattgt tttgaaggat aaagcatttt taggaagtct cagctgggct 1740
gtgttactag tagatgaagc tcacaggttg aaaaacgatg attctttgtt gtacaaagct 1800
ttaatggaat ttgacactaa tcacaggctt cttattactg gtactccttt acaaaatagt 1860
ttaaaagaac tttgggcgct gctacatttt atcatgcccg ctaagtttga aacatgggac 1920
gaattcaaaa gagaacacga aaacaccaca aactccacaa actataccaa actccacaaa 1980
caacttgaac cgtttatttt aagacgggta aagaaagatg tagaaaaatc tctccccgct 2040
aaagtagaac aaattcttag ggtagagatg acgtctatcc agaaacaata ctataagtgg 2100
atattaacaa aaaattataa tgccttgaga agaggagtca aaggatccac aacaaccttc 2160
ttaaatattg tgatagaact gaagaaatgt tgtaaccatt cgtctttgat caagccccca 2220
gatattgaaa cacaatacaa tcaacacgac gttttgcagc aacttctcag aggttcggga 2280
aaattagtgc ttctggataa attgcttatc cgtttgcgca atactggcca tagagtacta 2340
atcttctcgc agatggtccg gatgttggac attcttgccg aatatttgca gcttcgacat 2400
ttcccgtttc agaggctaga tggtggcatc aagggagagc tgcgacgtca agccttagat 2460
catttcaatg ctgaagggtc tcaagatttt tgcttccttc tttcaactcg cgcagggggc 2520
ttgggcatta atttagctac tgctgatact gtgataattt ttgattcgga ctggaatcct 2580
caaaacgatc ttcaagcgca ggcaagagct cataggatcg gtcaaaagaa ccaagtcaac 2640
atttataggt tagttactgc tagatctgta gaggaagaaa ttgtagaaag ggcaaaacaa 2700
aaaatggtac tggatcatct tgtaattcag agaatggaca cgacgggaag aaccgttttg 2760
gacaaaaagg ggtcttctaa taataatccg tttaacaaag aagatctgac ggcgattttg 2820
aaatttggag ctgaggaatt atttaaagat gaagatgacg atgaggaacc aaactgtgat 2880
attgacgaaa ttcttcgacg agctgagacc agagatgaag ctccttcatt ggttggagat 2940
gaactacttt cggcatttaa agtagcaagt ttcgccgctt ttgacgaaga tgccgagccc 3000
tcaccagtca acaatgttgt taacgacgat gaaagtaaag actgggatga aattattcca 3060
gaaaaacttc gtatcaaggc agaggaagag gaaaagaaca aggaaatgga agatctttat 3120
cttcctccgc gaagtcgaaa aactcttcaa cagattaatc aatctgaaag tgacggggaa 3180
gaaggcaaag gtaggaagaa aacgaagaaa gatggagatg aatcgggagg ttccagtggc 3240
gatgatgaca ctgacgagga aaaacctaaa aaacgaggaa ggccaccagc aaaccccaga 3300
gaaaagttca agaacttcac tgatgctgag attagaaggt ttataaaaag ttataagaaa 3360
tttagtggac ccttaaagcg attagaggca gttgcttgtg atgctgaatt gcaagaaaaa 3420
ccattagctg agttacggaa attgggagaa cttcttcatg agaggtgcag ggcatttatg 3480
aatgaacaag ctaaagaaaa tacagagtct aacactcaag acgaacccaa aggtcgcaaa 3540
agaggaccat cgtttaaaat tggaggagtg tctgtaaatg ccaaaacgat gatggcttgt 3600
gaggaagagt tagaaccatt agatgaagtc attccagctg atccaaatga acgattacgt 3660
tgggtttttg atgtaaaaac gaagtcgtct cactttgatg tggactgggg tatggaagag 3720
gacactaagt tattgaaagg aatttatcac tatggtcttg gctcatggga gcaaataaaa 3780
ttggatccat tattaggcat tggtgataaa attttcctta ataatgaaga taaaaagccg 3840
caggctaaac atcttttatc aagagcagaa tacttattaa agattatgaa aaagcaatta 3900
gatctaaaga agggggttca aaaaccaaaa agacagagga aaaaagaaca aaaagttctt 3960
actaaggaaa ttattgatga cgatgaaagc tcaaatgatg tttcatcatt accaagttcc 4020
gctccagtta cagtatcagt agctccggtt gttaaaaagg taaagaaaga agtgaaaaaa 4080
gaaaaggagg ataaagaaga atcctcgccc gagaaaaagg aaaaaaaaga aggataa 4137
<210> 84
<211> 1724
<212> PRT
<213> Diabrotica virgifera
<400> 84
Met Glu Gly Ser Glu Ser Glu Asn Ser Ala Ser Gly Ser Gly Ser Glu
1 5 10 15
Asn Glu Ser Lys Ser Asp Ser Ser Asn Asn Ser Gly Ser Ala Ser Gly
20 25 30
Ser Ser Ser Ser Asp Gly Ser Asp Thr Gly Glu Glu Thr Val Glu Asn
35 40 45
Gly Ser Ala Asn Lys Ser Ser Ser Lys Ser Asp Gly Glu Glu Val Leu
50 55 60
Glu Glu Ser Asn Gly Cys Ser Gln Asp Ser Asn Ser Ile Pro Pro Ala
65 70 75 80
Ser Pro Asp Ser Ser Ser Lys Phe Asp Thr Thr Lys Asp Leu Ser Ser
85 90 95
Asp Arg Ser Ser Asp Pro Ser Ser Ile Arg Arg Ser Val Arg Ser Arg
100 105 110
Arg Glu Pro Glu Arg Leu Gln Ser Lys Asp Ser Asp Arg Ala Ser Ser
115 120 125
Asp Lys Ser Asn Lys Ser Ala Glu Asp Trp Lys Tyr Asn Asp Ala Ser
130 135 140
Ser Ser Glu Ser Glu Pro Glu Val Lys Glu Arg Pro Pro Pro Ser Lys
145 150 155 160
Arg Val Gly Ala Arg Ala Arg Thr Thr Val Ile Lys Lys Lys Lys Ser
165 170 175
Lys Lys Arg Ser Gln Tyr Ser Ser Glu Asp Glu Glu Thr Ser Asp Glu
180 185 190
Ser Asp Glu Asp Ser Arg Arg Ala Val Ser Arg Arg Lys Ala Thr Thr
195 200 205
Val Ser Tyr Lys Glu Glu Ser Glu Asp Glu Lys Thr Asp Ser Glu Asp
210 215 220
Leu Leu Glu Val Asp Asn Asn Glu Pro Val Glu Pro Val Pro Glu Glu
225 230 235 240
Lys Cys Glu Thr Ile Glu Arg Ile Leu Ala Thr Arg Arg Gly Lys Ile
245 250 255
Gly Val Thr Gly Asn Ile Thr Thr Val Tyr Tyr Val Glu Glu Asn Gly
260 265 270
Asp Pro Asn Glu Gly Val Asp Glu Lys Asp Leu Asp Ser Thr Glu Asp
275 280 285
Gln Tyr Leu Ile Lys Trp Lys Asp Trp Ala His Ile His Asn Thr Trp
290 295 300
Glu Ser Asp Lys Ser Leu Arg Glu Gln Lys Val Lys Gly Met Lys Lys
305 310 315 320
Leu Glu Asn Tyr Ile Lys Lys Glu Val Glu Ile Gln Gln Trp Leu Lys
325 330 335
Tyr Ser Thr Pro Glu Asp Val Glu Tyr Tyr Glu Cys Gln Met Glu Leu
340 345 350
Ser Gln Asp Leu Leu Lys Ser Phe Asn Glu Val Glu Arg Ile Ile Ala
355 360 365
Lys Tyr Asn Lys Pro Asp Gly Gly Lys Asp Tyr Tyr Ile Lys Trp Gln
370 375 380
Ser Leu Pro Tyr Ala Glu Ser Thr Trp Glu Asp Ser Val Leu Ile Gln
385 390 395 400
Arg Lys Trp Pro Asp Gln Ile Asn Glu Phe Glu Ala Arg Glu Gln Ser
405 410 415
Ser Met Thr Pro Thr Arg His Cys Lys Val Leu Lys His Arg Pro Lys
420 425 430
Phe His Glu Val Lys Thr Gln Pro Glu Tyr Met Met Gly Lys Glu Gln
435 440 445
Thr Leu Ile Leu Arg Asp Tyr Gln Ile His Gly Leu Asn Trp Met Ile
450 455 460
His Ser Trp Ser Lys Glu Asn Ser Val Ile Leu Ala Asp Glu Met Gly
465 470 475 480
Leu Gly Lys Thr Ile Gln Thr Ile Cys Phe Leu Tyr Tyr Leu Phe Asn
485 490 495
Thr His His Leu His Gly Pro Phe Leu Cys Val Val Pro Leu Ser Thr
500 505 510
Met Thr Ser Trp Gln Arg Glu Met Thr Gln Trp Ala Pro Asp Leu Asn
515 520 525
Phe Val Thr Tyr Leu Gly Asp Val Gln Ser Arg Asp Thr Ile Arg Gln
530 535 540
Tyr Glu Trp Cys Phe Glu Gly Ser Lys Arg Leu Lys Phe Asn Ala Ile
545 550 555 560
Leu Thr Thr Tyr Glu Ile Val Leu Lys Asp Lys Ala Phe Leu Gly Ser
565 570 575
Leu Ser Trp Ala Val Leu Leu Val Asp Glu Ala His Arg Leu Lys Asn
580 585 590
Asp Asp Ser Leu Leu Tyr Lys Ala Leu Met Glu Phe Asp Thr Asn His
595 600 605
Arg Leu Leu Ile Thr Gly Thr Pro Leu Gln Asn Ser Leu Lys Glu Leu
610 615 620
Trp Ala Leu Leu His Phe Ile Met Pro Ala Lys Phe Glu Thr Trp Asp
625 630 635 640
Glu Phe Lys Arg Glu His Glu Asn Thr Thr Asn Ser Thr Asn Tyr Thr
645 650 655
Lys Leu His Lys Gln Leu Glu Pro Phe Ile Leu Arg Arg Val Lys Lys
660 665 670
Asp Val Glu Lys Ser Leu Pro Ala Lys Val Glu Gln Ile Leu Arg Val
675 680 685
Glu Met Thr Ser Ile Gln Lys Gln Tyr Tyr Lys Trp Ile Leu Thr Lys
690 695 700
Asn Tyr Asn Ala Leu Arg Arg Gly Val Lys Gly Ser Thr Thr Thr Phe
705 710 715 720
Leu Asn Ile Val Ile Glu Leu Lys Lys Cys Cys Asn His Ser Ser Leu
725 730 735
Ile Lys Pro Pro Asp Ile Glu Thr Gln Tyr Asn Gln His Asp Val Leu
740 745 750
Gln Gln Leu Leu Arg Gly Ser Gly Lys Leu Val Leu Leu Asp Lys Leu
755 760 765
Leu Ile Arg Leu Arg Asn Thr Gly His Arg Val Leu Ile Phe Ser Gln
770 775 780
Met Val Arg Met Leu Asp Ile Leu Ala Glu Tyr Leu Gln Leu Arg His
785 790 795 800
Phe Pro Phe Gln Arg Leu Asp Gly Gly Ile Lys Gly Glu Leu Arg Arg
805 810 815
Gln Ala Leu Asp His Phe Asn Ala Glu Gly Ser Gln Asp Phe Cys Phe
820 825 830
Leu Leu Ser Thr Arg Ala Gly Gly Leu Gly Ile Asn Leu Ala Thr Ala
835 840 845
Asp Thr Val Ile Ile Phe Asp Ser Asp Trp Asn Pro Gln Asn Asp Leu
850 855 860
Gln Ala Gln Ala Arg Ala His Arg Ile Gly Gln Lys Asn Gln Val Asn
865 870 875 880
Ile Tyr Arg Leu Val Thr Ala Arg Ser Val Glu Glu Glu Ile Val Glu
885 890 895
Arg Ala Lys Gln Lys Met Val Leu Asp His Leu Val Ile Gln Arg Met
900 905 910
Asp Thr Thr Gly Arg Thr Val Leu Asp Lys Lys Gly Ser Ser Asn Asn
915 920 925
Asn Pro Phe Asn Lys Glu Asp Leu Thr Ala Ile Leu Lys Phe Gly Ala
930 935 940
Glu Glu Leu Phe Lys Asp Glu Asp Asp Asp Glu Glu Pro Asn Cys Asp
945 950 955 960
Ile Asp Glu Ile Leu Arg Arg Ala Glu Thr Arg Asp Glu Ala Pro Ser
965 970 975
Leu Val Gly Asp Glu Leu Leu Ser Ala Phe Lys Val Ala Ser Phe Ala
980 985 990
Ala Phe Asp Glu Asp Ala Glu Pro Ser Pro Val Asn Asn Val Val Asn
995 1000 1005
Asp Asp Glu Ser Lys Asp Trp Asp Glu Ile Ile Pro Glu Lys Leu
1010 1015 1020
Arg Ile Lys Ala Glu Glu Glu Glu Lys Asn Lys Glu Met Glu Asp
1025 1030 1035
Leu Tyr Leu Pro Pro Arg Ser Arg Lys Thr Leu Gln Gln Ile Asn
1040 1045 1050
Gln Ser Glu Ser Asp Gly Glu Glu Gly Lys Gly Arg Lys Lys Thr
1055 1060 1065
Lys Lys Asp Gly Asp Glu Ser Gly Gly Ser Ser Gly Asp Asp Asp
1070 1075 1080
Thr Asp Glu Glu Lys Pro Lys Lys Arg Gly Arg Pro Pro Ala Asn
1085 1090 1095
Pro Arg Glu Lys Phe Lys Asn Phe Thr Asp Ala Glu Ile Arg Arg
1100 1105 1110
Phe Ile Lys Ser Tyr Lys Lys Phe Ser Gly Pro Leu Lys Arg Leu
1115 1120 1125
Glu Ala Val Ala Cys Asp Ala Glu Leu Gln Glu Lys Pro Leu Ala
1130 1135 1140
Glu Leu Arg Lys Leu Gly Glu Leu Leu His Glu Arg Cys Arg Ala
1145 1150 1155
Phe Met Asn Glu Gln Ala Lys Glu Asn Thr Glu Ser Asn Thr Gln
1160 1165 1170
Asp Glu Pro Lys Gly Arg Lys Arg Gly Pro Ser Phe Lys Ile Gly
1175 1180 1185
Gly Val Ser Val Asn Ala Lys Thr Met Met Ala Cys Glu Glu Glu
1190 1195 1200
Leu Glu Pro Leu Asp Glu Val Ile Pro Ala Asp Pro Asn Glu Arg
1205 1210 1215
Leu Arg Trp Val Phe Asp Val Lys Thr Lys Ser Ser His Phe Asp
1220 1225 1230
Val Asp Trp Gly Met Glu Glu Asp Thr Lys Leu Leu Lys Gly Ile
1235 1240 1245
Tyr His Tyr Gly Leu Gly Ser Trp Glu Gln Ile Lys Leu Asp Pro
1250 1255 1260
Leu Leu Gly Ile Gly Asp Lys Ile Phe Leu Asn Asn Glu Asp Lys
1265 1270 1275
Lys Pro Gln Ala Lys His Leu Leu Ser Arg Ala Glu Tyr Leu Leu
1280 1285 1290
Lys Ile Met Lys Lys Gln Leu Asp Leu Lys Lys Gly Val Gln Lys
1295 1300 1305
Pro Lys Arg Gln Arg Lys Lys Glu Gln Lys Val Leu Thr Lys Glu
1310 1315 1320
Ile Ile Asp Asp Asp Glu Ser Ser Asn Asp Val Ser Ser Leu Pro
1325 1330 1335
Ser Ser Ala Pro Val Thr Val Ser Val Ala Pro Val Val Lys Lys
1340 1345 1350
Val Lys Lys Glu Val Lys Lys Glu Lys Glu Asp Lys Glu Glu Ser
1355 1360 1365
Ser Pro Glu Lys Lys Glu Lys Lys Lys Asp Lys Lys Lys Glu Lys
1370 1375 1380
Lys Thr Ser Gly Pro Met His Phe Ser Thr Asn Glu Pro Val Ala
1385 1390 1395
Leu Asn Val Leu Gly Asp Leu Asp Pro Leu Ile Phe Asn Glu Cys
1400 1405 1410
Lys Glu Lys Met Arg Pro Val Lys Lys Ala Leu Lys Ala Leu Asp
1415 1420 1425
Asn Pro Asp Glu Ser Leu Pro Glu Ala Glu Gln Val Gln His Thr
1430 1435 1440
Arg Asp Cys Leu Leu Gln Ile Gly Glu Gln Ile Asn Thr Cys Leu
1445 1450 1455
Leu Lys Tyr Thr Asp Pro Glu Lys Ile Lys Glu Trp Arg Ser Asn
1460 1465 1470
Leu Trp Tyr Phe Val Ser Lys Phe Thr Glu Tyr Asp Ala Lys Lys
1475 1480 1485
Leu Tyr Lys Leu Tyr Lys Lys Ala Cys Lys Lys Thr Asp Lys Ile
1490 1495 1500
Glu Thr Lys Lys Glu Lys Lys Ala Glu Lys Arg Ala Glu His Leu
1505 1510 1515
Glu Lys Glu Arg Glu Glu Thr Ala Ser Thr Ser Ala Asp Lys Val
1520 1525 1530
Lys Lys Ile Lys Ile Pro Arg Thr Glu Lys Lys Asp Ala Lys Glu
1535 1540 1545
His Lys Arg Lys His Asp Ser Asp Ser Glu Glu Ser Pro Lys Lys
1550 1555 1560
His Arg Ser Glu Lys Lys Glu Arg Arg Ala Lys Glu Lys Lys Arg
1565 1570 1575
Ser Arg Asp Glu Thr Ser Glu Asp Asp Gln Glu Tyr Arg Phe Asn
1580 1585 1590
Arg His Arg Lys Pro Gly Asn Tyr Arg His Asp Gln His Ala Pro
1595 1600 1605
Gln Asp Arg Trp Ser Gly Gly Gln Gln Glu Arg Phe Ser Gly Asp
1610 1615 1620
His Lys Arg Gln Gln Asp Tyr His Arg Gly Ala Gly Phe His Arg
1625 1630 1635
Asp Arg Asp Tyr Gln Arg Tyr Asp Lys Gly Ser Pro Glu Lys Asn
1640 1645 1650
Asn Asp Trp Arg Gln Tyr Pro Arg Gly Arg Glu Ile Met Pro Pro
1655 1660 1665
Met Pro Gly Gly Gln Pro Met Gly Met Gly Gly Gly Tyr Tyr Pro
1670 1675 1680
Pro Asn Tyr Asn Gln Gly Gln Gly Tyr Ala Pro Glu Gln Pro Phe
1685 1690 1695
Pro Pro Arg Asp Arg Phe Pro Leu Gly Asp Trp Arg Pro Pro Asp
1700 1705 1710
Arg Gly Gly Tyr Arg Tyr Asp Arg Arg Gln Gln
1715 1720
<210> 85
<211> 767
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 85
tacgagatgt tcatcggttg tgtaaggtgg tccgggctca gcgccatcaa aaaggtaggg 60
gtgattggtg cattttctca actgcatgaa aatattctgt agccgcattt ttgccacctg 120
tgcaccattc agtatatcaa tatccttcat tagcactttg gtattaccat tctcgctgca 180
ttttgctcaa tcctacatac acttttaact ccttcttggg ttttagccct ttctctactt 240
caattttcaa tcttctaagc aagaatggtt ttaatacagc atgcagcctc tccaccatgg 300
agttgcctcc cagacattga ctggtgttaa accaggcatc gaaatcatca gatgagttaa 360
aaacgtctgg cagtaagaag ttgagaagag accagagttc atgtaaattg ttttgtaatg 420
gagtacctgt tagcagtagc ctgttggtat tcttgaattc cctgagaatt tcggaaagct 480
tagtcttttt cattttttat acgatgagct tcatcaacga ccagatatct ccacttgaac 540
ttttttaata gagatttttc tttaatacac atttcatacg aggttataca gacatcccat 600
tcaccaggca tcatcgtatc tctgataatt gagttcctag cctcttgatc gccaatgaga 660
caaacagctc tcaaggttgg acaccactgc tggaactcat tcatccaatt tgataaggta 720
gatttaggaa caacgacaaa tatgaggacc aggtgtactt ttatagt 767
<210> 86
<211> 110
<212> PRT
<213> Diabrotica virgifera
<400> 86
Lys Met Lys Lys Thr Lys Leu Ser Glu Ile Leu Arg Glu Phe Lys Asn
1 5 10 15
Thr Asn Arg Leu Leu Leu Thr Gly Thr Pro Leu Gln Asn Asn Leu His
20 25 30
Glu Leu Trp Ser Leu Leu Asn Phe Leu Leu Pro Asp Val Phe Asn Ser
35 40 45
Ser Asp Asp Phe Asp Ala Trp Phe Asn Thr Ser Gln Cys Leu Gly Gly
50 55 60
Asn Ser Met Val Glu Arg Leu His Ala Val Leu Lys Pro Phe Leu Leu
65 70 75 80
Arg Arg Leu Lys Ile Glu Val Glu Lys Gly Leu Lys Pro Lys Lys Glu
85 90 95
Leu Lys Val Tyr Val Gly Leu Ser Lys Met Gln Arg Glu Trp
100 105 110
<210> 87
<211> 3074
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 87
ctttgttaat caaataaaac tttgtttcaa catattgcaa aattcatcta aacgttcaac 60
atgtcacaaa ctgaaggctc gacagaggcg agcgtaagtg cctcagaacc aatggaagaa 120
gcagagaact cggaattggc tcaaaatgaa gaatcttctt cagatactac ctctaagggt 180
gaagagttcg aggtcaaagt ggcttctgac agaggaaaaa gatttgacta cttgttgaaa 240
cagactgaaa tcttttcaca ttttatgaac caaacaaaat ctcccagtaa accaaaaact 300
gggaggccta aaaaagagaa gagtgataca tctgatttaa gacatcgtaa aactgaacaa 360
gaagaagatg aagaactttt agcagaaacc aaccttaaaa caaagactac aactcgtttt 420
gatgcctcac caccctacat caaacatggg gaaatgagag attatcaagt ccgtggtttg 480
aactggatga tttctttgta tgaacatggc atcaatggta ttttagcaga tgagatgggt 540
ttgggtaaaa ctttacaaac catatctctg cttggatata tgaagcacta taaaagtaca 600
cctggtcctc atattgtcat tgttcctaaa tctaccttat caaactggat gaatgagttc 660
gagaagtggt gtccaacctt gagagccgtt tgtctcattg gtgatcaaga ggctaggagc 720
tcatttatca gagatacgat gatgcctggt gaatgggatg tttgtgtaac ctcgtacgaa 780
atgtgtatta aagaaaaatc tgtatttaaa aagttcaact ggagatatat ggtcattgac 840
gaagctcatc gtataaaaaa tgaaaaatct aagctttccg aaattctcag ggagttcaag 900
actactaaca ggctactgct aacaggtact ccattacaaa acaatttaca cgaactctgg 960
gctcttctca acttcttact gccagatgtt ttcaactcat cggatgattt cgatgcctgg 1020
ttcaacacca gtcaatgtct gggagacaac gccttggtcg agagattgca tgctgtatta 1080
aaaccattct tgcttagaag attgaaagct gaagtggaga aacggctaaa acccaagaag 1140
gagttaaaag tgtatgtagg attgagcaag atgcaacgag aatggtatac caaagtgctg 1200
atgaaggata ttgatatagt gaatggtgca ggaaaggtag aaaaaatgcg actacagaat 1260
attctcatgc agttaagaaa atgcacaaat cacccctacc tttttgatgg cgctgagccc 1320
ggaccacctt acacaaccga tgaacatctc gtgtacaatt gcggtaaaat ggtgttgctg 1380
gataaactgc ttcccaaatt gaaggaacag gaatctcgtg tacttatctt ctctcagatg 1440
acccgtatgt tggatatact tgaagattac tgtcattggc gacagtacca atattgtcgt 1500
ttggatggtc aaaccccaca cgaagacaga cagagacaaa tcaacgagta taacgaagac 1560
aatagccaaa agtttatctt tatgttgtca actagagccg gtggattggg tatcaatttg 1620
gccacagctg atgtagttat tatatatgat tcggattgga atccccagat ggatctgcaa 1680
gccatggaca gagcgcatag aattggtcag aagaaacaag tcagagtttt caggtttatt 1740
accgaaaaca ctgtggaaga aaaaatcgtc gaaagagctg aagtaaaatt acgtttagac 1800
aaattagtta tccagcaggg tcgtttagcc gattccaaag cacagactct aaacaaagac 1860
gaaatgttga acatgatccg gcacggtgcc aaccacgtat ttgcttctaa ggattccgaa 1920
ataacagatg aagatatcga tagtatattg gaaaagggag aaatgaagac cgctcagcta 1980
gctcagaaga tggaaaccat gggcgaatcg tcacttcgca acttcacagt cgaaacaccc 2040
actgaatcag tctaccaatt cgaaggagaa gattatcgtg agaagcagaa aaccatcggc 2100
ttgagcaact ggatagaacc tcccaaaaga gaaaggaagg ccaactatgc cgtcgatgct 2160
tacttcagag aagctttaag ggtttctgag cctaaagcgc ctaaggctcc aagaccacca 2220
aaacagccca tcgtacaaga tttccagttt ttcccgccga gattattcga acttttggac 2280
caggagatct acttttacag gaaatctttg ggatataagg ttccgaaaaa cttagaactt 2340
ggacctgacg cgtccaagca acagaaagaa gagcaaagaa aaatagatga gtcagaaccg 2400
ctcaccgaag acgaacagca agaaaaagaa aacttgttaa cgcaaggttt caccaattgg 2460
agtaaacgcg atttcaatca gttcatcaaa gccaacgaga aatatggtag ggacgatatt 2520
gagaacatcg ccaaggatgt tgaaggcaaa acgcctgaag aagttatgga atattctgcg 2580
gtgttttggg aaagatgtca tgaattacag gatattgata gaataatggc ccagattgag 2640
agaggagaaa ctaaaataca aagaagagct agtattaaga aggcacttga tgctaaaatg 2700
gcaagatatc gtgcaccatt ccatcagctg agaatttctt acggcaccaa caaaggcaag 2760
aactacatgg aggacgaaga caggtttttg gtgtgtatgt tgcacaagtt gggtttcgat 2820
agagaaaacg tttatgaaga gttaagagca gctgtacgtg cgtcaccaca attcagattt 2880
gattggttct taaaatcgag aactgccatg gagctgcaaa ggagatgcaa cacattgata 2940
acgttaatag aaagagaaaa tgctgaattg gaggaaagag aaaaaattga taaaaagaaa 3000
aaagtttcca aatcttcaaa tcttggaggt attcctgccc aaatcagctc gaaatcttca 3060
cagaaacgga agaa 3074
<210> 88
<211> 987
<212> PRT
<213> Diabrotica virgifera
<400> 88
Met Glu Glu Ala Glu Asn Ser Glu Leu Ala Gln Asn Glu Glu Ser Ser
1 5 10 15
Ser Asp Thr Thr Ser Lys Gly Glu Glu Phe Glu Val Lys Val Ala Ser
20 25 30
Asp Arg Gly Lys Arg Phe Asp Tyr Leu Leu Lys Gln Thr Glu Ile Phe
35 40 45
Ser His Phe Met Asn Gln Thr Lys Ser Pro Ser Lys Pro Lys Thr Gly
50 55 60
Arg Pro Lys Lys Glu Lys Ser Asp Thr Ser Asp Leu Arg His Arg Lys
65 70 75 80
Thr Glu Gln Glu Glu Asp Glu Glu Leu Leu Ala Glu Thr Asn Leu Lys
85 90 95
Thr Lys Thr Thr Thr Arg Phe Asp Ala Ser Pro Pro Tyr Ile Lys His
100 105 110
Gly Glu Met Arg Asp Tyr Gln Val Arg Gly Leu Asn Trp Met Ile Ser
115 120 125
Leu Tyr Glu His Gly Ile Asn Gly Ile Leu Ala Asp Glu Met Gly Leu
130 135 140
Gly Lys Thr Leu Gln Thr Ile Ser Leu Leu Gly Tyr Met Lys His Tyr
145 150 155 160
Lys Ser Thr Pro Gly Pro His Ile Val Ile Val Pro Lys Ser Thr Leu
165 170 175
Ser Asn Trp Met Asn Glu Phe Glu Lys Trp Cys Pro Thr Leu Arg Ala
180 185 190
Val Cys Leu Ile Gly Asp Gln Glu Ala Arg Ser Ser Phe Ile Arg Asp
195 200 205
Thr Met Met Pro Gly Glu Trp Asp Val Cys Val Thr Ser Tyr Glu Met
210 215 220
Cys Ile Lys Glu Lys Ser Val Phe Lys Lys Phe Asn Trp Arg Tyr Met
225 230 235 240
Val Ile Asp Glu Ala His Arg Ile Lys Asn Glu Lys Ser Lys Leu Ser
245 250 255
Glu Ile Leu Arg Glu Phe Lys Thr Thr Asn Arg Leu Leu Leu Thr Gly
260 265 270
Thr Pro Leu Gln Asn Asn Leu His Glu Leu Trp Ala Leu Leu Asn Phe
275 280 285
Leu Leu Pro Asp Val Phe Asn Ser Ser Asp Asp Phe Asp Ala Trp Phe
290 295 300
Asn Thr Ser Gln Cys Leu Gly Asp Asn Ala Leu Val Glu Arg Leu His
305 310 315 320
Ala Val Leu Lys Pro Phe Leu Leu Arg Arg Leu Lys Ala Glu Val Glu
325 330 335
Lys Arg Leu Lys Pro Lys Lys Glu Leu Lys Val Tyr Val Gly Leu Ser
340 345 350
Lys Met Gln Arg Glu Trp Tyr Thr Lys Val Leu Met Lys Asp Ile Asp
355 360 365
Ile Val Asn Gly Ala Gly Lys Val Glu Lys Met Arg Leu Gln Asn Ile
370 375 380
Leu Met Gln Leu Arg Lys Cys Thr Asn His Pro Tyr Leu Phe Asp Gly
385 390 395 400
Ala Glu Pro Gly Pro Pro Tyr Thr Thr Asp Glu His Leu Val Tyr Asn
405 410 415
Cys Gly Lys Met Val Leu Leu Asp Lys Leu Leu Pro Lys Leu Lys Glu
420 425 430
Gln Glu Ser Arg Val Leu Ile Phe Ser Gln Met Thr Arg Met Leu Asp
435 440 445
Ile Leu Glu Asp Tyr Cys His Trp Arg Gln Tyr Gln Tyr Cys Arg Leu
450 455 460
Asp Gly Gln Thr Pro His Glu Asp Arg Gln Arg Gln Ile Asn Glu Tyr
465 470 475 480
Asn Glu Asp Asn Ser Gln Lys Phe Ile Phe Met Leu Ser Thr Arg Ala
485 490 495
Gly Gly Leu Gly Ile Asn Leu Ala Thr Ala Asp Val Val Ile Ile Tyr
500 505 510
Asp Ser Asp Trp Asn Pro Gln Met Asp Leu Gln Ala Met Asp Arg Ala
515 520 525
His Arg Ile Gly Gln Lys Lys Gln Val Arg Val Phe Arg Phe Ile Thr
530 535 540
Glu Asn Thr Val Glu Glu Lys Ile Val Glu Arg Ala Glu Val Lys Leu
545 550 555 560
Arg Leu Asp Lys Leu Val Ile Gln Gln Gly Arg Leu Ala Asp Ser Lys
565 570 575
Ala Gln Thr Leu Asn Lys Asp Glu Met Leu Asn Met Ile Arg His Gly
580 585 590
Ala Asn His Val Phe Ala Ser Lys Asp Ser Glu Ile Thr Asp Glu Asp
595 600 605
Ile Asp Ser Ile Leu Glu Lys Gly Glu Met Lys Thr Ala Gln Leu Ala
610 615 620
Gln Lys Met Glu Thr Met Gly Glu Ser Ser Leu Arg Asn Phe Thr Val
625 630 635 640
Glu Thr Pro Thr Glu Ser Val Tyr Gln Phe Glu Gly Glu Asp Tyr Arg
645 650 655
Glu Lys Gln Lys Thr Ile Gly Leu Ser Asn Trp Ile Glu Pro Pro Lys
660 665 670
Arg Glu Arg Lys Ala Asn Tyr Ala Val Asp Ala Tyr Phe Arg Glu Ala
675 680 685
Leu Arg Val Ser Glu Pro Lys Ala Pro Lys Ala Pro Arg Pro Pro Lys
690 695 700
Gln Pro Ile Val Gln Asp Phe Gln Phe Phe Pro Pro Arg Leu Phe Glu
705 710 715 720
Leu Leu Asp Gln Glu Ile Tyr Phe Tyr Arg Lys Ser Leu Gly Tyr Lys
725 730 735
Val Pro Lys Asn Leu Glu Leu Gly Pro Asp Ala Ser Lys Gln Gln Lys
740 745 750
Glu Glu Gln Arg Lys Ile Asp Glu Ser Glu Pro Leu Thr Glu Asp Glu
755 760 765
Gln Gln Glu Lys Glu Asn Leu Leu Thr Gln Gly Phe Thr Asn Trp Ser
770 775 780
Lys Arg Asp Phe Asn Gln Phe Ile Lys Ala Asn Glu Lys Tyr Gly Arg
785 790 795 800
Asp Asp Ile Glu Asn Ile Ala Lys Asp Val Glu Gly Lys Thr Pro Glu
805 810 815
Glu Val Met Glu Tyr Ser Ala Val Phe Trp Glu Arg Cys His Glu Leu
820 825 830
Gln Asp Ile Asp Arg Ile Met Ala Gln Ile Glu Arg Gly Glu Thr Lys
835 840 845
Ile Gln Arg Arg Ala Ser Ile Lys Lys Ala Leu Asp Ala Lys Met Ala
850 855 860
Arg Tyr Arg Ala Pro Phe His Gln Leu Arg Ile Ser Tyr Gly Thr Asn
865 870 875 880
Lys Gly Lys Asn Tyr Met Glu Asp Glu Asp Arg Phe Leu Val Cys Met
885 890 895
Leu His Lys Leu Gly Phe Asp Arg Glu Asn Val Tyr Glu Glu Leu Arg
900 905 910
Ala Ala Val Arg Ala Ser Pro Gln Phe Arg Phe Asp Trp Phe Leu Lys
915 920 925
Ser Arg Thr Ala Met Glu Leu Gln Arg Arg Cys Asn Thr Leu Ile Thr
930 935 940
Leu Ile Glu Arg Glu Asn Ala Glu Leu Glu Glu Arg Glu Lys Ile Asp
945 950 955 960
Lys Lys Lys Lys Val Ser Lys Ser Ser Asn Leu Gly Gly Ile Pro Ala
965 970 975
Gln Ile Ser Ser Lys Ser Ser Gln Lys Arg Lys
980 985
<210> 89
<211> 4998
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 89
tttcaaataa aatttgttcc ttgataataa aaaaacaaag aaaatggagg ttaatccaat 60
aattagaact cgacatattg taaaattaat gaaaaatggc cgcaaaatat tatgtactaa 120
gattgccctg attctacaat atctcgagtt aaaattattg gattaaagtt tagtaaacgt 180
cattttgttt gttttttgtt caaggaacaa attttatttg aaaattcttt ttatctcttt 240
tagtttacga actagaacct tataaataat tcaattgttc agcagccaaa aatacataaa 300
aaatttgaaa aggtcacagt gtctagctga cccctagatt cagtttaaaa attaaaaata 360
ttattaatcg tcgggataat cgtagaacga ataacttgaa tactgcgcgt tactatttac 420
attagagcct aggttggtgc catctgaagg taacgggacc ggcaaaggcc ttgatggttt 480
gcgaggtcgg tatgttcctc tagaaccggc gtttgacggg ccacctggtt ttaaacgggg 540
tctgccagga ccccgccgca ttgatggggt ttgagcagta gaactgctag cttgagcagc 600
tccagaaact tccaaaaagc agtgggacgg tgatgaatgc atcgaagctg cagacatagt 660
agtagaatct ggagacggtt gatccgttaa aaagatacta ccaggtcccg gtgatgtaga 720
gacagaagaa ctattagata tctggcggcc aagccctgtc gtacggcttc gagatcctct 780
aggccgtccc cttcgagatg accctcttcc aggaagcctt ggtttgacag ttgtgccgta 840
tacattgtat acagtatatt tattcgtaat tgccgaatca gattcatcat tgtaaatgtc 900
tacgccatca tctatcagaa tgtcgttaga attgacactt aatggactgt tgggcccact 960
ttcgacgaca gtactagtag cttcttctaa tgtaactgat tccagtttag cttttttggg 1020
ttccatgcca actggtattg tcttatattg taattttcgt ttcctgtcta actcttcgga 1080
agtattatcg attttcaaat gatatttttg taccaattca tcatcatcca acagcaagga 1140
caccacttcc ttgggcttga gtgtatccgg tttaaagtta ccaccgctaa tgaccaattt 1200
ttgaatctcg ctcttttctc tagccctttg taagatgcgt tcttcaatag aacctttaca 1260
aattaatctg tacaccgtca cctgcttggt ctgacccaac cgatgggccc tgtccatagc 1320
ctgctggtcc acagtcgggt tccaatcact gtcgtagaaa attacagtat ctgcagcagt 1380
taaattgata ccaagtccac cagctcttgt cgacagtaga aaaacaaaaa tgtctgctct 1440
ggcttggaaa tcagcaacca tatcccttcg ttctgatatt tttgatgaac catctaacct 1500
catatactta tgatgcctgt gccacatgta ttcttctaaa agatcaatca tctttgtcat 1560
ctgcgaatat attaaaacgc gatgtccttc ctctttgagt cttttaagga gtccatcaag 1620
taccgacagt tttccagaat cggtaactaa actctcctta tctggtatca caatattcga 1680
aaaaccgtta acaggtctca aattatcaac tgcattaaac ggtcgaggat gtaaagtttc 1740
tgctgattta taattcaatt tattgttggt cgctttcgac cagtaagaat taagagagtt 1800
gaaactaaat tcgtctagat gacgctgtag atcccacgct gctctacgag aataacaata 1860
taagccgagt ggggccgccg ataccctagg catacaataa aaaagaaagg cgggaatttc 1920
agtctttgta cattggaaca cctgagttaa cctctttatg taaggaaaat cagtcaatat 1980
attttgtatc tggttcactc tatggtcatt aactcttaaa agtgcatcat ttcctgcgtt 2040
aagttcttta gtttttaatc taatattttt atgttcaaca gtttctggag tggaatgaaa 2100
cacatgatcg gtatgtgtgt aaaacactct atttcctttg ttttgttcag taaaaactaa 2160
atcaccaaat acatcactac ttcgaatctg atattgattt aaacggaaaa aattcctcaa 2220
ctgtaatgtc ggccgttttc taaaggatat gtcccatagt tttctataat ataatatttc 2280
attggatttt tggcattcgt aataatgttt ccacctgtgc aaaatattcc cttgaaatat 2340
cctaaaaaca tcttcagctg ataaacccaa aaagtgacaa aaattaaaaa tggtgggatg 2400
caaaccatct tgaatagcat cttttatgtc tcctggtttg aaaatgaagt gtttcctaat 2460
tttctccatt aaaatttctc gaacattgaa atcataaatt tgataaggaa ctgtgtactg 2520
caaagaactt attctaatgg gagatttggc gtctcttctc tcaaaaagtt cgggatggtt 2580
gcaaaccttt ctaaactgca tcaccaaatt catcaaattt gaagtaaaat tcttatctac 2640
agtgtgagaa tctcccccgc caactgtgta attcaagaga tcttcaattt tgattttttg 2700
ttttagagcc aaatacaata aattctgtct tgtggtcagt ggacagtaga ccattacttc 2760
tattttatca gacagttcat tttcaacatc tttcttgatt ctcctcaaca taaaaggttt 2820
taaaatcata tgtaaacgag ataagtgttt ttcatcgata ccagttttgt tttcagcatg 2880
gctttcaatg tcttttgaaa accattcgtt gaactcctca tgtgagtcaa agagtgttgg 2940
cataataaaa tgcaataagg cccatagctc cgccatactg ttttgtattg gggtaccact 3000
caacaacaat ctgttcctgc aactaaaacc taatagagtc ttccatctca ttgaactagt 3060
acttttgata gcctgtgctt catctagtat catgtattgc cattttattc tattaaagta 3120
ttttatatct gttataacta tttggtagga agttaccaca atgtgaaaac tagcgtcttt 3180
tgtatacatg tctttcaaat cccaaaactg ccttaaaatt tttctttcgt ttggatttcc 3240
ccaatagggc accactttaa aatccggcac aaacttggcc acttcttgct gccaattgtg 3300
cagggttgag gccggagata ttatcaaaaa agggccccag acagaatatt tttcagctat 3360
gtgacaaaga aacgcaatac tttgaacagt tttgcctaga cccatttcat cagctagaat 3420
accactgatt ccctgagagt ataaatttgc caaccaattc atccctctta gttgatatcc 3480
ttttaatttg cctctaaaca tattaggttg tggctgttca ccctctccat tgggaaattc 3540
attaagacac gaattggctt gttggtcaaa atgtctagtc cttgcttttt cactctgaaa 3600
tgcatctaat gcattctttt tggccatttc cttcatactt tcactatcgt aagtatcaca 3660
acttaatttt attgaacttt cctcgtctag ctggcttaaa attagcaact gttcttcagg 3720
agaagcctgt cccaatttct tggacatgaa atgagcatac agctcagtct gagtaataag 3780
aaagtttaat ttcctctgtt gtcgcttggc ttctaccaac tcgtggtcaa tttttctttg 3840
ttcttctgct tctttctcta accgtttctt aacttctcta tcaaaacgcc gtgagcgttt 3900
ccagtaagca atattctcac gtgataacct cttcatcctc catggctgtt ctttgactat 3960
tcgagcgctt tggagagctt tttgacgtgc atatttaaca caatgtgatg ccactcgttt 4020
gcactgcagt agcatttcct tgtgtttgtt aatttttgat ctatgttgct ttccaatttc 4080
ttttttgact atattagtaa ataattttcg ccgctttatg gtcatcatat cttcccattt 4140
ccgtctggac tcttcatctt tgaatttttt tgtttttttc tttggtatat gaagtcctaa 4200
aggaggagga ggtagagact gatttggaat gacaagtcca tattcagatg gcaaatactt 4260
atcagctata tcgtcgatgc tttggaaatc cattccattt tggagattca aatctaaaca 4320
tggttcatcc gaaatagcat ccaaaatatc aggatggtat agtggagact taaatgtgtc 4380
ttctatttta attttatttt tcttgacagg tactggtaga tttttttcta catgtggata 4440
aagatctact gcactgatca atccagctcc atagtatgca taattatcaa aattctcttt 4500
tctttttctt aaggattttt gatatgaatg caacctcata acatgcttat attgtacatc 4560
atccggacta ctatctgaac tttcttgtag aacatcagca agccatttcc tcctagttga 4620
aacagtttta agattgtaat actcattggt agagtgaggt tctgaatctt ttaaaataga 4680
atctatattg acatcactca gattgcccat gccatcatca gaatcgtcag agtcgctact 4740
taactgtaat tggttgtgta catctcgtaa aaacatatta gtgtcgacag cttgctcaac 4800
tcttcttaca tgaactggtt tagctgtata tgatctatta gtttgatcaa ggtagctgtt 4860
ggtgggtaat attttgtatg atttatccct gccgttccac attttttcta aatgtaataa 4920
actgttttca gaatatctat ataaattaag ctaatataat tttacattac attacattct 4980
caattagttc atttttta 4998
<210> 90
<211> 1512
<212> PRT
<213> Diabrotica virgifera
<400> 90
Met Trp Asn Gly Arg Asp Lys Ser Tyr Lys Ile Leu Pro Thr Asn Ser
1 5 10 15
Tyr Leu Asp Gln Thr Asn Arg Ser Tyr Thr Ala Lys Pro Val His Val
20 25 30
Arg Arg Val Glu Gln Ala Val Asp Thr Asn Met Phe Leu Arg Asp Val
35 40 45
His Asn Gln Leu Gln Leu Ser Ser Asp Ser Asp Asp Ser Asp Asp Gly
50 55 60
Met Gly Asn Leu Ser Asp Val Asn Ile Asp Ser Ile Leu Lys Asp Ser
65 70 75 80
Glu Pro His Ser Thr Asn Glu Tyr Tyr Asn Leu Lys Thr Val Ser Thr
85 90 95
Arg Arg Lys Trp Leu Ala Asp Val Leu Gln Glu Ser Ser Asp Ser Ser
100 105 110
Pro Asp Asp Val Gln Tyr Lys His Val Met Arg Leu His Ser Tyr Gln
115 120 125
Lys Ser Leu Arg Lys Arg Lys Glu Asn Phe Asp Asn Tyr Ala Tyr Tyr
130 135 140
Gly Ala Gly Leu Ile Ser Ala Val Asp Leu Tyr Pro His Val Glu Lys
145 150 155 160
Asn Leu Pro Val Pro Val Lys Lys Asn Lys Ile Lys Ile Glu Asp Thr
165 170 175
Phe Lys Ser Pro Leu Tyr His Pro Asp Ile Leu Asp Ala Ile Ser Asp
180 185 190
Glu Pro Cys Leu Asp Leu Asn Leu Gln Asn Gly Met Asp Phe Gln Ser
195 200 205
Ile Asp Asp Ile Ala Asp Lys Tyr Leu Pro Ser Glu Tyr Gly Leu Val
210 215 220
Ile Pro Asn Gln Ser Leu Pro Pro Pro Pro Leu Gly Leu His Ile Pro
225 230 235 240
Lys Lys Lys Thr Lys Lys Phe Lys Asp Glu Glu Ser Arg Arg Lys Trp
245 250 255
Glu Asp Met Met Thr Ile Lys Arg Arg Lys Leu Phe Thr Asn Ile Val
260 265 270
Lys Lys Glu Ile Gly Lys Gln His Arg Ser Lys Ile Asn Lys His Lys
275 280 285
Glu Met Leu Leu Gln Cys Lys Arg Val Ala Ser His Cys Val Lys Tyr
290 295 300
Ala Arg Gln Lys Ala Leu Gln Ser Ala Arg Ile Val Lys Glu Gln Pro
305 310 315 320
Trp Arg Met Lys Arg Leu Ser Arg Glu Asn Ile Ala Tyr Trp Lys Arg
325 330 335
Ser Arg Arg Phe Asp Arg Glu Val Lys Lys Arg Leu Glu Lys Glu Ala
340 345 350
Glu Glu Gln Arg Lys Ile Asp His Glu Leu Val Glu Ala Lys Arg Gln
355 360 365
Gln Arg Lys Leu Asn Phe Leu Ile Thr Gln Thr Glu Leu Tyr Ala His
370 375 380
Phe Met Ser Lys Lys Leu Gly Gln Ala Ser Pro Glu Glu Gln Leu Leu
385 390 395 400
Ile Leu Ser Gln Leu Asp Glu Glu Ser Ser Ile Lys Leu Ser Cys Asp
405 410 415
Thr Tyr Asp Ser Glu Ser Met Lys Glu Met Ala Lys Lys Asn Ala Leu
420 425 430
Asp Ala Phe Gln Ser Glu Lys Ala Arg Thr Arg His Phe Asp Gln Gln
435 440 445
Ala Asn Ser Cys Leu Asn Glu Phe Pro Asn Gly Glu Gly Glu Gln Pro
450 455 460
Gln Pro Asn Met Phe Arg Gly Lys Leu Lys Gly Tyr Gln Leu Arg Gly
465 470 475 480
Met Asn Trp Leu Ala Asn Leu Tyr Ser Gln Gly Ile Ser Gly Ile Leu
485 490 495
Ala Asp Glu Met Gly Leu Gly Lys Thr Val Gln Ser Ile Ala Phe Leu
500 505 510
Cys His Ile Ala Glu Lys Tyr Ser Val Trp Gly Pro Phe Leu Ile Ile
515 520 525
Ser Pro Ala Ser Thr Leu His Asn Trp Gln Gln Glu Val Ala Lys Phe
530 535 540
Val Pro Asp Phe Lys Val Val Pro Tyr Trp Gly Asn Pro Asn Glu Arg
545 550 555 560
Lys Ile Leu Arg Gln Phe Trp Asp Leu Lys Asp Met Tyr Thr Lys Asp
565 570 575
Ala Ser Phe His Ile Val Val Thr Ser Tyr Gln Ile Val Ile Thr Asp
580 585 590
Ile Lys Tyr Phe Asn Arg Ile Lys Trp Gln Tyr Met Ile Leu Asp Glu
595 600 605
Ala Gln Ala Ile Lys Ser Thr Ser Ser Met Arg Trp Lys Thr Leu Leu
610 615 620
Gly Phe Ser Cys Arg Asn Arg Leu Leu Leu Ser Gly Thr Pro Ile Gln
625 630 635 640
Asn Ser Met Ala Glu Leu Trp Ala Leu Leu His Phe Ile Met Pro Thr
645 650 655
Leu Phe Asp Ser His Glu Glu Phe Asn Glu Trp Phe Ser Lys Asp Ile
660 665 670
Glu Ser His Ala Glu Asn Lys Thr Gly Ile Asp Glu Lys His Leu Ser
675 680 685
Arg Leu His Met Ile Leu Lys Pro Phe Met Leu Arg Arg Ile Lys Lys
690 695 700
Asp Val Glu Asn Glu Leu Ser Asp Lys Ile Glu Val Met Val Tyr Cys
705 710 715 720
Pro Leu Thr Thr Arg Gln Asn Leu Leu Tyr Leu Ala Leu Lys Gln Lys
725 730 735
Ile Lys Ile Glu Asp Leu Leu Asn Tyr Thr Val Gly Gly Gly Asp Ser
740 745 750
His Thr Val Asp Lys Asn Phe Thr Ser Asn Leu Met Asn Leu Val Met
755 760 765
Gln Phe Arg Lys Val Cys Asn His Pro Glu Leu Phe Glu Arg Arg Asp
770 775 780
Ala Lys Ser Pro Ile Arg Ile Ser Ser Leu Gln Tyr Thr Val Pro Tyr
785 790 795 800
Gln Ile Tyr Asp Phe Asn Val Arg Glu Ile Leu Met Glu Lys Ile Arg
805 810 815
Lys His Phe Ile Phe Lys Pro Gly Asp Ile Lys Asp Ala Ile Gln Asp
820 825 830
Gly Leu His Pro Thr Ile Phe Asn Phe Cys His Phe Leu Gly Leu Ser
835 840 845
Ala Glu Asp Val Phe Arg Ile Phe Gln Gly Asn Ile Leu His Arg Trp
850 855 860
Lys His Tyr Tyr Glu Cys Gln Lys Ser Asn Glu Ile Leu Tyr Tyr Arg
865 870 875 880
Lys Leu Trp Asp Ile Ser Phe Arg Lys Arg Pro Thr Leu Gln Leu Arg
885 890 895
Asn Phe Phe Arg Leu Asn Gln Tyr Gln Ile Arg Ser Ser Asp Val Phe
900 905 910
Gly Asp Leu Val Phe Thr Glu Gln Asn Lys Gly Asn Arg Val Phe Tyr
915 920 925
Thr His Thr Asp His Val Phe His Ser Thr Pro Glu Thr Val Glu His
930 935 940
Lys Asn Ile Arg Leu Lys Thr Lys Glu Leu Asn Ala Gly Asn Asp Ala
945 950 955 960
Leu Leu Arg Val Asn Asp His Arg Val Asn Gln Ile Gln Asn Ile Leu
965 970 975
Thr Asp Phe Pro Tyr Ile Lys Arg Leu Thr Gln Val Phe Gln Cys Thr
980 985 990
Lys Thr Glu Ile Pro Ala Phe Leu Phe Tyr Cys Met Pro Arg Val Ser
995 1000 1005
Ala Ala Pro Leu Gly Leu Tyr Cys Tyr Ser Arg Arg Ala Ala Trp
1010 1015 1020
Asp Leu Gln Arg His Leu Asp Glu Phe Ser Phe Asn Ser Leu Asn
1025 1030 1035
Ser Tyr Trp Ser Lys Ala Thr Asn Asn Lys Leu Asn Tyr Lys Ser
1040 1045 1050
Ala Glu Thr Leu His Pro Arg Pro Phe Asn Ala Val Asp Asn Leu
1055 1060 1065
Arg Pro Val Asn Gly Phe Ser Asn Ile Val Ile Pro Asp Lys Glu
1070 1075 1080
Ser Leu Val Thr Asp Ser Gly Lys Leu Ser Val Leu Asp Gly Leu
1085 1090 1095
Leu Lys Arg Leu Lys Glu Glu Gly His Arg Val Leu Ile Tyr Ser
1100 1105 1110
Gln Met Thr Lys Met Ile Asp Leu Leu Glu Glu Tyr Met Trp His
1115 1120 1125
Arg His His Lys Tyr Met Arg Leu Asp Gly Ser Ser Lys Ile Ser
1130 1135 1140
Glu Arg Arg Asp Met Val Ala Asp Phe Gln Ala Arg Ala Asp Ile
1145 1150 1155
Phe Val Phe Leu Leu Ser Thr Arg Ala Gly Gly Leu Gly Ile Asn
1160 1165 1170
Leu Thr Ala Ala Asp Thr Val Ile Phe Tyr Asp Ser Asp Trp Asn
1175 1180 1185
Pro Thr Val Asp Gln Gln Ala Met Asp Arg Ala His Arg Leu Gly
1190 1195 1200
Gln Thr Lys Gln Val Thr Val Tyr Arg Leu Ile Cys Lys Gly Ser
1205 1210 1215
Ile Glu Glu Arg Ile Leu Gln Arg Ala Arg Glu Lys Ser Glu Ile
1220 1225 1230
Gln Lys Leu Val Ile Ser Gly Gly Asn Phe Lys Pro Asp Thr Leu
1235 1240 1245
Lys Pro Lys Glu Val Val Ser Leu Leu Leu Asp Asp Asp Glu Leu
1250 1255 1260
Val Gln Lys Tyr His Leu Lys Ile Asp Asn Thr Ser Glu Glu Leu
1265 1270 1275
Asp Arg Lys Arg Lys Leu Gln Tyr Lys Thr Ile Pro Val Gly Met
1280 1285 1290
Glu Pro Lys Lys Ala Lys Leu Glu Ser Val Thr Leu Glu Glu Ala
1295 1300 1305
Thr Ser Thr Val Val Glu Ser Gly Pro Asn Ser Pro Leu Ser Val
1310 1315 1320
Asn Ser Asn Asp Ile Leu Ile Asp Asp Gly Val Asp Ile Tyr Asn
1325 1330 1335
Asp Glu Ser Asp Ser Ala Ile Thr Asn Lys Tyr Thr Val Tyr Asn
1340 1345 1350
Val Tyr Gly Thr Thr Val Lys Pro Arg Leu Pro Gly Arg Gly Ser
1355 1360 1365
Ser Arg Arg Gly Arg Pro Arg Gly Ser Arg Ser Arg Thr Thr Gly
1370 1375 1380
Leu Gly Arg Gln Ile Ser Asn Ser Ser Ser Val Ser Thr Ser Pro
1385 1390 1395
Gly Pro Gly Ser Ile Phe Leu Thr Asp Gln Pro Ser Pro Asp Ser
1400 1405 1410
Thr Thr Met Ser Ala Ala Ser Met His Ser Ser Pro Ser His Cys
1415 1420 1425
Phe Leu Glu Val Ser Gly Ala Ala Gln Ala Ser Ser Ser Thr Ala
1430 1435 1440
Gln Thr Pro Ser Met Arg Arg Gly Pro Gly Arg Pro Arg Leu Lys
1445 1450 1455
Pro Gly Gly Pro Ser Asn Ala Gly Ser Arg Gly Thr Tyr Arg Pro
1460 1465 1470
Arg Lys Pro Ser Arg Pro Leu Pro Val Pro Leu Pro Ser Asp Gly
1475 1480 1485
Thr Asn Leu Gly Ser Asn Val Asn Ser Asn Ala Gln Tyr Ser Ser
1490 1495 1500
Tyr Ser Phe Tyr Asp Tyr Pro Asp Asp
1505 1510
<210> 91
<211> 8026
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 91
cgtcgctatg tcatataaga ccaatgcgtc atttttgctg aacgcgtaaa atgtagaaaa 60
caggtctatt ttgcaaattt ttaagttacg tggactacct aattgtatat taaactatta 120
gaaagacgat aatcatattt tttactgcgg atgattaacc ttaatgtgaa tattttgtga 180
taacatgatg agaattcgaa gatgagtgac gaaactccgg gggtagggca gggtgctctg 240
cccccgagag agggccaaag ccttcgactc cttgcagagc gccctactag tggtgctacg 300
gtaagggtag cccaggttgt tggtggtcag tatgtgttga caacacaatc acatggtatg 360
ccagctctag cacagattgc tgctgggaat cccaacgtca ctcgtctgat aagcatcagt 420
ccaactagag gtggacaatc gtccccacta aggcccagtt tggccaatca gtcgatcgtt 480
aatgttctta ccaagtctcg accaaatcct aatgtacgct tacagttatt tcaatccggt 540
gagagttctg gaaacaatgt ccagcatagt ccccattcga gatcactcaa aaggccgttg 600
tcttccacgg gtgaaaaaaa agatagctac gcttctaagc tgcaacatgt aatgaaccat 660
cgcattgttc gctcaaaatt aatgaaagaa aagtataatg aacatcttct agaggcctat 720
tatttagaga ccggaaataa cattctagat ttatatcaat ttgccaaaag acctaaaacc 780
caagcgtatc tagcttatct taaggaacat gccatcgatc ctcgagatta tcctgaactt 840
cagactacaa caactgttac tgtaccgcaa acgacgccta atacaccaac tgctacctct 900
gtcagctctc tgcccggtat ctctcatagt tacgccatcc agactaccag ttctactgta 960
acgacaccag aaagtaacag taacacctct acgccgaaat cagtatctgt caaagtgaag 1020
tctacatcac ttccgaatac tgttagtcaa gagatgattg tagagaaggc gaaacaagaa 1080
gcgtacgtgg tccaacgaat agccgattta cagaaggaag gaatatggtc tgaaaggaga 1140
cttcccaaag tgcaagagat gcctcggcct aaagcgcatt gggacttttt gatcgaagaa 1200
atggtctggt tggcagctga ttttgcgcag gaacgcaaat ggaagaaagc cgccgcgaaa 1260
aaatgtgcca gaatggtaca gaagtatttc caagacaagg cgctcgccgc ccaaaaagcg 1320
gaaaaggctc acgaacaaaa tcttagaagg atagccgcgt tctgtgcaaa ggagattaag 1380
atcttttgga acaacgtcga aaaactcgtc gagtataaac agaatacaat cttggaggag 1440
aagcggaaaa aggcgctcga tcagcagctt agttttatcg tggatcagac tgagaagtat 1500
tcgcagttgc ttgccgaagg aatgaataag accgcagaac agcctcctag ttcagcgcca 1560
tctcgatcag tgtctcgaac gcagtctgat acagaattcg atccggatct tcagagcgat 1620
gaagacgacg aagagaccat tgctcgagaa gaagctttag gtaacgaagg acataaagaa 1680
gaaatcgaag cgctacagaa agaatctcag atggaattag acgatttact agaggacgat 1740
ttcctgaggg attacctttt aaatcgagac acgatccgat tcagcgaatc cgaagattcg 1800
gacgatgaca cggactcgaa aaaagaatct ttcaaaggcg acaaagaaca gtctgacgat 1860
tctgaatctt ctaaagaaga agatacggaa gacgagagcg aagatgaatc tatgaaggtt 1920
actgaatcgg ttgttaaaga agaacacgac gagttgaaaa tattagtaga agattctcaa 1980
aaagagggag aaattaagac tgaacaagat acaaaagacg accttatcaa tgacgcagct 2040
gctatagctg aaagtatcca acctaaagga aacaccctgt cttctactaa tgtatcaaca 2100
aatataccat ttttattaaa atatacgcta agagaatacc agcacatcgg tttggattgg 2160
ctggtaacta tgttcgacag aaaactgaac ggtatattag cagatgaaat gggtttaggc 2220
aaaacaatac aaacgatagc tcttctagca cacttggcgt gcgagaagga aaactggggc 2280
ccccatctga tagtagtccc cacttctgtg atgctgaatt gggaaatgga atgcaaaaag 2340
tggtgtccgg cttttaaaat tctaacgtat tacggaacgc agaaggaaag aaaatttaaa 2400
cggataggat ggacgaagcc taacgcgttt cacatatgca ttacttcgta caagctagtc 2460
attcaggacc accagagttt caggaggaaa aagtggaagt atctgatact ggacgaggcc 2520
caaaacatca agaatttcaa gtcgcaacga tggcagctgt tgttaaattt tcaaactcaa 2580
caacgtctgc tgttgactgg tacacctttg cagaacaacc tcatggaatt gtggtccctt 2640
atgcattttt taatgccgaa cgtatttcag tcgcatagag agttcaaaga atggttttcg 2700
aatccggtga caggaatgat tgaaggaaat tctgaataca acgaaagtat tatcaagaga 2760
ctgcacaagg tattaagacc atttcttcta aggcggttga aaagcgaagt ggaaaaacaa 2820
atgccaaaaa agtacgaaca cgtggtcatg tgtaggctat ccaaacgaca gaggtatttg 2880
tatgatgact acatgtcccg agcaaaaacg agggaaactt taactactgg aaatctgttg 2940
agtgttataa atgtgctgat gcagctgagg aaagtgtgta atcatccgaa tctatttgaa 3000
attagaccaa cgacatcgcc ttttcagtgt gacaacatcc ggcttcatat tccatccatt 3060
gtatattcag ctttagatta cgatcctgat aagcacgtga accttcaagc tttaaatctt 3120
ctactaatca tgcaagaaat ccactttggt tcgtaccagt gttaccggat gagacaatca 3180
agaaattcca agaaaatttt cgaaatggaa acgaattcta gcaaaaatcc accaccttgt 3240
ccgccatgta agttagccat gcgagttcta acagacaaac cttcagccac tgacgaaaag 3300
aatgagaaga aagacatgca agctttaagt cagccgcctc cattgcaagt taaaggaatg 3360
agccagccta acatgaagat gaaggtttct ggagtgcaat ttgttccaca gagcatactt 3420
aaatcaattc cagtagtgaa catatcacaa ggggctacag gtcaaatcgg agcacctgtt 3480
agtgtgacat ctgtattaaa accacaagac aaaatatctg ctagttttgc acagctagtt 3540
caaacgtcta ctggcaaaca cttgttacta acgtcgaatc ccaacattac gacgagccca 3600
gtgacaacta caacaccagg tggacaaaaa ttgaccttcc tatcgaagca gcccgtttct 3660
acgattggta atgcgggcca tgctgtaacg aaagcttatg tcaaatttca gttaacgtct 3720
gttacgacag catcaacttt cacaacagtt acgacagtca actccaatac gatatctgta 3780
gctaaaagtg aagataacaa agggatgcga atgtctgttg gtaatgatta tataggtaaa 3840
ctttattcta aacaaaatag cctggacgtg cgatggaata gcggcgaaaa acatttaggt 3900
ttaacaaatg aagacgatcc caaaggtgaa cgaaagaaga gactttccct catgtcacgc 3960
atcaacaaga tccgttgctc agctcttcca ctgtacggcc gagatttcca agaagctgtc 4020
aaaatatata cgcctaacca gctggatgtt tggaacgggg gtcatattca ctgcttgaac 4080
acactgtaca ataaggatgc caggaatgaa acgacggatt gtctccaaga cgcgttgttt 4140
aatcctgaaa gaagattgga agctctaaaa gatacttttg atcgatttat attctatgta 4200
ccttctgtga aagtggcgga acccgaactg caagtgtggc atcctccacc gagtaaatat 4260
tggggccaaa aacacgagaa acaacttata cagaaactat tcctaaaacc tgcaacacct 4320
cttcatagta tagcatctgc aatggtaacg cagtttccag atcctaggct tattcaatat 4380
gactgtggga agttacaaac tctggatata ctattgagga agttaaaact gggaagtcat 4440
cgagtattga tcttcacgca gatgacgaaa atgttggatg tactagaggc atttttgaat 4500
taccacggtc atatatatct taggttagat ggtaccacaa aagttgatca aagacaagtg 4560
ttgatggaga ggttcaacgg tgataaacgt attttcgctt ttattttgtc cacgcgttcc 4620
gggggcgtgg gtgtaaattt aaccggagcg gatactgtga tattttatga ttccgattgg 4680
aatccaacta tggacgcgca agcgcaagat cgttgtcacc gaatcggtca aacgagagac 4740
gtacacattt acaggctagt tagcgagcga acgatagagg agaatatatt gaagaaggcc 4800
aatcagaaac gattgctcgg agatctggcg atcgaagggg gtaatttcac aacggcgtac 4860
ttcaagagtt cgacgattca ggacttattc aacatagacc aaaacgaaga aagcgcatct 4920
gcccgaatgt cagaagttgt cgaactgaga aaagaaagag agaaggccct cagcacagac 4980
ctggttcatt ctgctgacga taaagccacc gtcggtgctc tcgaaaatgc tttcgaagca 5040
tgcgaggacg accaggacgt ccaagccgcg aaaacggcca aagccgaagc tgttgcagat 5100
cttgcagagt ttgatgaaaa cattcctctg gatgatcaag agaaagaacc tgagatcagc 5160
aaggcggaac aggaaattaa taatattata gaaaagttaa ctcccataga aaaatacgcc 5220
atgaatttca tcgaggcaac agaatctgcg tggtctgcag aacagcttgc agctgctgca 5280
agagagatcg aagaacagaa aaaggaatgg gagcagaacc gtctggcggc gatgcgagaa 5340
gaggaggaac gtcgtgctcg agagttagaa gaagaatctg atatcatcac gtattcaaga 5400
gatgacgcca ccaaccaggt tagctcaaaa aacaaaaaaa tcaataggta taataaaatt 5460
ttaagtaata aaagggttag gctcaaaaaa gatggagatg aagacgttga gaaaaaagat 5520
gacgtcgaga aaaaagatgg agttgaaaaa aggttgaaga agactaggac acgaaggctg 5580
tctcaaaaaa gcaaagatgt agaggtcgaa gaaccggatg cttgtgaatc acaagaagaa 5640
tctcaaatta acggagggga tacggataat agtgatagtg attctgattc tgatagcgaa 5700
tcttcatctt ccatggaatc taaaactacc ttaaaccacg ttgatccaaa ttcacctaga 5760
actaggtcta ggggcacagt ggctattaac ctttggacac tcgatgtcag cccgattttg 5820
cctggagaaa aaccgatgaa aaaatacggg gagaaccata gaaaaaatat taagagggtt 5880
agatctgtgt ctgaaaacga taacgatgga gataaagacg gtagaaagcg attgaggagg 5940
aaatacccca ccagtttaga aacatcagaa gaagaaaaca gtaaccagtc aagagaaaaa 6000
tctactaaga aacgtgccaa ggtagcaccc aaagggaaaa cttgtaaagt aattttaagt 6060
aatatactga acgataaacg atttaaagtc aacttaaaag aagacattga gatttcagtg 6120
agcacacaaa ttaatgagac ttccaccagc tcaaaccaga atcaaaccaa agattgcgag 6180
tctagtcaac atgagaatag caatttagat gaacagaatg attctcttga caatacagaa 6240
gttacctcat ccgaacttag taaattaact ggttgtactg aaatagataa taacgaaagt 6300
agtaaacagg aaaatgaaga attagacgaa tctatactcg aagataaata tgatgaagat 6360
ttcattacaa acaaaaatga agacatagat gaagaaacac tccttgaaga agataatcag 6420
atagagcagg ttgaaaataa aaatattgat agcacgaaag atgaaaaaca gggtgatgac 6480
agtaatgttt cagatgtagg tcatttaagt aaagataacg ataatgagga aaaaatggaa 6540
gtaacagaaa gtgttgacga ggaaaatggt gatatcaata agaaagtaga tgaagatgag 6600
agcgttaaag ataaaagaga aaggagaaaa ggtaatgagg aagatgataa tacagacaat 6660
gaagaaaaca tccaaaagtc agaaaatgat gagggcgata ttaaaaagca aggaaatcaa 6720
gatgaagaag tagaagagaa aaccttagga aattctactg aatcagttaa cgaaatagca 6780
aatgaaataa gtagatgcaa acctttaaat gagcagcaca acgaattggt agatgaagta 6840
gtaaatgaca caagtaatat ggatgaatat ataaaaaaat cggaaaattc caaagttgta 6900
gaaaagacaa gtgaagaaat actattcaac gataggggaa atcaagattc atcgtcccag 6960
gatgtaaaag atgaagagat atcatcccac aacagaggag atgaaaaggt gtcattccac 7020
gataggatag ataaagaggt attacctgaa tgtaggaaag aggaagagaa acacaataga 7080
aaaaatgaag tactatcaca aactataaaa gatgaagagg cacagtccca caataggaaa 7140
gatgaatcgg gtacatttcc aaacgtagca gatatagaaa atagacttaa caacaaagtt 7200
cctcacgtcg ataatggtca taccgaaacg gtcagaatgt ctaaattggt aacgtctaat 7260
agaaatgcca atttcaggtc tcctgaaacg agaagaagct tcagaaagtg tggtaaaatt 7320
tcgaacaatc agactttaga cggttgggtg aaacggtcgc ctgtattacc tgtcgaagct 7380
gctaaagtaa acgataactc aaaatataaa aatgttggtt cgcccgagtt atagggagat 7440
ttgactgtgg aaagaggaga aatttaaaag tttttgatag ttaaaaaagt gtttattgat 7500
caatgtacac tgcaataagg taataactca aaaataattt atttctttac agttttcttc 7560
ttcatccact cctggacaaa ggcctcacga agtgttttac aagtttcttt gataacgggt 7620
aaaaccaaaa aatagtaaag ttcgcataac cttctggcta atgtctagtc ttagggttca 7680
agtcgcgcaa gcgcccagac cgaccgcttt acgtgccttc cgaatgacgg cggcggctca 7740
gaacaatttc ttaatgtcag tgccaggaat ctaacctaga tcctctagct tgttaagtca 7800
gtaataaaca ttagttcaac ggacatattg tcactttatt gcgcatgcgt ttatcattac 7860
tgagtcttga gttctgccta gccgtaccgt tgacatattc gtaaagattg tagtaataag 7920
gcatgcatca gatctttata gatttcaaac atgcttatga ctcagttaca attcgtccaa 7980
gactatggaa tggtatagtt gagctggaca tacctaagaa attagc 8026
<210> 92
<211> 2410
<212> PRT
<213> Diabrotica virgifera
<400> 92
Met Ser Asp Glu Thr Pro Gly Val Gly Gln Gly Ala Leu Pro Pro Arg
1 5 10 15
Glu Gly Gln Ser Leu Arg Leu Leu Ala Glu Arg Pro Thr Ser Gly Ala
20 25 30
Thr Val Arg Val Ala Gln Val Val Gly Gly Gln Tyr Val Leu Thr Thr
35 40 45
Gln Ser His Gly Met Pro Ala Leu Ala Gln Ile Ala Ala Gly Asn Pro
50 55 60
Asn Val Thr Arg Leu Ile Ser Ile Ser Pro Thr Arg Gly Gly Gln Ser
65 70 75 80
Ser Pro Leu Arg Pro Ser Leu Ala Asn Gln Ser Ile Val Asn Val Leu
85 90 95
Thr Lys Ser Arg Pro Asn Pro Asn Val Arg Leu Gln Leu Phe Gln Ser
100 105 110
Gly Glu Ser Ser Gly Asn Asn Val Gln His Ser Pro His Ser Arg Ser
115 120 125
Leu Lys Arg Pro Leu Ser Ser Thr Gly Glu Lys Lys Asp Ser Tyr Ala
130 135 140
Ser Lys Leu Gln His Val Met Asn His Arg Ile Val Arg Ser Lys Leu
145 150 155 160
Met Lys Glu Lys Tyr Asn Glu His Leu Leu Glu Ala Tyr Tyr Leu Glu
165 170 175
Thr Gly Asn Asn Ile Leu Asp Leu Tyr Gln Phe Ala Lys Arg Pro Lys
180 185 190
Thr Gln Ala Tyr Leu Ala Tyr Leu Lys Glu His Ala Ile Asp Pro Arg
195 200 205
Asp Tyr Pro Glu Leu Gln Thr Thr Thr Thr Val Thr Val Pro Gln Thr
210 215 220
Thr Pro Asn Thr Pro Thr Ala Thr Ser Val Ser Ser Leu Pro Gly Ile
225 230 235 240
Ser His Ser Tyr Ala Ile Gln Thr Thr Ser Ser Thr Val Thr Thr Pro
245 250 255
Glu Ser Asn Ser Asn Thr Ser Thr Pro Lys Ser Val Ser Val Lys Val
260 265 270
Lys Ser Thr Ser Leu Pro Asn Thr Val Ser Gln Glu Met Ile Val Glu
275 280 285
Lys Ala Lys Gln Glu Ala Tyr Val Val Gln Arg Ile Ala Asp Leu Gln
290 295 300
Lys Glu Gly Ile Trp Ser Glu Arg Arg Leu Pro Lys Val Gln Glu Met
305 310 315 320
Pro Arg Pro Lys Ala His Trp Asp Phe Leu Ile Glu Glu Met Val Trp
325 330 335
Leu Ala Ala Asp Phe Ala Gln Glu Arg Lys Trp Lys Lys Ala Ala Ala
340 345 350
Lys Lys Cys Ala Arg Met Val Gln Lys Tyr Phe Gln Asp Lys Ala Leu
355 360 365
Ala Ala Gln Lys Ala Glu Lys Ala His Glu Gln Asn Leu Arg Arg Ile
370 375 380
Ala Ala Phe Cys Ala Lys Glu Ile Lys Ile Phe Trp Asn Asn Val Glu
385 390 395 400
Lys Leu Val Glu Tyr Lys Gln Asn Thr Ile Leu Glu Glu Lys Arg Lys
405 410 415
Lys Ala Leu Asp Gln Gln Leu Ser Phe Ile Val Asp Gln Thr Glu Lys
420 425 430
Tyr Ser Gln Leu Leu Ala Glu Gly Met Asn Lys Thr Ala Glu Gln Pro
435 440 445
Pro Ser Ser Ala Pro Ser Arg Ser Val Ser Arg Thr Gln Ser Asp Thr
450 455 460
Glu Phe Asp Pro Asp Leu Gln Ser Asp Glu Asp Asp Glu Glu Thr Ile
465 470 475 480
Ala Arg Glu Glu Ala Leu Gly Asn Glu Gly His Lys Glu Glu Ile Glu
485 490 495
Ala Leu Gln Lys Glu Ser Gln Met Glu Leu Asp Asp Leu Leu Glu Asp
500 505 510
Asp Phe Leu Arg Asp Tyr Leu Leu Asn Arg Asp Thr Ile Arg Phe Ser
515 520 525
Glu Ser Glu Asp Ser Asp Asp Asp Thr Asp Ser Lys Lys Glu Ser Phe
530 535 540
Lys Gly Asp Lys Glu Gln Ser Asp Asp Ser Glu Ser Ser Lys Glu Glu
545 550 555 560
Asp Thr Glu Asp Glu Ser Glu Asp Glu Ser Met Lys Val Thr Glu Ser
565 570 575
Val Val Lys Glu Glu His Asp Glu Leu Lys Ile Leu Val Glu Asp Ser
580 585 590
Gln Lys Glu Gly Glu Ile Lys Thr Glu Gln Asp Thr Lys Asp Asp Leu
595 600 605
Ile Asn Asp Ala Ala Ala Ile Ala Glu Ser Ile Gln Pro Lys Gly Asn
610 615 620
Thr Leu Ser Ser Thr Asn Val Ser Thr Asn Ile Pro Phe Leu Leu Lys
625 630 635 640
Tyr Thr Leu Arg Glu Tyr Gln His Ile Gly Leu Asp Trp Leu Val Thr
645 650 655
Met Phe Asp Arg Lys Leu Asn Gly Ile Leu Ala Asp Glu Met Gly Leu
660 665 670
Gly Lys Thr Ile Gln Thr Ile Ala Leu Leu Ala His Leu Ala Cys Glu
675 680 685
Lys Glu Asn Trp Gly Pro His Leu Ile Val Val Pro Thr Ser Val Met
690 695 700
Leu Asn Trp Glu Met Glu Cys Lys Lys Trp Cys Pro Ala Phe Lys Ile
705 710 715 720
Leu Thr Tyr Tyr Gly Thr Gln Lys Glu Arg Lys Phe Lys Arg Ile Gly
725 730 735
Trp Thr Lys Pro Asn Ala Phe His Ile Cys Ile Thr Ser Tyr Lys Leu
740 745 750
Val Ile Gln Asp His Gln Ser Phe Arg Arg Lys Lys Trp Lys Tyr Leu
755 760 765
Ile Leu Asp Glu Ala Gln Asn Ile Lys Asn Phe Lys Ser Gln Arg Trp
770 775 780
Gln Leu Leu Leu Asn Phe Gln Thr Gln Gln Arg Leu Leu Leu Thr Gly
785 790 795 800
Thr Pro Leu Gln Asn Asn Leu Met Glu Leu Trp Ser Leu Met His Phe
805 810 815
Leu Met Pro Asn Val Phe Gln Ser His Arg Glu Phe Lys Glu Trp Phe
820 825 830
Ser Asn Pro Val Thr Gly Met Ile Glu Gly Asn Ser Glu Tyr Asn Glu
835 840 845
Ser Ile Ile Lys Arg Leu His Lys Val Leu Arg Pro Phe Leu Leu Arg
850 855 860
Arg Leu Lys Ser Glu Val Glu Lys Gln Met Pro Lys Lys Tyr Glu His
865 870 875 880
Val Val Met Cys Arg Leu Ser Lys Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Asp Asp
885 890 895
Tyr Met Ser Arg Ala Lys Thr Arg Glu Thr Leu Thr Thr Gly Asn Leu
900 905 910
Leu Ser Val Ile Asn Val Leu Met Gln Leu Arg Lys Val Cys Asn His
915 920 925
Pro Asn Leu Phe Glu Ile Arg Pro Thr Thr Ser Pro Phe Gln Cys Asp
930 935 940
Asn Ile Arg Leu His Ile Pro Ser Ile Val Tyr Ser Ala Leu Asp Tyr
945 950 955 960
Asp Pro Asp Lys His Val Asn Leu Gln Ala Leu Asn Leu Leu Leu Ile
965 970 975
Met Gln Glu Ile His Phe Gly Ser Tyr Gln Cys Tyr Arg Met Arg Gln
980 985 990
Ser Arg Asn Ser Lys Lys Ile Phe Glu Met Glu Thr Asn Ser Ser Lys
995 1000 1005
Asn Pro Pro Pro Cys Pro Pro Cys Lys Leu Ala Met Arg Val Leu
1010 1015 1020
Thr Asp Lys Pro Ser Ala Thr Asp Glu Lys Asn Glu Lys Lys Asp
1025 1030 1035
Met Gln Ala Leu Ser Gln Pro Pro Pro Leu Gln Val Lys Gly Met
1040 1045 1050
Ser Gln Pro Asn Met Lys Met Lys Val Ser Gly Val Gln Phe Val
1055 1060 1065
Pro Gln Ser Ile Leu Lys Ser Ile Pro Val Val Asn Ile Ser Gln
1070 1075 1080
Gly Ala Thr Gly Gln Ile Gly Ala Pro Val Ser Val Thr Ser Val
1085 1090 1095
Leu Lys Pro Gln Asp Lys Ile Ser Ala Ser Phe Ala Gln Leu Val
1100 1105 1110
Gln Thr Ser Thr Gly Lys His Leu Leu Leu Thr Ser Asn Pro Asn
1115 1120 1125
Ile Thr Thr Ser Pro Val Thr Thr Thr Thr Pro Gly Gly Gln Lys
1130 1135 1140
Leu Thr Phe Leu Ser Lys Gln Pro Val Ser Thr Ile Gly Asn Ala
1145 1150 1155
Gly His Ala Val Thr Lys Ala Tyr Val Lys Phe Gln Leu Thr Ser
1160 1165 1170
Val Thr Thr Ala Ser Thr Phe Thr Thr Val Thr Thr Val Asn Ser
1175 1180 1185
Asn Thr Ile Ser Val Ala Lys Ser Glu Asp Asn Lys Gly Met Arg
1190 1195 1200
Met Ser Val Gly Asn Asp Tyr Ile Gly Lys Leu Tyr Ser Lys Gln
1205 1210 1215
Asn Ser Leu Asp Val Arg Trp Asn Ser Gly Glu Lys His Leu Gly
1220 1225 1230
Leu Thr Asn Glu Asp Asp Pro Lys Gly Glu Arg Lys Lys Arg Leu
1235 1240 1245
Ser Leu Met Ser Arg Ile Asn Lys Ile Arg Cys Ser Ala Leu Pro
1250 1255 1260
Leu Tyr Gly Arg Asp Phe Gln Glu Ala Val Lys Ile Tyr Thr Pro
1265 1270 1275
Asn Gln Leu Asp Val Trp Asn Gly Gly His Ile His Cys Leu Asn
1280 1285 1290
Thr Leu Tyr Asn Lys Asp Ala Arg Asn Glu Thr Thr Asp Cys Leu
1295 1300 1305
Gln Asp Ala Leu Phe Asn Pro Glu Arg Arg Leu Glu Ala Leu Lys
1310 1315 1320
Asp Thr Phe Asp Arg Phe Ile Phe Tyr Val Pro Ser Val Lys Val
1325 1330 1335
Ala Glu Pro Glu Leu Gln Val Trp His Pro Pro Pro Ser Lys Tyr
1340 1345 1350
Trp Gly Gln Lys His Glu Lys Gln Leu Ile Gln Lys Leu Phe Leu
1355 1360 1365
Lys Pro Ala Thr Pro Leu His Ser Ile Ala Ser Ala Met Val Thr
1370 1375 1380
Gln Phe Pro Asp Pro Arg Leu Ile Gln Tyr Asp Cys Gly Lys Leu
1385 1390 1395
Gln Thr Leu Asp Ile Leu Leu Arg Lys Leu Lys Leu Gly Ser His
1400 1405 1410
Arg Val Leu Ile Phe Thr Gln Met Thr Lys Met Leu Asp Val Leu
1415 1420 1425
Glu Ala Phe Leu Asn Tyr His Gly His Ile Tyr Leu Arg Leu Asp
1430 1435 1440
Gly Thr Thr Lys Val Asp Gln Arg Gln Val Leu Met Glu Arg Phe
1445 1450 1455
Asn Gly Asp Lys Arg Ile Phe Ala Phe Ile Leu Ser Thr Arg Ser
1460 1465 1470
Gly Gly Val Gly Val Asn Leu Thr Gly Ala Asp Thr Val Ile Phe
1475 1480 1485
Tyr Asp Ser Asp Trp Asn Pro Thr Met Asp Ala Gln Ala Gln Asp
1490 1495 1500
Arg Cys His Arg Ile Gly Gln Thr Arg Asp Val His Ile Tyr Arg
1505 1510 1515
Leu Val Ser Glu Arg Thr Ile Glu Glu Asn Ile Leu Lys Lys Ala
1520 1525 1530
Asn Gln Lys Arg Leu Leu Gly Asp Leu Ala Ile Glu Gly Gly Asn
1535 1540 1545
Phe Thr Thr Ala Tyr Phe Lys Ser Ser Thr Ile Gln Asp Leu Phe
1550 1555 1560
Asn Ile Asp Gln Asn Glu Glu Ser Ala Ser Ala Arg Met Ser Glu
1565 1570 1575
Val Val Glu Leu Arg Lys Glu Arg Glu Lys Ala Leu Ser Thr Asp
1580 1585 1590
Leu Val His Ser Ala Asp Asp Lys Ala Thr Val Gly Ala Leu Glu
1595 1600 1605
Asn Ala Phe Glu Ala Cys Glu Asp Asp Gln Asp Val Gln Ala Ala
1610 1615 1620
Lys Thr Ala Lys Ala Glu Ala Val Ala Asp Leu Ala Glu Phe Asp
1625 1630 1635
Glu Asn Ile Pro Leu Asp Asp Gln Glu Lys Glu Pro Glu Ile Ser
1640 1645 1650
Lys Ala Glu Gln Glu Ile Asn Asn Ile Ile Glu Lys Leu Thr Pro
1655 1660 1665
Ile Glu Lys Tyr Ala Met Asn Phe Ile Glu Ala Thr Glu Ser Ala
1670 1675 1680
Trp Ser Ala Glu Gln Leu Ala Ala Ala Ala Arg Glu Ile Glu Glu
1685 1690 1695
Gln Lys Lys Glu Trp Glu Gln Asn Arg Leu Ala Ala Met Arg Glu
1700 1705 1710
Glu Glu Glu Arg Arg Ala Arg Glu Leu Glu Glu Glu Ser Asp Ile
1715 1720 1725
Ile Thr Tyr Ser Arg Asp Asp Ala Thr Asn Gln Val Ser Ser Lys
1730 1735 1740
Asn Lys Lys Ile Asn Arg Tyr Asn Lys Ile Leu Ser Asn Lys Arg
1745 1750 1755
Val Arg Leu Lys Lys Asp Gly Asp Glu Asp Val Glu Lys Lys Asp
1760 1765 1770
Asp Val Glu Lys Lys Asp Gly Val Glu Lys Arg Leu Lys Lys Thr
1775 1780 1785
Arg Thr Arg Arg Leu Ser Gln Lys Ser Lys Asp Val Glu Val Glu
1790 1795 1800
Glu Pro Asp Ala Cys Glu Ser Gln Glu Glu Ser Gln Ile Asn Gly
1805 1810 1815
Gly Asp Thr Asp Asn Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Glu
1820 1825 1830
Ser Ser Ser Ser Met Glu Ser Lys Thr Thr Leu Asn His Val Asp
1835 1840 1845
Pro Asn Ser Pro Arg Thr Arg Ser Arg Gly Thr Val Ala Ile Asn
1850 1855 1860
Leu Trp Thr Leu Asp Val Ser Pro Ile Leu Pro Gly Glu Lys Pro
1865 1870 1875
Met Lys Lys Tyr Gly Glu Asn His Arg Lys Asn Ile Lys Arg Val
1880 1885 1890
Arg Ser Val Ser Glu Asn Asp Asn Asp Gly Asp Lys Asp Gly Arg
1895 1900 1905
Lys Arg Leu Arg Arg Lys Tyr Pro Thr Ser Leu Glu Thr Ser Glu
1910 1915 1920
Glu Glu Asn Ser Asn Gln Ser Arg Glu Lys Ser Thr Lys Lys Arg
1925 1930 1935
Ala Lys Val Ala Pro Lys Gly Lys Thr Cys Lys Val Ile Leu Ser
1940 1945 1950
Asn Ile Leu Asn Asp Lys Arg Phe Lys Val Asn Leu Lys Glu Asp
1955 1960 1965
Ile Glu Ile Ser Val Ser Thr Gln Ile Asn Glu Thr Ser Thr Ser
1970 1975 1980
Ser Asn Gln Asn Gln Thr Lys Asp Cys Glu Ser Ser Gln His Glu
1985 1990 1995
Asn Ser Asn Leu Asp Glu Gln Asn Asp Ser Leu Asp Asn Thr Glu
2000 2005 2010
Val Thr Ser Ser Glu Leu Ser Lys Leu Thr Gly Cys Thr Glu Ile
2015 2020 2025
Asp Asn Asn Glu Ser Ser Lys Gln Glu Asn Glu Glu Leu Asp Glu
2030 2035 2040
Ser Ile Leu Glu Asp Lys Tyr Asp Glu Asp Phe Ile Thr Asn Lys
2045 2050 2055
Asn Glu Asp Ile Asp Glu Glu Thr Leu Leu Glu Glu Asp Asn Gln
2060 2065 2070
Ile Glu Gln Val Glu Asn Lys Asn Ile Asp Ser Thr Lys Asp Glu
2075 2080 2085
Lys Gln Gly Asp Asp Ser Asn Val Ser Asp Val Gly His Leu Ser
2090 2095 2100
Lys Asp Asn Asp Asn Glu Glu Lys Met Glu Val Thr Glu Ser Val
2105 2110 2115
Asp Glu Glu Asn Gly Asp Ile Asn Lys Lys Val Asp Glu Asp Glu
2120 2125 2130
Ser Val Lys Asp Lys Arg Glu Arg Arg Lys Gly Asn Glu Glu Asp
2135 2140 2145
Asp Asn Thr Asp Asn Glu Glu Asn Ile Gln Lys Ser Glu Asn Asp
2150 2155 2160
Glu Gly Asp Ile Lys Lys Gln Gly Asn Gln Asp Glu Glu Val Glu
2165 2170 2175
Glu Lys Thr Leu Gly Asn Ser Thr Glu Ser Val Asn Glu Ile Ala
2180 2185 2190
Asn Glu Ile Ser Arg Cys Lys Pro Leu Asn Glu Gln His Asn Glu
2195 2200 2205
Leu Val Asp Glu Val Val Asn Asp Thr Ser Asn Met Asp Glu Tyr
2210 2215 2220
Ile Lys Lys Ser Glu Asn Ser Lys Val Val Glu Lys Thr Ser Glu
2225 2230 2235
Glu Ile Leu Phe Asn Asp Arg Gly Asn Gln Asp Ser Ser Ser Gln
2240 2245 2250
Asp Val Lys Asp Glu Glu Ile Ser Ser His Asn Arg Gly Asp Glu
2255 2260 2265
Lys Val Ser Phe His Asp Arg Ile Asp Lys Glu Val Leu Pro Glu
2270 2275 2280
Cys Arg Lys Glu Glu Glu Lys His Asn Arg Lys Asn Glu Val Leu
2285 2290 2295
Ser Gln Thr Ile Lys Asp Glu Glu Ala Gln Ser His Asn Arg Lys
2300 2305 2310
Asp Glu Ser Gly Thr Phe Pro Asn Val Ala Asp Ile Glu Asn Arg
2315 2320 2325
Leu Asn Asn Lys Val Pro His Val Asp Asn Gly His Thr Glu Thr
2330 2335 2340
Val Arg Met Ser Lys Leu Val Thr Ser Asn Arg Asn Ala Asn Phe
2345 2350 2355
Arg Ser Pro Glu Thr Arg Arg Ser Phe Arg Lys Cys Gly Lys Ile
2360 2365 2370
Ser Asn Asn Gln Thr Leu Asp Gly Trp Val Lys Arg Ser Pro Val
2375 2380 2385
Leu Pro Val Glu Ala Ala Lys Val Asn Asp Asn Ser Lys Tyr Lys
2390 2395 2400
Asn Val Gly Ser Pro Glu Leu
2405 2410
<210> 93
<211> 240
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNF2-螺旋酶简并dsRNA序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (216)..(216)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (222)..(222)
<223> n为a、c、g或t
<400> 93
cgsythctyy tmacsggyac hcctctvcar aayaarctwc chgarytstg ggcbytdcth 60
aayttyytvc tbccstcbat yttyaarwsb tgytcbacdt tygarcartg gttcaaygcv 120
cchttygcha cmacbggmga raargtygar ytdaaygarg argaracvat yytkatyaty 180
mgdcgtytdc ayaargtyyt kcgwccktty ytvytnmgdc gnytvaaaaa rgargtmgar 240
<210> 94
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNF2-螺旋酶简并dsRNA序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> n为a、c、g或t
<400> 94
mghgcygtbt gyythatygg ngaycar 27
<210> 95
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNF2-螺旋酶简并dsRNA序列
<400> 95
tayaarctyc tvytsacmgg machccgytb caraacaayc tmgargaryt rttycatytr 60
<210> 96
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNF2-螺旋酶简并dsRNA序列
<400> 96
garttygaya cbaaycaymg rctkcthath acwggbacyc ckytvcaraa ywskytdaar 60
g 61
<210> 97
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Bromodomain简并dsRNA序列
<400> 97
ytswsygaac crttyatgaa ryt 23
<210> 98
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HAND-SLIDE简并dsRNA序列
<400> 98
gchgtvgatg cytayttymg vgargcwytv mgdgtytchg arccyaargc dccdaargch 60
cchmg 65
<210> 99
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Chromodomain简并dsRNA序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(33)
<223> n为a、c、g或t
<400> 99
mghaartrbg ayatggavga rvvdccbaar ytngar 36
<210> 100
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Chromodomain简并dsRNA序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> n为a、c、g或t
<400> 100
bhggdaarad dggrkkbryb ggmaaymwna chacdrtsta ykmhrtagar gaaaay 56
<210> 101
<211> 322
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 101
aagaaggcat agaacagaaa gagagttggg cgaacgaata tctcagttca tttaaagtgg 60
ctagttatgt tacaaaagaa ggggaagttg aggaagaagt tgacactgag attattaaac 120
aagaagcgga aaataccgat ccggcctact ggatcaagct gcttagacat cattatgagc 180
aacaacagga agatatagct aggacgttag gaaaaggcaa aagagtgagg aaacaggtta 240
attataatga cggaggaatg acaactgaca cacgagaaga tacgacatgg caagaaaatc 300
tctctgatta ccattctgac tt 322
<210> 102
<211> 401
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 102
tcacagtcga aacacccact gaatcagtct accaattcga aggagaagat tatcgtgaga 60
agcagaaaac catcggcttg agcaactgga tagaacctcc caaaagagaa aggaaggcca 120
actatgccgt cgatgcttac ttcagagaag ctttaagggt ttctgagcct aaagcgccta 180
aggctccaag accaccaaaa cagcccatcg tacaagattt ccagtttttc ccgccgagat 240
tattcgaact tttggaccag gagatctact tttacaggaa atctttggga tataaggttc 300
cgaaaaactt agaacttgga cctgacgcgt ccaagcaaca gaaagaagag caaagaaaaa 360
tagatgagtc agaaccgctc accgaagacg aacagcaaga a 401
<210> 103
<211> 271
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 103
ttgctcaatc ctacatacac ttttaactcc ttcttgggtt ttagcccttt ctctacttca 60
attttcaatc ttctaagcaa gaatggtttt aatacagcat gcagcctctc caccatggag 120
ttgcctccca gacattgact ggtgttaaac caggcatcga aatcatcaga tgagttaaaa 180
acgtctggca gtaagaagtt gagaagagac cagagttcat gtaaattgtt ttgtaatgga 240
gtacctgtta gcagtagcct gttggtattc t 271
<210> 104
<211> 372
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 104
gatcaaattc aagcaactag cgaaattgga aaaaaaatca gacgaagaac ttactgaata 60
ttacaaacat ttcgttatga tgtgcaagaa gcagacaggc atgaacatag aagacagcaa 120
ctatgacaat accatcgaac atatctcaga agaaaaggca cgaaggacat tggaaaggct 180
ggagctgttg tcgaggatca gagaagaaat tttaacccat cctaaactcg acgaaagatt 240
gagggtgtgc attacttcgg ctgatatgcc tgaatggtgg attgccggca aacacgacaa 300
ggatctcttg ttgggggtcg ccaaacatgg tttaggaaga accgactact accttctgaa 360
cgatcctgat ct 372
<210> 105
<211> 315
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 105
tttgcttcct tctttcaact cgcgcagggg gcttgggcat taatttagct actgctgata 60
ctgtgataat ttttgattcg gactggaatc ctcaaaacga tcttcaagcg caggcaagag 120
ctcataggat cggtcaaaag aaccaagtca acatttatag gttagttact gctagatctg 180
tagaggaaga aattgtagaa agggcaaaac aaaaaatggt actggatcat cttgtaattc 240
agagaatgga cacgacggga agaaccgttt tggacaaaaa ggggtcttct aataataatc 300
cgtttaacaa agaag 315
<210> 106
<211> 449
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 106
acttatctaa agggatgcta gctgagttcg atgtcatact cacaacgtat acgctggttg 60
gaaatagttc agaagagaga aaaatgttcc gagtgacaag gatgcattat gtaatcttcg 120
atgaagcaca tatgttgaaa aatatgaata ctcttcggta tgaaaattta attaagataa 180
acgctaaaca taggatactg ttaaccggca ctccgttaca aaataattta ttagaactaa 240
tgtcgctgtt gatatttgtg atgccgaata tattcgctga aaaaaggtgg acttgaaaaa 300
cttattccaa aaaaattcta aaaaagcaga agacgactct ctacctacct tcgaaaagga 360
gcaaattgaa caagccaaaa gaattatgaa acctttcctt ttgcgaagac tgaaatgtga 420
cgtccttcgg gatcttccca agaaaacgg 449
<210> 107
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Mi2.T7.F
<400> 107
taatacgact cactataggg aagaaggcat agaacaga 38
<210> 108
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Mi2.T7.R
<400> 108
taatacgact cactataggg tcagaatggt aatcagaga 39
<210> 109
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物ISWI30.T7.F
<400> 109
taatacgact cactataggg tgaatcagtc taccaatt 38
<210> 110
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物ISWI30.T7.R
<400> 110
taatacgact cactataggg ggttctgact catctatt 38
<210> 111
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物ISWI2.T7.F
<400> 111
taatacgact cactataggg ttgctcaatc ctacataca 39
<210> 112
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物ISWI2.T7.R
<400> 112
taatacgact cactataggg gaataccaac aggctact 38
<210> 113
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物KSMT.T7.F
<400> 113
taatacgact cactataggg gatcaaattc aagcaact 38
<210> 114
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物KSMT.T7.R
<400> 114
taatacgact cactataggg ttcttcctaa accatgtt 38
<210> 115
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物CHD1.T7.F
<400> 115
taatacgact cactataggg tttgcttcct tctttcaa 38
<210> 116
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物CHD1.T7.R
<400> 116
taatacgact cactataggg cttctttgtt aaacggatt 39
<210> 117
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物ETL1.T7.F
<400> 117
taatacgact cactataggg acttatctaa agggatgcta 40
<210> 118
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物ETL1.T7.R
<400> 118
taatacgact cactataggg gtagagagtc gtcttctg 38
<210> 119
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Mi2.qPCR.F
<400> 119
agagtgagga aacaggtt 18
<210> 120
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Mi2.qPCR.R
<400> 120
aagtcagaat ggtaatcaga g 21
<210> 121
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Mi2.qPCR.F3
<400> 121
agttgggcga acgaatatct 20
<210> 122
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Mi2.qPCR.R3
<400> 122
cggtattttc cgcttcttgt 20
<210> 123
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物ISWI30.qPCR.F
<400> 123
aggaaatctt tgggatataa gg 22
<210> 124
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物ISWI.qPCR.R
<400> 124
ttcttgctgt tcgtcttc 18
<210> 125
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物ISWI30.qPCR.F
<400> 125
tcacagtcga aacacccact 20
<210> 126
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物ISWI.qPCR.R
<400> 126
tggccttcct ttctcttttg 20
<210> 127
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物ISWI2.qPCR.F
<400> 127
gcagtaagaa gttgagaaga 20
<210> 128
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物ISWI2.qPCR.R
<400> 128
agaataccaa caggctact 19
<210> 129
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物KSMT.qPCR.F
<400> 129
cacgaaggac attggaaa 18
<210> 130
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物KSMT.qPCR.R
<400> 130
gcacaccctc aatctttc 18
<210> 131
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物CHD1.qPCR.F
<400> 131
ttataggtta gttactgcta gatc 24
<210> 132
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物CHD1.qPCR.R
<400> 132
tcgtgtccat tctctgaa 18
<210> 133
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物ETL1.qPCR.F
<400> 133
tgatatttgt gatgccgaat 20
<210> 134
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物ETL1.qPCR.R
<400> 134
agagtcgtct tctgcttt 18
<210> 135
<211> 4768
<212> RNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 135
caaguggcca uggcaugcca cagggucccc cuggacaacc aggucagcaa caccaaggcc 60
gaacugcuga uaauuuacau gccuuacaaa aagcaauaga uacaauggaa gaaaaaggua 120
ugcaagaaga ucagagguau ucacaguuac uggcguuacg ugcuagaucc aguggucaac 180
caucuaacgg aguucuuaca ccgcugcaaa ugaaucaacu uagaaaucaa auuauggcau 240
acaggugccu agcgaggagc caaccaauuc cuccuucaau aauguugggg cugcaaggaa 300
agaggccuga cgguucacca caguuuccua caccuccguc aaguccguuu caaccacaag 360
gaccuggugc acccccuggu ccggaacaac caccagcuaa ugcagaaaac guagcagagc 420
cagcagcacc aguaggaccg caaggugcac aaggaccucc uaaccaacag agagcucaaa 480
cuagccaguu aguccccaau aagcaaacuc guuucacuac caugcccaaa ccaucuggac 540
uagauccacu aguucuucuu caagagaggg aaacuagggu ggcagcuaga aucgcugcua 600
gaauagaaca auguaguaac uuaccuacca aucuuucaga caaaguccgc augcaagcac 660
agauagaauu gagagcuuug cggugccuua auuuccaaag gcaacuaaga agcgaaauuu 720
ugaacuguau uaggagagau auaacgcuug aaucugcugu aaauuuuaaa gcauauaaaa 780
gaacgaagcg acagggucua aaagaaucga gagcuacaga gaaguuagaa aaacaacaga 840
aguuagaagc agaaagaaag agaagacaga agaaccaaga auuuuugaau gcuguauuga 900
acaauggaaa agaauucaag gaauuccaca agcagaauca agcgaaauua gcuaagauua 960
auaaagcugu uauuaauuau cacgcuaaug cugaaagaga gcaaaagaaa gaagcagaaa 1020
ggagagagaa ggaacguaug aucagauuga uggcagaaga ugaagaaggu uauagacagu 1080
ugaucgauca aaagaaagac aaacgucuag cguucuugcu uucccaaaca gaugaauaua 1140
ucaguaacuu aacagagaug gugaaaaugc acaaagucga acaaaguaac aagaagcggg 1200
aagaagaacg acggaagaga aggcaagaca aaaugcagca gccugacagg aaagucacag 1260
uuaucgaaau ggcuacuggg aauaagguua guggagaaaa cgcuccgacu guccaggaac 1320
uuccugaaug guuacagacu cauccugguu gggagaugau agauacagaa gacgaggacg 1380
agaaugacga auauagaaug gacgauuaug aagaaaauaa ucaagucgau gcuacagaaa 1440
ucauucagaa agccaagguu gaggaugacg aauaucacaa gaaugccaca gaggaacaga 1500
cguacuacgg uauugcacau acagugagcg agucaguauc agaacaggcc uccauuauga 1560
uaaacgguga acugaaagag uaccagguca aaggacugga auggauggua uccuuguaca 1620
acaacaaucu uaaugguauc cuagcagacg agauggguuu ggguaagacu auucaaacca 1680
uuggccugau caccuacuug auggagaaaa aaaaguugaa ugggccauuu uugaucauug 1740
ugccguuauc cacuauaucu aauuggaugu uggaguucga aaaaugggcu ccuucuguug 1800
uggucgucuc cuacaaaggc ucaccugguc acaggaaauu gcuucagggu cagaugaagu 1860
cagcaaaauu caauguucuu cuuacuacuu augaauauau cauuaaagau aagggaauuc 1920
uuucaaaagu accguuuaag uauaugaucg uggacgaggg ucacagaaug aagaaccauc 1980
auugcaaguu gacccagacu uugaacacuc acuacgcagc uccuuuccgc cuucucuuaa 2040
ccgguacucc ucuacaaaac aaacuaccag aacugugggc guugcuuaac uucuuacuuc 2100
cgucuauuuu caagaguugu uccacuuucg agcaaugguu caacgccccu uucgcaacca 2160
cgggagaaaa gguugaacuu aacgaagaag aaaccauccu uaucauccga cgucuucaca 2220
aaguccugcg accuuuccuc uuaagacguc ucaaaaagga aguagagucu cagcuucccg 2280
acaaagucga auacauuauc aaaugcgaga uguccgguuu gcaaaaagug uuguaccaac 2340
acaugcagag caagggaguu cugcucaccg acggguccga aaaggguaau aggggccgag 2400
guggagcuaa ggcuaucaug aauaccauca ugcaacugcg gaagcugugu aaucauccuu 2460
ucauguucca aaugaucgaa gaaaaguauu gugaauaugu aggcaugggu gggggacuca 2520
caucagggcc ggauauauac agaucuucug guaaauuuga acuucuggau cggguauugc 2580
caaagcucaa ggcgacugac cacagagucc uacuguucug ucaaaugacg acguugauga 2640
acaucaugga agacuacuuc auuuggagag guuacaaaua ucuucgucug gaugguaugg 2700
uaaaagcgga agaucgggcg gaacuacuca agaaguucaa ugacaaacaa agcgaauauu 2760
uuguguuucu auugucaaca agagcaggag gucuuggacu caacuugcaa agugcugaua 2820
cuguuaucau cuuugauucu gacuggaauc cucaccagga uuuacaagcu caagaucgug 2880
cccaucguau aggccagcaa aaugaaguca ggguccuacg uuuaaugaca guuaauucag 2940
uggaagaaag aaucuuagcu gcagcuaaau acaaacuuau aauggacgag aaaguaaucc 3000
aagcugguau guucgaucag aagucuacag gcucagagag acaucaguuu uugcagagua 3060
uuuuacacca ugacggaagc gacgaagaag aggaaaacga aguuccugau gacgaaacag 3120
ugaaccagau guuggcccga agggaaaacg aauuucagcu uuuccagaag auggaucagg 3180
aaagaaagga agaagaugaa aagaccggaa agucgcgacu uauucaagaa agcgaauugc 3240
ccgaauggcu guugaagcaa gacgaugaaa ucuacucgug gggccuugau gauccagaug 3300
cuguuuuagg aagggguagu aggcaaagaa aagaaguuga uuauguugac agccugacgg 3360
agaaagagug gcuuaaggcu auugacgaag agggagaauu ugaggaagaa caagaaggug 3420
auaaagaagg ucucagaaag aaaagaggga ggaagaggaa gaagcgcgau gaugacgaag 3480
aggcaagcca aauuaagaga agaaaggugc aucuagccga gaucaagaug aagaaaaaga 3540
ugaagaggcu uauggaaguu guugugaacu acagggauag ggaugguaga guauugagcg 3600
aaccguuuau gaaacuucca ucaaagaagg aguuaccuga auauuacgau acgauuaaga 3660
aaccuauuga uauugaaaaa gucguugcca acguagaaga aggaaaauau uucacgaugc 3720
acgauuugga aagagauuuc gacuugcugu gccaaaacgc ccaacaauac aacgaagaag 3780
acuccaugau cuacgaggac agccucguuc uucgacaggu guuuagaagc gcgagggaaa 3840
agaucgacgg uaccucagac cacgacgaca acgccgaugg accggcggug gcucagauca 3900
aacgaccucg ugguagaccu cgaaaacaca agagacccga agagaucgag gccgaagcgg 3960
cggcucagaa agcuauggag gaggcaucga agcugagagc ucaagcugag gcggaagagc 4020
uuagaucuaa gguggaggag gcaucucaga gagccaaaga ggaagcgaaa gcaagggagg 4080
aagccaaagc uagggaagaa gccgaaaucg agaacaugga ggagauuccc acaagcacau 4140
gaucuauaga gcaaccggaa acaaaaaggc aaaaaagaaa uauuauauag aaaagaugua 4200
cauguucaau ggagauacau uuucgcugag uuacaacggg uaaugcuuuu acaacggaua 4260
uuuugacgua ugaauguuga cguucagaug aaguauauuu auaaaauaau ccagaccuuu 4320
acguuuuggu ugauuuguuu ucuguauugu ucaguuuauu gaacaaccau uaauagcagc 4380
uuaccuaaau gauuuagaaa agcaucugag uuauuuagau aaguuuugag auuauauuua 4440
uuaacuuuaa uauuacuauc uuuauuauag cauauuguaa uuauuuuuuc cuguccuucu 4500
uucguugugu gguagauaau ccgagaguca acaguuauaa gcaaaugaaa uucaguuaaa 4560
ccucaaaugu acaaaaugau caaauuaaug uuuacaauuu auuuuuuuac cacgcacauc 4620
cacuauuacu auugucaguc auugagauau cauuuuauau agcuccaugu cugucuuccu 4680
caauuuacag agaagcaauu agacaaguaa ugacauaaua uggugcugaa auaaugugcu 4740
ugauagugau guugaaaaag uaacuauu 4768
<210> 136
<211> 5147
<212> RNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 136
ucacgugccu ccacaaggcc auguuccucc acagggucac gugccuccac aaggccaugu 60
uccuccacag ggacaucuuc cuccacaggg ccauauucca ccacaggguc augguccaac 120
gcagggccac auaccuccuc aggggcaugu uccaccacaa ggacauauac cuccucaagg 180
gcaugcaccc ccacaaggac augcaccacc acaggggcau ccuggcguuc cuccugguca 240
ucagagucau ccucaagggc auccacaaac accagggcau ccuggaccug gacauauacc 300
accuggugga gcaaugcacc cagggcauua uccaaguggc cauggcaugc cacagggucc 360
cccuggacaa ccaggucagc aacaccaagg ccgaacugcu gauaauuuac augccuuaca 420
aaaagcaaua gauacaaugg aagaaaaagg uaugcaagaa gaucagaggu auucacaguu 480
acuggcguua cgugcuagau ccagugguca accaucuaac ggaguucuua caccgcugca 540
aaugaaucaa cuuagaaauc aaauuauggc auacaggugc cuagcgagga gccaaccaau 600
uccuccuuca auaauguugg ggcugcaagg aaagaggccu gacgguucac cacaguuucc 660
uacaccuccg ucaaguccgu uucaaccaca aggaccuggu gcacccccug guccggaaca 720
accaccagcu aaugcagaaa acguagcaga gccagcagca ccaguaggac cgcaaggugc 780
acaaggaccu ccuaaccaac agagagcuca aacuagccag uuagucccca auaagcaaac 840
ucguuucacu accaugccca aaccaucugg acuagaucca cuaguucuuc uucaagagag 900
ggaaacuagg guggcagcua gaaucgcugc uagaauagaa caauguagua acuuaccuac 960
caaucuuuca gacaaagucc gcaugcaagc acagauagaa uugagagcuu ugcggugccu 1020
caauuuccaa aggcaacuaa gaagcgaaau uuugaacugu auuaggagag auauaacgcu 1080
ugaaucugcu guaaauuuua aagcauauaa aagaacgaag cgacaggguc uaaaagaauc 1140
gagagcuaca gagaaguuag aaaaacaaca gaaguuagaa gcagaaagaa agagaagaca 1200
gaagaaccaa gaauuuuuga augcuguauu gaacaaugga aaagaauuca aggaauucca 1260
caagcagaau caagcgaaau uagcuaagau uaauaaagcu guuauuaauu aucacgcuaa 1320
ugcugaaaga gagcaaaaga aagaagcaga aaggagagag aaggaacgua ugaucagauu 1380
gauggcagaa gaugaagaag guuauagaaa gcucauugau caaaagaaag acaaacgucu 1440
agcguucuug cuuucgcaaa cagaugagua uauaacuaac cucacggaga ugguaaagca 1500
acacaaguug gaacaaacca auaaaaagaa agaggaggaa aaacgcaaga agaagcagca 1560
gaaaaugcaa caaccagaua ggaaaguuac aguucuggaa acugcaacag guaaaaaagu 1620
aacaggagag gcugcuccua cacugcgaca aguucaagaa ugguuaaucc aacauccugg 1680
augggagaug gucgauacag augaugagga ugaugaaaac ggggagaaga gggaugauga 1740
cuaugaugaa aaucaagaag uggaugaugc aaaagaaguu auuaaaaaag cuaaaguuga 1800
agaugacgaa uaucacaaaa acacaaaaga agaacagacu uacuacagua uugcucacac 1860
uguucaugaa gugguaacag aacaagcauc cauucugguu aauggaaagc uuaaggaaua 1920
ucaaauuaga ggguuagaau ggaugguguc uuuguacaau aacaaucuga augguauucu 1980
agcagaugag augggucuag guaaaaccau ucaaacgauu ggcuuguuga ccuauuugau 2040
ggaaaaaaag aagauaaaug gaccguuuuu gaucauagug ccacuuucaa ccauuucuaa 2100
uuggauguug gaauuucaaa agugggcccc uacuguaguu gucauuucau acaaaggcuc 2160
uccugugguu agaaaaguga uccagagcca guuaaaagcu gcuaaauuca augugcuucu 2220
cacuaccuac gaguacauua uuaaggacaa ggguguauua gcaaaaaucc cauuuaaaua 2280
uaugaucaua gaugaggguc aucguaugaa aaaccaccac ugcaaauuga cucaaguccu 2340
gaauacgcac uauuuggcgc ccuacagacu ccugcuuacu gguacucccc uacaaaauaa 2400
auuaccagaa uuaugggccu uguugaauuu cuuguugccu ucgauuuuca agaguugcuc 2460
cacuuuugaa caaugguuca augcgccauu cgcaacaaca ggagaaaagg uugaguuaaa 2520
cgaagaagaa acuauccuua ucauccgucg ucuucacaaa guacucaggc cguuucuccu 2580
gagacgucuc aagaaagaag ucgaaucuca gcuuccagac aaaguggaau auaucauaaa 2640
gugugacaug ucgggccuac aaaagguucu cuaugcacac augcagagca aggguguguu 2700
acuuaccgau gguuccgaga agggcaguaa aggaagggga ucuaaggcac ugaugaacac 2760
cauuaugcag cugaggaaac ugugcaauca uccguuuaug uuccaaaaua ucgaagagaa 2820
auauugugau cauguuggua uugcuggugg agugguuucu ggacccgaca cuuauagggu 2880
aucugguaag uuugagcucu uggacagaau auugcccaaa augaaagcaa cuaaccauag 2940
gauucuucuu uucugucaaa ugacucaauu aaugaccauc auggaagauu aucuaaauug 3000
gagaggauuc aaauaucuuc gucuugaugg uacaaucaaa ucagaagauc gcggggaccu 3060
auuaucgaaa uuuaaugaua aaaauaguga auauuuuuug uuuuugcuau cuacacgggc 3120
uggaggucug ggacuuaauu ugcagacagc ugauacugug auuaucuucg auuccgauug 3180
gaauccucau caggauuuac aagcucagga ucgagcucau cguauuggac agcaaaauga 3240
gguccgaguu uugcguuuga ugacuguuaa cucuguugag gaacgaauuu uagcugcagc 3300
uaaauacaag cuuacuaugg acgaaaaggu cauucaagcu gguauguucg aucagaaguc 3360
uacgggaucu gaaaggcagc aguuucuuca gaguauuuua cacaaugaug guagugauga 3420
agaagaggaa aaugaagugc cugaugacga aaccgucaac caaaugauag cuaggacaga 3480
ggaugaguuu cagcucuucc aaaaaaugga uacggaaaga aaagaggaga augaaaaacu 3540
uggucagcau aaaaagucgc gauugguuca agaaugugaa cuuccggauu ggcugacaaa 3600
gccagaugaa gaugauggcu ggggugauga uuauacugaa gcgcuauugg gcagaggaac 3660
caggcagcga aaggaaguug auuaugcuga uaguuuaaca gaaaaggaau gguuaaaggc 3720
uaucgaugaa gacggagacu acgaugaaga agaagaggaa gaaaaaguac aaaagaagag 3780
ggguaggaag agaaggaagc gugacgauuc ugacgaugac accagcaguu cuacgagaag 3840
gcguaagcua ccccaaaguc agguagaagc uaggcuaaag agaaaaauga aaaaguugau 3900
gaacauaguu acaaauuaua aagacaggga uggacgacag cuuagcgauc aauucauuaa 3960
auugccucca aggaaagagu auccagacua uuauacuauu auuaaaaagc cuauagauau 4020
uagcaagaua uuaaauuaua uagaugaugg aaaguacucu gauuucuccg aucuggaacg 4080
agacuucaug cuucucugcc agaaugcuca aaucuauaac gaagaagcgu cguugauuca 4140
cgaagacagc aucguacugc agucggucuu uucgagugcc aagcagaaga ucgaagccuc 4200
cccggauucg gacgacgaaa aagaugacaa uaauuccgau guagaaacuc cuaagaauaa 4260
aaauaaaccu gguaaaggca agagacgacc cggcaggccu aggaggucgg cgaaaaaaua 4320
cauuucggac gacgaugacg acgacugaag aguuuaggug uaagagaaau gagaaugaaa 4380
uucuuauugc aaaaguugua cauaugaagg uguuguuauu cuuuaccaaa gcugguaaau 4440
guuugauuua aagggaaacu ggaacuuuuc ucuugguuuu agauaguacu auagauaggu 4500
uuugauaggg aauaacaggu ucaagauucg ccccaguuga aauuugcuua aaugaucaaa 4560
gaguacuuaa guauaaugaa ucacgauugu uuaaauuuua acuugcacuu agugacaaaa 4620
aaauaacagc uuauaaauaa auuuacguag caagaaugau ccuauugauu aagaaugaau 4680
gagccucucc aaagauaguc caaaaagugu uucaggguga aaaggaguug ugaaaaauac 4740
aagauggucu gcuaagcaac cuucuuugua acaaaaauca uguuuuucca gaaauuuuuu 4800
uuuauuuuau uaauauaguc cucuuuuauc ucaauacaac gcgauuccag cgauuuucca 4860
aacuucuuua ugccgucgga auaaggcccc accuagauug gauccguauu ucuccuauca 4920
gauccgaucc gacgucggau ugaaagcaaa cucaagguau uaagguaugg cugcacuuac 4980
auuggauccc cauccuccga uccgauauag ggcgauugau aggagaagcu acagcagaga 5040
agcaguucga cgucggccga uaucggaucg gucuucucac uacaguguag gcacugcgcu 5100
uuaauaccuu cccuaauaac acuaaacauu ccauguaugu uccuaga 5147
<210> 137
<211> 5134
<212> RNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 137
acaguuaaau auugaaaaug gccugguguu uugauaaaac ggaagaggcg aauuucuagu 60
agcauuuuaa gguuucauuu gcauuuaaaa caaauucaug uauuauaaaa uguaggauac 120
guuuccucgu auccaucuac uuaauuuagg auaacaauaa agggugugag acaguuaaau 180
auugaaaaug gccagugcuu cauuauuacc caaaacuuuc acuucuauug guggcaaagc 240
ccuaccuacc aacucacaac aaaacauuca gucaaaauuu aaagagauua caguuccacc 300
aggaaauacu ccucaagaug uuaaagaagg ccccagucac caaucaaauc caaaccauuu 360
ggcuucucuu caaaaggcca uugaaacuau ggaagagaag ggcuuacaag cugauccuag 420
auauucacag uuacuugcau ugcgagcuag cauuccuggg gcagaagaaa augguucucc 480
cuucucaaac aaccaaauca agcaauuaag aaaccaaaua auggcuuaca gguguuuggc 540
aagaaaucaa ccuguuccaa acaauuuagu auuagguuug cauggaaaaa cuccugaaaa 600
aguuccacau auuguaccuc caccgcaacc ucaagaagua ccuaaugggg gcgauccagg 660
accuucaaca aguucugcug cugcuguagc uccuagaaca ccacaaaagc ugccagcaaa 720
accaauugag gcucagcuug ucaacagaga accaagaguc acuacuuuau cuaaaccauc 780
uuccauagac ccuguuguuc uauuacaaga acgagaaaac aggguagcag cucguauagc 840
agcgaggauu gaacaaguca guaaucugcc gacugauaug ucugaggcau uacguauucg 900
ggcacaaaua gaacucagag cuuugagaug ucuaaaccuc cagagacaac uucguaguga 960
gguuuugagc uguauucgac gggacacaac auuagaaaca gcaguaaaug uaaaagcguu 1020
uaaacggacc aaacgucaag gucuucgaga agcuagagca acagaaaaac uugagaaaca 1080
acaaaagcug gaagcagaga gaaagaaacg ccagaagaac caagaguucu uaaacaaugu 1140
gauggcacac gcuaaagauu ucaaagaauu ccacaggcag aaccaagcaa aacuuucuaa 1200
acuuaauaaa gcuauucuua cuuaucacgc uaaugcggag agagaacaaa agaaggaaca 1260
agagagaaga gaaaaggaac guaugaagaa auugauggca gaagaugaag aagguuauag 1320
acaguugauc gaucaaaaga aagacaaacg ucuagcguuc uugcuuucgc aaacagauga 1380
guauauaacu aaccucacgg agaugguaaa gcaacacaag uuggaacaaa ccaauaaaaa 1440
gaaagaggag gaaaaacgca agaagaagca gcagaaaaug caacaaccag auaggaaagu 1500
uacaguucug gaaacugcaa cagguaaaaa aguaacagga gaggcugcuc cuacacugcg 1560
acaaguucag gaaugguuaa uccaacaucc uggaugggag auggucgaua cagaugauga 1620
ggaugaugaa aacggggaga agagggauga ugacuaugau gaaaaucaag aaguggauga 1680
ugcaaaagaa guuauuaaaa aagcuaaagu ugaagaugac gaauaucaca aaaacacaaa 1740
agaagaacag acuuacuaca guauugcuca cacuguucau gaagugguaa cagaacaagc 1800
auccauucug guuaauggaa agcuuaagga auaucaaauu agaggguuag aauggauggu 1860
gucuuuguac aauaacaauc ugaaugguau ucuagcagau gagauggguc uagguaaaac 1920
cauucaaacg auuggcuugu ugaccuauuu gauggaaaaa aagaagauaa auggaccguu 1980
uuugaucaua gugccacuuu caaccauuuc uaauuggaug uuggaauuuc aaaagugggc 2040
cccuacugua guugucauuu cauacaaagg cucuccugug guuagaaaag ugauccagag 2100
ccaguuaaaa gcugcuaaau ucaaugugcu ucucacuacc uacgaguaca uuauuaagga 2160
caagggugua uuagcaaaaa ucccauuuaa auauaugauc auagaugagg gucaucguau 2220
gaaaaaccac cacugcaaau ugacucaagu ccugaauacg cacuauuugg cgcccuacag 2280
acuccugcuu acugguacuc cccuacaaaa uaaauuacca gaauuauggg ccuuguugaa 2340
uuucuuguug ccuucgauuu ucaagaguug cuccacuuuu gaacaauggu ucaaugcgcc 2400
auucgcaaca acaggagaaa agguugaguu aaacgaagaa gaaacuaucc uuaucauccg 2460
ucgucuucac aaaguacuca ggccguuucu ccugagacgu cucaagaaag aagucgaauc 2520
ucagcuucca gacaaagugg aauauaucau aaagugugac augucgggcc uacaaaaggu 2580
ucucuaugca cacaugcaga gcaagggugu guuacuuacc gaugguuccg agaagggcag 2640
uaaaggaagg ggaucuaagg cacugaugaa caccauuaug cagcugagga aacugugcaa 2700
ucauccguuu auguuccaaa auaucgaaga gaaauauugu gaucauguug guauugcugg 2760
uggagugguu ucuggacccg acacuuauag gguaucuggu aaguuugagc ucuuggacag 2820
aauauugccc aaaaugaaag caacuaacca uaggauucuu cuuuucuguc aaaugacuca 2880
auuaaugacc aucauggaag auuaucuaaa uuggagagga uucaaauauc uucgucuuga 2940
ugguacaauc aaaucagaag aucgcgggga ccuauuaucg aaauuuaaug auaaaaauag 3000
ugaauauuuu uuguuuuugc uaucuacacg ggcuggaggu cugggacuua auuugcagac 3060
agcugauacu gugauuaucu ucgauuccga uuggaauccu caucaggauu uacaagcuca 3120
ggaucgagcu caucguauug gacagcaaaa ugagguccga guuuugcguu ugaugacugu 3180
uaacucuguu gaggaacgaa uuuuagcugc agcuaaauac aagcuuacua uggacgaaaa 3240
ggucauucaa gcugguaugu ucgaucagaa gucuacaggc ucagagagac aucaguuuuu 3300
gcagaguauu uuacaccaug acggaagcga cgaagaagag gaaaacgaag uuccugauga 3360
cgaaacagug aaccagaugu uggcccgaag ggaaaacgaa uuucagcuuu uccagaagau 3420
ggaucaggaa agaaaggaag aagaugaaaa gaccggaaag ucgcgacuua uucaagaaag 3480
cgaauugccc gaauggcugu ugaagcaaga cgaugaaauc uacucguggg gccuugauga 3540
uccagaugcu guuuuaggaa gggguaguag gcaaagaaaa gaaguugauu auguugacag 3600
ccugacggag aaagaguggc uuaaggcuau ugacgaagag ggagaauuug aggaagaaca 3660
agaaggugau aaagaagguc ucagaaagaa aagagggagg aagaggaaga agcgcgauga 3720
ugacgaagag gcaagccaaa uuaagagaag aaaggugcau cuagccgaga ucaagaugaa 3780
gaaaaagaug aagaggcuua uggaaguugu ugugaacuac agggacaggg augguagagu 3840
auugagcgaa ccguuuauga aacuuccauc aaagaaggag uuaccugagu auuacgauac 3900
gauuaagaaa ccuauugaua uugaaaaagu cguugccaac guagaagaag gaaaauauuu 3960
cacgaugcac gauuuggaaa gagauuucga cuugcugugc caaaacgccc aacaauacaa 4020
cgaagaagac uccaugaucu acgaggacag ccucguucuu cgacaggugu uuagaagcgc 4080
gagggaaaag aucgacggua ccucagacca cgacgacaac gccgauggac cggcgguggc 4140
ucagaucaaa cgaccucgug guagaccucg aaaacacaag agacccgaag agaucgaggc 4200
cgaagcggcg gcucagaaag cuauggagga ggcaucgaag cugagagcuc aagcugaggc 4260
ggaagagcuu agaucuaagg uggaggaggc aucucagaga gccaaagagg aagcgaaagc 4320
aagggaggaa gccaaagcua gggaagaagc cgaaaucgag aacauggagg agauucccac 4380
aagcacauga ucuauagagc aaccggaaac aaaaaggcaa aaaagaaaua uuauauagaa 4440
aagauguaca uguucaaugg agauacauuu ucgccgaguu acaacgggua augcuuuuac 4500
aacggauauu uugacguaug aauguugacg uucagaugaa guauauuuau aaaauaaucc 4560
agaccuuuac guuuugguug auuuguuuuc uguauuguuc aguuuauuga acaaccauua 4620
auagcagcuu accuaaauga uuuagaaaag caucugaguu auuuagauaa guuuugagau 4680
uauauuuauu aacuuuaaua uuacuaucuu uauuauagca uauuguaauu auuuuuuccu 4740
guccuucuuu cguugugugg uagauaaucc gagagucaac aguuauaagc aaaugaaauu 4800
caguuaaacc ucaaauguac aaaaugauca aauuaauguu uacaauuuau uuuuuuacca 4860
cgcacauuca cuauuacuau ugucagucau ugagauauca uuuuauauag cuccaugucu 4920
gucuuccuca auuuacagag aagcaauuag acaaguaaug acauaauaug gugcugaaau 4980
aaugugcuug auagugaugu ucacaaagua acuauucguu acaaaguacu cguuacuuac 5040
aaauaccgaa acuaacgauu acuauacaga gaggcaaauc guuacuuuga uuacacugau 5100
uacuucguau caaucguauc agagcgagua acga 5134
<210> 138
<211> 538
<212> RNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 138
aguguauuag caaaaauccc auuuaaauau augaucauag augaggguca ucguaugaaa 60
aaccaccacu gcaaauugac ucaaguccug aauacgcacu auuuggcgcc cuacagacuc 120
cugcuuacug guacuccccu acaaaauaaa uuaccagaau uaugggccuu guugaauuuc 180
uuguugccuu cgauuuucaa gaguugcucc acuuuugaac aaugguucaa ugcgccauuc 240
gcaacaacag gagaaaaggu ugaguuaaac gaagaagaaa cuauccuuau cauccgucgu 300
cuucacaaag uacucaggcc guuucuccug agacgucuca agaaagaagu cgaaucucag 360
cuuccagaca aaguggaaua uaucauaaag ugugacaugu cgggccuaca aaagguucuc 420
uaugcacaca ugcagagcaa ggguguguua cuuaccgaug guuccgagaa gggcaguaaa 480
ggaaggggau cuaaggacaa cuagaugaac accauuaugc agcugaggaa acugugcu 538
<210> 139
<211> 352
<212> RNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 139
uugaacugua uuaggagaga uauaacgcuu gaaucugcug uaaauuuuaa agcauauaaa 60
agaacgaagc gacagggucu aaaagaaucg agagcuacag agaaguuaga aaaacaacag 120
aaguuagaag cagaaagaaa gagaagacag aagaaccaag aauuuuugaa ugcuguauug 180
aacaauggaa aagaauucaa ggaauuccac aagcagaauc aagcgaaauu agcuaagauu 240
aauaaagcug uuauuaauua ucacgcuaau gcugaaagag agcaaaagaa agaagcagaa 300
aggagagaga aggaacguau gaucagauug auggcagaag augaagaagg uu 352
<210> 140
<211> 459
<212> RNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 140
augaggguca ucguaugaaa aaccaccacu gcaaauugac ucaaguccug aauacgcacu 60
auuuggcgcc cuacagacuc cugcuuacug guacuccccu acaaaauaaa uuaccagaau 120
uaugggccuu guugaauuuc uuguugccuu cgauuuucaa gaguugcucc acuuuugaac 180
aaugguucaa ugcgccauuc gcaacaacag gagaaaaggu ugaguuaaac gaagaagaaa 240
cuauccuuau cauccgucgu cuucacaaag uacucaggcc guuucuccug agacgucuca 300
agaaagaagu cgaaucucag cuuccagaca aaguggaaua uaucauaaag ugugacaugu 360
cgggccuaca aaagguucuc uaugcacaca ugcagagcaa ggguguguua cuuaccgaug 420
guuccgagaa gggcaguaaa ggaaggggau cuaaggaca 459
<210> 141
<211> 812
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Brahmav1 hpRNA
<400> 141
gcgcccuaca gacuccugcu uacugguacu ccccuacaaa auaaauuacc agaauuaugg 60
gccuuguuga auuucuuguu gccuucgauu uucaagaguu gcuccacuuu ugaacaaugg 120
uucaaugcgc cauucgcaac aacaggagaa aagguugagu uaaacgaaga agaaacuauc 180
cuuaucaucc gucgucuuca caaaguacuc aggccguuuc uccugagacg ucucaagaaa 240
gaagucgaau cucagcuucc agacaaagug gaauauauca uaaaguguga caugugacua 300
guaccgguug ggaaagguau guuucugcuu cuaccuuuga uauauauaua auaauuauca 360
cuaauuagua guaauauagu auuucaagua uuuuuuucaa aauaaaagaa uguaguauau 420
agcuauugcu uuucuguagu uuauaagugu guauauuuua auuuauaacu uuucuaauau 480
augaccaaaa cauggugaug ugcagguuga uccgcggaca ugucacacuu uaugauauau 540
uccacuuugu cuggaagcug agauucgacu ucuuucuuga gacgucucag gagaaacggc 600
cugaguacuu ugugaagacg acggaugaua aggauaguuu cuucuucguu uaacucaacc 660
uuuucuccug uuguugcgaa uggcgcauug aaccauuguu caaaagugga gcaacucuug 720
aaaaucgaag gcaacaagaa auucaacaag gcccauaauu cugguaauuu auuuuguagg 780
ggaguaccag uaagcaggag ucuguagggc gc 812
<210> 142
<211> 822
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Brahmav2 hpRNA
<400> 142
cauauaaaag aacgaagcga cagggucuaa aagaaucgag agcuacagag aaguuagaaa 60
aacaacagaa guuagaagca gaaagaaaga gaagacagaa gaaccaagaa uuuuugaaug 120
cuguauugaa caauggaaaa gaauucaagg aauuccacaa gcagaaucaa gcgaaauuag 180
cuaagauuaa uaaagcuguu auuaauuauc acgcuaaugc ugaaagagag caaaagaaag 240
aagcagaaag gagagagaag gaacguauga ucagauugau ggcagaagau gaagaagguu 300
gacuaguacc gguugggaaa gguauguuuc ugcuucuacc uuugauauau auauaauaau 360
uaucacuaau uaguaguaau auaguauuuc aaguauuuuu uucaaaauaa aagaauguag 420
uauauagcua uugcuuuucu guaguuuaua aguguguaua uuuuaauuua uaacuuuucu 480
aauauaugac caaaacaugg ugaugugcag guugauccgc ggaaccuucu ucaucuucug 540
ccaucaaucu gaucauacgu uccuucucuc uccuuucugc uucuuucuuu ugcucucuuu 600
cagcauuagc gugauaauua auaacagcuu uauuaaucuu agcuaauuuc gcuugauucu 660
gcuuguggaa uuccuugaau ucuuuuccau uguucaauac agcauucaaa aauucuuggu 720
ucuucugucu ucucuuucuu ucugcuucua acuucuguug uuuuucuaac uucucuguag 780
cucucgauuc uuuuagaccc ugucgcuucg uucuuuuaua ug 822
<210> 143
<211> 5146
<212> RNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 143
uugagaacga gaacacgaac gaguguaucg ucguguuucu uuuucuuugg uuauugugua 60
aauuaauuac aaacguguua aaauuuacuu aaaguuagug auuuguguau uuauaguuug 120
uaagugaugg caucagauga agaaguggag gauucuuucg ccggggagga agaugccccc 180
gacgauacgg cugaacaaau agauaacgau ccugauucug aagauggugu uccuaaagga 240
ggggaagaag augaugauua ugaaccagaa gauuccagaa agaaaaagaa gggaaagaaa 300
agaaaagcca ggggagaaga aaagaaaggc aagaaaaaga agaaaaagcg aaagaaugau 360
aguggggaug aaagugacuu uggagaagau gauaauggag guggggacuc agauuaugca 420
agcaguagua aaagaggaag gaaaaagggu ucuacuaaac acucuucugc aucaucaaca 480
ccaacaccag cuagugacuc uggcacagga ggcaugccca ccaucgagca aguuuguuca 540
acauuugguu uaacugaugu cgagcuugac uauucagaug cugauaugca aaacuugacc 600
accuauaagu uguuccaaca gcaugugaga ccgcuccuug cuaaggaaaa uccaaagguu 660
ccuaugucaa aguugaugau guugguugcu gcaaaauggc gcgaauuuuc uaauucaaac 720
cccaaucugc aaagcgaaaa ugaaccgucu gcugcaacuu caaccacauc ugaagaaagu 780
uauccaaaaa cuaaucguuc gagagcaucc aaggaagcag cacaaaagau aguagaggcu 840
gacucugagc cauaugauga cgaauuugau gacgaagacg aggaggaaaa agaagagaaa 900
ggaaagaaaa aaaagaguaa uagaggaagg ccuaguaaaa agaaggcuac uaaaguacca 960
acuuuaaaga uuaaacuagg aaagaggaag cguggaaguu cggaugaaga gggcgaucuu 1020
aguggaggug gcucugaucg cgauucugau gcugaguuug agcagaugcu acaagaagcu 1080
gaagaaccaa aauccaacaa aucuaccacu ggugaagaau ccgcacagcc aucagaauca 1140
ccugcagaug aaaauccacc accaaaacgc aaagcgaaaa ccaaaauugg uugcaaaaca 1200
aagagaaaga agaaaacaaa gagugguaaa ccugaagaug aaaauuauga acaucaagau 1260
uacugcgagg uaugucaaca agguggagaa auuauccucu gugauacuug cccuagagcu 1320
uaccacuugg uuugccugga accugaauua gaagaagccc cugaaggaaa guggaguugc 1380
ccucauugug agaaugaagg uccggcugaa caagaugaug acgagcauca agaauucugc 1440
aggguuugca aagauggugg cgaacuuuug uguugcgauu ccuguacauc ugcguaccac 1500
acgcacuguc uuaacccgcc acuucccgaa auaccugacg gcgauuggaa auguccuagg 1560
ugcgguuguc cgccucuugu gggcaaaguu gcgaaaauuc uuacguggaa auggguugau 1620
gauccuccua aaaagaagga caauggugaa gaggagccuc cuacacgaca uagagaguac 1680
uuuguuaagu ggcaugagcu aucauauugg cauuguaguu ggauaaccga gcuucaauug 1740
gauguauauc auccucucau guuucgaagu uauucaagaa agugggacau ggaagagccu 1800
ccuaaacuug aagaaccuau ggaugaagcu gacacuagau guagcagauu ccugaaaaug 1860
gguggaaaca acaacgacga ugaacucgaa gagaaguauu acagauacgg aauaaaacca 1920
gaauggcuaa uaguccaucg ugucaucaac caccguacga ugcgagacgg aagaacuuug 1980
uacuuaguaa aauggcgaga gcuaacuuac gaucaagcua ccugggaaga agauucugac 2040
gauaucccag cccuaaaguc ugccaucgaa uauuacacag auucaagagc ugcuaauuua 2100
uccggagcug gagguaagcu aaagaagaaa guuggaagga agccgaaagc uaaagaacuu 2160
aucgaugacg acgauagaaa cgguccucgc agauauacuc caccgccaga uaagcccugc 2220
agugaucuga agaagaaacu agacaaacaa cccucauauu uggacgagag uggauugcuu 2280
cacgaguacc aacuagaggg ucuuaacugg cuucguuauu cgugggccaa cgguauagac 2340
acuaucuuag ccgacgagau gggucucggu aaaaccauuc aaaccauugu cuucuuguau 2400
ucgcucuaca aggaagguca cugcaaaggu ccguuucuaa uuaguguccc acuuucaacg 2460
aucaucaauu gggagagaga auucgaaaau ugggcaccug auuuuuauug uauuacauau 2520
guuggugaca aggacugcag agccgugauu cgugagaacg aacucaguuu cgaagauggu 2580
gcugucagag gaggucgagc uucgagaauc agagccgguu ccaucaaguu uaacguuuug 2640
uugaccagcu acgaauuaau uucgaucgau ucggcauguc ucgguucuau cgaaugggcc 2700
guuuugguag ucgaugaagc ucauagauug aaaagcaauc aaucaaaauu cuucaaaauc 2760
uuaaacgcuu auaauauagc uuauaaacuc cucuugaccg gaacaccgcu ucaaaacaac 2820
cucgaagaau uguuccauuu guugaacuuc cucaacgguc agaaauucaa cgaucuccaa 2880
aacuuccaag ccgaauucgc cgacauuucg aaagaagacc aagugaagaa auugcacgag 2940
auguugggac cucauaugcu gcgucgucuc aaggccgaug ugcugaagag caugccuucg 3000
aaaucugaau uuaucgucag agucgaauua ucgcccaugc agaagaaaua uuauaaauau 3060
auuuugacga ggaacuuuga agcuuuaaau ccuaaaggag gcggacaguc gguaucuuua 3120
cuuaacauua ugauggaucu caagaaaugu ugcaaccauc ccuaucuuuu cccagccgcc 3180
ucggaagaag cuccgcuggg uccccauggu aauugggaug uaggucauuu gauuaaggcu 3240
ucaggaaagu uggugcuauu agcgaagaug uugaagaucc uuagagaaca gggucacaga 3300
guguugaucu ucucgcaaau gacgaagaug uuggauauaa uggaagauuu ucuugaagga 3360
gaaggguaua aauacgaacg uauugauggg gcuauuacug guaaucuccg ucaagaagcu 3420
aucgauaggu uuaacgcucc aggugcuccc caguuuguuu uccuuuuguc cacuaaagcu 3480
ggugguuugg gcaucaaucu ugcuacagca gauacuguaa ucaucuauga uuccgauugg 3540
aauccccaca augauauuca ggcauucucc agagcucauc guaucgguca agccaacaag 3600
gugaugaucu accguuuugu aacacguaac aguguggaag aacguguuac gcaaguagcc 3660
aagcggaaaa ugauguuaac ucacuuggua gucagaccug gaaugggcgg aaaaggugcc 3720
aacuuuacua agcaagaguu ggacgauauu cucagauucg guacugaaga auuguuuaaa 3780
gaaagugaag gcaaagaaga cgaagccauu cacuacgacg acaaagcugu gggagaauug 3840
cuggaucguu cuaaagaagg cauagaacag aaagagaguu gggcgaacga auaucucagu 3900
ucauuuaaag uggcuaguua uguuacaaaa gaaggggaag uugaggaaga aguugacacu 3960
gagauuauua aacaagaagc ggaaaauacc gauccggccu acuggaucaa gcugcuuaga 4020
caucauuaug agcaacaaca ggaagauaua gcuaggacgu uaggaaaagg caaaagagug 4080
aggaaacagg uuaauuauaa ugacggagga augacaacug acacacgaga agauacgaca 4140
uggcaagaaa aucucucuga uuaccauucu gacuuuucug cgggaucgga ugaggauaag 4200
gaagacgaua aggaagacga ugauucgaug agaagaacga cgccgauuua agcagaagga 4260
gucgaagaaa gauggaaagg aaagacgaga aggaucgucc uuuaccaccg uuacuagcca 4320
gaguuggcgg caauauugaa guacucgguu uuaaugccag gcagcguaaa gcguuccuua 4380
augcuauuau gcgcuacgga augccaccac aagacgcuuu caauucacag uggcugguga 4440
gagaucuucg aggaaaaucu gagaagauau ucaaggcuua cgugucucuc uuuaugaggc 4500
aucuuugcga accuggugca gauaaugcug auacguuugc ggacggugug ccgagggaag 4560
gacugaguag gcaacauguu uugacaagga uuggugugau gucacuuaua agaaagaagg 4620
uucaggaguu cgaacacauc aacggcgagu auagcaugcc ggaaguaauc aaaaagagca 4680
uuauggauca aaauaaaauc aaugccgccg gcaccgccac cacaagcgaa gcagaaacgc 4740
cuaaaagugc uacuaccagu acuagugcua cgccagcuac aagugcugcu cccagucccg 4800
cucccacaca aggagaagau aaagauaagg auaaagauuc cguucagagu gacgaaaaua 4860
aagauaaaga agugguuaau aaaacggaaa ccgaagauga agagaagaaa acgggagaau 4920
cuucaacaga aaagccgaaa acugaaccgg aagaagugaa agaagcuucu ccgaaaaccg 4980
aaauuccuga agcuaguucc gaagcugaua aaucugagau caaauccgaa gucgauaccu 5040
cgucuguaac cagcgaggaa aagaaagaag agaaagagga agaggccaaa aaagaagaac 5100
ccgaagagac caaaauggaa auacaggagg aggaacuugu uaaaga 5146
<210> 144
<211> 3076
<212> RNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 144
agcggcggca gcacgcagca ggcaacacug gcaacagcag uuuuuuuaac gcgcgguggc 60
ugagaauuga gaaugcuguu guaaauuucu uuguuaauca aauaaaacuu uguuucaaca 120
uauugcaaaa uucaucuaaa cguucaacau gucacaaacu gaaggcucga cagaggcgag 180
cguaagugcc ucagaaccaa uggaagaagc agagaacucg gaauuggcuc aaaaugaaga 240
aucuucuuca gauacuaccu cuaaggguga agaguucgag gucaaagugg cuucugacag 300
aggaaaaaga uuugacuacu uguugaaaca gacugaaauc uuuucacauu uuaugaacca 360
aacaaaaucu cccaguaaac caaaaacugg gaggccuaaa aaagagaaga gugauacauc 420
ugauuuaaga caucguaaaa cugaacaaga agaagaugaa gaacuuuuag cagaaaccaa 480
ccuuaaaaca aagacuacaa cucguuuuga ugccucacca cccuacauca aacaugggga 540
aaugagagau uaucaagucc gugguuugaa cuggaugauu ucuuuguaug aacauggcau 600
caaugguauu uuagcagaug agauggguuu ggguaaaacu uuacaaacca uaucucugcu 660
uggauauaug aagcacuaua aaaguacacc ugguccucau auugucauug uuccuaaauc 720
uaccuuauca aacuggauga augaguucga gaaguggugu ccaaccuuga gagccguuug 780
ucucauuggu gaucaagagg cuaggagcuc auuuaucaga gauacgauga ugccugguga 840
augggauguu uguguaaccu cguacgaaau guguauuaaa gaaaaaucug uauuuaaaaa 900
guucaacugg agauauaugg ucauugacga agcucaucgu auaaaaaaug aaaaaucuaa 960
gcuuuccgaa auucucaggg aguucaagac uacuaacagg cuacugcuaa cagguacucc 1020
auuacaaaac aauuuacacg aacucugggc ucuucucaac uucuuacugc cagauguuuu 1080
caacucaucg gaugauuucg augccugguu caacaccagu caaugucugg gagacaacgc 1140
cuuggucgag agauugcaug cuguauuaaa accauucuug cuuagaagau ugaaagcuga 1200
aguggagaaa cggcuaaaac ccaagaagga guuaaaagug uauguaggau ugagcaagau 1260
gcaacgagaa ugguauacca aagugcugau gaaggauauu gauauaguga auggugcagg 1320
aaagguagaa aaaaugcgac uacagaauau ucucaugcag uuaagaaaau gcacaaauca 1380
ccccuaccuu uuugauggcg cugagcccgg accaccuuac acaaccgaug aacaucucgu 1440
guacaauugc gguaaaaugg uguugcugga uaaacugcuu cccaaauuga aggaacagga 1500
aucucgugua cuuaucuucu cucagaugac ccguauguug gauauacuug aagauuauug 1560
ucauuggcga caguaccaau auugucguuu ggauggucaa accccacacg aagacagaca 1620
gagacaaauc aacgaguaua acgaagacaa uagccaaaag uuuaucuuua uguugucaac 1680
uagagccggu ggauugggua ucaauuuggc cacagcugau guaguuauua uauaugauuc 1740
ggauuggaau ccccagaugg aucugcaagc cauggacaga gcgcauagaa uuggucagaa 1800
gaaacaaguc agaguuuuca gguuuauuac cgaaaacacu guggaagaaa aaaucgucga 1860
aagagcugaa guaaaauuac guuuagacaa auuaguuauc cagcaggguc guuuagccga 1920
uuccaaagca cagacucuaa acaaagacga aauguugaac augauccggc acggugccaa 1980
ccacguauuu gcuucuaagg auuccgaaau aacagaugaa gauaucgaua guauauugga 2040
aaagggagaa augaagaccg cucagcuagc ucagaagaug gaaaccaugg gcgaaucguc 2100
acuucgcaac uucacagucg aaacacccac ugaaucaguc uaccaauucg aaggagaaga 2160
uuaucgugag aagcagaaaa ccaucggcuu gagcaacugg auagaaccuc ccaaaagaga 2220
aaggaaggcc aacuaugccg ucgaugcuua cuucagagaa gcuuuaaggg uuucugagcc 2280
uaaagcgccu aaggcuccaa gaccaccaaa acagcccauc guacaagauu uccaguuuuu 2340
cccgccgaga uuauucgaac uuuuggacca ggagaucuac uuuuacagga aaucuuuggg 2400
auauaagguu ccgaaaaacu uagaacuugg accugacgcg uccaagcaac agaaagaaga 2460
gcaaagaaaa auagaugagu cagaaccgcu caccgaagac gaacagcaag aaaaagaaaa 2520
cuuguuaacg caagguuuca ccaauuggag uaaacgcgau uucaaucagu ucaucaaagc 2580
caacgagaaa uaugguaggg acgauauuga gaacaucgcc aaggauguug aaggcaaaac 2640
gccugaagaa guuauggaau auucugcggu guuuugggaa agaugucaug aauuacagga 2700
uauugauaga auaauggccc agauugagag aggagaaacu aaaauacaaa gaagagcuag 2760
uauuaagaag gcacuugaug cuaaaauggc aagauaucgu gcaccauucc aucagcugag 2820
aauuucuuac ggcaccaaca aaggcaagaa cuacauggag gacgaagaca gguuuuuggu 2880
guguauguug cacaaguugg guuucgauag agaaaacguu uaugaagagu uaagagcagc 2940
uguacgugcg ucaccacaau ucagauuuga uugguucuua aaaucgagaa cugccaugga 3000
gcugcaaagg agaugcaaca cauugauaac guuaauagaa agagaaaaug cugaauugga 3060
ggaaagagaa aaaauu 3076
<210> 145
<211> 4137
<212> RNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 145
auggaaggcu cagagucgga aaauucagcu ucugguuccg guucagaaaa ugagagcaaa 60
agugauucca guaacaacuc uggaagcgcu ucugguaguu cuucuucgga cgguuccgau 120
acaggcgaag aaacuguaga aaauggaucg gccaauaaaa guaguaguaa aagugacgga 180
gaagaaguac uugaagaaag uaacgggugu agccaagauu caaacucuau accuccugcu 240
aguccagaua guucgaguaa auucgauacu accaaagauu uaaguucuga uaggaguucg 300
gaucccucua gcaucagacg aucaguuagg ucgcgaagag agccggaaag acuucagagu 360
aaagacagug auagggcuuc gagugauaaa agcaacaaaa gugcugaaga uuggaaauac 420
aaugacgcua guucgucaga gucugaacca gaaguaaaag aacgcccccc accuaguaaa 480
cgcguaggug ccagagcgcg aacgacugug auaaaaaaga aaaaguccaa gaaaagaagc 540
caauacaguu cagaagauga ggaaacgagc gacgaaagcg augaggauag uaggagagcu 600
guguccagaa ggaaggcuac uacaguuagu uacaaggaag aaagugagga ugagaaaacg 660
gauuccgagg auuugcuaga aguugauaau aaugaaccgg uagaaccugu cccggaagaa 720
aaaugugaaa caauagaaag aauuuuggca acgagaagag gaaaaauugg aguuaccgga 780
aacauuacua cagucuacua uguagaagaa aauggugauc cgaaugaagg aguugaugaa 840
aaggauuuag auaguacaga agaucaguau cuaaucaaau ggaaagauug ggcucauauu 900
cacaacacau gggaaucaga caaaaguuua cgagaacaga aaguaaaggg gaugaaaaaa 960
uuggaaaauu auaucaaaaa agaagucgaa auucaacagu ggcuuaaaua uucuacuccu 1020
gaggaugugg aauauuauga augucaaaug gaguuaucuc aggaucuuuu gaagaguuuc 1080
aacgaggucg agaggauaau agcaaaguac aauaagccug auggggguaa agauuauuau 1140
auuaaauggc aaagucuucc auaugcugaa ucgacuuggg aagauucagu ucuaauucaa 1200
cgaaaauggc cugaccaaau aaaugaauuc gaagcuaggg agcaaucaag uaugacccca 1260
acgagacacu guaaaguacu caaacauaga cccaaauucc acgaagucaa gacccagccu 1320
gaauauauga ugggcaaaga acagacuuug auacugcgug auuaccaaau acauggucuc 1380
aacuggauga uacauuccug gucaaaagaa aacucuguua uauuagcaga cgagaugggg 1440
cucgguaaaa cgauucagac aauuugcuuu cuauacuauc ucuucaauac ucaccaccuc 1500
cacggaccau uuuugugugu ugugccccuu ucuacaauga cgucguggca gagggaaaug 1560
acacaguggg cacccgacuu gaacuuuguc acauacuugg gagauguuca guccagagau 1620
acgauucgcc aauaugaaug gugcuuugaa gggucaaaaa ggcuaaaguu caaugcaauu 1680
cucacaacgu augaaauugu uuugaaggau aaagcauuuu uaggaagucu cagcugggcu 1740
guguuacuag uagaugaagc ucacagguug aaaaacgaug auucuuuguu guacaaagcu 1800
uuaauggaau uugacacuaa ucacaggcuu cuuauuacug guacuccuuu acaaaauagu 1860
uuaaaagaac uuugggcgcu gcuacauuuu aucaugcccg cuaaguuuga aacaugggac 1920
gaauucaaaa gagaacacga aaacaccaca aacuccacaa acuauaccaa acuccacaaa 1980
caacuugaac cguuuauuuu aagacgggua aagaaagaug uagaaaaauc ucuccccgcu 2040
aaaguagaac aaauucuuag gguagagaug acgucuaucc agaaacaaua cuauaagugg 2100
auauuaacaa aaaauuauaa ugccuugaga agaggaguca aaggauccac aacaaccuuc 2160
uuaaauauug ugauagaacu gaagaaaugu uguaaccauu cgucuuugau caagccccca 2220
gauauugaaa cacaauacaa ucaacacgac guuuugcagc aacuucucag agguucggga 2280
aaauuagugc uucuggauaa auugcuuauc cguuugcgca auacuggcca uagaguacua 2340
aucuucucgc agaugguccg gauguuggac auucuugccg aauauuugca gcuucgacau 2400
uucccguuuc agaggcuaga ugguggcauc aagggagagc ugcgacguca agccuuagau 2460
cauuucaaug cugaaggguc ucaagauuuu ugcuuccuuc uuucaacucg cgcagggggc 2520
uugggcauua auuuagcuac ugcugauacu gugauaauuu uugauucgga cuggaauccu 2580
caaaacgauc uucaagcgca ggcaagagcu cauaggaucg gucaaaagaa ccaagucaac 2640
auuuauaggu uaguuacugc uagaucugua gaggaagaaa uuguagaaag ggcaaaacaa 2700
aaaaugguac uggaucaucu uguaauucag agaauggaca cgacgggaag aaccguuuug 2760
gacaaaaagg ggucuucuaa uaauaauccg uuuaacaaag aagaucugac ggcgauuuug 2820
aaauuuggag cugaggaauu auuuaaagau gaagaugacg augaggaacc aaacugugau 2880
auugacgaaa uucuucgacg agcugagacc agagaugaag cuccuucauu gguuggagau 2940
gaacuacuuu cggcauuuaa aguagcaagu uucgccgcuu uugacgaaga ugccgagccc 3000
ucaccaguca acaauguugu uaacgacgau gaaaguaaag acugggauga aauuauucca 3060
gaaaaacuuc guaucaaggc agaggaagag gaaaagaaca aggaaaugga agaucuuuau 3120
cuuccuccgc gaagucgaaa aacucuucaa cagauuaauc aaucugaaag ugacggggaa 3180
gaaggcaaag guaggaagaa aacgaagaaa gauggagaug aaucgggagg uuccaguggc 3240
gaugaugaca cugacgagga aaaaccuaaa aaacgaggaa ggccaccagc aaaccccaga 3300
gaaaaguuca agaacuucac ugaugcugag auuagaaggu uuauaaaaag uuauaagaaa 3360
uuuaguggac ccuuaaagcg auuagaggca guugcuugug augcugaauu gcaagaaaaa 3420
ccauuagcug aguuacggaa auugggagaa cuucuucaug agaggugcag ggcauuuaug 3480
aaugaacaag cuaaagaaaa uacagagucu aacacucaag acgaacccaa aggucgcaaa 3540
agaggaccau cguuuaaaau uggaggagug ucuguaaaug ccaaaacgau gauggcuugu 3600
gaggaagagu uagaaccauu agaugaaguc auuccagcug auccaaauga acgauuacgu 3660
uggguuuuug auguaaaaac gaagucgucu cacuuugaug uggacugggg uauggaagag 3720
gacacuaagu uauugaaagg aauuuaucac uauggucuug gcucauggga gcaaauaaaa 3780
uuggauccau uauuaggcau uggugauaaa auuuuccuua auaaugaaga uaaaaagccg 3840
caggcuaaac aucuuuuauc aagagcagaa uacuuauuaa agauuaugaa aaagcaauua 3900
gaucuaaaga aggggguuca aaaaccaaaa agacagagga aaaaagaaca aaaaguucuu 3960
acuaaggaaa uuauugauga cgaugaaagc ucaaaugaug uuucaucauu accaaguucc 4020
gcuccaguua caguaucagu agcuccgguu guuaaaaagg uaaagaaaga agugaaaaaa 4080
gaaaaggagg auaaagaaga auccucgccc gagaaaaagg aaaaaaaaga aggauaa 4137
<210> 146
<211> 767
<212> RNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 146
uacgagaugu ucaucgguug uguaaggugg uccgggcuca gcgccaucaa aaagguaggg 60
gugauuggug cauuuucuca acugcaugaa aauauucugu agccgcauuu uugccaccug 120
ugcaccauuc aguauaucaa uauccuucau uagcacuuug guauuaccau ucucgcugca 180
uuuugcucaa uccuacauac acuuuuaacu ccuucuuggg uuuuagcccu uucucuacuu 240
caauuuucaa ucuucuaagc aagaaugguu uuaauacagc augcagccuc uccaccaugg 300
aguugccucc cagacauuga cugguguuaa accaggcauc gaaaucauca gaugaguuaa 360
aaacgucugg caguaagaag uugagaagag accagaguuc auguaaauug uuuuguaaug 420
gaguaccugu uagcaguagc cuguugguau ucuugaauuc ccugagaauu ucggaaagcu 480
uagucuuuuu cauuuuuuau acgaugagcu ucaucaacga ccagauaucu ccacuugaac 540
uuuuuuaaua gagauuuuuc uuuaauacac auuucauacg agguuauaca gacaucccau 600
ucaccaggca ucaucguauc ucugauaauu gaguuccuag ccucuugauc gccaaugaga 660
caaacagcuc ucaagguugg acaccacugc uggaacucau ucauccaauu ugauaaggua 720
gauuuaggaa caacgacaaa uaugaggacc agguguacuu uuauagu 767
<210> 147
<211> 3074
<212> RNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 147
cuuuguuaau caaauaaaac uuuguuucaa cauauugcaa aauucaucua aacguucaac 60
augucacaaa cugaaggcuc gacagaggcg agcguaagug ccucagaacc aauggaagaa 120
gcagagaacu cggaauuggc ucaaaaugaa gaaucuucuu cagauacuac cucuaagggu 180
gaagaguucg aggucaaagu ggcuucugac agaggaaaaa gauuugacua cuuguugaaa 240
cagacugaaa ucuuuucaca uuuuaugaac caaacaaaau cucccaguaa accaaaaacu 300
gggaggccua aaaaagagaa gagugauaca ucugauuuaa gacaucguaa aacugaacaa 360
gaagaagaug aagaacuuuu agcagaaacc aaccuuaaaa caaagacuac aacucguuuu 420
gaugccucac cacccuacau caaacauggg gaaaugagag auuaucaagu ccgugguuug 480
aacuggauga uuucuuugua ugaacauggc aucaauggua uuuuagcaga ugagaugggu 540
uuggguaaaa cuuuacaaac cauaucucug cuuggauaua ugaagcacua uaaaaguaca 600
ccugguccuc auauugucau uguuccuaaa ucuaccuuau caaacuggau gaaugaguuc 660
gagaaguggu guccaaccuu gagagccguu ugucucauug gugaucaaga ggcuaggagc 720
ucauuuauca gagauacgau gaugccuggu gaaugggaug uuuguguaac cucguacgaa 780
auguguauua aagaaaaauc uguauuuaaa aaguucaacu ggagauauau ggucauugac 840
gaagcucauc guauaaaaaa ugaaaaaucu aagcuuuccg aaauucucag ggaguucaag 900
acuacuaaca ggcuacugcu aacagguacu ccauuacaaa acaauuuaca cgaacucugg 960
gcucuucuca acuucuuacu gccagauguu uucaacucau cggaugauuu cgaugccugg 1020
uucaacacca gucaaugucu gggagacaac gccuuggucg agagauugca ugcuguauua 1080
aaaccauucu ugcuuagaag auugaaagcu gaaguggaga aacggcuaaa acccaagaag 1140
gaguuaaaag uguauguagg auugagcaag augcaacgag aaugguauac caaagugcug 1200
augaaggaua uugauauagu gaauggugca ggaaagguag aaaaaaugcg acuacagaau 1260
auucucaugc aguuaagaaa augcacaaau caccccuacc uuuuugaugg cgcugagccc 1320
ggaccaccuu acacaaccga ugaacaucuc guguacaauu gcgguaaaau gguguugcug 1380
gauaaacugc uucccaaauu gaaggaacag gaaucucgug uacuuaucuu cucucagaug 1440
acccguaugu uggauauacu ugaagauuac ugucauuggc gacaguacca auauugucgu 1500
uuggaugguc aaaccccaca cgaagacaga cagagacaaa ucaacgagua uaacgaagac 1560
aauagccaaa aguuuaucuu uauguuguca acuagagccg guggauuggg uaucaauuug 1620
gccacagcug auguaguuau uauauaugau ucggauugga auccccagau ggaucugcaa 1680
gccauggaca gagcgcauag aauuggucag aagaaacaag ucagaguuuu cagguuuauu 1740
accgaaaaca cuguggaaga aaaaaucguc gaaagagcug aaguaaaauu acguuuagac 1800
aaauuaguua uccagcaggg ucguuuagcc gauuccaaag cacagacucu aaacaaagac 1860
gaaauguuga acaugauccg gcacggugcc aaccacguau uugcuucuaa ggauuccgaa 1920
auaacagaug aagauaucga uaguauauug gaaaagggag aaaugaagac cgcucagcua 1980
gcucagaaga uggaaaccau gggcgaaucg ucacuucgca acuucacagu cgaaacaccc 2040
acugaaucag ucuaccaauu cgaaggagaa gauuaucgug agaagcagaa aaccaucggc 2100
uugagcaacu ggauagaacc ucccaaaaga gaaaggaagg ccaacuaugc cgucgaugcu 2160
uacuucagag aagcuuuaag gguuucugag ccuaaagcgc cuaaggcucc aagaccacca 2220
aaacagccca ucguacaaga uuuccaguuu uucccgccga gauuauucga acuuuuggac 2280
caggagaucu acuuuuacag gaaaucuuug ggauauaagg uuccgaaaaa cuuagaacuu 2340
ggaccugacg cguccaagca acagaaagaa gagcaaagaa aaauagauga gucagaaccg 2400
cucaccgaag acgaacagca agaaaaagaa aacuuguuaa cgcaagguuu caccaauugg 2460
aguaaacgcg auuucaauca guucaucaaa gccaacgaga aauaugguag ggacgauauu 2520
gagaacaucg ccaaggaugu ugaaggcaaa acgccugaag aaguuaugga auauucugcg 2580
guguuuuggg aaagauguca ugaauuacag gauauugaua gaauaauggc ccagauugag 2640
agaggagaaa cuaaaauaca aagaagagcu aguauuaaga aggcacuuga ugcuaaaaug 2700
gcaagauauc gugcaccauu ccaucagcug agaauuucuu acggcaccaa caaaggcaag 2760
aacuacaugg aggacgaaga cagguuuuug guguguaugu ugcacaaguu ggguuucgau 2820
agagaaaacg uuuaugaaga guuaagagca gcuguacgug cgucaccaca auucagauuu 2880
gauugguucu uaaaaucgag aacugccaug gagcugcaaa ggagaugcaa cacauugaua 2940
acguuaauag aaagagaaaa ugcugaauug gaggaaagag aaaaaauuga uaaaaagaaa 3000
aaaguuucca aaucuucaaa ucuuggaggu auuccugccc aaaucagcuc gaaaucuuca 3060
cagaaacgga agaa 3074
<210> 148
<211> 4998
<212> RNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 148
uuucaaauaa aauuuguucc uugauaauaa aaaaacaaag aaaauggagg uuaauccaau 60
aauuagaacu cgacauauug uaaaauuaau gaaaaauggc cgcaaaauau uauguacuaa 120
gauugcccug auucuacaau aucucgaguu aaaauuauug gauuaaaguu uaguaaacgu 180
cauuuuguuu guuuuuuguu caaggaacaa auuuuauuug aaaauucuuu uuaucucuuu 240
uaguuuacga acuagaaccu uauaaauaau ucaauuguuc agcagccaaa aauacauaaa 300
aaauuugaaa aggucacagu gucuagcuga ccccuagauu caguuuaaaa auuaaaaaua 360
uuauuaaucg ucgggauaau cguagaacga auaacuugaa uacugcgcgu uacuauuuac 420
auuagagccu agguuggugc caucugaagg uaacgggacc ggcaaaggcc uugaugguuu 480
gcgaggucgg uauguuccuc uagaaccggc guuugacggg ccaccugguu uuaaacgggg 540
ucugccagga ccccgccgca uugauggggu uugagcagua gaacugcuag cuugagcagc 600
uccagaaacu uccaaaaagc agugggacgg ugaugaaugc aucgaagcug cagacauagu 660
aguagaaucu ggagacgguu gauccguuaa aaagauacua ccaggucccg gugauguaga 720
gacagaagaa cuauuagaua ucuggcggcc aagcccuguc guacggcuuc gagauccucu 780
aggccguccc cuucgagaug acccucuucc aggaagccuu gguuugacag uugugccgua 840
uacauuguau acaguauauu uauucguaau ugccgaauca gauucaucau uguaaauguc 900
uacgccauca ucuaucagaa ugucguuaga auugacacuu aauggacugu ugggcccacu 960
uucgacgaca guacuaguag cuucuucuaa uguaacugau uccaguuuag cuuuuuuggg 1020
uuccaugcca acugguauug ucuuauauug uaauuuucgu uuccugucua acucuucgga 1080
aguauuaucg auuuucaaau gauauuuuug uaccaauuca ucaucaucca acagcaagga 1140
caccacuucc uugggcuuga guguauccgg uuuaaaguua ccaccgcuaa ugaccaauuu 1200
uugaaucucg cucuuuucuc uagcccuuug uaagaugcgu ucuucaauag aaccuuuaca 1260
aauuaaucug uacaccguca ccugcuuggu cugacccaac cgaugggccc uguccauagc 1320
cugcuggucc acagucgggu uccaaucacu gucguagaaa auuacaguau cugcagcagu 1380
uaaauugaua ccaaguccac cagcucuugu cgacaguaga aaaacaaaaa ugucugcucu 1440
ggcuuggaaa ucagcaacca uaucccuucg uucugauauu uuugaugaac caucuaaccu 1500
cauauacuua ugaugccugu gccacaugua uucuucuaaa agaucaauca ucuuugucau 1560
cugcgaauau auuaaaacgc gauguccuuc cucuuugagu cuuuuaagga guccaucaag 1620
uaccgacagu uuuccagaau cgguaacuaa acucuccuua ucugguauca caauauucga 1680
aaaaccguua acaggucuca aauuaucaac ugcauuaaac ggucgaggau guaaaguuuc 1740
ugcugauuua uaauucaauu uauuguuggu cgcuuucgac caguaagaau uaagagaguu 1800
gaaacuaaau ucgucuagau gacgcuguag aucccacgcu gcucuacgag aauaacaaua 1860
uaagccgagu ggggccgccg auacccuagg cauacaauaa aaaagaaagg cgggaauuuc 1920
agucuuugua cauuggaaca ccugaguuaa ccucuuuaug uaaggaaaau cagucaauau 1980
auuuuguauc ugguucacuc uauggucauu aacucuuaaa agugcaucau uuccugcguu 2040
aaguucuuua guuuuuaauc uaauauuuuu auguucaaca guuucuggag uggaaugaaa 2100
cacaugaucg guaugugugu aaaacacucu auuuccuuug uuuuguucag uaaaaacuaa 2160
aucaccaaau acaucacuac uucgaaucug auauugauuu aaacggaaaa aauuccucaa 2220
cuguaauguc ggccguuuuc uaaaggauau gucccauagu uuucuauaau auaauauuuc 2280
auuggauuuu uggcauucgu aauaauguuu ccaccugugc aaaauauucc cuugaaauau 2340
ccuaaaaaca ucuucagcug auaaacccaa aaagugacaa aaauuaaaaa uggugggaug 2400
caaaccaucu ugaauagcau cuuuuauguc uccugguuug aaaaugaagu guuuccuaau 2460
uuucuccauu aaaauuucuc gaacauugaa aucauaaauu ugauaaggaa cuguguacug 2520
caaagaacuu auucuaaugg gagauuuggc gucucuucuc ucaaaaaguu cgggaugguu 2580
gcaaaccuuu cuaaacugca ucaccaaauu caucaaauuu gaaguaaaau ucuuaucuac 2640
agugugagaa ucucccccgc caacugugua auucaagaga ucuucaauuu ugauuuuuug 2700
uuuuagagcc aaauacaaua aauucugucu uguggucagu ggacaguaga ccauuacuuc 2760
uauuuuauca gacaguucau uuucaacauc uuucuugauu cuccucaaca uaaaagguuu 2820
uaaaaucaua uguaaacgag auaaguguuu uucaucgaua ccaguuuugu uuucagcaug 2880
gcuuucaaug ucuuuugaaa accauucguu gaacuccuca ugugagucaa agaguguugg 2940
cauaauaaaa ugcaauaagg cccauagcuc cgccauacug uuuuguauug ggguaccacu 3000
caacaacaau cuguuccugc aacuaaaacc uaauagaguc uuccaucuca uugaacuagu 3060
acuuuugaua gccugugcuu caucuaguau cauguauugc cauuuuauuc uauuaaagua 3120
uuuuauaucu guuauaacua uuugguagga aguuaccaca augugaaaac uagcgucuuu 3180
uguauacaug ucuuucaaau cccaaaacug ccuuaaaauu uuucuuucgu uuggauuucc 3240
ccaauagggc accacuuuaa aauccggcac aaacuuggcc acuucuugcu gccaauugug 3300
caggguugag gccggagaua uuaucaaaaa agggccccag acagaauauu uuucagcuau 3360
gugacaaaga aacgcaauac uuugaacagu uuugccuaga cccauuucau cagcuagaau 3420
accacugauu cccugagagu auaaauuugc caaccaauuc aucccucuua guugauaucc 3480
uuuuaauuug ccucuaaaca uauuagguug uggcuguuca cccucuccau ugggaaauuc 3540
auuaagacac gaauuggcuu guuggucaaa augucuaguc cuugcuuuuu cacucugaaa 3600
ugcaucuaau gcauucuuuu uggccauuuc cuucauacuu ucacuaucgu aaguaucaca 3660
acuuaauuuu auugaacuuu ccucgucuag cuggcuuaaa auuagcaacu guucuucagg 3720
agaagccugu cccaauuucu uggacaugaa augagcauac agcucagucu gaguaauaag 3780
aaaguuuaau uuccucuguu gucgcuuggc uucuaccaac ucguggucaa uuuuucuuug 3840
uucuucugcu ucuuucucua accguuucuu aacuucucua ucaaaacgcc gugagcguuu 3900
ccaguaagca auauucucac gugauaaccu cuucauccuc cauggcuguu cuuugacuau 3960
ucgagcgcuu uggagagcuu uuugacgugc auauuuaaca caaugugaug ccacucguuu 4020
gcacugcagu agcauuuccu uguguuuguu aauuuuugau cuauguugcu uuccaauuuc 4080
uuuuuugacu auauuaguaa auaauuuucg ccgcuuuaug gucaucauau cuucccauuu 4140
ccgucuggac ucuucaucuu ugaauuuuuu uguuuuuuuc uuugguauau gaaguccuaa 4200
aggaggagga gguagagacu gauuuggaau gacaagucca uauucagaug gcaaauacuu 4260
aucagcuaua ucgucgaugc uuuggaaauc cauuccauuu uggagauuca aaucuaaaca 4320
ugguucaucc gaaauagcau ccaaaauauc aggaugguau aguggagacu uaaauguguc 4380
uucuauuuua auuuuauuuu ucuugacagg uacugguaga uuuuuuucua cauguggaua 4440
aagaucuacu gcacugauca auccagcucc auaguaugca uaauuaucaa aauucucuuu 4500
ucuuuuucuu aaggauuuuu gauaugaaug caaccucaua acaugcuuau auuguacauc 4560
auccggacua cuaucugaac uuucuuguag aacaucagca agccauuucc uccuaguuga 4620
aacaguuuua agauuguaau acucauuggu agagugaggu ucugaaucuu uuaaaauaga 4680
aucuauauug acaucacuca gauugcccau gccaucauca gaaucgucag agucgcuacu 4740
uaacuguaau ugguugugua caucucguaa aaacauauua gugucgacag cuugcucaac 4800
ucuucuuaca ugaacugguu uagcuguaua ugaucuauua guuugaucaa gguagcuguu 4860
gguggguaau auuuuguaug auuuaucccu gccguuccac auuuuuucua aauguaauaa 4920
acuguuuuca gaauaucuau auaaauuaag cuaauauaau uuuacauuac auuacauucu 4980
caauuaguuc auuuuuua 4998
<210> 149
<211> 8026
<212> RNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 149
cgucgcuaug ucauauaaga ccaaugcguc auuuuugcug aacgcguaaa auguagaaaa 60
caggucuauu uugcaaauuu uuaaguuacg uggacuaccu aauuguauau uaaacuauua 120
gaaagacgau aaucauauuu uuuacugcgg augauuaacc uuaaugugaa uauuuuguga 180
uaacaugaug agaauucgaa gaugagugac gaaacuccgg ggguagggca gggugcucug 240
cccccgagag agggccaaag ccuucgacuc cuugcagagc gcccuacuag uggugcuacg 300
guaaggguag cccagguugu ugguggucag uauguguuga caacacaauc acaugguaug 360
ccagcucuag cacagauugc ugcugggaau cccaacguca cucgucugau aagcaucagu 420
ccaacuagag guggacaauc guccccacua aggcccaguu uggccaauca gucgaucguu 480
aauguucuua ccaagucucg accaaauccu aauguacgcu uacaguuauu ucaauccggu 540
gagaguucug gaaacaaugu ccagcauagu ccccauucga gaucacucaa aaggccguug 600
ucuuccacgg gugaaaaaaa agauagcuac gcuucuaagc ugcaacaugu aaugaaccau 660
cgcauuguuc gcucaaaauu aaugaaagaa aaguauaaug aacaucuucu agaggccuau 720
uauuuagaga ccggaaauaa cauucuagau uuauaucaau uugccaaaag accuaaaacc 780
caagcguauc uagcuuaucu uaaggaacau gccaucgauc cucgagauua uccugaacuu 840
cagacuacaa caacuguuac uguaccgcaa acgacgccua auacaccaac ugcuaccucu 900
gucagcucuc ugcccgguau cucucauagu uacgccaucc agacuaccag uucuacugua 960
acgacaccag aaaguaacag uaacaccucu acgccgaaau caguaucugu caaagugaag 1020
ucuacaucac uuccgaauac uguuagucaa gagaugauug uagagaaggc gaaacaagaa 1080
gcguacgugg uccaacgaau agccgauuua cagaaggaag gaauaugguc ugaaaggaga 1140
cuucccaaag ugcaagagau gccucggccu aaagcgcauu gggacuuuuu gaucgaagaa 1200
auggucuggu uggcagcuga uuuugcgcag gaacgcaaau ggaagaaagc cgccgcgaaa 1260
aaaugugcca gaaugguaca gaaguauuuc caagacaagg cgcucgccgc ccaaaaagcg 1320
gaaaaggcuc acgaacaaaa ucuuagaagg auagccgcgu ucugugcaaa ggagauuaag 1380
aucuuuugga acaacgucga aaaacucguc gaguauaaac agaauacaau cuuggaggag 1440
aagcggaaaa aggcgcucga ucagcagcuu aguuuuaucg uggaucagac ugagaaguau 1500
ucgcaguugc uugccgaagg aaugaauaag accgcagaac agccuccuag uucagcgcca 1560
ucucgaucag ugucucgaac gcagucugau acagaauucg auccggaucu ucagagcgau 1620
gaagacgacg aagagaccau ugcucgagaa gaagcuuuag guaacgaagg acauaaagaa 1680
gaaaucgaag cgcuacagaa agaaucucag auggaauuag acgauuuacu agaggacgau 1740
uuccugaggg auuaccuuuu aaaucgagac acgauccgau ucagcgaauc cgaagauucg 1800
gacgaugaca cggacucgaa aaaagaaucu uucaaaggcg acaaagaaca gucugacgau 1860
ucugaaucuu cuaaagaaga agauacggaa gacgagagcg aagaugaauc uaugaagguu 1920
acugaaucgg uuguuaaaga agaacacgac gaguugaaaa uauuaguaga agauucucaa 1980
aaagagggag aaauuaagac ugaacaagau acaaaagacg accuuaucaa ugacgcagcu 2040
gcuauagcug aaaguaucca accuaaagga aacacccugu cuucuacuaa uguaucaaca 2100
aauauaccau uuuuauuaaa auauacgcua agagaauacc agcacaucgg uuuggauugg 2160
cugguaacua uguucgacag aaaacugaac gguauauuag cagaugaaau ggguuuaggc 2220
aaaacaauac aaacgauagc ucuucuagca cacuuggcgu gcgagaagga aaacuggggc 2280
ccccaucuga uaguaguccc cacuucugug augcugaauu gggaaaugga augcaaaaag 2340
ugguguccgg cuuuuaaaau ucuaacguau uacggaacgc agaaggaaag aaaauuuaaa 2400
cggauaggau ggacgaagcc uaacgcguuu cacauaugca uuacuucgua caagcuaguc 2460
auucaggacc accagaguuu caggaggaaa aaguggaagu aucugauacu ggacgaggcc 2520
caaaacauca agaauuucaa gucgcaacga uggcagcugu uguuaaauuu ucaaacucaa 2580
caacgucugc uguugacugg uacaccuuug cagaacaacc ucauggaauu guggucccuu 2640
augcauuuuu uaaugccgaa cguauuucag ucgcauagag aguucaaaga augguuuucg 2700
aauccgguga caggaaugau ugaaggaaau ucugaauaca acgaaaguau uaucaagaga 2760
cugcacaagg uauuaagacc auuucuucua aggcgguuga aaagcgaagu ggaaaaacaa 2820
augccaaaaa aguacgaaca cguggucaug uguaggcuau ccaaacgaca gagguauuug 2880
uaugaugacu acaugucccg agcaaaaacg agggaaacuu uaacuacugg aaaucuguug 2940
aguguuauaa augugcugau gcagcugagg aaagugugua aucauccgaa ucuauuugaa 3000
auuagaccaa cgacaucgcc uuuucagugu gacaacaucc ggcuucauau uccauccauu 3060
guauauucag cuuuagauua cgauccugau aagcacguga accuucaagc uuuaaaucuu 3120
cuacuaauca ugcaagaaau ccacuuuggu ucguaccagu guuaccggau gagacaauca 3180
agaaauucca agaaaauuuu cgaaauggaa acgaauucua gcaaaaaucc accaccuugu 3240
ccgccaugua aguuagccau gcgaguucua acagacaaac cuucagccac ugacgaaaag 3300
aaugagaaga aagacaugca agcuuuaagu cagccgccuc cauugcaagu uaaaggaaug 3360
agccagccua acaugaagau gaagguuucu ggagugcaau uuguuccaca gagcauacuu 3420
aaaucaauuc caguagugaa cauaucacaa ggggcuacag gucaaaucgg agcaccuguu 3480
agugugacau cuguauuaaa accacaagac aaaauaucug cuaguuuugc acagcuaguu 3540
caaacgucua cuggcaaaca cuuguuacua acgucgaauc ccaacauuac gacgagccca 3600
gugacaacua caacaccagg uggacaaaaa uugaccuucc uaucgaagca gcccguuucu 3660
acgauuggua augcgggcca ugcuguaacg aaagcuuaug ucaaauuuca guuaacgucu 3720
guuacgacag caucaacuuu cacaacaguu acgacaguca acuccaauac gauaucugua 3780
gcuaaaagug aagauaacaa agggaugcga augucuguug guaaugauua uauagguaaa 3840
cuuuauucua aacaaaauag ccuggacgug cgauggaaua gcggcgaaaa acauuuaggu 3900
uuaacaaaug aagacgaucc caaaggugaa cgaaagaaga gacuuucccu caugucacgc 3960
aucaacaaga uccguugcuc agcucuucca cuguacggcc gagauuucca agaagcuguc 4020
aaaauauaua cgccuaacca gcuggauguu uggaacgggg gucauauuca cugcuugaac 4080
acacuguaca auaaggaugc caggaaugaa acgacggauu gucuccaaga cgcguuguuu 4140
aauccugaaa gaagauugga agcucuaaaa gauacuuuug aucgauuuau auucuaugua 4200
ccuucuguga aaguggcgga acccgaacug caaguguggc auccuccacc gaguaaauau 4260
uggggccaaa aacacgagaa acaacuuaua cagaaacuau uccuaaaacc ugcaacaccu 4320
cuucauagua uagcaucugc aaugguaacg caguuuccag auccuaggcu uauucaauau 4380
gacuguggga aguuacaaac ucuggauaua cuauugagga aguuaaaacu gggaagucau 4440
cgaguauuga ucuucacgca gaugacgaaa auguuggaug uacuagaggc auuuuugaau 4500
uaccacgguc auauauaucu uagguuagau gguaccacaa aaguugauca aagacaagug 4560
uugauggaga gguucaacgg ugauaaacgu auuuucgcuu uuauuuuguc cacgcguucc 4620
gggggcgugg guguaaauuu aaccggagcg gauacuguga uauuuuauga uuccgauugg 4680
aauccaacua uggacgcgca agcgcaagau cguugucacc gaaucgguca aacgagagac 4740
guacacauuu acaggcuagu uagcgagcga acgauagagg agaauauauu gaagaaggcc 4800
aaucagaaac gauugcucgg agaucuggcg aucgaagggg guaauuucac aacggcguac 4860
uucaagaguu cgacgauuca ggacuuauuc aacauagacc aaaacgaaga aagcgcaucu 4920
gcccgaaugu cagaaguugu cgaacugaga aaagaaagag agaaggcccu cagcacagac 4980
cugguucauu cugcugacga uaaagccacc gucggugcuc ucgaaaaugc uuucgaagca 5040
ugcgaggacg accaggacgu ccaagccgcg aaaacggcca aagccgaagc uguugcagau 5100
cuugcagagu uugaugaaaa cauuccucug gaugaucaag agaaagaacc ugagaucagc 5160
aaggcggaac aggaaauuaa uaauauuaua gaaaaguuaa cucccauaga aaaauacgcc 5220
augaauuuca ucgaggcaac agaaucugcg uggucugcag aacagcuugc agcugcugca 5280
agagagaucg aagaacagaa aaaggaaugg gagcagaacc gucuggcggc gaugcgagaa 5340
gaggaggaac gucgugcucg agaguuagaa gaagaaucug auaucaucac guauucaaga 5400
gaugacgcca ccaaccaggu uagcucaaaa aacaaaaaaa ucaauaggua uaauaaaauu 5460
uuaaguaaua aaaggguuag gcucaaaaaa gauggagaug aagacguuga gaaaaaagau 5520
gacgucgaga aaaaagaugg aguugaaaaa agguugaaga agacuaggac acgaaggcug 5580
ucucaaaaaa gcaaagaugu agaggucgaa gaaccggaug cuugugaauc acaagaagaa 5640
ucucaaauua acggagggga uacggauaau agugauagug auucugauuc ugauagcgaa 5700
ucuucaucuu ccauggaauc uaaaacuacc uuaaaccacg uugauccaaa uucaccuaga 5760
acuaggucua ggggcacagu ggcuauuaac cuuuggacac ucgaugucag cccgauuuug 5820
ccuggagaaa aaccgaugaa aaaauacggg gagaaccaua gaaaaaauau uaagaggguu 5880
agaucugugu cugaaaacga uaacgaugga gauaaagacg guagaaagcg auugaggagg 5940
aaauacccca ccaguuuaga aacaucagaa gaagaaaaca guaaccaguc aagagaaaaa 6000
ucuacuaaga aacgugccaa gguagcaccc aaagggaaaa cuuguaaagu aauuuuaagu 6060
aauauacuga acgauaaacg auuuaaaguc aacuuaaaag aagacauuga gauuucagug 6120
agcacacaaa uuaaugagac uuccaccagc ucaaaccaga aucaaaccaa agauugcgag 6180
ucuagucaac augagaauag caauuuagau gaacagaaug auucucuuga caauacagaa 6240
guuaccucau ccgaacuuag uaaauuaacu gguuguacug aaauagauaa uaacgaaagu 6300
aguaaacagg aaaaugaaga auuagacgaa ucuauacucg aagauaaaua ugaugaagau 6360
uucauuacaa acaaaaauga agacauagau gaagaaacac uccuugaaga agauaaucag 6420
auagagcagg uugaaaauaa aaauauugau agcacgaaag augaaaaaca gggugaugac 6480
aguaauguuu cagauguagg ucauuuaagu aaagauaacg auaaugagga aaaaauggaa 6540
guaacagaaa guguugacga ggaaaauggu gauaucaaua agaaaguaga ugaagaugag 6600
agcguuaaag auaaaagaga aaggagaaaa gguaaugagg aagaugauaa uacagacaau 6660
gaagaaaaca uccaaaaguc agaaaaugau gagggcgaua uuaaaaagca aggaaaucaa 6720
gaugaagaag uagaagagaa aaccuuagga aauucuacug aaucaguuaa cgaaauagca 6780
aaugaaauaa guagaugcaa accuuuaaau gagcagcaca acgaauuggu agaugaagua 6840
guaaaugaca caaguaauau ggaugaauau auaaaaaaau cggaaaauuc caaaguugua 6900
gaaaagacaa gugaagaaau acuauucaac gauaggggaa aucaagauuc aucgucccag 6960
gauguaaaag augaagagau aucaucccac aacagaggag augaaaaggu gucauuccac 7020
gauaggauag auaaagaggu auuaccugaa uguaggaaag aggaagagaa acacaauaga 7080
aaaaaugaag uacuaucaca aacuauaaaa gaugaagagg cacaguccca caauaggaaa 7140
gaugaaucgg guacauuucc aaacguagca gauauagaaa auagacuuaa caacaaaguu 7200
ccucacgucg auaaugguca uaccgaaacg gucagaaugu cuaaauuggu aacgucuaau 7260
agaaaugcca auuucagguc uccugaaacg agaagaagcu ucagaaagug ugguaaaauu 7320
ucgaacaauc agacuuuaga cgguugggug aaacggucgc cuguauuacc ugucgaagcu 7380
gcuaaaguaa acgauaacuc aaaauauaaa aauguugguu cgcccgaguu auagggagau 7440
uugacugugg aaagaggaga aauuuaaaag uuuuugauag uuaaaaaagu guuuauugau 7500
caauguacac ugcaauaagg uaauaacuca aaaauaauuu auuucuuuac aguuuucuuc 7560
uucauccacu ccuggacaaa ggccucacga aguguuuuac aaguuucuuu gauaacgggu 7620
aaaaccaaaa aauaguaaag uucgcauaac cuucuggcua augucuaguc uuaggguuca 7680
agucgcgcaa gcgcccagac cgaccgcuuu acgugccuuc cgaaugacgg cggcggcuca 7740
gaacaauuuc uuaaugucag ugccaggaau cuaaccuaga uccucuagcu uguuaaguca 7800
guaauaaaca uuaguucaac ggacauauug ucacuuuauu gcgcaugcgu uuaucauuac 7860
ugagucuuga guucugccua gccguaccgu ugacauauuc guaaagauug uaguaauaag 7920
gcaugcauca gaucuuuaua gauuucaaac augcuuauga cucaguuaca auucguccaa 7980
gacuauggaa ugguauaguu gagcuggaca uaccuaagaa auuagc 8026
<210> 150
<211> 240
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNF2/螺旋酶简并dsRNA序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (216)..(216)
<223> n为a、c、g或u
<220>
<221> misc_feature
<222> (222)..(222)
<223> n为a、c、g或u
<400> 150
cgsyuhcuyy umacsggyac hccucuvcar aayaarcuwc chgaryusug ggcbyudcuh 60
aayuuyyuvc ubccsucbau yuuyaarwsb ugyucbacdu uygarcarug guucaaygcv 120
cchuuygcha cmacbggmga raarguygar yudaaygarg argaracvau yyukauyauy 180
mgdcguyudc ayaarguyyu kcgwcckuuy yuvyunmgdc gnyuvaaaaa rgargumgar 240
<210> 151
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNF2/螺旋酶简并dsRNA序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> n为a、c、g或u
<400> 151
mghgcygubu gyyuhauygg ngaycar 27
<210> 152
<211> 60
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNF2/螺旋酶简并dsRNA序列
<400> 152
uayaarcuyc uvyusacmgg machccgyub caraacaayc umgargaryu ruuycauyur 60
<210> 153
<211> 61
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNF2/螺旋酶简并dsRNA序列
<400> 153
garuuygaya cbaaycaymg rcukcuhauh acwggbacyc ckyuvcaraa ywskyudaar 60
g 61
<210> 154
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Bromodomain简并dsRNA序列
<400> 154
yuswsygaac cruuyaugaa ryu 23
<210> 155
<211> 65
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HAND-SLIDE简并dsRNA序列
<400> 155
gchguvgaug cyuayuuymg vgargcwyuv mgdguyuchg arccyaargc dccdaargch 60
cchmg 65
<210> 156
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Chromodomain简并dsRNA序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(33)
<223> n为a、c、g或u
<400> 156
mghaarurbg ayauggavga rvvdccbaar yungar 36
<210> 157
<211> 56
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Chromodomain简并dsRNA序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> n为a、c、g或u
<400> 157
bhggdaarad dggrkkbryb ggmaaymwna chacdrusua ykmhruagar gaaaay 56
<210> 158
<211> 322
<212> RNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 158
aagaaggcau agaacagaaa gagaguuggg cgaacgaaua ucucaguuca uuuaaagugg 60
cuaguuaugu uacaaaagaa ggggaaguug aggaagaagu ugacacugag auuauuaaac 120
aagaagcgga aaauaccgau ccggccuacu ggaucaagcu gcuuagacau cauuaugagc 180
aacaacagga agauauagcu aggacguuag gaaaaggcaa aagagugagg aaacagguua 240
auuauaauga cggaggaaug acaacugaca cacgagaaga uacgacaugg caagaaaauc 300
ucucugauua ccauucugac uu 322
<210> 159
<211> 401
<212> RNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 159
ucacagucga aacacccacu gaaucagucu accaauucga aggagaagau uaucgugaga 60
agcagaaaac caucggcuug agcaacugga uagaaccucc caaaagagaa aggaaggcca 120
acuaugccgu cgaugcuuac uucagagaag cuuuaagggu uucugagccu aaagcgccua 180
aggcuccaag accaccaaaa cagcccaucg uacaagauuu ccaguuuuuc ccgccgagau 240
uauucgaacu uuuggaccag gagaucuacu uuuacaggaa aucuuuggga uauaagguuc 300
cgaaaaacuu agaacuugga ccugacgcgu ccaagcaaca gaaagaagag caaagaaaaa 360
uagaugaguc agaaccgcuc accgaagacg aacagcaaga a 401
<210> 160
<211> 271
<212> RNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 160
uugcucaauc cuacauacac uuuuaacucc uucuuggguu uuagcccuuu cucuacuuca 60
auuuucaauc uucuaagcaa gaaugguuuu aauacagcau gcagccucuc caccauggag 120
uugccuccca gacauugacu gguguuaaac caggcaucga aaucaucaga ugaguuaaaa 180
acgucuggca guaagaaguu gagaagagac cagaguucau guaaauuguu uuguaaugga 240
guaccuguua gcaguagccu guugguauuc u 271
<210> 161
<211> 372
<212> RNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 161
gaucaaauuc aagcaacuag cgaaauugga aaaaaaauca gacgaagaac uuacugaaua 60
uuacaaacau uucguuauga ugugcaagaa gcagacaggc augaacauag aagacagcaa 120
cuaugacaau accaucgaac auaucucaga agaaaaggca cgaaggacau uggaaaggcu 180
ggagcuguug ucgaggauca gagaagaaau uuuaacccau ccuaaacucg acgaaagauu 240
gagggugugc auuacuucgg cugauaugcc ugaauggugg auugccggca aacacgacaa 300
ggaucucuug uugggggucg ccaaacaugg uuuaggaaga accgacuacu accuucugaa 360
cgauccugau cu 372
<210> 162
<211> 315
<212> RNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 162
uuugcuuccu ucuuucaacu cgcgcagggg gcuugggcau uaauuuagcu acugcugaua 60
cugugauaau uuuugauucg gacuggaauc cucaaaacga ucuucaagcg caggcaagag 120
cucauaggau cggucaaaag aaccaaguca acauuuauag guuaguuacu gcuagaucug 180
uagaggaaga aauuguagaa agggcaaaac aaaaaauggu acuggaucau cuuguaauuc 240
agagaaugga cacgacggga agaaccguuu uggacaaaaa ggggucuucu aauaauaauc 300
cguuuaacaa agaag 315
<210> 163
<211> 449
<212> RNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 163
acuuaucuaa agggaugcua gcugaguucg augucauacu cacaacguau acgcugguug 60
gaaauaguuc agaagagaga aaaauguucc gagugacaag gaugcauuau guaaucuucg 120
augaagcaca uauguugaaa aauaugaaua cucuucggua ugaaaauuua auuaagauaa 180
acgcuaaaca uaggauacug uuaaccggca cuccguuaca aaauaauuua uuagaacuaa 240
ugucgcuguu gauauuugug augccgaaua uauucgcuga aaaaaggugg acuugaaaaa 300
cuuauuccaa aaaaauucua aaaaagcaga agacgacucu cuaccuaccu ucgaaaagga 360
gcaaauugaa caagccaaaa gaauuaugaa accuuuccuu uugcgaagac ugaaauguga 420
cguccuucgg gaucuuccca agaaaacgg 449
<210> 164
<211> 4125
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 164
atggcatcag atgaagaagt ggaggattct ttcgccgggg aggaagatgc ccccgacgat 60
acggctgaac aaatagataa cgatcctgat tctgaagatg gtgttcctaa aggaggggaa 120
gaagatgatg attatgaacc agaagattcc agaaagaaaa agaagggaaa gaaaagaaaa 180
gccaggggag aagaaaagaa aggcaagaaa aagaagaaaa agcgaaagaa tgatagtggg 240
gatgaaagtg actttggaga agatgataat ggaggtgggg actcagatta tgcaagcagt 300
agtaaaagag gaaggaaaaa gggttctact aaacactctt ctgcatcatc aacaccaaca 360
ccagctagtg actctggcac aggaggcatg cccaccatcg agcaagtttg ttcaacattt 420
ggtttaactg atgtcgagct tgactattca gatgctgata tgcaaaactt gaccacctat 480
aagttgttcc aacagcatgt gagaccgctc cttgctaagg aaaatccaaa ggttcctatg 540
tcaaagttga tgatgttggt tgctgcaaaa tggcgcgaat tttctaattc aaaccccaat 600
ctgcaaagcg aaaatgaacc gtctgctgca acttcaacca catctgaaga aagttatcca 660
aaaactaatc gttcgagagc atccaaggaa gcagcacaaa agatagtaga ggctgactct 720
gagccatatg atgacgaatt tgatgacgaa gacgaggagg aaaaagaaga gaaaggaaag 780
aaaaaaaaga gtaatagagg aaggcctagt aaaaagaagg ctactaaagt accaacttta 840
aagattaaac taggaaagag gaagcgtgga agttcggatg aagagggcga tcttagtgga 900
ggtggctctg atcgcgattc tgatgctgag tttgagcaga tgctacaaga agctgaagaa 960
ccaaaatcca acaaatctac cactggtgaa gaatccgcac agccatcaga atcacctgca 1020
gatgaaaatc caccaccaaa acgcaaagcg aaaaccaaaa ttggttgcaa aacaaagaga 1080
aagaagaaaa caaagagtgg taaacctgaa gatgaaaatt atgaacatca agattactgc 1140
gaggtatgtc aacaaggtgg agaaattatc ctctgtgata cttgccctag agcttaccac 1200
ttggtttgcc tggaacctga attagaagaa gcccctgaag gaaagtggag ttgccctcat 1260
tgtgagaatg aaggtccggc tgaacaagat gatgacgagc atcaagaatt ctgcagggtt 1320
tgcaaagatg gtggcgaact tttgtgttgc gattcctgta catctgcgta ccacacgcac 1380
tgtcttaacc cgccacttcc cgaaatacct gacggcgatt ggaaatgtcc taggtgcggt 1440
tgtccgcctc ttgtgggcaa agttgcgaaa attcttacgt ggaaatgggt tgatgatcct 1500
cctaaaaaga aggacaatgg tgaagaggag cctcctacac gacatagaga gtactttgtt 1560
aagtggcatg agctatcata ttggcattgt agttggataa ccgagcttca attggatgta 1620
tatcatcctc tcatgtttcg aagttattca agaaagtggg acatggaaga gcctcctaaa 1680
cttgaagaac ctatggatga agctgacact agatgtagca gattcctgaa aatgggtgga 1740
aacaacaacg acgatgaact cgaagagaag tattacagat acggaataaa accagaatgg 1800
ctaatagtcc atcgtgtcat caaccaccgt acgatgcgag acggaagaac tttgtactta 1860
gtaaaatggc gagagctaac ttacgatcaa gctacctggg aagaagattc tgacgatatc 1920
ccagccctaa agtctgccat cgaatattac acagattcaa gagctgctaa tttatccgga 1980
gctggaggta agctaaagaa gaaagttgga aggaagccga aagctaaaga acttatcgat 2040
gacgacgata gaaacggtcc tcgcagatat actccaccgc cagataagcc ctgcagtgat 2100
ctgaagaaga aactagacaa acaaccctca tatttggacg agagtggatt gcttcacgag 2160
taccaactag agggtcttaa ctggcttcgt tattcgtggg ccaacggtat agacactatc 2220
ttagccgacg agatgggtct cggtaaaacc attcaaacca ttgtcttctt gtattcgctc 2280
tacaaggaag gtcactgcaa aggtccgttt ctaattagtg tcccactttc aacgatcatc 2340
aattgggaga gagaattcga aaattgggca cctgattttt attgtattac atatgttggt 2400
gacaaggact gcagagccgt gattcgtgag aacgaactca gtttcgaaga tggtgctgtc 2460
agaggaggtc gagcttcgag aatcagagcc ggttccatca agtttaacgt tttgttgacc 2520
agctacgaat taatttcgat cgattcggca tgtctcggtt ctatcgaatg ggccgttttg 2580
gtagtcgatg aagctcatag attgaaaagc aatcaatcaa aattcttcaa aatcttaaac 2640
gcttataata tagcttataa actcctcttg accggaacac cgcttcaaaa caacctcgaa 2700
gaattgttcc atttgttgaa cttcctcaac ggtcagaaat tcaacgatct ccaaaacttc 2760
caagccgaat tcgccgacat ttcgaaagaa gaccaagtga agaaattgca cgagatgttg 2820
ggacctcata tgctgcgtcg tctcaaggcc gatgtgctga agagcatgcc ttcgaaatct 2880
gaatttatcg tcagagtcga attatcgccc atgcagaaga aatattataa atatattttg 2940
acgaggaact ttgaagcttt aaatcctaaa ggaggcggac agtcggtatc tttacttaac 3000
attatgatgg atctcaagaa atgttgcaac catccctatc ttttcccagc cgcctcggaa 3060
gaagctccgc tgggtcccca tggtaattgg gatgtaggtc atttgattaa ggcttcagga 3120
aagttggtgc tattagcgaa gatgttgaag atccttagag aacagggtca cagagtgttg 3180
atcttctcgc aaatgacgaa gatgttggat ataatggaag attttcttga aggagaaggg 3240
tataaatacg aacgtattga tggggctatt actggtaatc tccgtcaaga agctatcgat 3300
aggtttaacg ctccaggtgc tccccagttt gttttccttt tgtccactaa agctggtggt 3360
ttgggcatca atcttgctac agcagatact gtaatcatct atgattccga ttggaatccc 3420
cacaatgata ttcaggcatt ctccagagct catcgtatcg gtcaagccaa caaggtgatg 3480
atctaccgtt ttgtaacacg taacagtgtg gaagaacgtg ttacgcaagt agccaagcgg 3540
aaaatgatgt taactcactt ggtagtcaga cctggaatgg gcggaaaagg tgccaacttt 3600
actaagcaag agttggacga tattctcaga ttcggtactg aagaattgtt taaagaaagt 3660
gaaggcaaag aagacgaagc cattcactac gacgacaaag ctgtgggaga attgctggat 3720
cgttctaaag aaggcataga acagaaagag agttgggcga acgaatatct cagttcattt 3780
aaagtggcta gttatgttac aaaagaaggg gaagttgagg aagaagttga cactgagatt 3840
attaaacaag aagcggaaaa taccgatccg gcctactgga tcaagctgct tagacatcat 3900
tatgagcaac aacaggaaga tatagctagg acgttaggaa aaggcaaaag agtgaggaaa 3960
caggttaatt ataatgacgg aggaatgaca actgacacac gagaagatac gacatggcaa 4020
gaaaatctct ctgattacca ttctgacttt tctgcgggat cggatgagga taaggaagac 4080
gataaggaag acgatgattc gatgagaaga acgacgccga tttaa 4125
<210> 165
<211> 2928
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 165
atgtcacaaa ctgaaggctc gacagaggcg agcgtaagtg cctcagaacc aatggaagaa 60
gcagagaact cggaattggc tcaaaatgaa gaatcttctt cagatactac ctctaagggt 120
gaagagttcg aggtcaaagt ggcttctgac agaggaaaaa gatttgacta cttgttgaaa 180
cagactgaaa tcttttcaca ttttatgaac caaacaaaat ctcccagtaa accaaaaact 240
gggaggccta aaaaagagaa gagtgataca tctgatttaa gacatcgtaa aactgaacaa 300
gaagaagatg aagaactttt agcagaaacc aaccttaaaa caaagactac aactcgtttt 360
gatgcctcac caccctacat caaacatggg gaaatgagag attatcaagt ccgtggtttg 420
aactggatga tttctttgta tgaacatggc atcaatggta ttttagcaga tgagatgggt 480
ttgggtaaaa ctttacaaac catatctctg cttggatata tgaagcacta taaaagtaca 540
cctggtcctc atattgtcat tgttcctaaa tctaccttat caaactggat gaatgagttc 600
gagaagtggt gtccaacctt gagagccgtt tgtctcattg gtgatcaaga ggctaggagc 660
tcatttatca gagatacgat gatgcctggt gaatgggatg tttgtgtaac ctcgtacgaa 720
atgtgtatta aagaaaaatc tgtatttaaa aagttcaact ggagatatat ggtcattgac 780
gaagctcatc gtataaaaaa tgaaaaatct aagctttccg aaattctcag ggagttcaag 840
actactaaca ggctactgct aacaggtact ccattacaaa acaatttaca cgaactctgg 900
gctcttctca acttcttact gccagatgtt ttcaactcat cggatgattt cgatgcctgg 960
ttcaacacca gtcaatgtct gggagacaac gccttggtcg agagattgca tgctgtatta 1020
aaaccattct tgcttagaag attgaaagct gaagtggaga aacggctaaa acccaagaag 1080
gagttaaaag tgtatgtagg attgagcaag atgcaacgag aatggtatac caaagtgctg 1140
atgaaggata ttgatatagt gaatggtgca ggaaaggtag aaaaaatgcg actacagaat 1200
attctcatgc agttaagaaa atgcacaaat cacccctacc tttttgatgg cgctgagccc 1260
ggaccacctt acacaaccga tgaacatctc gtgtacaatt gcggtaaaat ggtgttgctg 1320
gataaactgc ttcccaaatt gaaggaacag gaatctcgtg tacttatctt ctctcagatg 1380
acccgtatgt tggatatact tgaagattat tgtcattggc gacagtacca atattgtcgt 1440
ttggatggtc aaaccccaca cgaagacaga cagagacaaa tcaacgagta taacgaagac 1500
aatagccaaa agtttatctt tatgttgtca actagagccg gtggattggg tatcaatttg 1560
gccacagctg atgtagttat tatatatgat tcggattgga atccccagat ggatctgcaa 1620
gccatggaca gagcgcatag aattggtcag aagaaacaag tcagagtttt caggtttatt 1680
accgaaaaca ctgtggaaga aaaaatcgtc gaaagagctg aagtaaaatt acgtttagac 1740
aaattagtta tccagcaggg tcgtttagcc gattccaaag cacagactct aaacaaagac 1800
gaaatgttga acatgatccg gcacggtgcc aaccacgtat ttgcttctaa ggattccgaa 1860
ataacagatg aagatatcga tagtatattg gaaaagggag aaatgaagac cgctcagcta 1920
gctcagaaga tggaaaccat gggcgaatcg tcacttcgca acttcacagt cgaaacaccc 1980
actgaatcag tctaccaatt cgaaggagaa gattatcgtg agaagcagaa aaccatcggc 2040
ttgagcaact ggatagaacc tcccaaaaga gaaaggaagg ccaactatgc cgtcgatgct 2100
tacttcagag aagctttaag ggtttctgag cctaaagcgc ctaaggctcc aagaccacca 2160
aaacagccca tcgtacaaga tttccagttt ttcccgccga gattattcga acttttggac 2220
caggagatct acttttacag gaaatctttg ggatataagg ttccgaaaaa cttagaactt 2280
ggacctgacg cgtccaagca acagaaagaa gagcaaagaa aaatagatga gtcagaaccg 2340
ctcaccgaag acgaacagca agaaaaagaa aacttgttaa cgcaaggttt caccaattgg 2400
agtaaacgcg atttcaatca gttcatcaaa gccaacgaga aatatggtag ggacgatatt 2460
gagaacatcg ccaaggatgt tgaaggcaaa acgcctgaag aagttatgga atattctgcg 2520
gtgttttggg aaagatgtca tgaattacag gatattgata gaataatggc ccagattgag 2580
agaggagaaa ctaaaataca aagaagagct agtattaaga aggcacttga tgctaaaatg 2640
gcaagatatc gtgcaccatt ccatcagctg agaatttctt acggcaccaa caaaggcaag 2700
aactacatgg aggacgaaga caggtttttg gtgtgtatgt tgcacaagtt gggtttcgat 2760
agagaaaacg tttatgaaga gttaagagca gctgtacgtg cgtcaccaca attcagattt 2820
gattggttct taaaatcgag aactgccatg gagctgcaaa ggagatgcaa cacattgata 2880
acgttaatag aaagagaaaa tgctgaattg gaggaaagag aaaaaatt 2928
<210> 166
<211> 330
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 166
atgaaaaaga ctaagctttc cgaaattctc agggaattca agaataccaa caggctactg 60
ctaacaggta ctccattaca aaacaattta catgaactct ggtctcttct caacttctta 120
ctgccagacg tttttaactc atctgatgat ttcgatgcct ggtttaacac cagtcaatgt 180
ctgggaggca actccatggt ggagaggctg catgctgtat taaaaccatt cttgcttaga 240
agattgaaaa ttgaagtaga gaaagggcta aaacccaaga aggagttaaa agtgtatgta 300
ggattgagca aaatgcagcg agaatggtaa 330
<210> 167
<211> 4125
<212> RNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 167
auggcaucag augaagaagu ggaggauucu uucgccgggg aggaagaugc ccccgacgau 60
acggcugaac aaauagauaa cgauccugau ucugaagaug guguuccuaa aggaggggaa 120
gaagaugaug auuaugaacc agaagauucc agaaagaaaa agaagggaaa gaaaagaaaa 180
gccaggggag aagaaaagaa aggcaagaaa aagaagaaaa agcgaaagaa ugauaguggg 240
gaugaaagug acuuuggaga agaugauaau ggaggugggg acucagauua ugcaagcagu 300
aguaaaagag gaaggaaaaa ggguucuacu aaacacucuu cugcaucauc aacaccaaca 360
ccagcuagug acucuggcac aggaggcaug cccaccaucg agcaaguuug uucaacauuu 420
gguuuaacug augucgagcu ugacuauuca gaugcugaua ugcaaaacuu gaccaccuau 480
aaguuguucc aacagcaugu gagaccgcuc cuugcuaagg aaaauccaaa gguuccuaug 540
ucaaaguuga ugauguuggu ugcugcaaaa uggcgcgaau uuucuaauuc aaaccccaau 600
cugcaaagcg aaaaugaacc gucugcugca acuucaacca caucugaaga aaguuaucca 660
aaaacuaauc guucgagagc auccaaggaa gcagcacaaa agauaguaga ggcugacucu 720
gagccauaug augacgaauu ugaugacgaa gacgaggagg aaaaagaaga gaaaggaaag 780
aaaaaaaaga guaauagagg aaggccuagu aaaaagaagg cuacuaaagu accaacuuua 840
aagauuaaac uaggaaagag gaagcgugga aguucggaug aagagggcga ucuuagugga 900
gguggcucug aucgcgauuc ugaugcugag uuugagcaga ugcuacaaga agcugaagaa 960
ccaaaaucca acaaaucuac cacuggugaa gaauccgcac agccaucaga aucaccugca 1020
gaugaaaauc caccaccaaa acgcaaagcg aaaaccaaaa uugguugcaa aacaaagaga 1080
aagaagaaaa caaagagugg uaaaccugaa gaugaaaauu augaacauca agauuacugc 1140
gagguauguc aacaaggugg agaaauuauc cucugugaua cuugcccuag agcuuaccac 1200
uugguuugcc uggaaccuga auuagaagaa gccccugaag gaaaguggag uugcccucau 1260
ugugagaaug aagguccggc ugaacaagau gaugacgagc aucaagaauu cugcaggguu 1320
ugcaaagaug guggcgaacu uuuguguugc gauuccugua caucugcgua ccacacgcac 1380
ugucuuaacc cgccacuucc cgaaauaccu gacggcgauu ggaaaugucc uaggugcggu 1440
uguccgccuc uugugggcaa aguugcgaaa auucuuacgu ggaaaugggu ugaugauccu 1500
ccuaaaaaga aggacaaugg ugaagaggag ccuccuacac gacauagaga guacuuuguu 1560
aaguggcaug agcuaucaua uuggcauugu aguuggauaa ccgagcuuca auuggaugua 1620
uaucauccuc ucauguuucg aaguuauuca agaaaguggg acauggaaga gccuccuaaa 1680
cuugaagaac cuauggauga agcugacacu agauguagca gauuccugaa aaugggugga 1740
aacaacaacg acgaugaacu cgaagagaag uauuacagau acggaauaaa accagaaugg 1800
cuaauagucc aucgugucau caaccaccgu acgaugcgag acggaagaac uuuguacuua 1860
guaaaauggc gagagcuaac uuacgaucaa gcuaccuggg aagaagauuc ugacgauauc 1920
ccagcccuaa agucugccau cgaauauuac acagauucaa gagcugcuaa uuuauccgga 1980
gcuggaggua agcuaaagaa gaaaguugga aggaagccga aagcuaaaga acuuaucgau 2040
gacgacgaua gaaacggucc ucgcagauau acuccaccgc cagauaagcc cugcagugau 2100
cugaagaaga aacuagacaa acaacccuca uauuuggacg agaguggauu gcuucacgag 2160
uaccaacuag agggucuuaa cuggcuucgu uauucguggg ccaacgguau agacacuauc 2220
uuagccgacg agaugggucu cgguaaaacc auucaaacca uugucuucuu guauucgcuc 2280
uacaaggaag gucacugcaa agguccguuu cuaauuagug ucccacuuuc aacgaucauc 2340
aauugggaga gagaauucga aaauugggca ccugauuuuu auuguauuac auauguuggu 2400
gacaaggacu gcagagccgu gauucgugag aacgaacuca guuucgaaga uggugcuguc 2460
agaggagguc gagcuucgag aaucagagcc gguuccauca aguuuaacgu uuuguugacc 2520
agcuacgaau uaauuucgau cgauucggca ugucucgguu cuaucgaaug ggccguuuug 2580
guagucgaug aagcucauag auugaaaagc aaucaaucaa aauucuucaa aaucuuaaac 2640
gcuuauaaua uagcuuauaa acuccucuug accggaacac cgcuucaaaa caaccucgaa 2700
gaauuguucc auuuguugaa cuuccucaac ggucagaaau ucaacgaucu ccaaaacuuc 2760
caagccgaau ucgccgacau uucgaaagaa gaccaaguga agaaauugca cgagauguug 2820
ggaccucaua ugcugcgucg ucucaaggcc gaugugcuga agagcaugcc uucgaaaucu 2880
gaauuuaucg ucagagucga auuaucgccc augcagaaga aauauuauaa auauauuuug 2940
acgaggaacu uugaagcuuu aaauccuaaa ggaggcggac agucgguauc uuuacuuaac 3000
auuaugaugg aucucaagaa auguugcaac caucccuauc uuuucccagc cgccucggaa 3060
gaagcuccgc ugggucccca ugguaauugg gauguagguc auuugauuaa ggcuucagga 3120
aaguuggugc uauuagcgaa gauguugaag auccuuagag aacaggguca cagaguguug 3180
aucuucucgc aaaugacgaa gauguuggau auaauggaag auuuucuuga aggagaaggg 3240
uauaaauacg aacguauuga uggggcuauu acugguaauc uccgucaaga agcuaucgau 3300
agguuuaacg cuccaggugc uccccaguuu guuuuccuuu uguccacuaa agcugguggu 3360
uugggcauca aucuugcuac agcagauacu guaaucaucu augauuccga uuggaauccc 3420
cacaaugaua uucaggcauu cuccagagcu caucguaucg gucaagccaa caaggugaug 3480
aucuaccguu uuguaacacg uaacagugug gaagaacgug uuacgcaagu agccaagcgg 3540
aaaaugaugu uaacucacuu gguagucaga ccuggaaugg gcggaaaagg ugccaacuuu 3600
acuaagcaag aguuggacga uauucucaga uucgguacug aagaauuguu uaaagaaagu 3660
gaaggcaaag aagacgaagc cauucacuac gacgacaaag cugugggaga auugcuggau 3720
cguucuaaag aaggcauaga acagaaagag aguugggcga acgaauaucu caguucauuu 3780
aaaguggcua guuauguuac aaaagaaggg gaaguugagg aagaaguuga cacugagauu 3840
auuaaacaag aagcggaaaa uaccgauccg gccuacugga ucaagcugcu uagacaucau 3900
uaugagcaac aacaggaaga uauagcuagg acguuaggaa aaggcaaaag agugaggaaa 3960
cagguuaauu auaaugacgg aggaaugaca acugacacac gagaagauac gacauggcaa 4020
gaaaaucucu cugauuacca uucugacuuu ucugcgggau cggaugagga uaaggaagac 4080
gauaaggaag acgaugauuc gaugagaaga acgacgccga uuuaa 4125
<210> 168
<211> 2928
<212> RNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 168
augucacaaa cugaaggcuc gacagaggcg agcguaagug ccucagaacc aauggaagaa 60
gcagagaacu cggaauuggc ucaaaaugaa gaaucuucuu cagauacuac cucuaagggu 120
gaagaguucg aggucaaagu ggcuucugac agaggaaaaa gauuugacua cuuguugaaa 180
cagacugaaa ucuuuucaca uuuuaugaac caaacaaaau cucccaguaa accaaaaacu 240
gggaggccua aaaaagagaa gagugauaca ucugauuuaa gacaucguaa aacugaacaa 300
gaagaagaug aagaacuuuu agcagaaacc aaccuuaaaa caaagacuac aacucguuuu 360
gaugccucac cacccuacau caaacauggg gaaaugagag auuaucaagu ccgugguuug 420
aacuggauga uuucuuugua ugaacauggc aucaauggua uuuuagcaga ugagaugggu 480
uuggguaaaa cuuuacaaac cauaucucug cuuggauaua ugaagcacua uaaaaguaca 540
ccugguccuc auauugucau uguuccuaaa ucuaccuuau caaacuggau gaaugaguuc 600
gagaaguggu guccaaccuu gagagccguu ugucucauug gugaucaaga ggcuaggagc 660
ucauuuauca gagauacgau gaugccuggu gaaugggaug uuuguguaac cucguacgaa 720
auguguauua aagaaaaauc uguauuuaaa aaguucaacu ggagauauau ggucauugac 780
gaagcucauc guauaaaaaa ugaaaaaucu aagcuuuccg aaauucucag ggaguucaag 840
acuacuaaca ggcuacugcu aacagguacu ccauuacaaa acaauuuaca cgaacucugg 900
gcucuucuca acuucuuacu gccagauguu uucaacucau cggaugauuu cgaugccugg 960
uucaacacca gucaaugucu gggagacaac gccuuggucg agagauugca ugcuguauua 1020
aaaccauucu ugcuuagaag auugaaagcu gaaguggaga aacggcuaaa acccaagaag 1080
gaguuaaaag uguauguagg auugagcaag augcaacgag aaugguauac caaagugcug 1140
augaaggaua uugauauagu gaauggugca ggaaagguag aaaaaaugcg acuacagaau 1200
auucucaugc aguuaagaaa augcacaaau caccccuacc uuuuugaugg cgcugagccc 1260
ggaccaccuu acacaaccga ugaacaucuc guguacaauu gcgguaaaau gguguugcug 1320
gauaaacugc uucccaaauu gaaggaacag gaaucucgug uacuuaucuu cucucagaug 1380
acccguaugu uggauauacu ugaagauuau ugucauuggc gacaguacca auauugucgu 1440
uuggaugguc aaaccccaca cgaagacaga cagagacaaa ucaacgagua uaacgaagac 1500
aauagccaaa aguuuaucuu uauguuguca acuagagccg guggauuggg uaucaauuug 1560
gccacagcug auguaguuau uauauaugau ucggauugga auccccagau ggaucugcaa 1620
gccauggaca gagcgcauag aauuggucag aagaaacaag ucagaguuuu cagguuuauu 1680
accgaaaaca cuguggaaga aaaaaucguc gaaagagcug aaguaaaauu acguuuagac 1740
aaauuaguua uccagcaggg ucguuuagcc gauuccaaag cacagacucu aaacaaagac 1800
gaaauguuga acaugauccg gcacggugcc aaccacguau uugcuucuaa ggauuccgaa 1860
auaacagaug aagauaucga uaguauauug gaaaagggag aaaugaagac cgcucagcua 1920
gcucagaaga uggaaaccau gggcgaaucg ucacuucgca acuucacagu cgaaacaccc 1980
acugaaucag ucuaccaauu cgaaggagaa gauuaucgug agaagcagaa aaccaucggc 2040
uugagcaacu ggauagaacc ucccaaaaga gaaaggaagg ccaacuaugc cgucgaugcu 2100
uacuucagag aagcuuuaag gguuucugag ccuaaagcgc cuaaggcucc aagaccacca 2160
aaacagccca ucguacaaga uuuccaguuu uucccgccga gauuauucga acuuuuggac 2220
caggagaucu acuuuuacag gaaaucuuug ggauauaagg uuccgaaaaa cuuagaacuu 2280
ggaccugacg cguccaagca acagaaagaa gagcaaagaa aaauagauga gucagaaccg 2340
cucaccgaag acgaacagca agaaaaagaa aacuuguuaa cgcaagguuu caccaauugg 2400
aguaaacgcg auuucaauca guucaucaaa gccaacgaga aauaugguag ggacgauauu 2460
gagaacaucg ccaaggaugu ugaaggcaaa acgccugaag aaguuaugga auauucugcg 2520
guguuuuggg aaagauguca ugaauuacag gauauugaua gaauaauggc ccagauugag 2580
agaggagaaa cuaaaauaca aagaagagcu aguauuaaga aggcacuuga ugcuaaaaug 2640
gcaagauauc gugcaccauu ccaucagcug agaauuucuu acggcaccaa caaaggcaag 2700
aacuacaugg aggacgaaga cagguuuuug guguguaugu ugcacaaguu ggguuucgau 2760
agagaaaacg uuuaugaaga guuaagagca gcuguacgug cgucaccaca auucagauuu 2820
gauugguucu uaaaaucgag aacugccaug gagcugcaaa ggagaugcaa cacauugaua 2880
acguuaauag aaagagaaaa ugcugaauug gaggaaagag aaaaaauu 2928
<210> 169
<211> 330
<212> RNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 169
augaaaaaga cuaagcuuuc cgaaauucuc agggaauuca agaauaccaa caggcuacug 60
cuaacaggua cuccauuaca aaacaauuua caugaacucu ggucucuucu caacuucuua 120
cugccagacg uuuuuaacuc aucugaugau uucgaugccu gguuuaacac cagucaaugu 180
cugggaggca acuccauggu ggagaggcug caugcuguau uaaaaccauu cuugcuuaga 240
agauugaaaa uugaaguaga gaaagggcua aaacccaaga aggaguuaaa aguguaugua 300
ggauugagca aaaugcagcg agaaugguaa 330

Claims (56)

1.一种分离的核酸分子，其包含至少一个染色质重塑基因多核苷酸，其中该多核苷酸与异源启动子可操作地连接。
2.权利要求1的多核苷酸，其中该多核苷酸选自下组：
SEQ ID NO:1、3、5和7；SEQ ID NO:1、3、5和7中任一者的互补物；SEQ ID NO:1、3、5和7中任一者的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:1、3、5和7中任一者的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；包含SEQ ID NO:1、3、5和7中任一者的根萤叶甲属(Diabrotica)生物的天然编码序列；包含SEQ ID NO:1、3、5和7中任一者的根萤叶甲属生物的天然编码序列的互补物；被转录为包含SEQ ID NO:139和/或SEQ ID NO:140的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列；被转录为包含SEQ ID NO:139和/或SEQ ID NO:140的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的互补物；包含SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:10的根萤叶甲属生物的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；包含SEQ ID NO:8和/或SEQ IDNO:10的根萤叶甲属生物的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；被转录为包含SEQ ID NO:139和/或SEQ ID NO:140的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；和被转录为包含SEQ ID NO:139和/或SEQ ID NO:140的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；
SEQ ID NO:79或SEQ ID NO:164；SEQ ID NO:79或SEQ ID NO:164的互补物；SEQ IDNO:79或SEQ ID NO:164的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:79或SEQ ID NO:164的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；包含SEQ ID NO:79或SEQ ID NO:164的根萤叶甲属生物的天然编码序列；包含SEQ ID NO:79或SEQ ID NO:164的根萤叶甲属生物的天然编码序列的互补物；被转录为包含SEQ ID NO:143或SEQ ID NO:167的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列；被转录为包含SEQ ID NO:143或SEQ ID NO:167的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的互补物；包含SEQ ID NO:101的根萤叶甲属生物的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；包含SEQ ID NO:101的根萤叶甲属生物的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；被转录为包含SEQ ID NO:158的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；和被转录为包含SEQ ID NO:158的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；
SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:165；SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:165的互补物；SEQ IDNO:81或SEQ ID NO:165的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:165的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；包含SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:165的根萤叶甲属生物的天然编码序列；包含SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:165的根萤叶甲属生物的天然编码序列的互补物；被转录为包含SEQ ID NO:144或SEQ ID NO:168的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列；被转录为包含SEQ ID NO:144或SEQ ID NO:168的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的互补物；被转录为包含SEQ ID NO:144或SEQ IDNO:168的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；和被转录为包含SEQ ID NO:144或SEQ ID NO:168的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；
SEQ ID NO:83；SEQ ID NO:83的互补物；SEQ ID NO:83的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:83的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；包含SEQ ID NO:83的根萤叶甲属生物的天然编码序列；包含SEQ ID NO:83的根萤叶甲属生物的天然编码序列的互补物；被转录为包含SEQ ID NO:145的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列；被转录为包含SEQ ID NO:145的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的互补物；包含SEQID NO:105的根萤叶甲属生物的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；包含SEQ IDNO:105的根萤叶甲属生物的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；被转录为包含SEQ ID NO:162的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；和被转录为包含SEQ ID NO:162的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；
SEQ ID NO:85或SEQ ID NO:166；SEQ ID NO:85或SEQ ID NO:166的互补物；SEQ IDNO:85或SEQ ID NO:166的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:85或SEQ ID NO:166的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；包含SEQ ID NO:85或SEQ ID NO:166的根萤叶甲属生物的天然编码序列；包含SEQ ID NO:85或SEQ ID NO:166的根萤叶甲属生物的天然编码序列的互补物；被转录为包含SEQ ID NO:146或SEQ ID NO:169的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列；被转录为包含SEQ ID NO:146或SEQ ID NO:169的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的互补物；包含SEQ ID NO:103的根萤叶甲属生物的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；包含SEQ ID NO:103的根萤叶甲属生物的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；被转录为包含SEQ ID NO:160的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；和被转录为包含SEQ ID NO:160的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；
SEQ ID NO:87；SEQ ID NO:87的互补物；SEQ ID NO:87的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:87的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；包含SEQ ID NO:87的根萤叶甲属生物的天然编码序列；包含SEQ ID NO:87的根萤叶甲属生物的天然编码序列的互补物；被转录为包含SEQ ID NO:147的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列；被转录为包含SEQ ID NO:147的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的互补物；包含SEQID NO:102的根萤叶甲属生物的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；包含SEQ IDNO:102的根萤叶甲属生物的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；被转录为包含SEQ ID NO:159的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；和被转录为包含SEQ ID NO:159的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；
SEQ ID NO:89；SEQ ID NO:89的互补物；SEQ ID NO:89的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:89的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；包含SEQ ID NO:89的根萤叶甲属生物的天然编码序列；包含SEQ ID NO:89的根萤叶甲属生物的天然编码序列的互补物；被转录为包含SEQ ID NO:148的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列；被转录为包含SEQ ID NO:148的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的互补物；被转录为包含SEQ ID NO:148的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；和被转录为包含SEQ ID NO:148的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；
SEQ ID NO:91；SEQ ID NO:91的互补物；SEQ ID NO:91的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:91的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；包含SEQ ID NO:91的根萤叶甲属生物的天然编码序列；包含SEQ ID NO:91的根萤叶甲属生物的天然编码序列的互补物；被转录为包含SEQ ID NO:149的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列；被转录为包含SEQ ID NO:149的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的互补物；被转录为包含SEQ ID NO:149的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；和被转录为包含SEQ ID NO:149的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补物。
3.一种植物转化载体，其包含权利要求1的多核苷酸。
4.权利要求1的多核苷酸，其中所述生物选自下组：玉米根萤叶甲(D.v.virgiferaLeConte)；巴氏根萤叶甲(D.barberi Smith and Lawrence)；十一星根萤叶甲(D.u.howardi)；墨西哥玉米根萤叶甲(D.v.zeae)；黄瓜条根萤叶甲(D.balteataLeConte)；D.u.tenella；南美叶甲(D.speciosa Germar)；和D.u.undecimpunctataMannerheim。
5.从权利要求1的多核苷酸转录的核糖核酸(RNA)分子。
6.从权利要求1的多核苷酸的表达产生的双链核糖核酸分子。
7.权利要求6的双链核糖核酸分子，其中使所述多核苷酸序列与鞘翅目害虫接触可抑制与所述多核苷酸特异性互补的内源核苷酸序列的表达。
8.权利要求7的双链核糖核酸分子，其中使所述核糖核苷酸分子与鞘翅目害虫接触可杀死害虫或抑制害虫的生长、生殖和/或进食。
9.权利要求6的双链RNA，其包含第一、第二和第三RNA区段，其中所述第一RNA区段包含所述多核苷酸，其中所述第三RNA区段通过所述第二多核苷酸序列连接到所述第一RNA区段，以及其中所述第三RNA区段基本上是所述第一RNA区段的反向互补物，使得所述第一和第三RNA区段当转录成核糖核酸时杂交而形成双链RNA。
10.权利要求5的RNA，其选自由长度为约15个至约30个核苷酸的双链核糖核酸分子和单链核糖核酸分子构成的组。
11.包含权利要求1的多核苷酸的植物转化载体，其中所述异源启动子在植物细胞中有功能。
12.用权利要求1的多核苷酸转化的细胞。
13.权利要求12的细胞，其中所述细胞是原核细胞。
14.权利要求12的细胞，其中所述细胞是真核细胞。
15.权利要求14的细胞，其中所述细胞是植物细胞。
16.用权利要求1的多核苷酸转化的植物。
17.权利要求16的植物的种子，其中所述种子包含所述多核苷酸。
18.自权利要求16的植物产生的商业产品，其中该商业产物包含可检测量的所述多核苷酸。
19.权利要求16的植物，其中所述至少一个多核苷酸在该植物中表达为双链核糖核酸分子。
20.权利要求15的细胞，其中所述细胞是玉米细胞。
21.权利要求16的植物，其中所述植物是玉米。
22.权利要求16的植物，其中所述至少一个多核苷酸在该植物中表达为核糖核酸分子，且当鞘翅目害虫摄食该植物的一部分时，该核糖核酸分子抑制与该至少一个多核苷酸特异性互补的内源多核苷酸的表达。
23.权利要求1的多核苷酸，还包含至少一个额外的多核苷酸，所述额外的多核苷酸编码抑制内源害虫基因的表达的RNA分子。
24.权利要求23的多核苷酸，其中所述额外的多核苷酸编码导致亲代RNAi表型的iRNA分子。
25.权利要求24的多核苷酸，其中所述额外的多核苷酸编码抑制hunchback或kruppel基因表达的iRNA分子。
26.权利要求23的多核苷酸，其中所述额外的多核苷酸编码这样的iRNA分子，该iRNA分子导致与该iRNA分子接触的鞘翅目害虫的生长和/或发育减少和/或死亡(致死性RNAi)。
27.一种植物转化载体，其包含权利要求23的多核苷酸，其中每个所述的多核苷酸与在植物细胞中有功能的异源启动子可操作连接。
28.一种用于控制鞘翅目害虫群体的方法，所述方法包括提供包含核糖核酸(RNA)分子的作用剂，所述RNA分子与鞘翅目害虫接触时起作用以抑制该鞘翅目害虫内的生物学功能，其中该RNA与选自下组的多核苷酸可特异性地杂交：SEQ ID NO:135-163和SEQ ID NO:167-169中任意者；SEQ ID NO:135-163和SEQ ID NO:167-169中任意者的互补物；SEQ ID NO:135-163和SEQ ID NO:167-169中任意者的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:135-163和SEQ ID NO:167-169中任意者的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:166中任意者的转录物；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ IDNO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:166中任意者的转录物的互补物；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:79、SEQ IDNO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ IDNO:164、SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:166中任意者的转录物的至少15个连续核苷酸的片段；以及SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:79、SEQ IDNO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ IDNO:164、SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:166中任意者的转录物的至少15个连续核苷酸的片段的互补物。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述作用剂是双链RNA分子。
30.一种用于控制鞘翅目害虫群体的方法，所述方法包括：
向鞘翅目害虫中引入核糖核酸(RNA)分子，所述核糖核酸(RNA)分子在与该鞘翅目害虫接触时起作用以抑制该鞘翅目害虫内的生物学功能，其中所述RNA与选自下组的任意多核苷酸可特异性杂交：
SEQ ID NO:135-163和SEQ ID NO:167-169，
SEQ ID NO:135-163和SEQ ID NO:167-169中任意者的互补物，
SEQ ID NO:135-163和SEQ ID NO:167-169中任意者的至少15个连续核苷酸的片段，
SEQ ID NO:135-163和SEQ ID NO:167-169中任意者的至少15个连续核苷酸的片段的互补物，
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ IDNO:164、SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:166中任意者的转录物，
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ IDNO:164、SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:166中任意者的转录物的互补物，
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ IDNO:164、SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:166中任意者的转录物的至少15个连续核苷酸的片段，和
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ IDNO:164、SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:166中任意者的转录物的至少15个连续核苷酸的片段的互补物，
从而产生具有pRNAi表型的鞘翅目害虫。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述RNA被引入雄性鞘翅目害虫中。
32.根据权利要求30所述的方法，其中所述RNA被引入雌性鞘翅目害虫中，该方法还包括将具有所述pRNAi表型的雌性鞘翅目害虫释放到所述害虫群体中，其中该群体的具有所述pRNAi表型的雌性鞘翅目害虫与雄性害虫的交配相比于该群体的其他雌性害虫与雄性害虫的交配产生较少的可存活后代。
33.一种用于控制鞘翅目害虫群体的方法，该方法包括：
提供包含第一和第二多核苷酸序列的作用剂，该作用剂在与所述鞘翅目害虫接触时起作用以抑制该鞘翅目害虫内的生物学功能，其中所述第一多核苷酸序列包含与SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:168或SEQ ID NO:169的约19个到约30个连续核苷酸显示约90％到约100％序列同一性的区域，并且其中所述第一多核苷酸序列与第二多核苷酸序列特异性杂交。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述核糖核酸分子是双链核糖核酸分子。
35.根据权利要求33所述的方法，其中相对于侵染缺少所述经转化的植物细胞的相同宿主植物物种的宿主植物的相同害虫物种的群体，所述鞘翅目害虫群体减小。
36.一种用于控制鞘翅目害虫群体的方法，所述方法包括：
在鞘翅目害虫的宿主植物中提供包含权利要求1的多核苷酸的经转化的植物细胞，其中所述多核苷酸被表达以产生核糖核酸分子，所述核糖核酸分子在与属于该群体的鞘翅目害虫接触时起作用以抑制该鞘翅目害虫中的靶序列的表达，并导致该鞘翅目害虫或害虫群体的生殖相对于在不包含所述多核苷酸的相同宿主植物物种的植物上的相同害虫物种的生殖减少。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述核糖核酸分子是双链核糖核酸分子。
38.根据权利要求36所述的方法，其中，相对于侵染缺乏所述经转化的植物细胞的相同物种的宿主植物的鞘翅目害虫群体，所述鞘翅目害虫群体减小。
39.一种控制植物中鞘翅目害虫侵染的方法，所述方法包括在鞘翅目害虫的饵食中提供与选自下组的多核苷酸可特异性杂交的核糖核酸(RNA)：
SEQ ID NO:135-163和SEQ ID NO:167-169；
SEQ ID NO:135-163和SEQ ID NO:167-169中任意者的互补物；
SEQ ID NO:135-163和SEQ ID NO:167-169中任意者的至少15个连续核苷酸的片段；和
SEQ ID NO:135-163和SEQ ID NO:167-169中任意者的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ IDNO:164、SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:166中任意者的转录物；
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ IDNO:164、SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:166中任意者的转录物的互补物；
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ IDNO:164、SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:166中任意者的转录物的至少15个连续核苷酸的片段；和
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ IDNO:164、SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:166中任意者的转录物的至少15个连续核苷酸的片段的互补物。
40.根据权利要求39的方法，其中所述饵食包含经转化而表达所述多核苷酸的植物细胞。
41.根据权利要求39的方法，其中可特异性杂交的RNA包含在双链RNA分子中。
42.一种用于提高玉米作物产量的方法，所述方法包括：
将权利要求1的核酸引入玉米植物中以产生转基因玉米植物；和
栽培所述玉米植物以允许所述至少一个多核苷酸的表达；其中所述至少一个多核苷酸的表达抑制鞘翅目害虫生殖或生长以及由于鞘翅目害虫感染所致的产量损失。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述至少一个多核苷酸的表达产生RNA分子，所述RNA分子抑制已接触该玉米植物的一部分的鞘翅目害虫中至少第一靶基因的表达。
44.一种用于产生转基因植物细胞的方法，所述方法包括：
用包含权利要求1的核酸的载体转化植物细胞；
在足以允许生发出包含多个经转化的植物细胞的植物细胞培养物的条件下培养经转化的植物细胞；
选择已将所述至少一个多核苷酸整合到其基因组中的经转化的植物细胞；
对所述经转化的植物细胞筛选由所述至少一个多核苷酸编码的核糖核酸(RNA)分子的表达；和
选择表达所述RNA的植物细胞。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述RNA分子是双链RNA分子。
46.一种用于为转基因植物提供针对鞘翅目害虫的保护的方法，所述方法包括：
提供通过权利要求44的方法产生的转基因植物细胞；和
从所述转基因植物细胞再生转基因植物，其中由所述至少一个多核苷酸编码的核糖核酸分子的表达足以调变与经转化的植物接触的鞘翅目害虫中的靶基因的表达。
47.一种用于产生转基因植物细胞的方法，所述方法包括：
用载体转化植物细胞，所述载体包含用于保护植物免遭鞘翅目害虫的手段；
在足以允许生发出包含多个经转化的植物细胞的植物细胞培养物的条件下培养经转化的植物细胞；
选择已在其基因组中整合了所述用于保护植物免遭鞘翅目害虫的手段的经转化的植物细胞；
对经转化的植物细胞筛选用于抑制鞘翅目害虫中必需基因表达的手段的表达；和
选择表达所述用于抑制鞘翅目害虫中必需基因表达的手段的植物细胞。
48.一种产生针对鞘翅目害虫受保护的转基因植物的方法，所述方法包括：
提供通过权利要求47的方法产生的转基因植物细胞；和
从所述转基因植物细胞再生转基因植物，其中所述用于抑制鞘翅目害虫中必需基因表达的手段的表达足以调变与经转化的植物接触的鞘翅目害虫中靶基因的表达。
49.权利要求1的核酸，还包含编码来自苏云金芽孢杆菌的多肽的多核苷酸。
50.权利要求49的核酸，其中来自苏云金芽孢杆菌的多肽选自Cry1B、Cry1I、Cry2A、Cry3、Cry7A、Cry8、Cry9D、Cry14、Cry18、Cry22、Cry23、Cry34、Cry35、Cry36、Cry37、Cry43、Cry55、Cyt1A和Cyt2C。
51.权利要求15的细胞，其中所述细胞包含编码来自苏云金芽孢杆菌的多肽的多核苷酸。
52.权利要求51的细胞，其中来自苏云金芽孢杆菌的多肽选自Cry1B、Cry1I、Cry2A、Cry3、Cry7A、Cry8、Cry9D、Cry14、Cry18、Cry22、Cry23、Cry34、Cry35、Cry36、Cry37、Cry43、Cry55、Cyt1A和Cyt2C。
53.权利要求16的植物，其中所述植物包含编码来自苏云金芽孢杆菌的多肽的多核苷酸。
54.权利要求53的植物，其中来自苏云金芽孢杆菌的多肽选自Cry1B、Cry1I、Cry2A、Cry3、Cry7A、Cry8、Cry9D、Cry14、Cry18、Cry22、Cry23、Cry34、Cry35、Cry36、Cry37、Cry43、Cry55、Cyt1A和Cyt2C。
55.根据权利要求42所述的方法，其中所述转化的植物细胞包含编码来自苏云金芽孢杆菌的多肽的核苷酸序列。
56.根据权利要求55所述的方法，其中来自苏云金芽孢杆菌的多肽选自Cry1B、Cry1I、Cry2A、Cry3、Cry7A、Cry8、Cry9D、Cry14、Cry18、Cry22、Cry23、Cry34、Cry35、Cry36、Cry37、Cry43、Cry55、Cyt1A和Cyt2C。
CN201580072334.2A 2014-12-16 2015-12-16 用于控制鞘翅目害虫染色质重塑基因亲代rnai抑制 Pending CN107208098A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462092768P 2014-12-16 2014-12-16
US62/092,768 2014-12-16
US201562170076P 2015-06-02 2015-06-02
US62/170,076 2015-06-02
PCT/US2015/066134 WO2016100536A1 (en) 2014-12-16 2015-12-16 Parental rnai suppression of chromatin remodeling genes to control coleopteran pests

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107208098A true CN107208098A (zh) 2017-09-26

Family

ID=56127549

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580072334.2A Pending CN107208098A (zh) 2014-12-16 2015-12-16 用于控制鞘翅目害虫染色质重塑基因亲代rnai抑制

Country Status (16)

Country Link
US (2) US9994844B2 (zh)
EP (1) EP3234140A4 (zh)
JP (1) JP2018506960A (zh)
KR (1) KR20170101929A (zh)
CN (1) CN107208098A (zh)
AU (1) AU2015364690A1 (zh)
BR (1) BR112017012407A2 (zh)
CA (1) CA2970671A1 (zh)
CL (1) CL2017001520A1 (zh)
CO (1) CO2017006663A2 (zh)
IL (1) IL252830A0 (zh)
MX (1) MX2017007534A (zh)
PH (1) PH12017501094A1 (zh)
RU (1) RU2017123536A (zh)
TW (1) TW201629224A (zh)
WO (1) WO2016100536A1 (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110241249A (zh) * 2019-07-18 2019-09-17 华中农业大学 一种快速检测覆土中双孢蘑菇疣孢霉病病原菌的引物及方法
CN111087455A (zh) * 2019-11-07 2020-05-01 三峡大学 一种水稻育性相关蛋白OsSMARCAL1及其编码基因与应用
CN111763253A (zh) * 2020-07-29 2020-10-13 中国农业科学院植物保护研究所 染色质重塑因子iswi、编码基因和在烟粉虱med隐种温度耐受性中的作用
CN112094951A (zh) * 2020-10-23 2020-12-18 安康学院 一种桑树线虫传多面体病毒的定量检测方法
CN114380899A (zh) * 2022-01-17 2022-04-22 中国农业科学院植物保护研究所 番茄潜叶蛾染色质重塑因子brm及其编码基因和应用
CN114437192A (zh) * 2022-01-17 2022-05-06 中国农业科学院植物保护研究所 一种番茄潜叶蛾染色质重塑因子iswi及其编码基因和应用
CN115181745A (zh) * 2022-04-01 2022-10-14 中国农业科学院蜜蜂研究所 抑制蜜蜂Rho1基因的siRNA及其应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2986265A1 (en) 2015-06-16 2016-12-22 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods to control insect pests

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007035650A2 (en) * 2005-09-16 2007-03-29 Monsanto Technology Llc Methods for genetic control of insect infestations in plants and compositions thereof
US20120174258A1 (en) * 2010-12-30 2012-07-05 Dow Agrosciences Llc Nucleic acid molecules that confer resistance to coleopteran pests

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8906876B2 (en) 2006-01-12 2014-12-09 Devgen Nv Methods for controlling pests using RNAi
UY34371A (es) * 2011-10-06 2013-05-31 Dow Agrosciences Llc Moléculas de ácido nucleico que se dirigen a rps6 y confieren resistencia a plagas de coleópteros.
WO2013052870A2 (en) * 2011-10-06 2013-04-11 Dow Agrosciences Llc Nucleic acid molecules that target pp1-87b and confer resistance to coleopteran pests
US20160230186A1 (en) * 2013-03-14 2016-08-11 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling diabrotica
TW201629219A (zh) * 2014-12-16 2016-08-16 陶氏農業科學公司 以染色質重塑基因之親代ＲＮＡ干擾（ＲＮＡｉ）抑制作用來控制半翅目害蟲之技術

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007035650A2 (en) * 2005-09-16 2007-03-29 Monsanto Technology Llc Methods for genetic control of insect infestations in plants and compositions thereof
US20120174258A1 (en) * 2010-12-30 2012-07-05 Dow Agrosciences Llc Nucleic acid molecules that confer resistance to coleopteran pests
CN103403162A (zh) * 2010-12-30 2013-11-20 陶氏益农公司 赋予对鞘翅目有害生物的抗性的核酸分子

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TARO MITO 等: "Krüppel acts as a gap gene regulating expression of hunchback and even-skipped in the intermediate germ cricket Gryllus bimaculatus", 《DEVELOPMENTAL BIOLOGY》 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110241249A (zh) * 2019-07-18 2019-09-17 华中农业大学 一种快速检测覆土中双孢蘑菇疣孢霉病病原菌的引物及方法
CN110241249B (zh) * 2019-07-18 2021-03-05 华中农业大学 一种快速检测覆土中双孢蘑菇疣孢霉病病原菌的引物及方法
CN111087455A (zh) * 2019-11-07 2020-05-01 三峡大学 一种水稻育性相关蛋白OsSMARCAL1及其编码基因与应用
CN111763253A (zh) * 2020-07-29 2020-10-13 中国农业科学院植物保护研究所 染色质重塑因子iswi、编码基因和在烟粉虱med隐种温度耐受性中的作用
CN112094951A (zh) * 2020-10-23 2020-12-18 安康学院 一种桑树线虫传多面体病毒的定量检测方法
CN112094951B (zh) * 2020-10-23 2023-05-09 安康学院 一种桑树线虫传多面体病毒的定量检测方法
CN114380899A (zh) * 2022-01-17 2022-04-22 中国农业科学院植物保护研究所 番茄潜叶蛾染色质重塑因子brm及其编码基因和应用
CN114437192A (zh) * 2022-01-17 2022-05-06 中国农业科学院植物保护研究所 一种番茄潜叶蛾染色质重塑因子iswi及其编码基因和应用
CN114380899B (zh) * 2022-01-17 2023-09-29 中国农业科学院植物保护研究所 番茄潜叶蛾染色质重塑因子brm及其编码基因和应用
CN114437192B (zh) * 2022-01-17 2023-09-29 中国农业科学院植物保护研究所 一种番茄潜叶蛾染色质重塑因子iswi及其编码基因和应用
CN115181745A (zh) * 2022-04-01 2022-10-14 中国农业科学院蜜蜂研究所 抑制蜜蜂Rho1基因的siRNA及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP3234140A4 (en) 2018-09-26
US20170369873A9 (en) 2017-12-28
WO2016100536A1 (en) 2016-06-23
TW201629224A (zh) 2016-08-16
JP2018506960A (ja) 2018-03-15
IL252830A0 (en) 2017-08-31
CO2017006663A2 (es) 2017-10-10
MX2017007534A (es) 2018-03-14
CA2970671A1 (en) 2016-06-23
CL2017001520A1 (es) 2018-01-26
AU2015364690A1 (en) 2017-06-15
EP3234140A1 (en) 2017-10-25
PH12017501094A1 (en) 2017-10-18
US20180245082A1 (en) 2018-08-30
RU2017123536A (ru) 2019-01-17
BR112017012407A2 (pt) 2018-07-31
US20160208251A1 (en) 2016-07-21
KR20170101929A (ko) 2017-09-06
US9994844B2 (en) 2018-06-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210403939A1 (en) Copi coatomer gamma subunit nucleic acid molecules that confer resistance to coleopteran and hemipteran pests
AU2021258028A1 (en) Copi coatomer alpha subunit nucleic acid molecules that confer resistance to coleopteran and hemipteran pests
CN107148218A (zh) 赋予鞘翅目和半翅目害虫抗性的copi外被体delta亚单位核酸分子
CN107208098A (zh) 用于控制鞘翅目害虫染色质重塑基因亲代rnai抑制
CN107148477A (zh) 赋予鞘翅目和半翅目害虫抗性的copi外被体beta亚单位核酸分子
CN110452908A (zh) 在昆虫害虫中下调基因表达
CN108531505A (zh) 在昆虫害虫中下调基因表达
CN106661590A (zh) 赋予鞘翅目害虫抗性的dre4核酸分子
CN106028796A (zh) 赋予鞘翅目和半翅目害虫抗性的ras对立物(rop)及相关核酸分子
CN106471123A (zh) 赋予鞘翅目和半翅目害虫抗性的sec23核酸分子
CN107278228A (zh) 用于控制半翅目害虫的HUNCHBACK基因的亲代RNAi抑制
CN106028838A (zh) 赋予鞘翅目害虫抗性的rnapii-140核酸分子
CN107532170A (zh) 控制昆虫害虫的rna聚合酶ii33核酸分子
CN107208097A (zh) 用于控制鞘翅目害虫kruppel基因亲代rnai抑制
CN107109426A (zh) 用于控制半翅目害虫的染色质重塑基因的亲代RNAi抑制
CN107109412A (zh) 用于控制鞘翅目害虫hunchback基因亲代rnai抑制
CN107532167A (zh) 控制昆虫害虫的rna聚合酶ii215核酸分子
CN107849580A (zh) 控制昆虫害虫的prp8核酸分子
CN107912048A (zh) 控制昆虫害虫的spt5核酸分子
CN108350413A (zh) 赋予对鞘翅目和半翅目害虫的抗性的rab5核酸分子
CN108431207A (zh) 赋予对鞘翅目和半翅目害虫的抗性的wupa核酸分子
CN108884469A (zh) 用于控制鞘翅目害虫和半翅目害虫的shibire/发动蛋白核酸分子
CN107109409A (zh) 用于控制鞘翅目和半翅目害虫的gho/sec24b2和sec24b1核酸分子
CN107949639A (zh) 控制昆虫害虫的snap25核酸分子
TW201728757A (zh) 控制昆蟲害蟲的gawky(gw)核酸分子

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20170926

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication