CN106028796A - 赋予鞘翅目和半翅目害虫抗性的ras对立物(rop)及相关核酸分子 - Google Patents

赋予鞘翅目和半翅目害虫抗性的ras对立物(rop)及相关核酸分子 Download PDF

Info

Publication number
CN106028796A
CN106028796A CN201480075840.2A CN201480075840A CN106028796A CN 106028796 A CN106028796 A CN 106028796A CN 201480075840 A CN201480075840 A CN 201480075840A CN 106028796 A CN106028796 A CN 106028796A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
sequence
rna
nucleic acid
plant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201480075840.2A
Other languages
English (en)
Inventor
K·E·纳瓦
H·李
C·耿
K·阿罗拉
B·维拉马尼
P·甘德拉
S·E·沃尔登
A·威尔森斯卡斯
E·诺尔
E·菲什列维奇
M·兰加萨米
M·L·F·弗雷
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Adtile Technologies Inc
Corteva Agriscience LLC
Original Assignee
Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Dow AgroSciences LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV, Dow AgroSciences LLC filed Critical Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority to CN201911165408.3A priority Critical patent/CN111088255A/zh
Publication of CN106028796A publication Critical patent/CN106028796A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Catching Or Destruction (AREA)

Abstract

本发明公开涉及通过在鞘翅目和/或半翅目害虫中对靶编码序列和转录的非编码序列的RNA干扰介导的抑制而控制鞘翅目和/或半翅目害虫的核酸分子及其使用方法。本发明公开还涉及使表达的核酸分子对于控制鞘翅目和/或半翅目害虫有用的方法、以及由此获得的植物细胞和植物。

Description

赋予鞘翅目和半翅目害虫抗性的RAS对立物(ROP)及相关核酸 分子
优先权声明
本申请要求2013年12月20日提交的“赋予鞘翅目和半翅目害虫抗性的RAS对立物(ROP)及相关核酸分子”的美国专利申请系列号61/919,322的申请日的利益。
技术领域
发明领域：本发明一般性地涉及由鞘翅目和半翅目害虫引起的植物损害的控制。在特定的实施方案中，本发明涉及目标编码和非编码序列的鉴定、及其用于在鞘翅目或半翅目害虫细胞中转录后阻遏或抑制目标编码序列和非编码序列表达从而提供植保作用的用途。
背景
西方玉米根虫(WCR)(玉米根萤叶甲)是北美的一种破坏性最大的玉米根虫物种，在美国中西部玉米种植区受到特别关注。北方玉米根虫(NCR)(巴氏根萤叶甲)是与WCR共栖大致相同范围的近缘物种。有几种叶甲属的其他相关亚种是北美洲的严重害虫：墨西哥玉米根虫(MCR)[墨西哥玉米根萤叶甲(D.virgifera zeae Krysan and Smith)]；南方玉米根虫(SCR)(十一星根萤叶甲)；黄瓜条根萤叶甲(D.balteata LeConte)；D.undecimpunctatatenella；和D.u.undecimpunctata Mannerheim。美国农业部目前估计玉米根虫每年造成10亿美元收入损失，包括8亿美元产量损失和2亿美元处理成本。
WCR卵和NCR卵两者都在夏季期间沉积在土壤中。这些昆虫在整个冬季都停留在卵阶段。卵是椭圆的、白色、且长度小于0.010cm。幼虫在5月下旬或6月上旬孵出，卵孵化的精确时间由于温度差异和位置而在各年间有所变化。新孵出的幼虫是白色的蠕虫，长度小于0.3175cm。一旦孵出，幼虫便开始以玉米根为食。玉米根虫经历三个幼虫龄。在进食几周后，幼虫蜕皮，进入蛹阶段。它们在土壤中化蛹，然后它们在7月和8月中以成虫从土壤出现。成体根虫长度约0.635cm。
玉米根虫幼虫在玉米和几种其他禾本科物种上完成发育。在黄色狗尾草上饲养的幼虫较晚出现，并且作为成虫比玉米上饲养的幼虫具有更小的头壳尺寸。Ellsbury等人，(2005)Environ.Entomol.34:627-634。WCR成虫以玉米穗丝、花粉、和暴露的穗尖上的籽粒为食。如果WCR成虫在存在玉米生殖组织之前出现，则它们可以以叶组织为食，由此减缓植物生长，且偶而杀死宿主植物。然而，当优选的穗丝和花粉变得可得到时，成虫会快速向其移动。NCR成虫也以玉米植物的生殖组织为食，但相比之下很少以玉米叶为食。
玉米中的大部分根虫损伤由幼虫进食引起。新孵出的根虫最初以细的玉米根毛为食，并钻入根尖中。随着幼虫长得更大，它们以初生根为食并钻入其中。在有大量玉米根虫时，幼虫进食经常导致修剪根，一直到玉米杆基部。严重的根损伤干扰根将水和养分转运到植物中的能力，降低植物生长，并导致籽粒产生减少，由此经常急剧降低总产量。严重的根损伤还经常导致玉米植物的倒伏，其使收获变得更难，并进一步降低产量。此外，成虫以玉米生殖组织为食可以导致穗尖的穗丝修剪。如果这种“穗丝剪切”在花粉脱落期间足够严重，则传粉可能受到破坏。
可以通过作物轮作、化学杀虫剂、生物杀虫剂(例如，孢子形成***苏云金芽孢杆菌)、或这些手段的组合来尝试控制玉米根虫。作物轮作的重大缺陷是过度限制了农田的用途。此外，一些根虫物种可以在大豆田间产卵，因此会降低用玉米和大豆实施的作物轮作的效率。
化学杀虫剂是最为人们所倚重的实现玉米根虫控制的手段。然而，使用化学杀虫剂并不是完美的玉米根虫控制策略；如果把化学杀虫剂的成本与使用杀虫剂后仍可能发生的根虫害所致的损失相加，则美国每年由于玉米根虫可能损失超过10亿美元。大的幼虫群体、大雨、和不适当的杀虫剂应用均可导致玉米根虫控制不充分。此外，杀虫剂的连续使用可能选择杀虫剂抗性根虫品系，并且由于杀虫剂中许多对非靶物种有毒性，有严重的影响环境之虞。
椿象(半翅目；蝽科)构成了另一大类重要的农业害虫。已知全世界有超过50个椿象的近缘物种引起作物损害。McPherson&McPherson,R.M.(2000)Stink bugs of economicimportance in America north of Mexico CRC Press。这些昆虫孳生于许多重要作物，包括玉米、大豆、水果、蔬菜、和谷物。新热带区布朗椿象(英雄美洲蝽)、红带椿象(盖德拟壁蝽)；棕翅蝽(茶翅蝽)、和南部绿色蝽(稻绿蝽)是特别受到关注的。
椿象在达到成体期之前要经历多个蛹期。从卵发育到成体的时间为约30-40天。在温暖的气候下会出现多个世代，导致显著的虫害压力。
蛹和成体均以来自软组织的汁液为食，它们还将消化酶注入到软组织中，引起口外组织的消化和坏死。然后摄入消化的植物材料和养分。植物维管***水分和养分的耗竭导致植物组织破坏。对于籽粒和种子发育的损害最为显著，因为产量和萌发显著减少。
当前的椿象管理依赖于单块田的杀虫剂处理。因此，迫切需要替代的管理策略，以将正在发生的作物损失降低到最低限度。
欧洲花粉甲虫(EPB)是严重的油菜害虫，其幼虫和成虫均以花和花粉为食。花粉甲虫对作物的损害可引起20-40％的产量损失。主要害虫物种为油菜花露尾甲。当前，油菜花粉甲虫的控制主要依赖于拟除虫菊酯类，但拟除虫菊酯类由于它们的环境与监管概况，预期很快会被逐步淘汰。而且，花粉甲虫对现有化学杀虫剂的抗性已有报道。因此，迫切需要具有新颖作用方式的环境友好的花粉甲虫控制方案。
在自然界中，花粉甲虫以成虫方式在土壤中或在落叶层下方过冬。成虫在春季从冬眠中复苏，开始以杂草的花为食，并迁移到开花的油菜植物上。在油菜上产卵。幼虫以花蕾和花为食，并在其中发育。晚期幼虫在土壤中找到化蛹位置。第二代成虫在七月和八月出现，并以各种开花植物为食，然后找到越冬的位置。
RNA干扰(RNAi)是一种利用内源细胞途径的方法，由此对足够大小的整个或任何部分靶基因序列特异性的干扰RNA(iRNA)分子(例如，双链RNA(dsRNA)分子)导致由其编码的mRNA的降解。在最近几年，在许多物种和实验***，例如线虫秀丽隐杆线虫、植物、昆虫胚胎、和组织培养物中的细胞中，已经使用RNAi进行基因“敲低”。参见，例如Fire等人，(1998)Nature391:806-811；Martinez等人，(2002)Cell 110:563-574；McManus和Sharp(2002)Nature Rev.Genetics 3:737-747。
RNAi通过包括切丁酶(DICER)蛋白质复合物的内源途径完成mRNA的降解。切丁酶将长的dsRNA分子切割成约20个核苷酸的短片段，称作小干扰RNA(siRNA)。siRNA解旋成两个单链RNA：乘客链(passenger strand)和引导链(guide strand)。乘客链被降解，引导链则被整合到RNA诱导的沉默复合物(RISC)中。微小核糖核酸(miRNA)分子可以类似地整合到RISC中。转录后基因沉默发生在引导链特异性结合mRNA分子的互补序列并且诱导Argonaute(RISC复合物的催化组分)切割时。尽管在一些真核生物，诸如植物、线虫类和一些昆虫中，siRNA和/或miRNA的初始浓度有限，但已知此过程***性地遍布于整个生物体。
仅与siRNA和/或miRNA互补的转录物被切割和降解，因此mRNA表达的敲低是序列特异性的。在植物中，存在切丁酶基因的几个功能组。RNAi的基因沉默效应持续数天，并且在实验条件下，可以导致靶向转录物的丰度下降90％或更多，随之发生相应蛋白质的水平降低。
美国专利No.7,612,194和美国专利公开文本2007/0050860、2010/0192265、和2011/0154545披露了自玉米根萤叶甲蛹分离的9112种表达序列标签(EST)序列的文库。在美国专利No.7,612,194和美国专利公开号2007/0050860中提出将与其中披露的玉米根萤叶甲液泡型H+-ATP酶(V-ATP酶)的几个特定部分序列之一互补的核酸分子与启动子可操作连接，以在植物细胞中表达反义RNA。美国专利公开文本No.2010/0192265提出将启动子与核酸分子可操作连接以在植物细胞中表达反义RNA，所述核酸分子与具有未知且未公开的功能的玉米根萤叶甲基因的特定部分序列互补(该部分序列据称与秀丽隐杆线虫中的C56C10.3基因产物58％相同)。美国专利公开文本No.2011/0154545提出将启动子与核酸分子可操作连接以在植物细胞中表达反义RNA，所述核酸分子与玉米根萤叶甲外被体(coatomer)β亚基基因的两个特定部分序列互补。此外，美国专利No.7,943,819公开了自玉米根萤叶甲幼虫、蛹、和切开的中肠分离的906种表达序列标签(EST)序列的文库，并且提出了将启动子与核酸分子可操作连接以在植物细胞中表达双链RNA，所述核酸分子与玉米根萤叶带电的多泡体蛋白4b基因的特定部分序列互补。
除了V-ATP酶的几个特定部分序列和未知功能的基因的特定部分序列之外，在美国专利No.7,612,194和美国专利公开文本2007/0050860、2010/0192265和2011/0154545中没有进一步提出使用其中列出的超过9000个序列中的任何特定序列进行RNA干扰。此外，美国专利No.7,612,194、以及美国专利公开文本2007/0050860、2010/0192265、和2011/0154545都没有教示提供的超过9000个序列中哪些其他序列在用作dsRNA或siRNA时在玉米根虫物种中会是致命的、甚至没有教示其有任何其他方面的用处。除了带电多泡体蛋白4b基因的特定部分序列之外，美国专利No.7,943,819没有提出使用其文中的超过900个序列的任何特定序列进行RNA干扰。此外，美国专利No.7,943,819没有教示其提供的超过900个序列中哪些其他序列在用作dsRNA或siRNA时在玉米根虫物种中会是致命的、甚至没有教示其有任何其他方面的用处。美国专利申请公开文本U.S.2013/040173和PCT申请公开文本WO2013/169923描述了源自玉米根萤叶甲Snf7基因的序列在玉米中进行RNA干扰的用途。(还公开于Bolognesi等人，(2012)PLos ONE 7(10):e47534.doi:10.1371/journal.pone.0047534)。
与玉米根虫DNA互补的绝大多数序列(如上述)用作dsRNA或siRNA时在玉米根虫物种中不是致命的。例如，Baum等人(2007,Nature Biotechnology 25:1322-1326)描述了RNAi对几个WCR基因靶的抑制作用。这些作者报告，在超过520ng/cm2的极高iRNA(例如，dsRNA)浓度下，他们测试的26个靶基因中有8个不能提供实验上显著的鞘翅目害虫死亡率。
公开
本文中公开了用于控制鞘翅目害虫和半翅目害虫的核酸分子(例如，靶基因、DNA、dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、和hpRNA)及其使用方法，所述鞘翅目害虫包括，例如，玉米根萤叶甲(西方玉米根虫，“WCR”)；巴氏根萤叶甲(北方玉米根虫，“NCR”)；十一星根萤叶甲(南方玉米根虫，“SCR”)；墨西哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米根虫，“MCR”)；黄瓜条根萤叶甲；D.u.tenella；D.u.undecimpunctata Mannerheim；油菜花露尾甲(花粉甲虫，“PB”)；并且所述半翅目害虫包括，例如，英雄美洲蝽(新热带区布朗椿象)、稻绿蝽(南部绿色蝽)、盖德拟壁蝽(红带椿象)、茶翅蝽(棕翅蝽)、拟绿蝽(绿色蝽)、和褐臭蝽(褐蝽)。在具体的实例中，公开了示例性核酸分子，其与鞘翅目和/或半翅目害虫的一个或多个天然核酸序列的至少一部分可以同源。
在这些和进一步的实例中，天然核酸序列可以是靶基因，其产物可以，例如但不限于：涉及代谢过程；涉及生殖过程；或者涉及幼虫发育。在一些实例中，借助于包含与靶基因同源的序列的核酸分子，靶基因表达的翻译后抑制在鞘翅目和/或半翅目害虫中可以是致命的，或导致生长和/或生殖降低。在具体的实例中，可选择编码Ras-对立物(Ras-opposite)的基因(编码的蛋白质在本文中被称为“ROP”；并且编码ROP的核酸在本文中被称为“rop”)作为转录后沉默的靶基因。在特定的实例中，可用于转录后抑制的靶基因是新基因rop。因此，本文中公开了包含rop的分离的核酸分子；编码rop的核苷酸序列的互补物；以及任何前述项的片段。rop的实例包括，但不限于，SEQ ID NO:1、115、120、122、124、126、131、和133。
还公开了包含编码与靶基因产物内的氨基酸序列(例如，ROP)至少85％相同的多肽的核苷酸序列的核酸分子。例如，核酸分子可以包含编码与SEQ ID NO:2、116、121、123、125、127、132、或134(ROP)的氨基酸序列至少85％相同的多肽的核苷酸序列。在特定的实例中，核酸分子包含编码与ROP内的氨基酸序列至少85％相同的多肽的核苷酸序列。进一步公开了包含编码这样的核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列是编码与靶基因产物内的氨基酸序列至少85％相同的多肽的核苷酸序列的反向互补序列。
还公开了用于产生iRNA(例如，dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、和hpRNA)分子的cDNA序列，所述iRNA与鞘翅目和/或半翅目害虫靶基因(例如rop)的全部或部分互补。在特定的实施方案中，dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、和/或hpRNA可以在体外产生，或由遗传修饰的生物(如植物或细菌)在体内产生。在特定的实例中，公开了可用于产生与rop(例如，SEQ IDNO:1、115、120、122、124、126、131、和133)的全部或部分互补的iRNA分子的cDNA分子。
进一步公开了抑制鞘翅目和/或半翅目害虫中必需基因的表达的手段、以及向植物提供鞘翅目和/或半翅目害虫抗性的手段。抑制鞘翅目和/或半翅目害虫中必需基因的表达的手段的实例包括单链或双链RNA分子，其为SEQ ID NO:3(叶甲属rop区1或rop reg1)、SEQ ID NO:4(叶甲属rop区2或rop reg2)、SEQ ID NO:114(叶甲属rop区v3或rop v3)、SEQID NO:119(美洲蝽属rop区1或BSB rop reg1)、SEQ ID NO:128(菜花露尾甲属rop区1或EPBrop reg1)中的至少之一，或其互补序列。抑制鞘翅目和/或半翅目害虫中必需基因的表达的手段的功能等价物包括与rop(例如，包含SEQ ID NO:1或115的WCR基因)的全部或部分基本上同源的单链或双链RNA分子。抑制鞘翅目和/或半翅目害虫中必需基因的表达的手段的功能等价物包括与rop(例如，包含SEQ ID NO:120、122、124、126、131、或133的PB基因)的全部或部分基本上同源的单链或双链RNA分子。对植物提供鞘翅目和/或半翅目害虫抗性的手段的另一个实例是这样的DNA分子，其包含与启动子可操作连接的、编码抑制鞘翅目和/或半翅目害虫中的必需基因的表达的手段的核酸序列，其中所述DNA分子能够整合到玉米或大豆植物的基因组中。
公开了控制鞘翅目和/或半翅目害虫群体的方法，所述方法包括向鞘翅目和/或半翅目害虫提供iRNA(例如，dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、和hpRNA)分子，所述iRNA分子在被鞘翅目和/或半翅目害虫摄取之后发挥作用而抑制鞘翅目和/或半翅目害虫体内的生物功能。例如，iRNA分子包含选自下组的核苷酸序列的全部或者一部分：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120、SEQ IDNO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:131、和SEQ ID NO:133；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ IDNO:119、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:131、和SEQ ID NO:133的互补序列；包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:131、和SEQ ID NO:133中任一者的全部或部分的叶甲属生物(例如，WCR)或半翅目生物(例如，BSB)或菜花露尾甲属生物(例如，EPB)的天然编码序列；包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:131、和SEQ ID NO:133中的任一者的全部或部分的叶甲属生物或半翅目生物或菜花露尾甲属生物的天然编码序列的互补序列；转录成包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQID NO:131、和SEQ ID NO:133任一者的全部或部分的天然RNA分子的叶甲属生物或半翅目生物或菜花露尾甲属生物的天然非编码序列；以及转录成包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120、SEQ IDNO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:131、和SEQ ID NO:133任一者的全部或部分的天然RNA分子的叶甲属生物或半翅目生物或菜花露尾甲属生物的天然非编码序列的互补序列。
本文中还公开了方法，其中可将dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、和/或hpRNA提供给鞘翅目和/或半翅目害虫，或提供在表达dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、和/或hpRNA的遗传修饰的植物细胞中。在这些和另外的实例中，dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、和/或hpRNA可被鞘翅目和/或半翅目害虫的幼虫摄入。然后，本发明的dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、和/或hpRNA的摄入可在幼虫中导致RNAi，进而可导致对于鞘翅目和/或半翅目害虫的生存力必需的基因的沉默，并最终导致幼虫死亡。因此，公开了这样的方法，其中将包含示例性核酸序列的用于控制鞘翅目和/或半翅目害虫的核酸分子提供给鞘翅目和/或半翅目害虫。在特定的实例中，通过使用本发明的核酸分子控制的鞘翅目和/或半翅目害虫可以是WCR、NCR、油菜花露尾甲(Meligethes aeneus)、英雄美洲蝽(Euchistus heros)、盖德拟壁蝽(Piezodorusguildinii)、茶翅蝽(Halyomorpha halys)、稻绿蝽(Nezara viridula)、拟绿蝽(Acrosternum hilare)、和褐臭蝽(Euschistus servus)。
附图简述
图1是来自单个转录模板的dsRNA的生成策略的图形表示。
图2是来自两个转录模板的dsRNA的生成策略的图形表示。
序列表中的序列的简述
使用如37C.F.R.§1.822规定的核苷酸碱基和氨基酸的标准字母缩写，示出了所附序列表中列出的核酸序列。对于每个核酸序列仅显示了一条链，但应理解对被展示的链的任何提述也包括其互补链和反向互补链。在所附序列表中：
SEQ ID NO:1显示了来自玉米根萤叶甲的rop的DNA序列。
SEQ ID NO:2显示了来自玉米根萤叶甲的ROP的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3显示了用于体外dsRNA合成的来自玉米根萤叶甲的rop reg1(区1)的DNA序列(未显示在5’和3’端的T7启动子序列)。
SEQ ID NO:4显示了用于体外dsRNA合成的来自玉米根萤叶甲的rop reg2(区2)的DNA序列(未显示在5’和3’端的T7启动子序列)。
SEQ ID NO:5显示了T7噬菌体启动子的DNA序列。
SEQ ID NO:6显示了用于体外dsRNA合成的YFP编码区区段的DNA序列(未显示在5’和3’端的T7启动子序列)。
SEQ ID NO:7-12显示了用来扩增来自玉米根萤叶甲的包含rop reg1、rop reg2的rop序列的多个部分的引物，以及用来扩增YFP编码区区段的引物。
SEQ ID NO:13表示见于pDAB114515中的来自玉米根萤叶甲发夹-RNA形成序列的rop v1。大写字母碱基为rop有义链，加下划线的小写字母碱基包含ST-LS1内含子，未加下划线的小写字母碱基为rop反义链。
TCAGCATGCTGTAAAATGCATGATATATCAGCAGAAGGCATTACATTGGTTGAAGATATTATGAAGAAAAGGGAACCGCTTGGTACCATGGAAGCTGTGTACTTGATAACACCTTCAGAAAAGTCAGTTCATGCTCTTATGAATGACTTTGAACCACCAAGACAGATGTACAGAGGGGCACACGTGTTTTTTACAGAAGCGTGTCCAGACgactagtaccggttgggaaag gtatgtttctgcttctacctttgatatatatataataattatcactaattagtagtaatatagtatttcaagtattt ttttcaaaataaaagaatgtagtatatagctattgcttttctgtagtttataagtgtgtatattttaatttataact tttctaatatatgaccaaaacatggtgatgtgcaggttgatccgcggttagtctggacacgcttctgtaaaaaacacgtgtgcccctctgtacatctgtcttggtggttcaaagtcattcataagagcatgaactgacttttctgaaggtgttatcaagtacacagcttccatggtaccaagcggttcccttttcttcataatatcttcaaccaatgtaatgccttctgctgatatatcatgcattttacagcatgctga
SEQ ID NO:14表示见于pDAB115770中的来自玉米根萤叶甲发夹RNA形成序列的rop v3。大写字母碱基为rop有义链，加下划线的小写字母碱基构成ST-LS1内含子，未加下划线的小写字母碱基为rop反义链。
CAAGTATGCTACGCATCTTCATCTCGCTGAAGACTGCATGAAGGCCTATCAGGGGTATATAGACAAGTTGTGTAAAGTTGAGCAGGATTTGGCAATGGGAACTGATGCCGAAGGCGAGAAAATCAAGGATCACATGCGCAACATCGTCCCCATCTTGCTAGATCCCAAAATCACCAATGAATACGATAAGAgactagtaccggttgggaaaggtatgtttctgcttctacc tttgatatatatataataattatcactaattagtagtaatatagtatttcaagtatttttttcaaaataaaagaatg tagtatatagctattgcttttctgtagtttataagtgtgtatattttaatttataacttttctaatatatgaccaaa acatggtgatgtgcaggttgatccgcggttatcttatcgtattcattggtgattttgggatctagcaagatggggacgatgttgcgcatgtgatccttgattttctcgccttcggcatcagttcccattgccaaatcctgctcaactttacacaacttgtctatatacccctgataggccttcatgcagtcttcagcgagatgaagatgcgtagcatacttg
SEQ ID NO:15显示了见于pDAB110853中的YFP发夹RNA形成序列v2。大写字母碱基为YFP有义链，加下划线的碱基包含ST-LS1内含子，小写字母、未加下划线的碱基为YFP反义链。
ATGTCATCTGGAGCACTTCTCTTTCATGGGAAGATTCCTTACGTTGTGGAGATGGAAGGGAATGTTGATGGCCACACCTTTAGCATACGTGGGAAAGGCTACGGAGATGCCTCAGTGGGAAAGgactagtaccggttgggaaaggtatgtttct gcttctacctttgatatatatataataattatcactaattagtagtaatatagtatttcaagtatttttttcaaaat aaaagaatgtagtatatagctattgcttttctgtagtttataagtgtgtatattttaatttataacttttctaatat atgaccaaaacatggtgatgtgcaggttgatccgcggttactttcccactgaggcatctccgtagcctttcccacgtatgctaaaggtgtggccatcaacattcccttccatctccacaacgtaaggaatcttcccatgaaagagaagtgctccagatgacat
SEQ ID NO:16显示了包含ST-LS1内含子的DNA序列。
SEQ ID NO:17显示了见于pDAB110556中的YFP编码序列。
SEQ ID NO:18显示了膜联蛋白区1的DNA序列。
SEQ ID NO:19显示了膜联蛋白区2的DNA序列。
SEQ ID NO:20显示了β血影蛋白2区1的DNA序列。
SEQ ID NO:21显示了β血影蛋白2区2的DNA序列。
SEQ ID NO:22显示了mtRP-L4区1的DNA序列。
SEQ ID NO:23显示了mtRP-L4区2的DNA序列。
SEQ ID NO:24--47显示了用于dsRNA合成的用来扩增膜联蛋白、β血影蛋白2、mtRP-L4、和YFP的基因区的引物。
SEQ ID NO:48显示了编码TIP41-样蛋白的玉米DNA序列。
SEQ ID NO:49显示了寡核苷酸T20NV的DNA序列。
SEQ ID NO:50--54显示了用于测量玉米转录物水平的引物和探针。
SEQ ID NO:55显示了用于二元载体骨架检测的SpecR编码区的一部分的DNA序列。
SEQ ID NO:56显示了用于基因组拷贝数分析的AAD1编码区的一部分的DNA序列。
SEQ ID NO:57显示了玉米转化酶基因的DNA序列。
SEQ ID NO:58到69显示了用于基因拷贝数分析的引物和探针的序列。
SEQ ID NO:70到111显示了借助于Sec1结构域鉴定的编码与SEQ ID NO:2具有序列同源性的蛋白质的叶甲属转录物序列。
SEQ ID NO:112和113显示了用于扩增包含rop v3(v3区)的叶甲属rop序列的多个部分的引物。
SEQ ID NO:114显示了用于体外dsRNA合成的来自玉米根萤叶甲的rop v3区(ropv3)的DNA序列(未显示在5’和3’端的T7启动子序列)。
SEQ ID NO:115显示了来自新热带区布朗椿象(英雄美洲蝽)的rop的DNA序列。
SEQ ID NO:116显示了英雄美洲蝽ROP蛋白。
SEQ ID NO:117和118显示了用于扩增包含BSB_rop reg1的英雄美洲蝽rop序列的一部分的引物。
SEQ ID NO:119显示了BSB_rop reg1的DNA序列。
SEQ ID NO:120显示了包含来自油菜花露尾甲的rop的DNA序列。
SEQ ID NO:121显示了来自油菜花露尾甲的ROP蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:122显示了包含来自油菜花露尾甲的rop的DNA序列。
SEQ ID NO:123显示了来自油菜花露尾甲的ROP蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:124显示了包含来自油菜花露尾甲的rop的DNA序列。
SEQ ID NO:125显示了来自油菜花露尾甲的ROP蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:126显示了包含来自油菜花露尾甲的rop的DNA序列。
SEQ ID NO:127显示了来自油菜花露尾甲的ROP蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:128显示了用于体外dsRNA合成的来自油菜花露尾甲的rop reg1(1区)的DNA序列(未显示在5’和3’端的T7启动子序列)。
SEQ ID NO:129和130显示了用于扩增包含rop reg1(1区)的菜花露尾甲属rop序列的多个部分的引物。
SEQ ID NO:131显示了包含来自油菜花露尾甲的rop-1的DNA序列。
SEQ ID NO:132显示了来自油菜花露尾甲的ROP-1蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:133显示了包含来自油菜花露尾甲的rop-2的DNA序列。
SEQ ID NO:134显示了来自油菜花露尾甲的ROP-2蛋白的氨基酸序列。
实施本发明的模式
本文中公开了用于控制鞘翅目和/或半翅目害虫侵染的方法和组合物。还提供了用于鉴定对于鞘翅目和/或半翅目害虫的生命周期必需的一个或多个基因，作为靶基因用于RNAi介导的鞘翅目和/或半翅目害虫群体控制的方法。可设计编码一个或多个dsRNA分子的DNA质粒载体来抑制生长、存活、发育、和/或生殖所必需的靶基因。在一些实施方案中，提供了通过与鞘翅目和/或半翅目害虫中靶基因的编码或非编码序列互补的核酸分子来转录后阻抑靶基因表达或抑制靶基因的方法。在这些和另外的实施方案中，鞘翅目和/或半翅目害虫可以摄取一种或多种从与靶基因的编码或非编码序列互补的核酸分子的全部或部分转录的dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、和/或hpRNA分子，由此提供植物保护效果。
因此，一些实施方案涉及使用与靶基因的编码和/或非编码序列互补的dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、和/或hpRNA对靶基因产物的表达进行序列特异性抑制，以实现对鞘翅目和/或半翅目害虫的至少部分控制。公开了一组分离纯化的核酸分子，其包含，例如，如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQID NO:131、和SEQ ID NO:133任一者中列出的核苷酸序列及其片段。在一些实施方案中，可以从这些序列、其片段、或包含这些序列之一的基因表达稳定化的dsRNA分子，用于靶基因的转录后沉默或抑制。在某些实施方案中，分离纯化的核酸分子包含SEQ ID NO:1的全部或部分。在其他实施方案中，分离纯化的核酸分子包含SEQ ID NO:3的全部或部分。在其他实施方案中，分离且纯化的核酸分子包含SEQ ID NO:4的全部或部分。在其他实施方案中，分离纯化的核酸分子包含SEQ ID NO:114的全部或部分。在其他实施方案中，分离纯化的核酸分子包含SEQ ID NO:115的全部或部分。在其他实施方案中，分离纯化的核酸分子包含SEQID NO:119、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的全部或部分。
一些实施方案涉及在其基因组中具有编码至少一种iRNA(例如，dsRNA)分子的至少一种重组DNA序列的重组宿主细胞(例如，植物细胞)。在特定的实施方案中，dsRNA分子可以在被鞘翅目和/或半翅目害虫摄取时产生，使鞘翅目和/或半翅目害虫中的靶基因发生转录后沉默或抑制其表达。重组DNA序列可以包含，例如，下述的任何一种或多种：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:119、SEQ IDNO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQID NO:128、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133中任一者的片段；或包含SEQ ID NO:1、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:131、或SEQID NO:133中一者或多者的基因的部分序列；或其互补物。
特定的实施方案涉及在其基因组中具有核酸DNA序列的重组宿主细胞，所述重组DNA序列编码包含SEQ ID NO:1、115、120、122、124、126、131、和/或133的全部或部分的至少一种iRNA(例如，dsRNA)分子。在被鞘翅目和/或半翅目害虫摄取时，iRNA分子可以使鞘翅目和/或半翅目害虫中包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的靶基因沉默或抑制其表达，由此导致鞘翅目和/或半翅目害虫中生长、发育、生殖、和/或进食的停止。
在一些实施方案中，在其基因组中具有编码至少一种dsRNA分子的至少一种重组核酸序列的重组宿主细胞可以是转化的植物细胞。一些实施方案涉及包含这样的转化的植物细胞的转基因植物。除了这样的转基因植物之外，还提供了任何转基因植物世代的后代植物、转基因种子、和转基因植物产品，它们均包含重组核酸序列。在特定的实施方案中，可以在转基因植物细胞中表达本发明的dsRNA分子。因此，在这些和其他实施方案中，可以从转基因植物细胞分离本发明的dsRNA分子。在特定的实施方案中，转基因植物是选自下组的植物，包括：玉米(玉蜀黍(Zea mays))、大豆(Glycine max)、和禾本科(Poaceae)的植物。
一些实施方案涉及用于调控鞘翅目和/或半翅目害虫细胞中靶基因表达的方法。在这些和其他实施方案中，可以提供核酸分子，其中所述核酸分子包含编码dsRNA分子的核苷酸序列。在特定的实施方案中，编码dsRNA分子的核苷酸序列可与启动子可操作连接，并且还可与转录终止序列可操作连接。在特定的实施方案中，用于调控鞘翅目和/或半翅目害虫细胞中靶基因表达的方法可包括：(a)用包含编码dsRNA分子的核苷酸序列的载体转化植物细胞；(b)在足以容许形成包含多个转化的植物细胞的植物细胞培养物的条件下培养所述转化的植物细胞；(c)选择已将载体整合到其基因组中的转化的植物细胞；和(d)确定选择的转化的植物细胞包含由载体的核苷酸序列编码的dsRNA分子。可以从基因组中整合有载体、且包含由载体的核苷酸序列编码的dsRNA分子的植物细胞再生植物。
因此，还公开了在其基因组中整合有载体的转基因植物，所述载体具有编码dsRNA分子的核苷酸序列，其中转基因植物包含由所述载体的核苷酸序列编码的dsRNA分子。在特定的实施方案中，植物中dsRNA分子的表达足以调控接触所述转化的植物或植物细胞(例如通过以转化的植物、植物的一部分(例如，根)或植物细胞为食)的鞘翅目和/或半翅目害虫细胞中靶基因的表达。本文中公开的转基因植物可以展现出对鞘翅目和/或半翅目害虫侵染的抗性和/或增强的耐受性。特定的转基因植物可以展现出对一种或多种选自下组的鞘翅目和/或半翅目害虫的抗性和/或增强的耐受性：WCR、NCR、SCR、MCR、玉米根萤叶甲、D.u.tenella、D.u.undecimpunctata Mannerheim、油菜花露尾甲、英雄美洲蝽、盖德拟壁蝽、茶翅蝽、稻绿蝽、拟绿蝽和褐臭蝽。
本文中还公开了用于将控制剂(如iRNA分子等)投送给鞘翅目和/或半翅目害虫的方法。这样的控制剂可以直接或间接地阻碍鞘翅目和/或半翅目害虫进食、生长或以其他方式致害宿主的能力。在一些实施方案中，抑制鞘翅目和/或半翅目害虫中靶基因表达的方法可以导致鞘翅目和/或半翅目害虫生长、发育、生殖和/或进食的停止。在一些实施方案中，所述方法最终可导致鞘翅目和/或半翅目害虫死亡。
在一些实施方案中，提供了包含本发明的iRNA(例如，dsRNA)分子的组合物(例如，局部用组合物)，供在植物、动物、和/或植物或动物的环境中使用以消除或降低鞘翅目和/或半翅目害虫的侵染。在特定的实施方案中，组合物可以是要喂给鞘翅目和/或半翅目害虫的营养组合物或食物来源。一些实施方案包括使鞘翅目和/或半翅目害虫可得到所述营养组合物或食物来源。包含iRNA分子的组合物的摄入可导致一个或多个鞘翅目和/或半翅目害虫细胞摄取所述分子，进而可导致鞘翅目和/或半翅目害虫细胞中至少一种靶基因表达的抑制。通过在鞘翅目和/或半翅目害虫的宿主中提供一种或多种包含本发明的iRNA分子的组合物，可以在任何存在鞘翅目和/或半翅目害虫的宿主组织或环境之中或之上限制或消除鞘翅目和/或半翅目害虫对植物或植物细胞的摄入或损伤。
本文中公开的组合物和方法可与用于控制鞘翅目和/或半翅目害虫所致损害的其他方法和组合物组合一起使用。例如，本文中所描述的用于针对鞘翅目和/或半翅目害虫保护植物的iRNA分子可以在这样的方法中使用，所述方法包括另外使用一种或多种针对鞘翅目和/或半翅目害虫有效的化学剂、针对鞘翅目和/或半翅目害虫有效的生物杀虫剂、作物轮作、或展现出与本发明的RNAi介导的方法和RNAi组合物的特征不同的特征(例如，在植物中重组产生对于鞘翅目和/或半翅目害虫有害的蛋白质(例如，Bt毒素))的重组遗传技术。
II.缩写
dsRNA 其中至少一部分核糖核酸为双链的核糖核酸
GI 生长抑制
NCBI 美国国家生物技术信息中心
gDNA 基因组DNA
iRNA 抑制性核糖核酸
ORF 开放阅读框
RNAi 核糖核酸干扰
miRNA 微小核糖核酸
siRNA 小干扰核糖核酸
shRNA 小发夹核糖核酸
hpRNA 含发夹的核糖核酸
UTR 非翻译区
WCR 西方玉米根虫(玉米根萤叶甲)
NCR 北方玉米根虫(巴氏根萤叶甲)
MCR 墨西哥玉米根虫(墨西哥玉米根萤叶甲)
PCR 聚合酶链式反应
RISC RNA诱导的沉默复合物
SCR 南方玉米根虫(十一星根萤叶甲)
BSB 新热带区布朗椿象(英雄美洲蝽)
PB 花粉甲虫(油菜花露尾甲)
III.术语
在以下描述和表中，使用了许多术语。为了提供对说明书和权利要求书的清楚且一致的理解，包括要赋予此类术语的范围，提供了以下定义：
鞘翅目害虫：如本文中使用的，术语“鞘翅目害虫”指以玉米和其它真正的禾本科为食的叶甲属昆虫。在具体的例子中，鞘翅目害虫选自下列清单，包括：玉米根萤叶甲(WCR)；巴氏根萤叶甲(NCR)；十一星根萤叶甲(SCR)；墨西哥玉米根萤叶甲(MCR)；黄瓜条根萤叶甲；D.u.tenella；D.u.undecimpunctata Mannerheim；和油菜花露尾甲。
半翅目害虫：如本文中使用的，术语“半翅目害虫”指蝽科昆虫，其以广泛的宿主植物为食并具有刺吸式口器。在特定的实例中，半翅目害虫选自下列清单，包括：英雄美洲蝽(新热带区布朗椿象)、稻绿蝽(南部绿色蝽)、盖德拟壁蝽(红带椿象)、茶翅蝽(棕翅蝽)、拟绿蝽(绿色蝽)、和褐臭蝽(褐蝽)。
(与生物)接触：如本文中使用的，与生物(例如，鞘翅目害虫和/或半翅目害虫)“接触”或被生物“摄取”等术语，就核酸分子而言，包括核酸分子内化到生物中，例如但不限于：生物摄取分子(例如，通过进食)；使生物与包含核酸分子的组合物接触；以及用包含核酸分子的溶液浸泡生物。
重叠群：如本文中使用的，术语“重叠群”指从源自单一遗传来源的一组重叠核酸区段重建的核酸序列。
玉米植物：如本文中使用的，术语“玉米植物”指物种玉蜀黍(玉米)的植物。
编码dsRNA：如本文中使用的，术语“编码dsRNA”包括这样的基因，其RNA转录产物能够形成分子内dsRNA结构(例如，发夹)或分子间dsRNA结构(例如，通过与靶RNA分子杂交)。
表达：如本文中使用的，序列(例如，基因或转基因)的“表达”是指这样的过程，通过该过程，核酸转录单元(包括，例如基因组DNA或cDNA)的编码信息被转化为细胞的操作部分、非操作部分、或结构部分(常常包括蛋白质的合成)。基因表达可能受到外部信号的影响，例如细胞、组织、或生物暴露于增加或降低基因表达的物质。基因表达也可以在从DNA到RNA再到蛋白质的途径中的任何位置受到调节。例如，通过控制对转录、翻译、RNA运输和加工、中间分子比如mRNA的降解的作用，或通过在特异性蛋白分子已经产生之后的活化、失活、区室化、或降解，或它们的组合，由此发生基因表达的调节。通过本领域已知的任何方法，包括但不限于，Northern(RNA)印迹、RT-PCR、Western(免疫)印迹，或体外、原位或体内蛋白活性测定，可以在RNA水平或蛋白质水平测量基因表达。
遗传物质：如本文中使用的，术语“遗传物质”包括所有基因和核酸分子，诸如DNA和RNA。
抑制：如本文中使用的，术语“抑制”在用于描述对编码序列(例如基因)的影响时是指从编码序列转录的mRNA和/或编码序列的肽、多肽、或蛋白质产物的细胞水平的可测量的降低。在一些实例中，抑制编码序列的表达可以使得表达大致消失。“特异性抑制”是指在实现特异性抑制的细胞中对靶编码序列的抑制不对其他编码序列(例如，基因)的表达产生影响。
分离的：“分离的”生物学组分(诸如核酸、肽或蛋白质)是已经从该组分所天然存在的生物细胞中的其他生物学组分(即，其他染色体和染色体外的DNA和RNA、和蛋白质)实质性分开、分开产生、或纯化出来。已经“分离的”核酸分子和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸分子和蛋白质。该术语还包括通过在宿主细胞内重组表达制备的核酸分子和蛋白质，以及化学合成的核酸分子、蛋白质和肽。
核酸分子：如本文中使用的，术语“核酸分子”可以是指核苷酸的聚合物形式，可包括RNA、cDNA、基因组DNA的有义和反义链，以及上述情形的合成形式和混合聚合物。核苷酸可以是指核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、或这两种类型核苷酸的任一者的修饰形式。如本文中使用的“核酸分子”与“核酸”和“多核苷酸”是同义词。除非另外指明，核酸分子通常在长度上具有至少10个碱基。根据惯例，核酸分子的核苷酸序列从分子的5’至3’端阅读。核苷酸序列的“互补物”是指与核苷酸序列的核碱基形成碱基对(即，A-T/U，和G-C)的核碱基的5’至3’序列。核酸序列的“反向互补物”指与核苷酸序列的核碱基形成碱基对的核碱基的3’至5’序列。
“核酸分子”包括DNA的单链和双链形式；RNA的单链形式；和RNA的双链形式(dsRNA)。术语“核苷酸序列”或“核酸序列”是指作为个别单链或在双链体中的核酸有义和反义链两者。术语“核糖核酸”(RNA)包括iRNA(抑制性RNA)、dsRNA(双链RNA)、siRNA(小干扰RNA)、shRNA(小发夹RNA)、mRNA(信使RNA)、miRNA(微小RNA)、hpRNA(发夹RNA)、tRNA(转运RNA)(无论是装载还是卸下相应的酰化氨基酸)、和cRNA(互补RNA)。术语“脱氧核糖核酸”(DNA)包括cDNA、基因组DNA、和DNA-RNA杂交体。术语“核酸区段”和“核苷酸序列区段”，或更一般而言的“区段”，本领域技术人员会理解它们是功能性的术语，其包括基因组序列、核糖体RNA序列、转运RNA序列、信使RNA序列、操纵子序列、和较小的工程化核苷酸序列，其编码或可适用于编码肽、多肽、或蛋白质。
寡核苷酸：寡核苷酸是短的核酸聚合物。寡核苷酸可通过切割较长核酸区段、或通过使单独的核苷酸前体聚合而形成。自动合成仪能够合成长度多达几百个碱基的寡核苷酸。由于寡核苷酸可与互补的核苷酸序列结合，因此它们可用作检测DNA或RNA的探针。由DNA(寡脱氧核糖核苷酸)组成的寡核苷酸可以用于PCR，PCR是一种用于扩增DNA和RNA(逆转录成cDNA)序列的技术。在PCR中，寡核苷酸一般被称为“引物”，其允许DNA聚合酶延伸寡核苷酸并复制互补链。
核酸分子可以包括天然存在的核苷酸和/或修饰核苷酸，它们通过天然存在和/或非天然存在的核苷酸连接而连接在一起。本领域技术人员易于理解，核酸分子可被化学修饰或生物化学修饰，或者可以含有非天然的或衍生化的核苷酸碱基。这些修饰包括，例如，标记物、甲基化、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰(例如，如不带电连接(uncharged linkage)的修饰：例如甲基膦酸盐、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等；带电连接(charged linkage)的修饰：例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等；悬垂部分的修饰：例如肽类；嵌入剂修饰：例如吖啶、补骨脂素等；螯合剂修饰；烷化剂(alkylator)修饰；和修饰的连接：例如α异头核酸等)。术语“核酸分子”还包括任何拓扑结构，包括单链的、双链的、部分双链体的、三链体的、发夹形的(hairpinned)、圆形的、挂锁形的结构。
如本文中使用的，就DNA而言，术语“编码序列”、“序列编码”、“结构核苷酸序列”、或“结构核酸分子”是指这样的核苷酸序列，当被置于适当的调节序列控制下时，其通过转录和mRNA最终翻译成多肽。就RNA而言，术语“编码序列”指翻译成肽、多肽或蛋白质的核苷酸序列。编码序列的边界由5’端的翻译起始密码子和3’端的翻译终止密码子所界定。编码序列包括但不限于：基因组DNA；cDNA；EST；和重组核苷酸序列。
基因组：如本文中所使用的，术语“基因组”是指存在于细胞核内的染色体DNA，并且也指存在于细胞的亚细胞组成部分内的细胞器DNA。在本发明的一些实施方案中，可以将DNA分子导入植物细胞中，使得DNA分子整合到植物细胞的基因组中。在这些和另外的实施方案中，DNA分子可以整合到植物细胞的核DNA中，或整合到植物细胞的叶绿体或线粒体的DNA中。术语“基因组”在其应用于细菌时，指细菌细胞内的染色体和质粒两者。在本发明的一些实施方案中，可以将DNA分子导入细菌中，使得DNA分子整合到细菌的基因组中。在这些和另外的实施方案中，DNA分子可以整合于染色体，或者作为稳定的质粒定位或位于稳定的质粒中。
序列同一性：如本文中使用的术语“序列同一性”或“同一性”，在两个核酸或多肽序列的情况下，是指在指定比较窗口上以最大对应性比对时，这两个序列中相同的残基。
如本文中使用的，术语“序列同一性百分比”可以是指通过在比较窗口上比较两个最优比对序列(例如，核酸序列或多肽序列)确定的值，其中为了实现这两个序列的最优比对，该比较窗口中的序列部分相比于参考序列(其不包含添加或缺失)可以包含添加或缺失(即，空位)。通过确定在两个序列中出现相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数目而产生匹配位置数，用该匹配位置数除以比较窗口中位置的总数，将结果乘以100而产生序列同一性的百分比，从而计算出该百分比。每个位置与参考序列相比均相同的序列被认为是与参考序列是100％相同的，反之亦然。
用于比较的序列比对方法是本领域技术人员熟知的。各种程序和比对算法例如描述于Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444；Higgins和Sharp(1988)Gene 73:237-244；Higgins和Sharp(1989)CABIOS 5:151-153；Corpet等人，(1988)Nucleic Acids Res.16:10881-10890；Huang等人，(1992)Comp.Appl.Biosci.8:155-165；Pearson等人，(1994)Methods Mol.Biol.24:307-331；Tatiana等人(1999)FEMS Microbiol.Lett.174:247-250。序列比对方法和同源性计算的详细考虑事项可见于例如，Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215:403-410。
美国国家生物技术信息中心(NCBI)基本局部比对搜索工具(BLASTTM；Altschul等人(1990))可在几个来源访问，包括美国国家生物技术信息中心(Bethesda,MD)、以及在互联网上，其与几种序列分析程序结合使用。怎样使用该程序确定序列同一性的描述可在互联网上BLAST的“帮助”部分获得。为了比较核酸序列，可以采用利用默认参数的默认BLOSUM62矩阵集的BLAST(Blastn)程序的“Blast 2序列”函数。在用这种方法评估时，与参考序列具有较大相似性的核酸序列将显示出同一性百分比的增加。
可特异性杂交/特异性互补：如本文中使用的，术语“可特异性杂交”和“特异性互补”是表明互补性的足够程度的术语，该互补性足以使得在核酸分子与靶核酸分子之间发生稳定且特异的结合。在两个核酸分子之间的杂交两种涉及核酸分子的核酸序列之间的反平行比对的形成。然后，两个分子能够与相反链上的相应碱基形成氢键以形成双链体分子，如果该双链体分子足够稳定，则可使用本领域中熟知的方法检出。核酸分子与其可特异性杂交的靶序列不一定是100％互补的。然而，对于特异性杂交必须存在的序列互补性量依赖所使用的杂交条件而变化。
导致特定严格程度的杂交条件会根据选择的杂交方法的性质和杂交的核酸序列的组成和长度而变化。通常，杂交的温度和杂交缓冲液的离子强度(尤其是Na+和/或Mg++浓度)将决定杂交严格性。洗涤缓冲液的离子强度和洗涤温度也影响严格性。关于获得特定严格性程度所需要的杂交条件的计算是本领域普通技术人员已知的，并且论述于例如Sambrook等人(编辑)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd ed.,vol.1-3,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989,chapters 9and 11,and updates；以及Hames和Higgins(编辑)Nucleic Acid Hybridization,IRL Press,Oxford,1985。关于核酸杂交的进一步详细说明和指导例如可见于Tijssen,"Overview ofprinciples of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays,"inLaboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- HybridizationwithNucleic Acid Probes,Part I,Chapter 2,Elsevier,NY,1993；以及Ausubel等人编辑，Current Protocols in Molecular Biology,Chapter 2,GreenePublishing and Wiley-Interscience,NY,1995,and updates。
如本文中使用的，“严格条件”涵盖仅在杂交分子与靶核酸分子内的同源序列之间存在大于80％序列匹配时才发生杂交的条件。“严格条件”包括另外的特定严格性水平。因此，如本文中使用的，“中等严格性”条件为具有80％以上序列匹配的分子将会杂交的条件(即，具有小于20％的错配)；“高严格性”条件为具有90％以上匹配的序列将会杂交的条件(即，具有小于10％的错配)；并且“极高严格性”条件为具有95％以上匹配的序列将会杂交的条件(即，具有小于5％的错配)。
以下是代表性的非限制性杂交条件：
高严格性条件(检测出共享至少90％序列同一性的序列)：在5X SSC缓冲液中在65℃杂交16小时；在2X SSC缓冲液中在室温下洗涤两次，每次15分钟；并且在0.5X SSC缓冲液中在65℃洗涤两次，每次20分钟。
中等严格性条件(检测出共享至少80％序列同一性的序列)：在5X到6X SSC缓冲液中在65--70℃杂交16-20小时；在2X SSC缓冲液中在室温下洗涤两次，每次5-20分钟；并且在1X SSC缓冲液中在55-70℃洗涤两次，每次30分钟。
非严格对照条件(共享至少50％序列同一性的序列会杂交)：在6X SSC缓冲液中在室温到55℃杂交16-20小时；在2X到3X SSC缓冲液中在室温到55℃洗涤至少两次，每次20-30分钟。
如本文中使用的，术语“基本上同源”或“实质性同源性”就连续核酸序列而言是指由这样的核酸分子产生的连续核苷酸序列，所述核酸分子在严格条件下与具有参考核酸序列的核酸分子杂交。例如，具有与SEQ ID NO:1的参考核酸序列基本上同源的序列的核酸分子是如下的那些核酸分子，所述核酸分子在严格条件(例如，所提出的中等严格性条件，见上文)下与具有SEQ ID NO:1的参考核酸序列的核酸分子杂交。基本上同源的序列可以具有至少80％序列同一性。例如，基本上同源的序列可以具有约80％到100％序列同一性，诸如约81％；约82％；约83％；约84％；约85％；约86％；约87％；约88％；约89％；约90％；约91％；约92％；约93％；约94％；约95％；约96％；约97％；约98％；约98.5％；约99％；约99.5％；和约100％。实质性同源性的特性与特异性杂交紧密相关。例如，当存在足够的互补程度时，核酸分子可特异性地杂交，以便避免核酸在特异性结合是期望的情况下(例如，在严格杂交条件下)与非靶序列的非特异性结合。
如本文中使用的，术语“直系同源物”是指两种或更多种物种中已经从共同的祖先核苷酸序列进化并且可以在所述两种或更多种物种中保留相同功能的基因。
如本文中使用的，当以5’至3’方向阅读的序列的每个核苷酸与当以3’至5’方向阅读时的另一序列的每个核苷酸序列互补时，两个核酸序列分子被认为展现出“完全互补性”。与参考核苷酸序列互补的核苷酸序列将展现出与参考核苷酸序列的反向互补序列相同的序列。这些术语和描述是本领域中定义明确的，并且是本领域普通技术人员容易理解的。
可操作连接：当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能性关系中时，则第一核酸序列与第二核酸序列是可操作连接的。当以重组方式产生时，可操作连接的核酸序列通常是毗连的，并且在必要时可以将两个蛋白质编码区连接在同一个阅读框内(例如，在翻译融合的ORF中)。然而，可操作连接的核酸不一定是毗连的。
在有关调节序列和编码序列的情况下使用时，术语“可操作连接”意味着该调节序列影响该连接的编码序列的表达。“调节序列”或“控制元件”是指影响转录的周期和水平/量、RNA加工或稳定性、或相关编码序列的翻译的核苷酸序列。调节序列可以包括启动子；翻译前导序列；内含子；增强子；茎环结构；阻抑物结合序列；终止序列；和多腺苷酸化识别序列等。特定的调节序列可位于与其可操作连接的编码序列的上游和/或下游。并且，与编码序列可操作连接的特定调节序列可位于双链核酸分子的相关互补链上。
启动子：如本文中使用的，术语“启动子”是指可以在转录起始上游的、且可能涉及RNA聚合酶与其他蛋白质的识别和结合而启动转录的DNA区域。启动子可与用于在细胞中表达的编码序列可操作连接，或者启动子可与编码信号序列的核苷酸序列可操作连接，所述核苷酸序列可与用于在细胞中表达的编码序列可操作连接。“植物启动子”可以是能够启动植物细胞转录的启动子。在发育控制下的启动子的实例包括优先启动某些组织中的转录的启动子，所述组织例如叶、根、种子、纤维、木质部导管、管胞、或厚壁组织。这样的启动子称为“组织优先”启动子。仅启动某些组织中的转录的启动子被称为“组织特异性”启动子。“细胞类型特异性”启动子主要驱动一个或多个器官中某些细胞类型(例如，根或叶中的维管细胞)中的表达。“诱导型”启动子可以是可以在环境控制之下的启动子。可通过诱导型启动子启动转录的环境条件的实例包括厌氧条件和光的存在。组织特异性启动子、组织优先启动子、细胞类型特异性启动子、和诱导型启动子构成“非组成型”启动子类别。“组成型”启动子是可在大多数环境条件下或在大多数组织或细胞类型中有活性的启动子。
在本发明的一些实施方案中可以使用任何诱导型启动子。参见Ward等人，(1993)Plant Mol.Biol.22:361-366。利用诱导型启动子，转录速率响应于诱导剂而增加。诱导型启动子的实例包括但不限于：来自响应于铜的ACEI***的启动子；响应于苯磺酰胺除草剂安全剂的来自玉米的In2基因启动子；来自Tn10的Tet阻抑物；和来自类固醇激素基因的诱导型启动子，其转录活性可通过糖皮质激素诱导(Schena等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:10421-10425)。
示例性的组成型启动子包括，但不限于：来自植物病毒的启动子，例如来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子；来自水稻肌动蛋白基因的启动子；泛素启动子；pEMU；MAS；玉米H3组蛋白启动子；和ALS启动子，欧洲油菜ALS3结构基因5'的Xba1/NcoI片段(或与所述Xba1/NcoI片段相似的核苷酸序列)(美国专利No.5,659,026)。
另外，在本发明的一些实施方案中可以利用任何组织特异性或组织优先启动子。用包含与组织特异性启动子可操作连接的编码序列的核酸分子转化的植物可唯一地或优先地在特异性组织中产生所述编码序列的产物。示例性的组织特异性或组织优先启动子包括但不限于：种子特异性启动子，如来自菜豆蛋白基因的启动子；叶特异性和光诱导型启动子，如来自cab或rubisco的启动子；花药特异性启动子，如来自LAT52的启动子；花粉特异性启动子，如来自Zm13的启动子；以及小孢子优先启动子，如来自apg的启动子。
大豆植物：如本文中使用的，术语“大豆植物”是指物种大豆属的植物，包括大豆(Glycine max)。
转化：如本文中使用的，术语“转化”或“转导”是指将一个或多个核酸分子转移到细胞中。当核酸分子通过核酸分子并入细胞基因组中、或通过附加型复制而由该细胞稳定复制时，细胞被转导到该细胞中的核酸分子“转化”。如本文中使用的，术语“转化”涵盖可将核酸分子导入这种细胞中的所有技术。实例包括但不限于：用病毒载体转染；用质粒载体转化；电穿孔(Fromm等人，(1986)Nature 319:791-793)；脂质体转染(Felgner等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413-7417)；显微注射(Mueller等人，(1978)Cell 15:579-585)；土壤杆菌介导的转移(Fraley等人，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4803-4807)；直接DNA摄取；和微粒轰击(Klein等人，(1987)Nature 327:70)。
转基因：外源核酸序列。在一些实例中，转基因可以是编码dsRNA分子的一条或两条链的序列，所述dsRNA分子包含与存在于鞘翅目和/或半翅目害虫中的核酸分子互补的核苷酸序列。在另外的实例中，转基因为反义核酸序列，其中所述反义核酸序列的表达抑制靶核酸序列的表达。在又另外的实例中，转基因可以是基因序列(例如，除草剂抗性基因)、编码工业或药学上有用的化合物的基因、或编码期望的农业性状的基因。在这些和其他实例子中，转基因可以含有与转基因的编码序列可操作连接的调节序列(例如，启动子)。
载体：引入到细胞中，例如产生转化的细胞的核酸分子。载体可以包含允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，诸如复制起点。载体的实例包括但不限于：质粒；粘粒；噬菌体；和携带外源DNA进入细胞中的病毒。载体还可以是RNA分子。载体还可包括一种或多种基因、反义序列、和/或选择标志物基因和本领域已知的其他遗传元件。载体可以转导、转化或感染细胞，由此引起细胞表达核酸分子和/或由该载体编码的蛋白质。任选地，载体包括辅助核酸分子实现进入细胞中的物质(例如脂质体、蛋白质包衣等)。
产量：相对于在相同生长位置在相同时间且在相同条件下生长的检验品种的产量，约100％或更大的稳定化产量。在特定的实施方案中，“提高的产量”或“提高产量”意指相对于在含有相当大密度的对该作物有害的鞘翅目和/或半翅目害虫的相同生长位置在相同时间且在相同条件下生长的检验品种的产量，具有105％至115％或更大的稳定化产量的栽培种。
除非特别指明或暗示，如本文中使用的术语“一个”、“一种”和“该”表示“至少一个/种”。
除非另外特别地解释，本文中使用的全部技术术语和科学术语具有与属于本公开的领域之内的普通技术人员通常所理解的相同的含义。可以在以下出版物中找到分子生物学中常见术语的定义：例如，Lewin’s Genes X,Jones&Bartlett Publishers,2009(ISBN100763766321)；Krebs等人(编辑)，The Encyclopedia of Molecular Biology,BlackwellScience Ltd.,1994(ISBN0-632-02182-9)；和Meyers R.A.(编辑)，Molecular Biology and Biotechnology:A Comprehensive Desk Reference,VCH Publishers,Inc.,1995(ISBN1-56081-569-8)。除非另有说明，所有百分比均以重量计，所有溶剂混合物比例以体积计。所有温度以摄氏度计。
IV.包含鞘翅目和/或半翅目害虫序列的核酸分子
A.概述
本文中描述了可用于控制鞘翅目和/或半翅目害虫的核酸分子。描述的核酸分子包括靶序列(例如，天然基因、和非编码序列)、dsRNA、siRNA、shRNA、hpRNA、和miRNA。例如，在一些实施方案中描述了dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA和/或hpRNA分子，其可与鞘翅目和/或半翅目害虫中的一种或多种天然核酸序列的全部或部分特异性地互补。在这些和另外的实施方案中，天然核酸序列可以是一种或多种靶基因，其产物可以例如但不限于：涉及代谢过程；涉及生殖过程；或者涉及幼虫发育。本文中描述的核酸分子在导入包含至少一种与该核酸分子特异性互补的天然核酸序列的细胞中时，可以在细胞中启动RNAi，随后降低或消除该天然核酸序列的表达。在一些实例中，借助于包含与靶基因特异性互补的序列的核酸分子，靶基因表达的表达的降低或消除在鞘翅目和/或半翅目害虫中可以是致命的，或导致生长和/或生殖降低。
在一些实施方案中，可以选择鞘翅目和/或半翅目害虫中的至少一种靶基因，其中靶基因包含具有rop(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133)的核苷酸序列。在特定的实例中，选择了鞘翅目和/或半翅目害虫中的靶基因，其中靶基因包含具有rop(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ IDNO:131、或SEQ ID NO:133)的新颖核苷酸序列。
在一些实施方案中，靶基因可以是包含编码多肽的核苷酸序列的核酸分子，所述多肽包含与rop(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ IDNO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133)的蛋白质产物的氨基酸序列至少85％相同(例如，约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约100％、或100％相同)的连续氨基酸序列。靶基因可以是鞘翅目和/或半翅目害虫中任何这样的核酸序列，对该序列的转录后抑制会对鞘翅目和/或半翅目害虫造成有害影响，或为植物提供针对鞘翅目和/或半翅目害虫的保护益处。在具体的实例中，靶基因是包含编码多肽的核苷酸序列的核酸分子，所述多肽包含与新的核苷酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的蛋白质产物的氨基酸序列至少85％相同、约90％相同、约95％相同、约96％相同、约97％相同、约98％相同、约99％相同、约100％相同、或100％相同的连续氨基酸序列。
依照本发明提供了核苷酸序列，其表达生成包含核苷酸序列的RNA分子，所述核苷酸序列与由鞘翅目和/或半翅目害虫中的编码序列编码的天然RNA分子的全部或部分特异性地互补。在一些实施方案中，在鞘翅目和/或半翅目害虫摄入表达的RNA分子后，可以获得鞘翅目和/或半翅目害虫细胞中编码序列的下调。在特定的实施方案中，鞘翅目和/或半翅目害虫细胞中编码序列的下调可以对鞘翅目和/或半翅目害虫的生长、生存力、增殖、和/或生殖产生有害影响。
在一些实施方案中，靶序列包括转录的非编码RNA序列，诸如5’UTR；3’UTR；剪接前导序列；内含子序列；末端内含子(outron)序列(例如，随后在反式剪接中修饰的5'UTRRNA)；donatron序列(例如，提供反式剪接的供体序列需要的非编码RNA)；和鞘翅目和/或半翅目害虫靶基因的其他非编码转录RNA。这样的序列可以衍生自单顺反子和多顺反子基因两者。
因此，本文中结合一些实施方案还描述了包含至少一种核苷酸序列的iRNA分子(例如，dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA和hpRNA)，所述核苷酸序列与鞘翅目和/或半翅目害虫中的靶序列的全部或部分特异性地互补。在一些实施方案中，iRNA分子可以包含与多个靶序列，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多个靶序列的全部或部分互补的核苷酸序列。在特定的实施方案中，iRNA分子可以在体外产生，或通过遗传修饰的生物(如植物或细菌)在体内产生。还公开了cDNA序列，其可以用于产生与鞘翅目和/或半翅目害虫中的靶序列的全部或部分特异性地互补的dsRNA分子、siRNA分子、shRNA分子、miRNA分子、和/或hpRNA分子。进一步描述了在实现特定宿主靶标的稳定转化中使用的重组DNA构建体。转化的宿主靶标可以从重组DNA构建体表达有效水平的dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、和/或hpRNA分子。因此，还描述了植物转化载体，其包含与在植物细胞中功能性的异源启动子可操作连接的至少一个核苷酸序列，其中核苷酸序列的表达生成包含与鞘翅目和/或半翅目害虫中的靶序列的全部或部分特异性地互补的核苷酸序列的RNA分子。
在一些实施方案中，可用于控制鞘翅目和/或半翅目害虫的核酸分子可以包括：包含rop(例如，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133)的从叶甲属、菜花露尾甲属、或半翅目生物分离的天然核酸序列的全部或部分；在表达时生成这样的RNA分子的核苷酸序列，所述RNA分子包含与由rop(例如，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:120、SEQ IDNO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133)编码的天然RNA分子的全部或部分特异性地互补的核苷酸序列；iRNA分子(例如，dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA和hpRNA)，所述iRNA分子包含与rop编码序列(例如，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQID NO:133)的全部或部分特异性地互补的至少一个核苷酸序列；可用于产生dsRNA分子、siRNA分子、miRNA和/或hpRNA分子的cDNA序列，所述分子与rop(例如，SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:115、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133)的pre-mRNA或mRNA的全部或部分特异性地互补；以及用于在实现特定宿主靶标的稳定转化中使用的重组DNA构建体，其中转化的宿主靶标包含前述核酸分子的一种或多种。
B.核酸分子
本发明提供了，除其他事项外，抑制鞘翅目和/或半翅目害虫的细胞、组织、或器官中的靶基因表达的iRNA(例如，dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA和hpRNA)分子；和能够在细胞或微生物中表达为iRNA分子以抑制鞘翅目和/或半翅目害虫的细胞、组织、或器官中的靶基因表达的DNA分子。
本发明的一些实施方案提供了分离的核酸分子，其包含至少一个(例如，一个、两个、三个、或更多个)选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ IDNO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的互补物；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:115、SEQ IDNO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:120、SEQ IDNO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；包含SEQ ID NO:1的叶甲属生物(例如，WCR)的天然编码序列；包含SEQ ID NO:115的半翅目生物的天然编码序列；包含SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的菜花露尾甲属生物的天然编码序列；包含SEQ ID NO:1的叶甲属生物的天然编码序列的互补物；包含SEQ ID NO:115的半翅目生物的天然编码序列的互补物；包含SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的菜花露尾甲属生物的天然编码序列的互补物；转录成包含SEQ ID NO:1的天然RNA分子的叶甲属生物的天然非编码序列；包含SEQ ID NO:1的分子；转录成包含SEQ ID NO:115的天然RNA分子的半翅目生物的天然非编码序列；转录成包含SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的天然RNA分子的菜花露尾甲属生物的天然非编码序列；转录成包含SEQ ID NO:1的天然RNA分子的叶甲属生物的天然非编码序列的互补物；转录成包含SEQ ID NO:115的天然RNA分子的半翅目生物的天然非编码序列的互补物；转录成包含SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQID NO:133的天然RNA分子的菜花露尾甲属生物的天然非编码序列的互补物；包含SEQ IDNO:1的叶甲属生物的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；包含SEQ ID NO:115的半翅目生物的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；包含SEQ ID NO:120、SEQ IDNO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的菜花露尾甲属生物的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；包含SEQ ID NO:1的叶甲属生物的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；包含SEQ ID NO:115的半翅目生物的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；包含SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的菜花露尾甲属生物的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；转录成包含SEQ ID NO:1的天然RNA分子的叶甲属生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；转录成包含SEQID NO:115的天然RNA分子的半翅目生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；转录成包含SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的天然RNA分子的菜花露尾甲属生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；转录成包含SEQ ID NO:1的天然RNA分子的叶甲属生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；转录成包含SEQ ID NO:115的天然RNA分子的半翅目生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；转录成包含SEQ IDNO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的天然RNA分子的菜花露尾甲属生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补物。在特定的实施方案中，分离的核酸序列与鞘翅目和/或半翅目害虫的接触或被其摄取可抑制鞘翅目和/或半翅目害虫的生长、发育、生殖和/或进食。
在一些实施方案中，本发明的核酸分子可以包含至少一个(例如，一个、两个、三个、或更多个)DNA序列，其能够在细胞或微生物中表达为iRNA分子以抑制鞘翅目和/或半翅目害虫的细胞、组织、或器官中的靶基因表达。这样的DNA序列可以与在包含该DNA分子的细胞中具备功能的启动子序列可操作连接，以启动或增强编码的能够形成dsRNA分子的RNA的转录。在一个实施方案中，至少一个(例如，一个、两个、三个、或更多个)DNA序列可衍生自包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ IDNO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的核苷酸序列。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQID NO:133的衍生物包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的片段。在一些实施方案中，这样的片段可包含例如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的至少约15个连续核苷酸、或其互补物。因此，这样的片段可包含，例如，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:115、SEQ IDNO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200个或更多个连续核苷酸，或其互补物。在这些和另外的实施方案中，这样的片段可包含例如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的超过约15个连续核苷酸，或其互补物。因此，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的片段可包含，例如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的15、16、17、18、19、20、21、约25(例如，22、23、24、25、26、27、28、和29)、约30、约40(例如，35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、和45)、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190、约200个或更多个连续核苷酸，或其互补物。
一些实施方案包括将部分或完全稳定化的dsRNA分子导入鞘翅目和/或半翅目害虫中以抑制鞘翅目和/或半翅目害虫的细胞、组织或器官中靶基因的表达。当表达为iRNA分子(例如，dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、和hpRNA)并被鞘翅目和/或半翅目害虫摄取时，包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ IDNO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的一个或多个片段的核酸序列可以引起下列一项或多项：鞘翅目和/或半翅目害虫的死亡、生长抑制、性别比变化、产卵量(brood size)减少、感染停止、和/或进食停止。例如，在一些实施方案中，提供了dsRNA分子，其包含含有与鞘翅目和/或半翅目害虫靶基因序列基本上同源的约15到约300或约19到约25个核苷酸的核苷酸序列，且包含含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的核苷酸序列的一个或多个片段。这样的dsRNA分子的表达可以例如导致摄取dsRNA分子的鞘翅目和/或半翅目害虫的死亡和/或生长抑制。
在某些实施方案中，本发明提供的dsRNA分子包含与包含SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:115、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的靶基因互补的核苷酸序列和/或与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:115、SEQID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ IDNO:133的片段互补的核苷酸序列，在鞘翅目和/或半翅目害虫中抑制所述靶基因导致对于鞘翅目和/或半翅目害虫的生长、发育、或其他生物学功能必需的蛋白质或核苷酸序列物质的减少或消除。选择的核苷酸序列可以与下列各项展现出约80％到约100％序列同一性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ IDNO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133；在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133中所示的核苷酸序列的连续片段；或前述项任一者的互补物。例如，选定的核苷酸序列可以与下列各项展现出约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约98.5％、约99％、约99.5％、或约100％的序列同一性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133；在SEQID NO:1、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133中所示的核苷酸序列的连续片段；或前述项任一者的互补物。
在一些实施方案中，能够在细胞或微生物中表达为iRNA分子以抑制靶基因表达的DNA分子可以包含与存在于一个或多个鞘翅目和/或半翅目害虫物种中的天然核酸序列的全部或部分特异性地互补的单个核苷酸序列，或者DNA分子可以是从多个这样的特异性互补序列构建而成的嵌合体。
在一些实施方案中，核酸分子可以包含以“间隔物序列”分开的第一和第二核苷酸序列。间隔物序列可以是任何包含促进第一和第二核苷酸序列之间的二级结构形成(在期望的情况下)的核苷酸序列的区域。在一个实施方案中，间隔物序列是mRNA的有义或反义编码序列的一部分。或者，间隔物序列可以包含能够与核酸分子可操作连接的核苷酸或其同源物的任何组合。
例如，在一些实施方案中，DNA分子可以包含编码一种或多种不同RNA分子的核苷酸序列，其中每种不同RNA分子分别包含第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，其中第一和第二核苷酸序列彼此互补。第一和第二核苷酸序列在RNA分子内可以通过间隔物序列连接。间隔物序列可以构成第一核苷酸序列或第二核苷酸序列的一部分。包含第一和第二核苷酸序列的RNA分子的表达可以通过第一和第二核苷酸序列的特异性碱基配对而导致本发明的dsRNA分子的形成。第一核苷酸序列或第二核苷酸序列可以与对于鞘翅目和/或半翅目害虫而言天然的核酸序列(例如，靶基因、或转录的非编码序列)、其衍生物、或其互补序列基本上相同。
dsRNA核酸分子包含聚合核糖核苷酸序列的双链，并且可以包含对磷酸-糖主链或核苷的修饰。可以适宜调整RNA结构的修饰以使得特异性抑制能够发生。在一个实施方案中，可以通过普遍存在的酶促过程来修饰dsRNA分子，以便能够生成siRNA分子。此酶促过程可以利用体外或体内的RNA酶III酶，如真核生物中的切丁酶。参见Elbashir等人，(2001)Nature 411:494-498；以及Hamilton和Baulcombe(1999)Science 286(5441):950-952。切丁酶或功能等效的RNA酶III酶将较大的dsRNA链和/或hpRNA分子切割成较小的寡核苷酸(例如，siRNA)，每个所述寡核苷酸长度一般为约19-25个核苷酸。由这些酶生成的siRNA分子具有2到3个核苷酸3’突出物、和5’磷酸和3’羟基末端。由RNA酶III酶生成的siRNA分子在细胞中解旋，并分成单链RNA。然后，siRNA分子与从靶基因转录的RNA序列特异性地杂交，并且这两种RNA分子随后通过固有的细胞RNA降解机制而被降解。这个过程可以导致由靶生物中的靶基因编码的RNA序列的有效降解或消除。结果导致靶向基因的转录后沉默。在一些实施方案中，通过内源RNA酶III酶从异源核酸分子产生的siRNA分子可以有效介导鞘翅目和/或半翅目害虫中靶基因的下调。
在一些实施方案中，本发明的核酸分子可以包括至少一种可被转录成单链RNA分子的非天然存在的核苷酸序列，所述单链RNA分子能够在体内通过分子间杂交形成dsRNA分子。这样的dsRNA序列常常进行自组装，并且可以在鞘翅目和/或半翅目害虫的营养来源中提供，以实现靶基因的转录后抑制。在这些和另外的实施方案中，本发明的核酸分子可以包含两种不同的非天然存在的核苷酸序列，其中每种序列与鞘翅目和/或半翅目害虫中的不同靶基因特异性地互补。当向鞘翅目和/或半翅目害虫以dsRNA分子的形式提供这样的核酸分子时，dsRNA分子抑制鞘翅目和/或半翅目害虫中至少两种不同靶基因的表达。
C.获得核酸分子
可以使用鞘翅目和/或半翅目害虫中的多种天然序列作为靶序列来设计本发明的核酸分子，如iRNA和编码iRNA的DNA分子。然而，天然序列的选择并非是直截了当的过程。鞘翅目和/或半翅目害虫的天然序列中仅有少数会是有效的靶标。例如，无法肯定地预测特定的天然序列是否可以被本发明的核酸分子有效下调，或者特定的天然序列的下调是否会对鞘翅目和/或半翅目害虫的生长、生存力、增殖和/或生殖具有有害影响。绝大多数的鞘翅目和/或半翅目害虫天然序列，如自其分离的EST(例如，如美国专利7,612,194和美国专利7,943,819中所列出的)，对鞘翅目和/或半翅目害虫，如WCR、NCR、油菜花露尾甲、英雄美洲蝽、稻绿蝽、盖德拟壁蝽、茶翅蝽、拟绿蝽、和褐臭蝽的生长、生存力、增殖和/或生殖没有有害影响。
同样无法预测，在可以对鞘翅目和/或半翅目害虫具有有害影响的天然序列中，哪些能够在重组技术中使用，从而在宿主植物中表达与这样的天然序列互补的核酸分子，并且在进食后对鞘翅目和/或半翅目害虫造成有害影响，同时不对宿主植物引起损害。
在一些实施方案中，本发明的核酸分子(例如，要在鞘翅目和/或半翅目害虫的宿主植物中提供的dsRNA分子)被选择为靶向这样的cDNA序列，其编码对于鞘翅目和/或半翅目害虫存活必需的蛋白质或蛋白质部分(如涉及代谢或分解代谢生物化学途径、细胞***、生殖、能量代谢、消化、宿主植物识别等的氨基酸序列)。如本文中描述的，靶生物摄入含有一种或多种dsRNA——所述dsRNA的至少一个区段与靶害虫生物细胞中产生的RNA的至少一个基本上相同的区段特异地互补——的组合物，可以导致靶生物的死亡或其他抑制。可以使用从鞘翅目和/或半翅目害虫衍生的核苷酸序列(DNA或RNA)来构建对鞘翅目和/或半翅目害虫侵染有抗性的植物细胞。例如，可以转化鞘翅目和/或半翅目害虫的宿主植物(例如，玉蜀黍或大豆)，使其含有从鞘翅目和/或半翅目害虫衍生的如本文中提供的一种或多种核苷酸序列。转化到宿主中的核苷酸序列可以编码一种或多种RNA，其在转化的宿主内的细胞或生物学流体中形成dsRNA序列，因此，如果/当鞘翅目和/或半翅目害虫与转基因宿主形成营养关系时，使得dsRNA可用。这可以导致鞘翅目和/或半翅目害虫细胞中一种或多种基因表达的阻抑，最终导致死亡或其生长或发育的抑制。
因此，在一些实施方案中，靶向实质参与鞘翅目和/或半翅目害虫的生长、发育和生殖的基因。本发明中使用的其他靶基因可以包括例如那些在鞘翅目和/或半翅目害虫的生存力、运动、迁移、生长、发育、感染性、进食位置的建立和生殖中发挥重要作用的靶基因。因此，靶基因可以是管家基因或转录因子。另外，本发明中使用的天然鞘翅目和/或半翅目害虫核苷酸序列也可以从植物、病毒、细菌或昆虫基因的同源物(例如，直系同源物)衍生，所述同源物的功能对于本领域技术人员是已知的，且其核苷酸序列与鞘翅目和/或半翅目害虫的基因组中的靶基因可特异性地杂交。通过杂交鉴定已知核苷酸序列的基因同源物的方法是本领域技术人员已知的。
在一些实施方案中，本发明提供了用于获得包含用于产生iRNA(例如，dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、和hpRNA)分子的核苷酸序列的核酸分子的方法。一种这样的实施方案包括：(a)对一种或多种靶基因分析其在鞘翅目和/或半翅目害虫中在dsRNA介导的基因阻抑后的表达、功能和表型；(b)用探针探查cDNA或gDNA文库，所述探针包含来自靶向的鞘翅目和/或半翅目害虫的核苷酸序列的全部或部分或其同源物，所述靶向的鞘翅目和/或半翅目害虫在dsRNA介导的阻抑分析中展现出改变的(例如，降低的)生长或发育表型；(c)鉴定与探针特异性杂交的DNA克隆；(d)分离步骤(b)中鉴定的DNA克隆；(e)对包含步骤(d)中分离的克隆的cDNA或gDNA片段测序，其中测序的核酸分子包含RNA序列的全部或大部分或其同源物；和(f)化学合成基因序列的全部或大部分、或siRNA、或shRNA、或miRNA或hpRNA或mRNA或dsRNA。
在另外的实施方案中，用于获得包含用于产生大部分的iRNA(例如，dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、和hpRNA)分子的核苷酸序列的核酸片段的方法包括：(a)合成第一和第二寡核苷酸引物，其与来自靶向的鞘翅目和/或半翅目害虫的天然核苷酸序列的一部分特异性地互补；和(b)使用步骤(a)的第一和第二寡核苷酸引物扩增克隆载体中存在的cDNA或gDNA***物，其中扩增的核酸分子包含siRNA或miRNA或shRNA或hpRNA或mRNA或dsRNA分子的大部分。
本发明的核酸可以通过多种途径分离、扩增、或产生。例如，可以通过PCR扩增从gDNA或cDNA文库衍生的靶核酸序列(例如，靶基因或靶转录的非编码序列)、或其部分而获得iRNA(例如，dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、和hpRNA)分子。可以从靶生物提取DNA或RNA，并且可以使用本领域普通技术人员已知的方法从其制备核酸文库。可使用自靶生物生成的gDNA或cDNA文库进行靶基因的PCR扩增和测序。可以使用确认的PCR产物作为体外转录的模板以在最低限度的启动子的情况下生成有义和反义RNA。或者，可以使用标准化学，如亚磷酰胺化学，通过许多技术(参见，例如Ozaki等人，(1992)Nucleic Acids Research,20:5205-5214；和Agrawal等人，(1990)Nucleic Acids Research,18:5419-5423)，包括使用自动化DNA合成仪(例如，P.E.Biosystems,Inc.(Foster City,Calif.)392或394型DNA/RNA合成仪)的任一者来合成核酸分子。参见，例如，Beaucage等人，(1992)Tetrahedron,48:2223-2311；美国专利4,415,732、4,458,066、4,725,677、4,973,679、和4,980,460。也可以采用备选化学，其生成非天然主链基团，如硫代磷酸酯、氨基磷酸酯，等等。
本发明的RNA、dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、或hpRNA分子可以由本领域技术人员可以通过手动或自动反应以化学或酶促方式产生，或者在包含含有编码RNA、dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、或hpRNA分子的序列的核酸分子的细胞中体内产生。还可以通过部分或完全有机合成产生RNA，可以通过体外酶促或有机合成引入任何经修饰的核糖核苷酸。可以通过细胞RNA聚合酶或噬菌体RNA聚合酶(例如，T3RNA聚合酶、T7RNA聚合酶、和SP6RNA聚合酶)合成RNA分子。可用于克隆和表达核苷酸序列的表达构建体是本领域中已知的。参见，例如，美国专利5,593,874、5,693,512、5,698,425、5,712,135、5,789,214、和5,804,693。可以在导入细胞中之前纯化化学合成或通过体外酶促合成合成的RNA分子。例如，可以通过用溶剂或树脂提取、沉淀、电泳、色谱法、或其组合从混合物纯化RNA分子。或者，可以在不纯化或最小程度纯化的情况下使用化学合成或通过体外酶促合成而合成的RNA分子，例如，以避免由于样品加工所致的损失。可以将RNA分子干燥贮存或溶解在水溶液中。溶液可以含有缓冲剂或盐以促进dsRNA分子双链体链的退火和/或稳定化。
在某些实施方案中，可以通过单一自身互补的RNA链或者从两条互补RNA链形成dsRNA分子。dsRNA分子可以在体内或在体外合成。细胞的内源RNA聚合酶可以在体内介导一条或两条RNA链的转录，或者可以使用克隆的RNA聚合酶在体内或在体外介导转录。通过宿主器官、组织、或细胞类型中的特异性转录(例如，通过使用组织特异性启动子进行)；刺激宿主中的环境条件(例如，通过使用响应于感染、胁迫、温度、和/或化学诱导物的诱导型启动子)；和/或在宿主的某个发育阶段或年龄人工造成转录(例如，通过使用发育阶段特异性启动子)，在鞘翅目和/或半翅目害虫中靶基因的转录后抑制可以是宿主靶向的。形成dsRNA分子的RNA链(不论是体外还是体内转录的)可以也可以不是多聚腺苷酸化的，并且可以能够也可以不能被细胞翻译机制翻译成多肽。
D.重组载体和宿主细胞转化
在一些实施方案中，本发明还提供了用于导入细胞(例如，细菌细胞、酵母细胞、或植物细胞)中的DNA分子，其中DNA分子包含这样的核苷酸序列，该核苷酸序列在表达为RNA并被鞘翅目和/或半翅目害虫摄取后，可实现对鞘翅目和/或半翅目害虫的细胞、组织或器官中靶基因的阻抑。因此，一些实施方案提供了重组核酸分子，其包含能够在植物细胞中表达为iRNA(例如，dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、和hpRNA)分子以抑制鞘翅目和/或半翅目害虫中靶基因表达的核酸序列。为了启动或增强表达，这样的重组核酸分子可以包含一种或多种调节序列，所述调节序列可以与能够表达为iRNA的核酸序列可操作连接。在植物中表达基因阻抑分子的方法是已知的，并且可以用于表达本发明的核苷酸序列。参见，例如，国际PCT公开号WO06/073727；和美国专利公开号2006/0200878Al)。
在具体的实施方案中，本发明的重组DNA分子可以包含编码dsRNA分子的核酸序列。这样的重组DNA分子可以编码这样的dsRNA分子，它们在被摄取后能够抑制鞘翅目和/或半翅目害虫细胞中内源靶基因的表达。在许多实施方案中，转录的RNA可以形成dsRNA分子，所述dsRNA分子可以以稳定化形式提供；例如，以发夹和茎和环结构的形式提供。
在这些和另外的实施方案中，dsRNA分子的一条链可以通过从与选自下组的核苷酸序列基本上同源的核苷酸序列转录而形成：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:1的互补物；SEQ IDNO:1的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:1的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；包含SEQ ID NO:1的叶甲属生物(例如，WCR)的天然编码序列；包含SEQ ID NO:1的叶甲属生物的天然编码序列的互补物；转录成包含SEQ ID NO:1的天然RNA分子的叶甲属生物的天然非编码序列；转录成包含SEQ ID NO:1的天然RNA分子的叶甲属生物的天然非编码序列的互补物；包含SEQ ID NO:1的叶甲属生物(例如，WCR)的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；包含SEQ ID NO:1的叶甲属生物的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；转录成包含SEQ ID NO:1的天然RNA分子的叶甲属生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；和转录成包含SEQ ID NO:1的天然RNA分子的叶甲属生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补物。
在其他实施方案中，dsRNA分子的一条链可以通过从与选自下组的核苷酸序列基本上同源的核苷酸序列转录而形成：SEQ ID NO:115；SEQ ID NO:115的互补物；SEQ ID NO:115的至少19个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:115的至少19个连续核苷酸的片段的互补物；包含SEQ ID NO:115的半翅目生物的天然编码序列；包含SEQ ID NO:115的半翅目生物的天然编码序列的互补物；转录成包含SEQ ID NO:115的天然RNA分子的半翅目生物的天然非编码序列；转录成包含SEQ ID NO:115的天然RNA分子的半翅目生物的天然非编码序列的互补物；包含SEQ ID NO:115的半翅目生物的天然编码序列的至少19个连续核苷酸的片段；包含SEQ ID NO:115的半翅目生物的天然编码序列的至少19个连续核苷酸的片段的互补物；转录成包含SEQ ID NO:115的天然RNA分子的半翅目生物的天然非编码序列的至少19个连续核苷酸的片段；和转录成包含SEQ ID NO:115的天然RNA分子的半翅目生物的天然非编码序列的至少19个连续核苷酸的片段的互补物。
在这些和另外的实施方案中，dsRNA分子的一条链可以通过从与选自下组的核苷酸序列基本上同源的核苷酸序列转录而形成：SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133；SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的互补物；SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；包含SEQID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ IDNO:133的菜花露尾甲属生物(例如，PB)的天然编码序列；包含SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的菜花露尾甲属生物的天然编码序列的互补物；转录成包含SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的天然RNA分子的菜花露尾甲属生物的天然非编码序列；转录成包含SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的天然RNA分子的菜花露尾甲属生物的天然非编码序列的互补物；包含SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQID NO:131、或SEQ ID NO:133的菜花露尾甲属生物(例如，PB)的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；包含SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的菜花露尾甲属生物的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；转录成包含SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ IDNO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的天然RNA分子的菜花露尾甲属生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；和转录成包含SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的天然RNA分子的菜花露尾甲属生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补物。
在特定的实施方案中，编码dsRNA分子的重组DNA分子可以在一个转录序列内包含至少两个核苷酸序列区段，这样的序列如此排列，使得该转录序列包含(相对于至少一个启动子)处于有义取向的第一核苷酸序列区段、和处于反义取向的第二核苷酸序列区段(其包含第一核苷酸序列区段的互补物)，其中有义核苷酸序列区段和反义核苷酸序列区段由约五(约5)到约一千(约1000)个核苷酸的间隔物序列区段连接或相连。间隔物序列区段可以在有义和反义序列区段之间形成环。有义核苷酸序列或反义核苷酸序列区段可以与靶基因(例如，包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的基因)或其片段的核苷酸序列基本上同源。然而，在一些实施方案中，重组DNA分子可以编码没有间隔物序列的dsRNA分子。在实施方案中，有义编码序列和反义编码序列可具有不同长度。
通过在本发明的重组核酸分子中创建适当的表达盒，可以容易地将鉴定为对鞘翅目和/或半翅目害虫具有有害影响或者针对鞘翅目和/或半翅目害虫的植物保护效果的序列掺入表达的dsRNA分子中。例如，可以通过如下步骤将这样的序列表达为具有茎和环结构的发夹：采用对应于靶基因序列(例如，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:120、SEQID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133及其片段)的第一区段；将此序列与第二区段间隔物区连接，所述第二区段间隔物区与第一区段不是同源或互补的；并将这与第三区段连接，其中第三区段的至少一部分与第一区段基本上互补。这样的构建体通过第一区段与第三区段的分子内碱基配对而形成茎和环结构，其中环结构形式包含第二区段。参见，例如，美国专利公开文本2002/0048814和2003/0018993；以及国际PCT公开文本WO94/01550和WO98/05770。可以例如以双链结构诸如茎环结构(例如，发夹)形式生成dsRNA分子，由此通过共表达靶基因的片段(例如在另外的植物表达盒上的靶基因的片段)增强靶向天然鞘翅目和/或半翅目害虫序列的siRNA的产生，这可导致siRNA产生增强，或者降低甲基化以防止dsRNA发夹启动子的转录基因沉默。
本发明的实施方案包括将本发明的重组核酸分子导入植物中(即，转化)以实现一种或多种iRNA分子的鞘翅目和/或半翅目害虫抑制水平的表达。重组DNA分子可以例如是载体，如线性或闭合环状质粒。载体***可以是单一载体或质粒，或者共同含有要导入宿主基因组中的总DNA的两个或更多个载体或质粒。另外，载体可以是表达载体。可以例如将本发明的核酸序列适当地***载体中，在一种或多种宿主中发挥功能以驱动连接的编码序列或其他DNA序列表达的合适启动子控制下。许多载体可用于此目的，适当载体的选择主要将取决于要***载体中的核酸的大小和要用载体转化的特定宿主细胞。根据其功能(例如，DNA扩增或DNA表达)及与其相容的特定宿主细胞，每种载体含有不同的组分。
为了对转基因植物赋予鞘翅目和/或半翅目害虫抗性，例如可以在重组植物的组织或流体内将重组DNA转录成iRNA分子(例如，形成dsRNA分子的RNA分子)。iRNA分子可包含与可引起宿主植物物种损害的鞘翅目和/或半翅目害虫内的相应转录核苷酸序列基本上同源且可特异性杂交的核苷酸序列。例如，鞘翅目和/或半翅目害虫可以通过摄取包含iRNA分子的转基因宿主植物的细胞或流体而接触在转基因宿主植物细胞中转录的iRNA分子。因此，靶基因的表达在侵染转基因宿主植物的鞘翅目和/或半翅目害虫内受到iRNA分子阻抑。在一些实施方案中，对靶鞘翅目和/或半翅目害虫中靶基因表达的阻抑可以生成对害虫侵染有抗性的植物。
为了使iRNA分子能够被投送给与已经用本发明的重组核酸分子转化的植物细胞处于营养关系的鞘翅目和/或半翅目害虫，需要在植物细胞中表达(即，转录)iRNA分子。因此，重组核酸分子可以包含与一种或多种调节序列(诸如在宿主细胞中发挥功能的异源启动子序列)可操作连接的本发明的核苷酸序列，所述宿主细胞诸如其中要扩增核酸分子的细菌细胞，或其中要表达核酸分子的植物细胞。
适合于用于本发明的核酸分子的启动子包括诱导型、病毒的、合成的、或组成型的那些启动子，它们都是本领域中熟知的。描述这样的启动子的非限制性实例包括美国专利6,437,217(玉米RS81启动子)；5,641,876(水稻肌动蛋白启动子)；6,426,446(玉米RS324启动子)；6,429,362(玉米PR-1启动子)；6,232,526(玉米A3启动子)；6,177,611(组成型玉米启动子)；5,322,938、5,352,605、5,359,142、和5,530,196(CaMV 35S启动子)；6,433,252(玉米L3油质蛋白启动子)；6,429,357(水稻肌动蛋白2启动子和稻肌动蛋白2内含子)；6,294,714(光诱导型启动子)；6,140,078(盐诱导型启动子)；6,252,138(病原体诱导型启动子)；6,175,060(磷缺乏诱导型启动子)；6,388,170(双向启动子)；6,635,806(γ薏苡辛(coixin)启动子)；及美国专利公开号2009/757,089(玉米叶绿体醛缩酶启动子)。其他启动子包括胆脂碱合酶(NOS)启动子(Ebert等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(16):5745-5749)和章鱼碱合酶(OCS)启动子(两者都在根癌土壤杆菌的肿瘤诱导质粒上携带)；花椰菜花叶病毒组(caulimovirus)启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S启动子(Lawton等人，(1987)Plant Mol.Biol.9:315-324)；CaMV35S启动子(Odell等人，(1985)Nature 313:810-812；玄参花叶病毒35S启动子(Walker等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(19):6624-6628)；蔗糖合酶启动子(Yang和Russell(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:4144-4148)；R基因复合物启动子(Chandler等人，(1989)Plant Cell 1:1175-1183)；叶绿素a/b结合蛋白基因启动子；CaMV 35S(美国专利5,322,938、5,352,605、5,359,142、和5,530,196)；FMV 35S(美国专利5,378,619和6,051,753)；PClSV启动子(美国专利No.5,850,019)；SCP1启动子(美国专利No.6,677,503)；和AGRtu.nos启动子(登录号V00087；Depicker等人，(1982)J.Mol.Appl.Genet.1:561-573；Bevan等人，(1983)Nature 304:184-187)。
在特定的实施方案中，本发明的核酸分子包含组织特异性启动子，如根特异性启动子。根特异性启动子驱动专门或优先在根组织中表达可操作连接的编码序列。根特异性启动子的实例是本领域中已知的。参见，例如，美国专利5,110,732；5,459,252和5,837,848；Opperman等人，(1994)Science 263:221-3；和Hirel等人，(1992)Plant Mol.Biol.20:207-18。在一些实施方案中，可以在两个根特异性启动子之间克隆依照本发明的用于鞘翅目和/或半翅目害虫控制的核苷酸序列或片段，所述根特异性启动子相对于所述核苷酸序列或片段以相反的转录方向排布，在转基因植物细胞中可操作，并且在转基因植物细胞中表达以在转基因植物细胞中产生RNA分子，RNA分子随后可形成dsRNA分子，如上文所述。鞘翅目和/或半翅目害虫可以摄取植物组织中表达的iRNA分子，从而实现对靶基因表达的阻抑。
可任选地与感兴趣的核酸分子可操作连接的其他调节序列包括5'UTR，5'UTR作为位于启动子序列和编码序列之间的翻译前导序列发挥功能。翻译前导序列存在于完全加工的mRNA中，并且其可以影响初级转录物的加工和/或RNA的稳定性。翻译前导序列的例子包括玉米和矮牵牛热休克蛋白前导物(美国专利No.5,362,865)、植物病毒外壳蛋白前导序列、植物rubisco前导序列等。参见，例如，Turner和Foster(1995)Molecular Biotech.3(3):225-36。5'UTR的非限制性实例包括GmHsp(美国专利No.5,659,122)；PhDnaK(美国专利No.5,362,865)；AtAnt1；TEV(Carrington和Freed(1990)J.Virol.64:1590-7)；和AGRtunos(登录号V00087；和Bevan等人，(1983)Nature 304:184-7)。
可任选地与感兴趣的核酸分子可操作连接的其他调节序列还包括3'非翻译序列、3'转录终止区、或多腺苷酸化区。这些是位于核苷酸序列下游的遗传元件，并且包括提供多腺苷酸化信号的多核苷酸、和/或能够影响转录或mRNA加工的其他调节信号。多腺苷酸化信号在植物中发挥功能以引起多腺苷酸化核苷酸添加至mRNA前体的3'端。多腺苷酸化序列可以源自多种植物基因或T-DNA基因。3'转录终止区的一个非限制性实例是胆脂碱合酶3'区(nos 3'；Fraley等人，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4803-7)。在Ingelbrecht等人，(1989)Plant Cell 1:671-80中提供了使用不同3'非翻译区的实例。多腺苷酸化信号的非限制性实例包括来自豌豆RbcS2基因的信号(Ps.RbcS2-E9；Coruzzi等人，(1984)EMBO J.3:1671-9)和AGRtu.nos(登录号E01312)。
一些实施方案可以包括植物转化载体，该植物转化载体包含分离纯化的DNA分子，该DNA分子包含与本发明的一种或多种核苷酸序列可操作连接的至少一种上文描述的调节序列。在表达时，一种或多种核苷酸序列生成一种或多种包含核苷酸序列的RNA分子，所述核苷酸序列与鞘翅目和/或半翅目害虫中的天然RNA分子的全部或部分特异性地互补。因此，核苷酸序列可以包含编码靶向的鞘翅目和/或半翅目害虫RNA转录物内存在的核糖核苷酸序列的全部或部分的区段，并且可以包含靶向的鞘翅目和/或半翅目害虫转录物的全部或部分的反向重复。植物转化载体可以含有与超过一种靶序列特异性互补的序列，由此容许产生超过一种dsRNA以抑制靶鞘翅目和/或半翅目害虫的一个或多个群体或物种的细胞中两种或更多种基因的表达。可以将与不同基因中存在的核苷酸序列特异性互补的核苷酸序列区段组合成单一复合核酸分子，以便在转基因植物中表达。这样的区段可以是连续的或者由间隔物序列分开。
在一些实施方案中，可以通过在同一质粒中依次***另外的核苷酸序列来修饰已经含有本发明的至少一个核苷酸序列的本发明质粒，其中所述另外的核苷酸序列与原有的至少一个核苷酸序列可操作连接于相同的调节元件。在一些实施方案中，核酸分子可以设计为抑制多种靶基因。在一些实施方案中，要抑制的多种基因可以获自相同的鞘翅目和/或半翅目害虫物种，这样做可以增强核酸分子的有效性。在其他实施方案中，基因可以来自不同的鞘翅目和/或半翅目害虫，这样可以拓宽药剂有效的鞘翅目和/或半翅目害虫的范围。当靶向多种基因以实现阻抑、或表达和阻抑的组合时，可以制造多顺反子DNA元件。
本发明的重组核酸分子或载体可以包含赋予转化的细胞，诸如植物细胞可选择表型的选择标志物。也可以使用选择标志物来选择包含本发明的重组核酸分子的植物或植物细胞。标志物可以编码杀生物剂抗性、抗生素抗性(例如，卡那霉素、遗传霉素(G418)、博来霉素、潮霉素，等等)、或除草剂抗性(例如，草甘膦等)。选择标志物的实例包括但不限于编码卡那霉素抗性并且可以使用卡那霉素、G418等选择的neo基因；编码双丙氨磷抗性的bar基因；编码草甘膦抗性的突变体EPSP合酶基因；赋予对溴苯腈的抗性的腈水解酶基因；赋予咪唑啉酮或磺酰脲抗性的突变体乙酰乳酸合酶基因(ALS)；和甲氨蝶呤抗性DHFR基因。可用多种选择标志物，其赋予对氨苄青霉素、博来霉素、氯霉素、庆大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、甲氨蝶呤、膦丝菌素、嘌呤霉素、大观霉素、利福平、链霉素和四环素等的抗性。这样的选择标志物的实例展示于，例如美国专利5,550,318；5,633,435；5,780,708和6,118,047。
本发明的重组核酸分子或载体还可以包含可筛选标志物。可以使用可筛选标志物来监测表达。示例性筛选标志物包括β-葡糖醛酸糖苷酶或uidA基因(GUS)，其编码已知的多种生色底物的酶(Jefferson等人，(1987)Plant Mol.Biol.Rep.5:387-405)；R基因座基因，其编码调节植物组织中花色素苷色素(红色)产生的产物(Dellaporta等人，(1988)"Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac."收录于18 th Stadler Genetics Symposium,P.Gustafson和R.Appels编辑，(New York:Plenum),pp.263-82)；β-内酰胺酶基因(Sutcliffe等人，(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:3737-41)；编码已知多种生色底物的酶(例如，PADAC，一种生色头孢菌素)的基因；萤光素酶基因(Ow等人，(1986)Science 234:856-9)；xylE基因,其编码能转化生色儿茶酚的儿茶酚双加氧酶(Zukowski等人，(1983)Gene 46(2-3):247-55)；淀粉酶基因(Ikatu等人，(1990)Bio/Technol.8:241-2)；酪氨酸酶基因，其编码能够将酪氨酸氧化为DOPA和多巴醌(dopaquinone)(其继而缩合成黑色素)的酶(Katz等人，(1983)J.Gen.Microbiol.129:2703-14))；和α-半乳糖苷酶。
在一些实施方案中，在用于创建转基因植物和在植物中表达异源核酸的方法中，可以使用如上文所描述的重组核酸分子来制备表现出对鞘翅目和/或半翅目害虫的易感性降低的转基因植物。例如，可以通过将编码iRNA分子的核酸分子***植物转化载体中，并将这些导入植物中来制备植物转化载体。
用于宿主细胞转化的适合方法包括任何能将DNA导入细胞中的方法，如通过原生质体转化(参见，例如，美国专利No.5,508,184)，通过干燥/抑制介导的DNA摄取(参见，例如，Potrykus等人.(1985)Mol.Gen.Genet.199:183-8)，通过电穿孔(参见，例如，美国专利No.5,384,253)，通过用碳化硅纤维搅拌(参见，例如，美国专利5,302,523和5,464,765)，通过土壤杆菌介导的转化(参见，例如，美国专利5,563,055；5,591,616；5,693,512；5,824,877；5,981,840；和6,384,301)，以及通过加速DNA包被的颗粒(参见，例如，美国专利5,015,580、5,550,318、5,538,880、6,160,208、6,399,861、和6,403,865)，等。特别可用于转化玉米的技术描述于例如美国专利5,591,616、7,060,876和7,939,3281中。通过应用诸如此类的这些技术，几乎任何物种的细胞都可被稳定转化。在一些实施方案中，转化DNA被整合到宿主细胞的基因组中。在多细胞物种的情况下，转基因细胞可再生为转基因生物。可以使用任何这些技术来产生转基因植物，例如在转基因植物的基因组中包含编码一种或多种iRNA分子的一种或多种核酸序列。
用于将表达载体导入植物中的广泛使用的方法是基于各种土壤杆菌物种的天然转化***。根癌土壤杆菌和发根土壤杆菌是将植物细胞遗传转化的植物致病性土壤细菌。根癌土壤杆菌和发根土壤杆菌的Ti和Ri质粒分别携带负责植物遗传转化的基因。Ti(诱导肿瘤)-质粒含有被称为T-DNA的大片段，其被转移到转化的植物中。Ti质粒的另一个片段，Vir区，负责T-DNA的转移。T-DNA区的边界为末端重复序列。在修饰的二元载体中，肿瘤诱导基因已缺失，Vir区的功能用于转移以T-DNA边界序列为界的外来DNA。T区还可含有用于转基因细胞和植物有效恢复的选择标志物、以及***用于转移诸如编码核酸的dsRNA之类序列的多克隆位点。
因此，在一些实施方案中，植物转化载体来源于根癌土壤杆菌的Ti质粒(参见，例如，美国专利4,536,475、4,693,977、4,886,937、和5,501,967；以及欧洲专利No.EP 0 122791)或发根土壤杆菌的Ri质粒。其他的植物转化载体包括，例如但不限于，由Herrera-Estrella等人，(1983)Nature 303:209-13；Bevan等人，(1983)Nature 304:184-7；Klee等人，(1985)Bio/Technol.3:637-42；以及在欧洲专利No.EP 0 120 516中所描述的那些载体，以及从任何前述文献来源的那些载体。可以修饰天然地与植物相互作用的其他细菌，如中华根瘤菌属、根瘤菌属、和中慢生根瘤菌属，以介导到许多各种各样的植物中的基因转移。通过获取卸甲Ti质粒和适合的二元载体，可以使这些植物相关的共生细菌能够胜任基因转移。
在提供外源DNA到受体细胞的递送之后，通常鉴定出转化的细胞用于进一步培养和植物再生。为了提高鉴定转化细胞的能力，人们可能期望采用如前提出的选择或筛选标志物基因，其中转化载体用来再生转化体。在采用选择标志物的情况下，通过使细胞暴露于选择剂或药剂，鉴定出在潜在转化的细胞群中的转化细胞。在采用筛选标志物的情况下，可针对期望的标志物基因性状来筛选细胞。
暴露于选择剂后存活的细胞、或者在筛选测定中已被评分为阳性的细胞，可以在支持植物再生的介质中进行培养。在一些实施方案中，可通过包含其他物质，如生长调节剂来改良任何适合的植物组织培养基(例如，MS和N6培养基)。可将组织维持在具有生长调节剂的基本培养基上，直到可得到足够的组织用于启动植物再生工作时为止，或者在重复多轮的手动选择之后，直到组织形态适合于再生时为止(例如，一般约2周)，然后转移到有助于芽形成的介质中。定期转移培养物，直到已经出现充分的芽形成时为止。一旦形成芽，将它们转移到有助于根形成的介质中。一旦形成足够的根，可将植物转移到土壤中，以便进一步生长和成熟。
为了证实再生植物中感兴趣核酸分子(例如，编码一种或多种iRNA分子的DNA序列，所述iRNA分子抑制鞘翅目和/或半翅目害虫中的靶基因表达)的存在，可以进行多种测定法。这样的测定法例如包括：分子生物学测定，如Southern和northern印迹、PCR、和核酸测序；生物化学测定，如检测蛋白质产物的存在，例如通过免疫学手段(ELISA和/或免疫印迹)或借助于酶功能；植物部分测定，如叶或根测定；和再生的全植物的表型分析。
可例如通过使用对感兴趣核酸分子特异的寡核苷酸引物进行PCR扩增来分析整合事件。PCR基因分型应当理解为包括但不限于，来源于分离的宿主植物愈伤组织的基因组DNA的聚合酶链反应(PCR)扩增，所述愈伤组织预期含有整合到基因组中的感兴趣核酸分子，然后进行标准克隆和PCR扩增产物的序列分析。PCR基因分型方法已被很好地描述(例如Rios,G等人，(2002)Plant J.32:243-53)，并可应用于来源于任何植物物种(例如，玉米或大豆)或组织类型(包括细胞培养物)的基因组DNA。
采用依赖于土壤杆菌的转化方法形成的转基因植物一般含有***一个染色体中的单个重组DNA序列。该单个重组DNA序列被称为“转基因事件”或“整合事件”。这样的转基因植物对于***的外源序列而言是半合的。在一些实施方案中，通过含有单个外源基因序列的独立分离的转基因植物与自身(例如T0植物)有***配(自交)以产生Tl种子，可获得相对于转基因为纯合的转基因植物。所产生的Tl种子的四分之一相对于所述转基因是纯合的。萌发Tl种子产生的植物可用于测试杂合性，所述测试一般使用SNP测定或热扩增测定，使得允许在杂合子和纯合子之间进行区分(即，接合型测定)。
在特定的实施方案中，在植物细胞中产生具有鞘翅目和/或半翅目害虫-抑制效果的至少2、3、4、5、6、7、8、9种或10种或更多种不同iRNA分子。可以从引入不同转化事件中的多种核酸序列、或从引入单一转化事件中的单一核酸序列表达iRNA分子(例如，dsRNA分子)。在一些实施方案中，在单一启动子的控制下表达多个iRNA分子。在其他实施方案中，在多个启动子的控制下表达多个iRNA分子。可以表达包含多个核酸序列的单一iRNA分子，所述核酸序列各自与在相同鞘翅目和/或半翅目害虫物种的不同群体中或在不同的鞘翅目和/或半翅目害虫物种中的一个或多个鞘翅目和/或半翅目害虫内的不同基因座(例如，由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ IDNO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133限定的基因座)同源。
除了用重组核酸分子直接转化植物之外，可通过使具有至少一个转基因事件的第一植物与缺乏这种事件的第二植物杂交来制造转基因植物。例如，可将包含编码iRNA分子的核苷酸序列的重组核酸分子导入易于转化的第一植物品系中而产生转基因植物，其中转基因植物可与第二植物品系杂交而使编码iRNA分子的核苷酸序列渗入到第二植物品系中。
本发明还包括含有本发明的一种或多种序列的商业产品。特定的实施方案包括从含有本发明的一种或多种核苷酸序列的重组植物或种子生产的商业产品。含有本发明的一种或多种序列的商业产品预期包括但不限于：植物的粗粉、油类、碾碎的或完整的籽粒或种子，或包含含有本发明的一种或多种序列的重组植物或种子的任何粗粉、油、或碾碎的或完整的籽粒的任何食物或动物饲料产品。本文中考虑的一种或多种商品或商业产品中的本发明的一种或多种序列的检测实际上证明，商品或商业产品是从为了使用dsRNA介导的基因阻抑方法控制鞘翅目和/或半翅目植物害虫的目的，设计为表达本发明的一种或多种核苷酸序列的转基因植物所生产的。
在一些方面，包括由自转化的植物细胞衍生的转基因植物产生的种子和商业产品，其中种子或商业产品包含可检出量的本发明的核酸序列。在一些实施方案中，例如，可以通过获得转基因植物并从它们制备食物或饲料来生产这样的商业产品。包含本发明的一种或多种核酸序列的商业产品包括例如但不限于：植物的粗粉、油类、碾碎的或完整的籽粒或种子，和包含含有本发明的一种或多种序列的重组植物或种子的任何粗粉、油、或碾碎的或完整的籽粒的任何食物产品。在一种或多种商品或商业产品中的检出本发明的一种或多种序列，实际上证明该商品或商业产品是由为了控制鞘翅目和/或半翅目害虫的目的，设计为表达本发明的一种或多种iRNA分子的转基因植物生产的。
在一些实施方案中，包含本发明的核酸分子的转基因植物或种子也可在其基因组中包含至少一个其他的转基因事件，包括但不限于：自其转录靶向鞘翅目和/或半翅目害虫中与由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133限定的基因座不同的基因座的iRNA分子的转基因事件，所述不同的基因座例如像，选自下组的一个或多个基因座：Caf1-180(美国专利申请公开号2012/0174258)、VatpaseC(美国专利申请公开号2012/0174259)、Rho1(美国专利申请公开号2012/0174260)、VatpaseH(美国专利申请公开号2012/0198586)、PPI-87B(美国专利申请公开号2013/0091600)、RPA70(美国专利申请公开号2013/0091601)、和RPS6(美国专利申请公开号2013/0097730)；自其转录靶向与鞘翅目和/或半翅目害虫不同的生物(例如，植物寄生性线虫)中的基因的iRNA分子的转基因事件；编码杀虫蛋白(例如，苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白)的基因，例如，Cry34Ab1(美国专利6,127,180、6,340,593、和6,624,145)、Cry35Ab1(美国专利6,083,499、6,340,593、和6,548,291)、在单一事件中的“Cry34/35Ab1”组合(例如，玉米事件DAS-59122-7；美国专利No.7,323,556)、Cry3A(例如，美国专利No.7,230,167)、Cry3B(例如，美国专利No.8,101,826)、Cry6A(例如，美国专利No.6,831,062)、及其组合(例如，美国专利申请2013/0167268、2013/0167269、和2013/0180016)；耐除草剂基因(例如，提供草甘膦、草丁膦、麦草畏或2,4--D耐受性的基因(例如，美国专利No.7,838,733))；以及促成转基因植物中的期望表型的基因，所述期望表型例如产量增加、脂肪酸代谢改变、或细胞质雄性不育的恢复。在特定的实施方案中，可以在植物中将编码本发明iRNA分子的序列与其他昆虫控制或抗病性性状组合以实现增强的昆虫损害和植物疾病控制的期望性状。例如，由于对所述性状的抗性的概率在田间将发生降低，组合采用独特作用模式的昆虫控制性状可以对受保护的转基因植物提供优越的持久性，该持久性优于含有单一控制性状的植物。
V.鞘翅目和/或半翅目害虫中的靶基因阻抑
A.概述
在本发明的一些实施方案中，可以对鞘翅目和/或半翅目害虫提供至少一种可用于控制鞘翅目和/或半翅目害虫的核酸分子，其中所述核酸分子在鞘翅目和/或半翅目害虫中导致RNAi介导的基因沉默。在特定的实施方案中，可以对鞘翅目和/或半翅目害虫提供iRNA分子(例如，dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、和hpRNA)。在一些实施方案中，可以通过使核酸分子与鞘翅目和/或半翅目害虫接触对鞘翅目和/或半翅目害虫提供可用于控制鞘翅目和/或半翅目害虫的核酸分子。在这些和另外的实施方案中，可以在鞘翅目和/或半翅目害虫的进食基质，例如营养组合物中提供可用于控制鞘翅目和/或半翅目害虫的核酸分子。在这些和另外的实施方案中，可以通过摄取被鞘翅目和/或半翅目害虫摄取的包含核酸分子的植物材料来提供可用于控制鞘翅目和/或半翅目害虫的核酸分子。在某些实施方案中，核酸分子通过表达导入植物材料中的重组核酸序列而存在于植物材料中，所述导入例如通过用包含重组核酸序列的载体转化植物细胞，并从转化的植物细胞再生植物材料或全植物来进行。
B.RNA介导的靶基因阻抑
在实施方案中，本发明提供了iRNA分子(例如，dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、和hpRNA)，可以设计此类分子使之靶向鞘翅目和/或半翅目害虫(例如，WCR、NCR、油菜花露尾甲、英雄美洲蝽、稻绿蝽、盖德拟壁蝽、茶翅蝽、拟绿蝽、和褐臭蝽)的转录组中的必需天然核苷酸序列(例如，必需基因)，例如设计有至少一条链包含与靶序列特异性互补的核苷酸序列的iRNA分子。如此设计的iRNA分子的序列可以与靶序列相同，或者可以含有不会阻止iRNA分子与其靶序列之间的特异性杂交的错配。
本发明的iRNA分子可以在用于鞘翅目和/或半翅目害虫中基因阻抑的方法中使用，由此降低由害虫对植物(例如，包含iRNA分子的受保护的转化植物)引起的损害水平或发生率。如本文中使用的，术语“基因阻抑”是指用于降低由于基因转录成mRNA及随后mRNA翻译而产生的蛋白质水平，包括降低基因或编码序列的蛋白质表达，包括任何公知的转录后抑制表达和转录阻抑表达的方法。通过从靶向阻抑的基因转录的mRNA的全部或部分与用于阻抑的相应iRNA分子之间的特异性同源性而介导转录后抑制。另外，转录后抑制是指通过核糖体结合的细胞中可用的mRNA量的实质性和可测量降低。
在RNAi分子是dsRNA分子的一些实施方案中，酶切丁酶可以将dsRNA分子切割成短siRNA分子(大约20个核苷酸长度)。借助于切丁酶对dsRNA分子的活性而生成的双链siRNA分子可以分成两个单链siRNA：“乘客链”和“引导链”。乘客链可以被降解，而引导链可以掺入RISC中。通过引导链与mRNA分子的特异性互补序列的特异性杂交，随后通过酶Argonaute(RISC复合物的催化组分)切割而发生转录后抑制。
在本发明的其他实施方案中，可以使用任何形式的iRNA分子。本领域技术人员会理解的是，在制备过程中及在对细胞提供iRNA分子的步骤过程中，dsRNA分子一般比单链RNA分子更稳定，并且一般在细胞中也是更稳定的。因此，例如，虽然在一些实施方案中siRNA和miRNA分子可能是同等有效的，但是dsRNA分子可以由于其稳定性而被选用。
在特定的实施方案中，提供了包含核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列可以在体外表达以产生iRNA分子，所述iRNA分子与由鞘翅目和/或半翅目害虫基因组内的核苷酸序列编码的核酸分子基本上同源。在某些实施方案中，体外转录的iRNA分子可以是包含茎环结构的稳定化的dsRNA分子。在鞘翅目和/或半翅目害虫接触体外转录的iRNA分子后，可以发生对鞘翅目和/或半翅目害虫中靶基因(例如，必需基因)的转录后抑制。
在本发明的一些实施方案中，在用于对鞘翅目和/或半翅目害虫中靶基因的转录后抑制的方法中利用包含核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的核酸分子的表达，其中所述核苷酸序列选自下组：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:1的互补物；SEQ ID NO:1的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:1的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；包含SEQ ID NO:1的叶甲属生物(例如，WCR)的天然编码序列；包含SEQ ID NO:1的叶甲属生物的天然编码序列的互补物；转录成包含SEQ ID NO:1的天然RNA分子的叶甲属生物的天然非编码序列；转录成包含SEQ ID NO:1的天然RNA分子的叶甲属生物的天然非编码序列的互补物；转录成包含SEQ ID NO:1的天然RNA分子的叶甲属生物的天然非编码序列的互补物；包含SEQ ID NO:1的叶甲属生物(例如，WCR)的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；包含SEQ ID NO:1的叶甲属生物的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；转录成包含SEQID NO:1的天然RNA分子的叶甲属生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；和转录成包含SEQ ID NO:1的天然RNA分子的叶甲属生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补物。在某些实施方案中，可以使用与前述任一项至少80％相同(例如，80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约100％、和100％)的核酸分子的表达。在这些和另外的实施方案中，可以表达与存在于至少一个鞘翅目和/或半翅目害虫细胞中的RNA分子特异性杂交的核酸分子。
在本发明的某些实施方案中，在用于对鞘翅目害虫中靶基因的转录后抑制的方法中利用包含核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的核酸分子的表达，其中所述核苷酸序列选自下组：SEQ ID NO:115；SEQ ID NO:115的互补物；SEQ ID NO:115的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:115的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；半翅目生物SEQ ID NO:115的天然编码序列；包含SEQ ID NO:115的半翅目生物的天然编码序列的互补物；转录成包含SEQ ID NO:115的天然RNA分子的半翅目生物的天然非编码序列；转录成包含SEQ IDNO:115的天然RNA分子的半翅目生物的天然非编码序列的互补物；转录成包含SEQ ID NO:115的天然RNA分子的半翅目生物的天然非编码序列的互补物；包含SEQ ID NO:115的半翅目生物的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；包含SEQ ID NO:115的半翅目生物的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；转录成包含SEQ ID NO:115的天然RNA分子的半翅目生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；和转录成包含SEQ ID NO:115的天然RNA分子的半翅目生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补物。在某些实施方案中，可以使用与前述任一项至少80％相同(例如，80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约100％、和100％)的核酸分子的表达。在这些和另外的实施方案中，可以表达与存在于至少一个鞘翅目害虫细胞中的RNA分子特异性杂交的核酸分子。
在本发明的一些实施方案中，在用于对鞘翅目和/或半翅目害虫中靶基因的转录后抑制的方法中利用包含核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的核酸分子的表达，其中所述核苷酸序列选自下组：SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133；SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的互补物；SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；包含SEQ ID NO:120、SEQ IDNO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的菜花露尾甲属生物(例如，EPB)的天然编码序列；包含SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的菜花露尾甲属生物的天然编码序列的互补物；转录成包含SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQID NO:131、或SEQ ID NO:133的天然RNA分子的菜花露尾甲属生物的天然非编码序列；转录成包含SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的天然RNA分子的菜花露尾甲属生物的天然非编码序列的互补物；转录成包含SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的天然RNA分子的菜花露尾甲属生物的天然非编码序列的互补物；包含SEQID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ IDNO:133的菜花露尾甲属生物(例如，EPB)的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；包含SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQID NO:133的菜花露尾甲属生物的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；转录成包含SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的天然RNA分子的菜花露尾甲属生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；和转录成包含SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ IDNO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的天然RNA分子的菜花露尾甲属生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补物。在某些实施方案中，可以使用与前述任一项至少80％相同(例如，80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约100％、和100％)的核酸分子的表达。在这些和另外的实施方案中，可以表达与存在于至少一个鞘翅目和/或半翅目害虫细胞中的RNA分子特异性杂交的核酸分子。
在其他实施方案中，在用于对鞘翅目和/或半翅目害虫中靶基因的转录后抑制的方法中可以使用包含核苷酸序列的至少19个连续核苷酸的至少一种核酸分子的表达，其中所述核苷酸序列选自下组：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:1的互补物；SEQ ID NO:1的至少19个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:1的至少19个连续核苷酸的片段的互补物；包含SEQ ID NO:1的叶甲属生物(例如，WCR)的天然编码序列；包含SEQ ID NO:1的叶甲属生物(例如，WCR)的天然编码序列的互补物；转录成包含SEQ ID NO:1的天然RNA分子的叶甲属生物的天然非编码序列；转录成包含SEQ ID NO:1的天然RNA分子的叶甲属生物的天然非编码序列的互补物；包含SEQ ID NO:1的叶甲属生物(例如，WCR)的天然编码序列的至少19个连续核苷酸的片段；包含SEQ ID NO:1的叶甲属生物的天然编码序列的至少19个连续核苷酸的片段的互补物；转录成包含SEQ ID NO:1的天然RNA分子的叶甲属生物的天然非编码序列的至少19个连续核苷酸的片段；和转录成包含SEQ ID NO:1的天然RNA分子的叶甲属生物的天然非编码序列的至少19个连续核苷酸的片段的互补物。在某些实施方案中，可以使用与前述任一项至少80％相同(例如，80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约100％、和100％)的核酸分子的表达。在这些和另外的实施方案中，可以表达与存在于至少一个鞘翅目和/或半翅目害虫细胞中的RNA分子特异性杂交的核酸分子。在特定的实例中，这样的核酸分子可包含含有SEQ ID NO:1的核苷酸序列。
在特定的实施方案中，在用于对鞘翅目害虫中靶基因的转录后抑制的方法中可以使用包含核苷酸序列的至少19个连续核苷酸的至少一种核酸分子的表达，其中所述核苷酸序列选自下组：SEQ ID NO:115；SEQ ID NO:115的互补物；SEQ ID NO:115的至少19个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:115的至少19个连续核苷酸的片段的互补物；包含SEQ ID NO:115的半翅目生物的天然编码序列；包含SEQ ID NO:115的半翅目生物的天然编码序列的互补物；转录成包含SEQ ID NO:115的天然RNA分子的半翅目生物的天然非编码序列；转录成包含SEQ ID NO:115的天然RNA分子的半翅目生物的天然非编码序列的互补物；包含SEQ IDNO:115的半翅目生物的天然编码序列的至少19个连续核苷酸的片段；包含SEQ ID NO:115的半翅目生物的天然编码序列的至少19个连续核苷酸的片段的互补物；转录成包含SEQ IDNO:115的天然RNA分子的半翅目生物的天然非编码序列的至少19个连续核苷酸的片段；和转录成包含SEQ ID NO:115的天然RNA分子的半翅目生物的天然非编码序列的至少19个连续核苷酸的片段的互补物。在某些实施方案中，可以使用与前述任一项至少80％相同(例如，80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约100％、和100％)的核酸分子的表达。在这些和另外的实施方案中，可以表达与存在于至少一个鞘翅目害虫细胞中的RNA分子特异性杂交的核酸分子。在特定的实例中，这样的核酸分子可包含含有SEQ ID NO:115的核苷酸序列。
在其他实施方案中，在用于对鞘翅目和/或半翅目害虫中靶基因的转录后抑制的方法中可以使用包含核苷酸序列的至少19个连续核苷酸的核酸分子的表达，其中所述核苷酸序列选自下组：SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ IDNO:131、或SEQ ID NO:133；SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的互补物；SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ IDNO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的至少19个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQID NO:133的至少19个连续核苷酸的片段的互补物；包含SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的菜花露尾甲属生物(例如，EPB)的天然编码序列；包含SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ IDNO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的菜花露尾甲属生物(例如，EPB)的天然编码序列的互补物；转录成包含SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的天然RNA分子的菜花露尾甲属生物的天然非编码序列；转录成包含SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的天然RNA分子的菜花露尾甲属生物的天然非编码序列的互补物；包含SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQID NO:133的菜花露尾甲属生物(例如，EPB)的天然编码序列的至少19个连续核苷酸的片段；包含SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的菜花露尾甲属生物的天然编码序列的至少19个连续核苷酸的片段的互补物；转录成包含SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ IDNO:131、或SEQ ID NO:133的天然RNA分子的菜花露尾甲属生物的天然非编码序列的至少19个连续核苷酸的片段；和转录成包含SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的天然RNA分子的菜花露尾甲属生物的天然非编码序列的至少19个连续核苷酸的片段的互补物。在某些实施方案中，可以使用与前述任一项至少80％相同(例如，80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约100％、和100％)的核酸分子的表达。在这些和另外的实施方案中，可以表达与存在于至少一个鞘翅目和/或半翅目害虫细胞中的RNA分子特异性杂交的核酸分子。在特定的实例中，这样的核酸分子可以包含含有SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133的核苷酸序列。
本发明的一些实施方案的重要特征在于，RNAi转录后抑制***能够容忍靶基因中预期由于遗传突变、株系多态性、或进化趋异而可能发生的序列变异。导入的核酸分子可以不必与靶基因的初级转录产物或完全加工的mRNA绝对同源，只要导入的核酸分子与靶基因的初级转录产物或完全加工的mRNA可特异性杂交即可。而且，相对于靶基因的初级转录产物或完全加工的mRNA，导入的核酸分子可以不必是全长的。
使用本发明的iRNA技术抑制靶基因是序列特异性的；即，靶向与iRNA分子基本上同源的核苷酸序列进行遗传抑制。在一些实施方案中，可以使用包含与靶基因序列的一部分相同的核苷酸序列的RNA分子进行抑制。在这些和另外的实施方案中，可以使用包含相对于靶基因序列具有一个或多个***、缺失和/或点突变的核苷酸序列的RNA分子。在特定的实施方案中，iRNA分子和靶基因的一部分可以共享例如至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约100％、和100％的序列同一性。或者，dsRNA分子的双链体区可以与靶基因转录物的一部分可特异性地杂交。在可特异性杂交的分子中，展现出较大同源性的小于全长的序列可补偿较长的、同源性较低的序列。dsRNA分子的双链体区中与靶基因转录物的一部分相同的核苷酸序列的长度可以是至少约15、16、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、100、200、300、400、500个、或至少约1000个碱基。在一些实施方案中，可以使用大于15个到100个核苷酸的序列。在其他实施方案中，可以使用大于约100个到200个核苷酸的序列。在特定的实施方案中，可以使用大于约200个到300个核苷酸的序列。在替代的实施方案中，可以使用大于约300个到500个核苷酸的序列。在特定的实施方案中，根据靶基因的大小，可以使用大于约500个到1000个核苷酸的序列。
在某些实施方案中，可以将鞘翅目和/或半翅目害虫中靶基因的表达在鞘翅目和/或半翅目害虫细胞内抑制至少10％；至少33％；至少50％；或至少80％，使得发生显著抑制。显著抑制是指高于阈值的抑制，所述抑制导致可检出的表型(例如，生长停止、进食停止、发育停止、和诱导性死亡，等等)，或与所抑制的靶基因对应的RNA和/或基因产物的可检出降低。虽然在本发明的某些实施方案中，在鞘翅目和/或半翅目害虫的基本上所有细胞中均发生抑制，但在其他实施方案中，仅在表达靶基因的细胞子集中发生抑制。
在一些实施方案中，细胞中的转录阻抑由展现出与启动子DNA序列或其互补物的实质性序列同一性的dsRNA分子的存在所介导，从而产生所谓的“启动子反式阻抑”。基因阻抑可以在可以摄取或接触此类dsRNA分子的鞘翅目和/或半翅目害虫中针对靶基因发挥效果，例如通过害虫摄取或接触含有dsRNA分子的植物材料。在启动子反式阻抑中使用的dsRNA分子可以特异性地设计为抑制或阻抑鞘翅目和/或半翅目害虫细胞中一种或多种同源或互补序列的表达。美国专利5,107,065、5,231,020、5,283,184、和5,759,829中公开了通过反义或有义取向的RNA进行转录后基因阻抑以调节植物细胞中的基因表达。
C.对鞘翅目和/或半翅目害虫提供的iRNA分子的表达
可以许多体外或体内形式的任一种进行表达用于在鞘翅目和/或半翅目害虫中RNAi介导的基因抑制的iRNA分子。然后，可以对鞘翅目和/或半翅目害虫提供iRNA分子，例如通过使iRNA分子与害虫接触，或通过引起害虫摄取或以别的方式内在化iRNA分子。本发明的一些实施方案包括鞘翅目和/或半翅目害虫的经转化的宿主植物、经转化的植物细胞、和经转化的植物的后代。经转化的植物细胞和经转化的植物可以工程化改造为例如在异源启动子控制下表达一种或多种iRNA分子，以提供害虫保护效果。因此，当在鞘翅目和/或半翅目害虫在进食期间食用转基因植物或植物细胞时，害虫可以摄取转基因植物或细胞中表达的iRNA分子。也可以将本发明的核苷酸序列导入广泛而多样的原核和真核微生物宿主中以产生iRNA分子。术语“微生物”包括原核和真核物种，如细菌和真菌。
基因表达的调控可以包括对此类表达的部分或完全阻抑。在另一个实施方案中，用于阻抑鞘翅目和/或半翅目害虫中基因表达的方法包括在害虫宿主的组织中提供基因阻抑量的至少一种如本文中所描述的核苷酸序列在转录后形成的dsRNA分子，其至少一个区段与鞘翅目和/或半翅目害虫细胞内的mRNA序列互补。根据本发明的鞘翅目和或半翅目害虫所摄取的dsRNA分子，包括其修饰的形式，如siRNA、shRNA、miRNA、或hpRNA分子，可以与从包含选自下列核苷酸序列的核酸分子转录的RNA分子至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约100％、或100％相同，所述核苷酸序列包括SEQID NO:1、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133。因此，提供了用于制备本发明的dsRNA分子的分离的且基本上纯化的核酸分子，包括但不限于非天然存在的核苷酸序列和重组DNA构建体，其在导入鞘翅目和/或半翅目害虫时阻抑或抑制其中的内源编码序列或靶编码序列的表达。
特定的实施方案提供了用于递送iRNA分子以转录后抑制鞘翅目和/或半翅目植物害虫中的一种或多种靶基因并控制鞘翅目和/或半翅目植物害虫群体的递送***。在一些实施方案中，所述递送***涉及包括对宿主转基因植物细胞或包含在宿主细胞中转录的RNA分子的宿主细胞内容物的摄取。在这些和另外的实施方案中，创建转基因植物细胞或转基因植物，其含有可提供本发明的稳定化dsRNA分子的重组DNA构建体。包含编码特定iRNA分子的核酸序列的转基因植物细胞和转基因植物可以如下产生：采用重组DNA技术(这些基础技术是本领域中熟知的)构建包含编码本发明的iRNA分子(例如，稳定化的dsRNA分子)的核苷酸序列的植物转化载体；以此转化植物细胞或植物；并以此生成含有转录的iRNA分子的转基因植物细胞或转基因植物。
为了对转基因植物赋予鞘翅目和/或半翅目害虫抗性，可以例如将重组DNA分子转录成iRNA分子，如dsRNA分子、siRNA分子、shRNA分子、miRNA分子、或hpRNA分子。在一些实施方案中，从重组DNA分子转录的RNA分子可以在重组植物的组织或流体内形成dsRNA分子。这样的dsRNA分子可以包含在核苷酸序列的一部分中，所述核苷酸序列与可侵染宿主植物的类型的鞘翅目和/或半翅目害虫内的DNA序列转录的相应核苷酸序列相同。鞘翅目和/或半翅目害虫内靶基因的表达被所述摄入的dsRNA分子所阻抑，并且鞘翅目和/或半翅目害虫中靶基因表达的阻抑导致，例如，鞘翅目和/或半翅目害虫的进食停止，最终结果是例如，转基因植物被保护免于受到该鞘翅目和/或半翅目害虫的进一步损害。已经显示dsRNA分子的调控作用可适用于害虫中表达的多种基因，包括例如负责细胞代谢或细胞转化的内源基因，包括管家基因；转录因子；蜕皮相关基因；和编码涉及细胞代谢或正常生长和发育的多肽的其他基因。
为了从体内转基因或表达构建体转录，可以在一些实施方案中使用调节区(例如，启动子、增强子、沉默子、和多聚腺苷酸化信号)以转录一条或多条RNA链。因此，在一些实施方案中，如上文提出的，在产生iRNA分子中使用的核苷酸序列可以与在植物宿主细胞中有功能的一种或多种启动子序列可操作连接。启动子可以是通常驻留于宿主基因组中的内源启动子。在可操作连接的启动子序列控制下的本发明的核苷酸序列可以进一步被其他有利地影响其转录和/或所得转录物的稳定性的序列所侧翼。这样的序列可以位于可操作连接启动子的上游、表达构建体3'端的下游、并且可以同时存在于启动子的上游和表达构建体3'端的下游。
一些实施方案提供了用于降低由以植物为食的鞘翅目和/或半翅目害虫引起的对宿主植物(例如，玉米或大豆植物)的损害的方法，其中所述方法包括在宿主植物中提供表达本发明的至少一种核酸分子的转化植物细胞，其中所述核酸分子在被鞘翅目和/或半翅目害虫摄取后发挥功能以抑制鞘翅目和/或半翅目害虫内靶序列的表达，该表达抑制导致鞘翅目和/或半翅目害虫的死亡、生长降低、和/或生殖降低，由此降低由鞘翅目和/或半翅目害虫引起的对宿主植物的损害。在一些实施方案中，核酸分子包含dsRNA分子。在这些和另外的实施方案中，核酸分子包含dsRNA分子，所述dsRNA分子各自包含超过一种与鞘翅目和/或半翅目害虫细胞中表达的核酸分子可特异性地杂交的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸分子由一种核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与鞘翅目和/或半翅目害虫细胞中表达的核酸分子可特异性地杂交。
在其他实施方案中，提供了用于提高玉米或大豆作物产量的方法，其中所述方法包括将本发明的至少一种核酸分子导入玉米或大豆植物中；栽培玉米或大豆植物以容许表达包含核酸序列的iRNA分子，其中包含所述核酸序列的iRNA分子的表达可抑制鞘翅目和/或半翅目害虫生长和/或鞘翅目和/或半翅目害虫损害，由此降低或消除由于鞘翅目和/或半翅目害虫侵染所致的产量损失。在一些实施方案中，iRNA分子是dsRNA分子。在这些和另外的实施方案中，核酸分子包含dsRNA分子，所述dsRNA分子各自包含超过一种与鞘翅目和/或半翅目害虫细胞中表达的核酸分子可特异性地杂交的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸分子由一种核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与鞘翅目和/或半翅目害虫细胞中表达的核酸分子可特异性地杂交。
在特定的实施方案中，提供了用于调控鞘翅目和/或半翅目害虫中靶基因表达的方法，所述方法包括：用包含编码本发明的至少一种核酸分子的核酸序列的载体转化植物细胞，其中所述核苷酸序列与启动子和转录终止序列可操作连接；在足以容许形成包含多个转化植物细胞的植物细胞培养物的条件下培养经转化的植物细胞；选择已经将核酸分子整合到其基因组中的转化植物细胞；对转化植物细胞筛选由整合的核酸分子编码的iRNA分子的表达；选择表达iRNA分子的转基因植物细胞；并且用选择的转基因植物细胞喂养鞘翅目和/或半翅目害虫。也可以从表达由整合的核酸分子编码的iRNA分子的转化植物细胞再生植物。在一些实施方案中，iRNA分子是dsRNA分子。在这些和另外的实施方案中，核酸分子包含dsRNA分子，所述dsRNA分子各自包含超过一种与鞘翅目和/或半翅目害虫细胞中表达的核酸分子可特异性地杂交的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸分子由一种核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与鞘翅目和/或半翅目害虫细胞中表达的核酸分子可特异性地杂交。
可以将本发明的iRNA分子作为来自掺入植物细胞基因组中的重组基因的表达产物、或者掺入应用于种植前种子的包衣或种子处理中而掺入植物物种(例如，玉米或大豆)的种子之内。包含重组基因的植物细胞被视为转基因事件。本发明的实施方案中还包括用于将iRNA分子投送给鞘翅目和/或半翅目害虫的递送***。例如，可以将本发明的iRNA分子直接导入鞘翅目和/或半翅目害虫细胞中。用于导入的方法可以包括将iRNA与来自鞘翅目和/或半翅目害虫宿主的植物组织直接混合，以及对宿主植物组织应用包含本发明的iRNA分子的组合物。例如，可将iRNA分子喷雾到植物表面上。或者，可以通过微生物表达iRNA分子，并且可以将微生物应用到植物表面上，或通过物理手段诸如注射导入根或茎中。如上文论述的，也可以对转基因植物进行遗传工程改造，使其以足以杀死已知侵染植物的鞘翅目和/或半翅目害虫的量表达至少一种iRNA分子。通过化学或酶促合成产生的iRNA分子也可以以符合常见农业实践的方式配制，并且作为喷雾产品使用以控制鞘翅目和/或半翅目害虫所致的植物损害。配制剂可以包含有效的叶覆盖需要的适当粘着剂(sticker)和湿润剂，以及保护iRNA分子(例如，dsRNA分子)免于UV损伤的UV保护剂。这样的添加剂通常在生物杀虫剂产业中使用，并且是本领域技术人员熟知的。这样的应用可以与其他喷雾杀虫剂应用(基于生物学的或其他方面)组合以增强针对鞘翅目和/或半翅目害虫的植物保护。
提供了在本文中论述的所有参考文献，包括在本文中引证的出版物、专利和专利申请，只不过是因为它们的公开在本申请的申请日之前。在本文中不应被解释为承认本发明人无权基于发明在先而排除这些公开的影响。
提供以下实施例以展示某些具体特征和/或方面。这些实施例不应被理解为将本公开限于所描述的具体特征或方面。
实施例
实施例1
候选靶基因的鉴定
选择多个WCR(玉米根萤叶甲)发育期进行汇集的转录组生成，以提供通过RNAi转基因植物抗虫技术控制的候选靶基因序列。
在一个范例中，从约0.9gm的完整第一龄WCR幼虫(孵化后4到5天；保持在16℃)分离总RNA，并使用下述基于苯酚/TRI -的方法(MOLECULAR RESEARCH CENTER,Cincinnati,OH)进行纯化：
将幼虫于室温在具有10mL TRI 的15mL匀浆器中均质化，直到获得均匀的悬浮液时为止。在室温温育5分钟后，将匀浆分配到1.5mL微量离心管中(每管1mL)，添加200μL氯仿，并将混合物强力振摇15秒。在室温提取10分钟之后，通过在4℃以12,000xg离心分离各个相。将上层相(包含约0.6mL)小心转移到另一个无菌的1.5mL管中，并添加等体积的室温异丙醇。在室温温育5到10分钟之后，将混合物在12,000x g(4℃或25℃)离心8分钟。
将上清液小心取出并弃去，并将RNA离心沉淀通过用75％乙醇涡旋振荡洗涤两次，在每次洗涤后通过在7,500x g(4℃或25℃)离心5分钟回收。小心去除乙醇，让离心沉淀风干3至5分钟，然后溶解在无核酸酶的无菌水中。通过在260nm和280nm测量吸光度(A)测定RNA浓度。从约0.9gm幼虫的典型提取产生超过1mg的总RNA，其中A260/A280比为1.9。如此提取的RNA在80℃贮存，直到进一步加工。
通过使等份跑1％琼脂糖凝胶确定RNA质量。在经高温灭菌的容器中，使用经DEPC(焦碳酸二乙酯)处理的水稀释的高温灭菌的10X TAE缓冲液(Tris乙酸盐EDTA；1X浓度为0.04M Tris乙酸盐，1mM EDTA(乙二胺四乙酸钠盐，pH 8.0)制成琼脂糖凝胶溶液。使用1XTAE作为运行缓冲液。在使用前，用RNASE(INVITROGEN INC.,Carlsbad,CA)清洁电泳槽和造孔梳。将2μL RNA样品与8μL TE缓冲液(10mM Tris HCl pH 7.0；1mM EDTA)和10μL RNA样品缓冲液(目录号70606；EMD4Bioscience,Gibbstown,NJ)混合。将样品于70℃加热3分钟，冷却至室温，每孔上样5μL(含有1μg到2μg RNA)。将市售的RNA分子量标记物在分离的孔中同时运行以进行分子大小比较。在60伏特下跑胶2小时。
由服务提供商(EUROFINS MWG Operon,Huntsville,AL)利用随机引发从幼虫总RNA制备标准化的cDNA文库。在EUROFINS MWG Operon通过GS FLX 454 TitaniumTM系列化学以1/2板的规模对标准化的幼虫cDNA文库进行测序，其产生具有平均读段长度348bp的超过600,000个读段。将350,000个读段装配成超过50,000个重叠群。使用公众可访问的程序F0RMATDB(可在NCBI访问)将未装配的读段和重叠群两者都转换成可BLAST的数据库。
类似地从其他WCR发育期收获的材料制备了总RNA和标准化的cDNA文库。合并代表各个发育期的cDNA文库成员，构建了用于靶基因筛选的汇集的转录组文库。
使用关于特定基因在其他昆虫(诸如果蝇和半翅目)中的致死RNAi效应的信息，选择用于RNAi靶向的候选基因。假设这些基因对于鞘翅目和/或半翅目昆虫的存活和生长是必需的。对于选定的靶基因，在转录物组序列数据库中鉴定其同源物，如下文所述。通过PCR扩增靶基因的全长或部分序列来制备用于产生双链RNA(dsRNA)的模板。
使用候选蛋白质编码序列针对含有未装配的叶甲属序列读段或已装配的重叠群的可BLAST数据库进行TBLASTN搜索。对于与叶甲属序列的显著命中(定义为：对于重叠群同源性，好于e-20；对于未装配的序列读段同源性，好于e-10)，使用BLASTX针对NCBI非冗余数据库加以确认。此BLASTX搜索的结果确认，在TBLASTN搜索中鉴定的叶甲属同源物候选基因序列确实包含叶甲属基因，或者是针对叶甲属序列中存在的非叶甲属候选基因序列的最佳命中。在大多数情况下，被注释为编码蛋白质的半翅目候选基因呈现出明确的与叶甲属转录物组序列中的一种或多种序列的序列同源性。在少数情况下可明显看出，某些基于与非叶甲属候选基因的同源性选择的叶甲属重叠群或未装配的序列读段有重叠，而且重叠群的装配未能连接起这些重叠。在这些情况下，使用v4.9(GENE CODESCORPORATION,Ann Arbor,MI)将序列装配成更长的重叠群。
编码叶甲属rop(SEQ ID NO:1)的候选靶基因被鉴定为可以导致鞘翅目害虫死亡、WCR中生长抑制、发育抑制、或生殖抑制的基因。
与WCR rop同源的基因
ROP含有Sec1家族(pfam00995)的保守结构域。已知Sec1家族蛋白涉及突触传导和普通分泌。其他也含有这个结构域的玉米根萤叶甲蛋白可能共享结构和/或功能性质，因此编码这些蛋白质之一的基因可能包括可导致鞘翅目害虫死亡、WCR中生长抑制、发育抑制、或生殖抑制的候选靶基因。
在黑腹果蝇中，编码Ras和RAS对立物(rop)的基因从一种双向启动子以不同方向转录(Harrison等人，(1995)Genetics 139:1701-1709)。68kDa的ROP蛋白与酿酒酵母蛋白SLT1、SEC1和SLP1享有序列同源性，后面这些蛋白质均涉及酵母细胞区室之间的囊泡运输(Salzberg等人，(1993)Development 117:1309-1319)。此外，ROP以剂量依赖性方式调节神经递质释放(Wu等人，(1998)EMBO Journal 17:127-139)。rop dsRNA转基因可与其他dsRNA分子组合以提供冗余的RNAi靶向和协同的RNAi效应。表达靶向rop的dsRNA的转基因玉米事件用于防止玉米根虫引起的噬根性损害(root feeding damage)。rop dsRNA转基因提供了新的作用模式，可以用来与苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白技术在昆虫抗性管理基因叠加(Insect Resistance Management gene pyramid)中组合，以减缓根虫群体对这两种根虫控制技术中的任一者发展抗性。
利用叶甲属候选基因rop的序列的全长或部分克隆来生成用于dsRNA合成的PCR扩增子。
SEQ ID NO:1显示了叶甲属rop的4816bp DNA序列。
SEQ ID NO:3显示了rop reg1的392bp DNA序列。
SEQ ID NO:4显示了rop reg2的627bp DNA序列。
SEQ ID NO:114显示了rop v3的201bp DNA序列。
实施例2
扩增靶基因产生dsRNA
设计引物通过PCR扩增每个靶基因的编码区部分。(参见表1以及SEQ ID NO:112和113)。在适当的情况下，将T7噬菌体启动子序列(TTAATACGACTCACTATAGGGAGA；SEQ ID NO:5)引入扩增的有义或反义链的5'端。参见表1。从WCR提取总DNA，并使用相对的引物，使用第一链cDNA作为模板进行PCR反应，引物的位置可扩增天然靶基因序列的全部或部分。还从包含黄色荧光蛋白(YFP)(SEQ ID NO:6；Shagin等人，(2004)Mol.Biol.Evol.21(5):841-50)编码区的DNA克隆扩增了dsRNA。
表1.用于扩增示例性rop靶基因和YFP阴性对照基因的编码区部分的引物和引物对
实施例3
RNAi构建体
通过PCR制备模板和dsRNA合成。图1中显示了一种提供特异性模板用于产生rop和YFPdsRNA的策略。使用表1中的引物对、以及从分离自WCR第一龄幼虫的总RNA制备的第一链cDNA(作为PCR模板)，制备了准备在rop dsRNA合成中使用的模板DNA。对于每个选定的rop和YFP靶基因区，PCR扩增在扩增的有义和反义链的5'端导入了一个T7启动子序列(YFP区段扩增自YFP编码区的DNA克隆)。然后将每个靶基因区的两个PCR扩增片段以大致相等的量混合，并将该混合物用作产生dsRNA的转录模板。参见图1。被特定引物对扩增的dsRNA模板序列是：SEQ ID NO:3(rop reg1)、SEQ ID NO:4(rop reg2)、SEQ ID NO:114(rop v3)、和YFP(SEQ ID NO:6)。合成用于昆虫生物测定的双链RNA，并使用RNAi试剂盒遵循制造商的说明书(INVITROGEN)进行纯化。使用分光光度计(THERMO SCIENTIFIC,Wilmington,DE)测量dsRNA的浓度。
植物转化载体的构建。使用化学合成的片段(DNA2.0,Menlo Park,CA)的组合以及标准分子克隆方法，组装了包含具有rop(SEQ ID NO:1)的区段的用于发夹形成的靶基因构建体的入门载体(pDAB112649和pDAB115766)。通过(在单一转录单位内)安排两个拷贝的靶基因区段彼此相反取向来易化RNA初级转录物形成分子内发夹，其中两个区段相隔一个ST-LS1内含子序列(SEQ ID NO:16)(Vancanneyt等人，(1990)Mol.Gen.Genet.220(2):245-50)。因此，初级mRNA转录物含有被内含子序列分开的两个rop基因区段，其中两个区段互为大的反向重复序列。用玉米泛素1启动子的拷贝(美国专利No.5,510,474)来驱动初级mRNA发夹转录物的产生，并用包含来自玉米过氧化物酶5基因的3'非翻译区(ZmPer5 3'UTR v2；美国专利No.6,699,984)的片段来终止表达发夹RNA的基因的转录。
入门载体pDAB112649包含rop v1发夹RNA构建体(SEQ ID NO:13)，其含有rop(SEQID NO:1)的一个区段。
入门载体pDAB115766包含rop v3发夹-RNA构建体(SEQ ID NO:14)，其含有不同于pDAB112649中所见的rop(SEQ ID NO:1)区段。
使用上述入门载体pDAB112649和pDAB115766与典型的二元目标载体(pDAB109805)进行标准重组反应，分别产生了用于土壤杆菌介导的玉米胚转化的rop发夹RNA表达转化载体(pDAB114515和pDAB115770)。
通过典型的二元目标载体(pDAB109805)与入门载体pDAB101670的标准重组反应，构建了包含表达YFP发夹dsRNA的基因的阴性对照二元载体pDAB110853。入门载体pDAB101670包含处于玉米泛素1启动子(如上文)的表达控制之下的YFP发夹序列(SEQ ID NO:15)和包含来自玉米过氧化物酶5基因(如上文)的3'非翻译区的片段。
二元目标载体pDAB109805包含处于甘蔗杆状DNA病毒(ScBV)启动子(Schenk等人，(1999)Plant Molec.Biol.39:1221-30)的调节之下的除草剂抗性基因(芳氧基链烷酸酯双加氧酶；AAD-1v3)(美国专利7838733(B2)，和Wright等人，(2010)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.107:20240-5)。一个人工5'UTR序列定位在SCBV启动子区段的3'端与AAD-1编码区的起始密码子之间，该5'UTR序列由来自玉米线条病毒(MSV)外壳蛋白基因5'UTR和来自玉米醇脱氢酶1(ADH1)基因的内含子6的序列组成。利用一个包含玉米脂肪酶基因的3'非翻译区(ZmLip 3'UTR；美国专利No.7,179,902)的片段来终止AAD-1mRNA的转录。
通过典型的二元目标载体(pDAB9989)与入门载体pDAB100287的标准重组反应，构建了另一个包含表达YFP蛋白的基因的阴性对照二元载体pDAB110556。二元目标载体pDAB9989包含处于玉米泛素1启动子(如上文)的表达调节之下的除草剂抗性基因(芳氧基链烷酸酯双加氧酶；AAD-1v3)(如上文)和一个包含来自玉米脂肪酶基因的3'非翻译区(ZmLip 3'UTR；如上文)的片段。入门载体pDAB100287包含处于玉米泛素1启动子(如上文)的表达控制之下的YFP编码区(SEQ ID NO:17)和一个包含来自玉米过氧化物酶5基因(如上文)的3'非翻译区的片段。
SEQ ID NO:13表示如见于pDAB114515中的rop v1发夹-RNA形成序列。
SEQ ID NO:14表示如见于pDAB115770中的rop v3发夹-RNA形成序列。
实施例4
昆虫饵料生物测定法
样品制备和生物测定法合成了许多dsRNA分子(包括对应于rop reg1(SEQ ID NO:3)、rop reg2(SEQ ID NO:4)、和rop v3(SEQ ID NO:114)，并使用RNAi试剂盒加以纯化。纯化的dsRNA分子配制在TE缓冲液中，所有生物测定都包含由此缓冲液组成的对照处理，用作WCR(玉米根萤叶甲)死亡率或生长抑制的背景检查。使用分光光度计(THERMO SCIENTIFIC,Wilmington,DE)测量生物测定缓冲液中的dsRNA分子的浓度。
用人工昆虫饵料喂养的新生昆虫幼虫进行生物测定来检测样品的昆虫活性。WCR卵从CROP CHARACTERISTICS,INC.(Farmington,MN)获得。
生物测定在特别为昆虫生物测定设计的128孔塑料托盘(C-D INTERNATIONAL,Pitman,NJ)中进行。每个孔含有大约1.0mL的为鞘翅目昆虫生长设计的人工饵料。通过移液管将60μL等份的dsRNA样品移送到每个孔的饵料的表面上(40μL/cm2)。dsRNA样品浓度按照每平方厘米的孔中表面积(1.5cm2)的dsRNA量(ng/cm2)计算。将经过处理的托盘保持在通风罩中，直到饵料表面上的液体蒸发或被吸收到饵料中时为止。
在羽化的几小时内，用湿润的驼毛刷将个体幼虫拾起并放置在处理过的饵料(每个孔一条或两条幼虫)上。然后用粘性透明塑料片密封128孔塑料托盘的孳生孔，并进行通风以允许气体交换。将生物测定托盘保持在控制的环境条件下(28℃，约40％相对湿度，16:8(光:暗))持续9天，此后记录暴露于每个样品的昆虫的总数、死亡昆虫的数量、和存活昆虫的重量。计算每次处理的平均死亡率百分比和平均生长抑制。生长抑制(GI)计算如下：
GI＝[1–(TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)]
其中TWIT为处理中的活昆虫的总重量；
TNIT为处理中的昆虫的总数；
TWIBC为背景检查(缓冲液对照)中活昆虫的总重量；并且
TNIBC为背景检查(缓冲液对照)中昆虫的总数。
使用软件(SAS,Cary,NC)完成统计分析。
LC50(致死浓度)定义为50％测试昆虫被杀死时的剂量。GI50(生长抑制)定义为测试昆虫的平均生长(例如，活重)为背景检查样品中所见的平均值的50％时的剂量。
重复生物测定证明，特定样品的摄取导致令人惊奇和出乎意料的玉米根虫幼虫死亡率和生长抑制。
实施例5
候选靶基因的筛选
在基于饵料的测定中，当将设计为抑制实施例1中鉴定的靶基因序列的合成dsRNA给予至WCR时，引起了死亡和生长抑制。在这个测定中观察到，rop reg1、rop reg2、和ropv3表现出的效力相比于其他筛选的dsRNA大幅增加。
重复的生物测定证明，对分别来源于rop reg1、rop reg2、和rop v3的dsRNA制备物的摄取导致西方玉米根虫幼虫的死亡和/或生长抑制。表2和表3显示了在WCR幼虫暴露于这些dsRNA 9天之后的基于饵料的饲喂生物测定的结果，以及从黄色荧光蛋白(YFP)编码区(SEQ ID NO:6)制备的dsRNA的阴性对照样品获得的结果。
表2.利用西方玉米根虫幼虫进食9天之后获得的rop dsRNA饵料进食测定的结果。ANOVA分析发现在平均死亡率％和平均生长抑制(GI)％上的显著差异使用Tukey--Kramer检验分离平均值。
*SEM＝平均标准误差。刮弧中的字母指明统计水平。不是由相同字母连接的水平是显著不同的(P<0.05)。
**TE＝Tris HCl(10mM)加EDTA(1mM)缓冲液，pH8。
***YFP＝黄色荧光蛋白
表3.rop dsRNA在WCR幼虫上的口服效力(ng/cm2)的总结。
基因名称 LC50 范围 GI50 范围
rop reg1 20.4 13.63到30.11 5.91 4.29到8.15
rop reg2 29.67 19.32到45.41 7.07 2.15到23.22
rop v3 25.35 18.46到34.47 10.06 6.32到16.00
以前有人提出，某些叶甲属物种基因可以用于RNAi介导的昆虫控制。参见美国专利公开号2007/0124836，其公开了906个序列，以及美国专利7,614,924，其公开了9,112个序列。然而确定了，许多被提示对RNAi介导的昆虫控制基因对控制叶甲属无效。还确定了，与表明其他对于RNAi介导的昆虫控制有用的基因相比，序列rop reg1、rop reg2、和rop v3各自提供了令人惊奇和出乎意料的优越的叶甲属控制。
例如，美国专利7,614,924提出，膜联蛋白、β血影蛋白2和mtRP-L4都在RNAi介导的昆虫控制中有效。SEQ ID NO:18为膜联蛋白区1(Reg 1)的DNA序列，SEQ ID NO:19为膜联蛋白区2(Reg 2)的DNA序列。SEQ ID NO:20为β血影蛋白2区1(Reg 1)的DNA序列，SEQ ID NO:21为β血影蛋白2区2(Reg 2)的DNA序列。SEQ ID NO:22为mtRP-L4区1(Reg 1)的DNA序列，并且SEQ ID NO:23为mtRP-L4区2(Reg 2)的DNA序列。还使用了YFP序列(SEQ ID NO:6)产生用作阴性对照的dsRNA。
分别利用上述序列通过实施例3中的方法来产生dsRNA。提供用于产生dsRNA的特异性模板的策略显示在图2中。使用表4中的引物对和从分离自WCR第一龄幼虫的总RNA制备的第一链cDNA(作为PCR模板)，制备了准备了在dsRNA合成中使用的模板DNA。(YFP从DNA克隆扩增。)对于每个选择的靶基因区，进行两个单独的PCR扩增。第一个PCR扩增在扩增的有义链的5'端引入T7启动子序列。第二个反应在反义链的5'端引入T7启动子序列。然后将每个靶基因区的两个PCR扩增片段以大致相等的量混合，并将混合物用作dsRNA产生的转录模板。参见图2。合成双链RNA，并使用 RNAi试剂盒遵循制造商的说明书(INVITROGEN)进行纯化。使用分光光度计(THERMOSCIENTIFIC,Wilmington,DE)测量dsRNA的浓度。并通过上述相同的基于饵料的生物测定方法测试每一种dsRNA。表4列出了用来产生膜联蛋白Reg1、膜联蛋白Reg2、β血影蛋白2Reg1、β血影蛋白2Reg2、mtRP-L4Reg1、和mtRP-L4Reg2dsRNA分子的引物的序列。在图2描绘的方法中使用的YFP引物序列也在表4中列出。表5呈现了WCR幼虫在暴露于这些dsRNA分子9天之后的基于饵料的饲喂生物测定的结果。重复的生物测定证明，在以上西方玉米根虫幼虫中，摄取这些dsRNA没有导致超过TE缓冲液、水、或YFP蛋白等对照样品中所见的死亡或生长抑制。
表4.用来扩增基因编码区的多个部分的引物和引物对。
表5.利用西方玉米根虫幼虫9天之后获得的饵料进食测定的结果。
*TE＝Tris HCl(10mM)加EDTA(1mM)缓冲液，pH8。
**YFP＝黄色荧光蛋白
实施例6
包含杀虫发夹dsRNA的转基因玉米组织的产生
土壤杆菌介导的转化
在土壤杆菌介导的转化之后，制成了通过表达稳定地整合到植物基因组中的嵌合基因而产生一种或多种杀虫dsRNA分子(例如，至少一种dsRNA分子，包括靶向含有rop SEQID NO:1的基因的dsRNA分子)的转基因玉米细胞、组织、和植物。采用超二元或二元转化载体的玉米转化方法是本领域中已知的，正如例如美国专利8,304,604中所描述。通过转化的组织在含吡氟氯禾灵的培养基上生长的能力选择它们，并视情况适宜筛选其dsRNA产生。可以将一部分这样的转化的组织培养物提供给新生玉米根虫幼虫以进行生物测定，基本上如实施例4中所描述。
土壤杆菌培养启动将包含上述(实施例3)二元转化载体pDAB114515、pDAB115770、pDAB110853或pDAB110556的土壤杆菌菌株DAt13192细胞(WO 2012/016222A2)的甘油储划线接种在含有适当抗生素的AB基本培养基平板(Watson等人，(1975)J.Bacteriol.123:255-264)上，并在20℃培养3天。然后将培养物划线接种在含有相同抗生素的YEP平板(gm/L：酵母提取物10；蛋白胨10；NaCl 5)上，并在20℃温育1天。
土壤杆菌培养在实验当天，以适合于实验中的构建体数目的体积制备接种培养基和乙酰丁香酮的储液，并将其移液到无菌的一次性250mL烧瓶中。接种培养基(Frame等人，(2011)Genetic Transformation Using Maize Immature Zygotic Embryos.IN PlantEmbryo Culture Methods and Protocols:Methods in Molecular Biology.T.A.Thorpeand E.C.Yeung,(Eds),Springer Science and Business Media,LLC.pp 327-341)含有：2.2gm/L MS盐；1X ISU改良的MS维生素(Frame等人，ibid.)；68.4gm/L蔗糖；36gm/L葡萄糖；115mg/L脯氨酸；和100mg/L肌醇；pH为5.4)。将乙酰丁香酮以200μM的终浓度(从100％二甲亚砜中的1M储液)添加到含有接种培养基的烧瓶中，并充分混合溶液。
对于每种构建体，来自YEP平板的1或2个满接种环的土壤杆菌悬浮在一次性50mL无菌离心管内15mL的接种培养基/乙酰丁香酮储液中，在分光光度计中在550nm(OD550)处测量溶液的光密度。然后使用另外的接种培养基/乙酰丁香酮混合物将悬液稀释到0.3到0.4的OD550。然后将土壤杆菌悬液的管水平放置在设置为在室温下约75rpm的平台摇床上，并在进行胚切开的同时振摇1到4小时。
穗消毒和胚分离未成熟玉米胚从玉米近交系B104(Hallauer等人，(1997)CropScience 37:1405-1406)植物获得，所述植物在温室中培养，并进行自花授粉或近亲授粉以产生穗。在授粉后大约10到12天收获穗。在实验当天，将穗脱壳，并通过浸没在20％市售漂白剂(ULTRAGermicidal Bleach，6.15％次氯酸钠；加两滴吐温20)的溶液中并振摇20到30分钟进行表面消毒，随后在层流罩内在无菌去离子水中冲洗三次。从每个穗无菌切下未成熟合子胚(1.8到2.2mm长)并随机分配到微量离心管中，每根微量离心管含有2.0mL的液体接种培养基中的适当土壤杆菌细胞的悬液，其中含200μM乙酰丁香酮，并添加了2μL的10％BREAK-S233表面活性剂(EVONIK INDUSTRIES；Essen,Germany)。对于一套给定的实验，每次转化均使用来自汇集的穗的胚。
土壤杆菌共培养在分离之后，将胚在摇动平台上放置5分钟。然后将管的内容物倾倒到共培养基的平板上，所述培养基含有4.33gm/L MS盐；1X ISU改良的MS维生素；30gm/L蔗糖；700mg/L L--脯氨酸；在KOH中的3.3mg/L的麦草畏(3,6-二氯-o-茴香酸或3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸)；100mg/L肌醇(myo-inositol)；100mg/L酪蛋白酶水解物；15mg/L AgNO3；200μM溶于DMSO中的乙酰丁香酮；和3gm/L GELZANTM，pH为5.8。用无菌一次性移液管移除液态土壤杆菌悬液。然后借助于显微镜，使用无菌镊子使胚定向为盾片面向朝上。盖上平板，用医用胶带密封，并放置在具有大约60μmol m-2s-1的光合有效辐射(PAR)的连续光照的25℃培养箱中。
愈伤组织选择和转基因事件的再生在共培养期之后，将胚转移到静息培养基上，静息培养基的组成为：4.33gm/L MS盐；1X ISU改良的MS维生素；30gm/L蔗糖；700mg/L L-脯氨酸；溶于KOH中的3.3mg/L的麦草畏；100mg/L肌醇；100mg/L酪蛋白酶水解物；15mg/LAgNO3；0.5gm/L MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸一水合物；PHYTOTECHNOLOGIES LABR.；Lenexa,KS)；250mg/L羧苄青霉素；和2.3gm/L GELZANTM；pH为5.8。将不超过36个胚移到每个平板上。将平板放置在透明的塑料盒中，在27℃下在大约50μmol m-2s-1PAR的连续光照下温育7到10天。然后将愈伤的胚转移(<18个/板)到选择培养基I上，所述培养基由具有100nM吡氟氯禾灵酸(R-Haloxyfop acid)(0.0362mg/L；用于选择包含AAD-1基因的愈伤组织)的静息培养基(上文)构成。将平板返回到透明盒中，在27℃下在大约50μmol m-2s-1PAR的连续光照下温育7天。然后将愈伤的胚转移(<12个/板)到选择培养基II上，所述培养基由具有500nM吡氟氯禾灵酸(R-Haloxyfop acid)(0.181mg/L)的静息培养基组成。将平板返回到透明盒中，在27℃下在大约50μmol m-2s-1PAR的连续光照下温育14天。这一选择步骤允许转基因愈伤组织进一步增殖和分化。
将增殖中的胚性愈伤组织转移到(<9个/板)预再生培养基上。预再生培养基含有4.33gm/L MS盐；1X ISU改良的MS维生素；45gm/L蔗糖；350mg/L L-脯氨酸；100mg/L肌醇；50mg/L酪蛋白酶水解物；1.0mg/L AgNO3；0.25gm/L MES；溶于NaOH中的0.5mg/L萘乙酸；溶于乙醇中的2.5mg/L脱落酸；1mg/L 6-苄氨基嘌呤；250mg/L羧苄青霉素；2.5gm/L GELZANTM；和0.181mg/L吡氟氯禾灵酸；pH为5.8。将平板保存在透明盒中，在27℃下在大约50μmol m- 2s-1PAR的连续光照下温育7天。然后将再生中的愈伤组织转移到(<6个/板)PHYTATRAYSTM(SIGMA-ALDRICH)中的再生培养基上，在28℃以每天16小时光照/8小时黑暗(以大约160μmol m-2s-1PAR)温育14天，直到发出芽和根为止。再生培养基含有4.33gm/L MS盐；1X ISU改良的MS维生素；60gm/L蔗糖；100mg/L肌醇；125mg/L羧苄青霉素；3gm/L GELLANTM胶；和0.181mg/L吡氟氯禾灵酸(R-Haloxyfop acid)；pH为5.8。然后分离具有主根的小芽，并不经选择直接转移到伸长培养基上。伸长培养基含有4.33gm/L MS盐；1X ISU改良的MS维生素；30gm/L蔗糖；和3.5gm/L:pH为5.8。
通过它们在含有吡氟氯禾灵的培养基上生长的能力而选择出转化植物芽，将所述芽从PHYTATRAYSTM移栽到填充有生长培养基(PROMIX BX；PREMIER TECH HORTICULTURE)的小盆中，小盆用杯子或HUMI-DOMES(ARCO PLASTICS)覆盖，然后在CONVIRON生长室中炼苗(27℃白天/24℃夜晚，16小时光周期，50-70％RH，200μmol m-2s-1PAR)。在一些情况下，分析推定的转基因小植物的转基因相对拷贝数，这使用设计用于检测整合到玉米基因组中的AAD1除草剂耐受基因的引物通过定量实时PCR测定来完成。此外，利用RNA qPCR测定来检测在推定的转化体表达的dsRNA中ST-LS1内含子序列的存在。然后将选定的转化小植物移动到温室中，以便进一步生长和测试。
转移T 0 植物和在温室中定植以进行生物测定和产生种子当植物达到V3-V4期时，将其移栽到IE CUSTOM BLEND(PROFILE/METRO MIX 160)土壤混合物中，在温室中(光曝露类型：光或同化作用；高光限值：1200PAR；16-小时昼长；27℃白天/24℃夜晚)培植至开花。
将要用于昆虫生物测定的植物从小盆移栽到TINUSTM350-4(SPENCER-LEMAIRE INDUSTRIES,Acheson,Alberta,Canada)(每每事件一个植物)。在移栽到约四天后，侵染植物以进行生物测定。
通过对T0转基因植物的穗丝授粉，其中花粉从非转基因良种近交系B104或其他适当的花粉供体采集而来，并种植所得的种子而获得T1代植物。在可能时进行互交。
实施例7
转基因玉米组织的分子分析
对在评估噬根损害的同日从温室培植的植物采集的叶和根的样品进行了玉米组织的分子分析(例如，RNA qPCR)。
用对Per5 3'UTR的RNA qPCR测定结果来验证发夹转基因的表达。(在非转化的玉米植物中预期会检出低水平的Per5 3'UTR，因为在玉米组织中通常存在内源Per5基因表达)。用针对表达的RNA中ST-LS1内含子序列(为形成dsRNA发夹分子所必需)的RNA qPCR测定结果来验证发夹转录物的存在。测量了相对于内源玉米基因的RNA水平的转基因RNA表达水平。
通过DNA qPCR分析检测基因组DNA中AAD1编码区的一部分，用来估计转基因***拷贝数。从培植在环境室中的植物采集样品用于这些分析。将结果与旨在检测单拷贝天然基因的一部分的测定法的DNA qPCR结果进行比较，并将简单事件(具有一个或两个转基因拷贝)推进到温室中的进一步研究。
另外，用旨在检测大观霉素抗性基因(SpecR；包含在T-DNA外部的二元载体质粒上)的一部分的qPCR测定法来确定转基因植物是否含有无关的整合的质粒骨架序列。
发夹RNA转录物表达水平：Per5 3'UTR qPCR通过Per 5 3'UTR序列的实时定量PCR(qPCR)来分析愈伤组织细胞事件或转基因植物，以确定全长发夹转录物的相对表达水平，与内部玉米基因(SEQ ID NO:48；登录号BT069734)的转录物水平比较，所述内部玉米基因编码TIP41-样蛋白(即，登录号AT4G34270的玉米同源物；具有74％同一性的tBLASTX得分)。使用RNAEASYTM96试剂盒(QIAGEN,Valencia,CA)分离RNA。洗脱后，根据试剂盒建议的方案进行总RNA的DNAse1处理。然后在8000分光光度计(THERMO SCIENTIFIC)上将RNA定量，并将浓度归一化为25ng/μL。大体上按照制造商推荐的方案，使用高容量cDNA合成试剂盒(INVITROGEN)制备第一链cDNA，反应体积10μL，含有5μL变性RNA。略微改变该方案以包括将10μL的100μM T20VN寡核苷酸(IDT)(SEQ ID NO:49；TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN，其中V是A、C、或G，N是A、C、G、或T/U)添加到随机引物储备预混物的1mL管中，以制备随机引物和寡dT混合的工作储备液。
在cDNA合成后，以无核酸酶的水将样品以1:3稀释，并储存在-20℃直到用于测定时为止。
在LIGHTCYCLERTM480(ROCHE DIAGNOSTICS,Indianapolis,IN)上以10μL的反应体积分别进行Per5 3'UTR和TIP41样转录物的实时PCR测定。对于Per5 3'UTR测定，利用引物P5U76S(F)(SEQ ID NO:50)和P5U76A(R)(SEQ ID NO:51)、以及ROCHE UNIVERSAL PROBETM(UPL76；目录号4889960001；用FAM标记)进行反应。对于TIP41-样参考基因测定，使用引物TIPmxF(SEQ ID NO:52)和TIPmxR(SEQ ID NO:53)、以及标记有HEX(六氯荧光素)的探针HXTIP(SEQ ID NO:54)。
所有测定都包括没有模板的阴性对照(仅有预混物)。为制备标准曲线，在源板中还包括空白(源孔中加水)，以检查样品交叉污染。在表6中列出了引物和探针序列。用于检测各种转录物的反应成分配方在表7中公开，PCR反应条件概述于表8中。在465nm处激发FAM(6-羧基荧光素亚磷酰胺)荧光部分，并测量在510nm处的荧光；HEX(六氯荧光素)荧光部分的对应值为533nm和580nm。
表6.用于转基因玉米中转录物水平的分子分析的引物序列。
*TIP41-样蛋白。
**NAv序列无法从供应商获得
表7.用于转录物检测的PCR反应配方。
表8.用于qPCR的热循环仪条件。
使用LIGHTCYCLERTM软件v1.5，根据供应商的推荐利用二阶导数最大算法计算Cq值，通过相对定量分析数据。对于表达分析，使用ΔΔCt方法(即，2-(Cq TARGET–Cq REF))计算表达值，所述方法依赖于比较两个靶之间的Cq值的差异，其中假定对于优化的PCR反应条件，每个循环产物都加倍，基值选择为2。
发夹转录物大小和完整性：Northern印迹测定在一些情况下，利用Northern印迹(RNA印迹)分析来确定在表达rop发夹dsRNA的转基因植物中rop发夹RNA的分子大小，从而获得转基因植物的另外的分子表征。
所有的材料和设备在使用之前用RNAZAP(AMBION/INVITROGEN)处理。将组织样品(100mg到500mg)采集到2mL SAFELOCK EPPENDORF管中，用配备三个钨珠的KLECKOTM组织粉碎器(GARCIA MANUFACTURING,Visalia,CA)在1mLTRIZOL(INVITROGEN)中破碎5分钟，然后在室温(RT)下温育10分钟。任选地，将样品在4℃在11,000rpm下离心10分钟，并将上清液转移到新鲜的2mL SAFELOCK EPPENDORF管中。在将200μL的氯仿添加到匀浆中之后，通过翻转该管2到5分钟进行混合，在RT下温育10分钟，并在4℃在12,000x g下离心15分钟。将上层相转移到无菌的1.5mL EPPENDORF管中，添加600μL的100％异丙醇，在RT温育10分钟到2小时之后，然后在4°到25℃在12,000x g下离心10分钟。弃去上清液，用1mL的70％乙醇将RNA离心沉淀物洗涤两次，在两次洗涤之间，在4°到25℃在7,500x g下离心10分钟。弃去乙醇，将离心沉淀物快速风干3到5分钟，然后重悬在50μL无核酸酶的水中。
使用(THERMO-FISHER)对总RNA定量，并将样品归一化为5μg/10μL。然后向每个样品中加入10μL的乙二醛(AMBION/INVITROGEN)。将5到14ng的DIG RNA标准标志物预混物(ROCHE APPLIED SCIENCE,Indianapolis,IN)分配并添加到等体积的乙二醛中。在50℃使样品和标志物RNA变性45分钟，并保存在冰上，直到上样到在NORTHERNMAX10X乙二醛运行缓冲液(AMBION/INVITROGEN)中的1.25％SEAKEM金琼脂糖(LONZA,Allendale,NJ)凝胶上为止，通过在65伏特/30mA下电泳2小时15分钟分离RNA。
电泳之后，在2X SSC冲洗凝胶5分钟，在凝胶DOC工作站(BIORAD,Hercules,CA)上成像，然后在RT过夜使RNA被动转移到尼龙膜(MILLIPORE)上，其中使用10X SSC作为转移缓冲液(由3M氯化钠和300mM柠檬酸三钠组成的20X SSC，pH 7.0)。转膜后，在2X SSC中冲洗膜5分钟，通过UV使RNA与该膜交联(AGILENT/STRATAGENE)，并使该膜在RT下干燥2天。
使膜在ULTRAHYB缓冲液(AMBION/INVITROGEN)中预杂交1到2小时。探针由含有感兴趣序列(例如，SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的反义序列部分，视情况适宜)的PCR扩增产物组成，其通过ROCHE APPLIED SCIENCE DIG程序用地高辛配基标记。在杂交管中推荐的缓冲液中60℃的温度下杂交过夜。杂交后，对印迹进行DIG洗涤，包装，暴露于胶片1到30分钟，然后将胶片显影，所有这些都通过DIG试剂盒的供应商推荐的方法来进行。
转基因拷贝数确定
将大约等同于2个叶冲孔块的玉米叶片收集在96孔的收集平板(QIAGEN)中。用配备一个不锈钢珠的KLECKOTM组织粉碎器(GARCIA MANUFACTURING,Visalia,CA)在BIOSPRINT96AP1溶解缓冲液(与BIOSPRINT96PLANT KIT一起提供；QIAGEN)中进行组织破碎。组织浸软之后，使用BIOSPRINT96PLANT KIT和BIOSPRINT96提取机器人以高通量形式分离基因组DNA(gDNA)。在设立qPCR反应之前，以2:3的DNA:水稀释基因组DNA。
qPCR分析通过使用***的实时PCR，借助水解探针测定来进行转基因检测。使用PROBE DESIGN SOFTWARE 2.0设计了要在水解探针测定中用于检测ST-LS1内含子序列(SEQ ID NO:16)、或检测SpecR基因(即，负载在二元载体质粒上的大观霉素抗性基因；SEQ ID NO:55；在表9中的SPC1寡核苷酸)的一部分的寡核苷酸。此外，使用PRIMER EXPRESS软件(APPLIED BIOSYSTEMS)设计了要在水解探针测定中用于检测AAD-1耐除草剂基因(SEQ ID NO:56；在表9中的GAAD1寡核苷酸)的区段的寡核苷酸。表9显示了引物和探针序列。测定用内源玉米染色体基因(转化酶(SEQ ID NO:57；登录号U16123；在本文中称为IVR1)的试剂多重化，所述基因用作内部参考序列以确保在每个测定中都存在gDNA。为了扩增，制备了在10μL体积的多重反应物中的1X终浓度的PROBES母液混合物(ROCHE APPLIED SCIENCE)，其含有每种引物各0.4μM，以及每种探针各0.2μM(表10)。如表11中概述进行两步扩增反应。FAM-和HEX-标记探针的荧光团活化和发射如上文所述；CY5偶联物在650nm处最大激发，并且在670nm处发最大荧光。
使用拟合点算法(软件发行版本1.5)和相对定量模块(基于ΔΔCt方法)，根据实时PCR数据确定Cp得分(荧光信号与背景阈值杂交的点)。如前所述处理数据(上文；RNA qPCR)。
表9.用于基因拷贝数确定和二元载体质粒骨架检测的引物和探针(具有荧光偶联物)的序列。
CY5＝花菁-5
表10.用于基因拷贝数分析和质粒骨架检测的反应成分
成分 量(μL) 储液 终浓度
2X缓冲液 5.0 2X 1X
适当的正向引物 0.4 10μM 0.4
适当的反向引物 0.4 10μM 0.4
适当的探针 0.4 5μM 0.2
IVR1-正向引物 0.4 10μM 0.4
IVR1-反向引物 0.4 10μM 0.4
IVR1-探针 0.4 5μM 0.2
H2O 0.6 NA* NA
gDNA 2.0 ND** ND
总计 10.0
*NA＝不适用
**ND＝未确定
表11.用于DNA qPCR的热循环仪条件
实施例8
转基因玉米的生物测定
体外昆虫生物测定通过生物测定方法来证实在植物细胞中产生的本主题发明的dsRNA的生物活性。参见，例如，Baum等人，(2007)Nat.Biotechnol.25(11):1322-1326。人们能够例如通过在受控的饲喂环境下给靶昆虫喂食来源于产生杀虫dsRNA的植物的各种植物组织或组织片来证实效力。或者，从来源于产生杀虫dsRNA的植物的各种植物组织制备提取物，并将提取的核酸分配在用于如以前在本文中描述的生物测定的人工饵料上面。将这样的饲喂测定的结果与类似方式进行的采用来自不产生杀虫dsRNA的宿主植物的适当对照组织、或其他对照样品的生物测定进行比较。
关于转基因玉米事件的昆虫生物测定
选择从经洗涤的卵孵化的两条西方玉米根虫幼虫(1到3日龄)并将其置于生物测定托盘的每个孔中。然后将这些孔用“拉-揭”(PULL N’PEEL)护盖(BIO-CV-16,BIO-SERV)覆盖，并置于具有18小时/6小时光照/黑暗周期的28℃培养箱中。在初始侵染9日之后，评估幼虫死亡率，其按照死亡昆虫占的每次处理中昆虫总数的百分比来计算。将昆虫样品在-20℃冷冻两天，然后汇集来自每个处理的昆虫幼虫并称重。生长抑制百分比按照实验处理的平均重量除以两个对照孔处理的平均重量的均值来计算。数据表示为(阴性对照的)生长抑制百分比。将超过对照平均重量的平均重量归一化为零。
温室中的昆虫生物测定从CROP CHARACTERISTICS(Farmington,MN)收到带有西方玉米根虫(WCR，玉米根萤叶甲)卵的土壤。在28℃温育WCR卵10到11天。洗掉卵上的土壤，将卵置于0.15％琼脂溶液中，浓度调节至每0.25mL等份大约75个到100个卵。将一份卵悬浮液加入培养皿中以设置孵化平板，用于监测孵化速率。
用150到200个WCR卵侵染中生长的玉米植物周围的土壤。允许昆虫摄食2周，在这段时间之后，对每个植物给出“根评级”。利用一个节损伤量表进行分级，大体上如Oleson等人，(2005,J.Econ.Entomol.98:1-8)所述。将通过了这个生物测定的植物移栽到18.9升的盆中供产生种子。用杀虫剂处理移植物以防止进一步根虫损害和昆虫释放到温室中。将植物人工授粉以产生种子。保存由这些植物产生的种子以评估植物的T1和后续世代。
温室生物测定包括两种阴性对照植物。转基因阴性对照植物通过用包含设计为产生黄色荧光蛋白(YFP)的基因或YFP发夹dsRNA的载体转化而生成(参见实施例4)。非转化的阴性对照植物从品系7sh382或B104的种子培植而来。在两个不同的日期进行生物测定，其中每一组植物材料中均包括阴性对照。
表12显示了rop-发夹植物的分子分析和生物测定的结果汇总。考察总结在表12中的生物测定结果揭示了一项令人惊奇和出乎意料的观察结果，即，大多数包含表达含有SEQID NO:1区段(例如，如在SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14中例示的)的rop发夹dsRNA的构建体的转基因玉米植物受到保护而免于通过喂养西方玉米根虫幼虫招致的根损害。37个被分级的事件中的二十二个具有0.5或更低的根评级。表13显示了阴性对照植物的分子分析和生物测定的合并结果。大多数植物不具有针对WCR幼虫喂养的保护，尽管34个被分级的植物中有五个具有0.75或更低的根评级。在阴性对照植物组中有时观察到一些具有低的根评级的植物的存在，这反映出在温室环境中进行这种类型的生物测定的可变性和困难。
表12.表达rop-发夹的玉米植物的温室生物测定和分子分析结果。
*RTL＝针对TIP4-样基因转录物水平测量的相对转录物水平。
表13.包含转基因的阴性对照植物和非转化玉米植物的温室生物测定和分子分析结果。
*RTL＝针对TIP4-样基因转录物水平测量的相对转录物水平。
**NG＝由于植物尺寸小未予分级
***ND＝未进行。
实施例9
包含鞘翅目害虫序列的转基因玉蜀黍
如实施例6中所述生成10个到20个转基因T0玉蜀黍植物。获得另外的10--20个表达针对RNAi构建体的发夹dsRNA的T1玉蜀黍独立品系用于玉米根虫攻击。发夹dsRNA可以按照SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14中所列出而衍生，或进一步包含SEQ ID NO:1。更多的发夹dsRNA可以，例如，衍生自鞘翅目害虫序列，例如像Caf1-180(美国专利申请公开号2012/0174258)、VatpaseC(美国专利申请公开号2012/0174259)、Rho1(美国专利申请公开号2012/0174260)、VatpaseH(美国专利申请公开号2012/0198586)、PPI-87B(美国专利申请公开号2013/0091600)、RPA70(美国专利申请公开号2013/0091601)、或RPS6(美国专利申请公开号2013/0097730)。这些通过RT-PCR或其他分子分析方法得以证实。来自选定的独立T1系的总RNA制备物任选地用于RT--PCR，其中引物被设计为在每个RNAi构建体中的发夹表达盒的ST-LS1内含子中结合。另外，用于RNAi构建体中每个靶基因的特异性引物任选地用于扩增在植物内siRNA产生所需要的预加工mRNA，并用于确认所述预加工mRNA的产生。对于每个靶基因的期望条带的扩增可确认每个转基因玉蜀黍植物中发夹RNA的表达。随后任选地利用RNA印迹杂交在独立转基因系中确认靶基因的dsRNA发夹加工成siRNA。
而且，与靶基因具有80％以上序列同一性、具有错配序列的RNAi分子对玉米根虫的影响类似于与靶基因具有100％序列同一性的RNAi分子。错配序列与天然序列的配对在同一个RNAi构建体中形成发夹dsRNA，由此产生出能够影响摄食中的鞘翅目害虫的生长、发育和生存力的植物加工的siRNA。
对应于靶基因的dsRNA、siRNA、shRNA、或miRNA的植物内递送以及被鞘翅目害虫进食后的摄取，导致鞘翅目害虫中的靶基因由于RNA介导的基因沉默而下调。当靶基因在发育的一个或多个阶段发挥重要作用的时候，鞘翅目害虫的生长、发育和生殖受到影响，而且在WCR、NCR、SCR、MCR、玉米根萤叶甲、D.u.tenella、和D.u.undecimpunctata Mannerheim的至少一者的情况下，会导致鞘翅目害虫无法成功侵染、摄食、发育、和/或生殖，或导致其死亡。然后通过靶基因的选择和RNAi的成功应用来控制鞘翅目害虫。
转基因RNAi品系和非转化玉米的表型比较选用于创建发夹dsRNA的靶鞘翅目害虫基因或序列与任何已知的植物基因序列都没有相似性。因此不期望靶向这些鞘翅目害虫基因或序列的构建体的(***性)RNAi的产生或活化对转基因植物会有任何有害影响。然而，将转基因系的发育和形态特征与非转化植物、以及用没有发夹表达基因的“无效”(null)载体转化的那些转基因系进行比较。比较了植物根、芽、叶和生殖特征。转基因植物和非转化植物在根长和生长模式上没有可观察到的差异。植物地上部特征，诸如高度、叶数和大小、开花时间、花大小和外观之类，是相似的。总的来说，在体外以及在温室土壤中培养时，在转基因系和没有表达靶iRNA分子的那些品系之间没有可观察的形态差异。
实施例10
包含鞘翅目害虫序列和另外的RNAi构建体的转基因玉蜀黍
转基因玉米植物在其基因组中包含异源编码序列，所述异源编码序列被转录成靶向鞘翅目害虫之外的生物的iRNA分子，对这样的转基因植物通过土壤杆菌或WHISKERSTM方法(参见Petolino和Arnold(2009)Methods Mol.Biol.526:59-67)进行二次转化，以产生一种或多种杀虫dsRNA分子(例如，至少一种dsRNA分子，包括靶向包含SEQ ID NO:1的基因的dsRNA分子)。基本上如实施例3中所述制备植物转化质粒载体，经由土壤杆菌或WHISKERSTM-介导的转化方法递送到获自转基因Hi II或B104玉米植物的玉米悬浮细胞或未成熟玉米胚中，所述玉米植物在其基因组中包含异源编码序列，所述异源编码序列被转录成靶向鞘翅目害虫之外的生物的iRNA分子。
实施例11
包含RNAi构建体和另外的鞘翅目害虫控制序列的转基因玉米
转基因玉米植物在其基因组中包含被转录成靶向鞘翅目害虫生物的iRNA分子的异源编码序列(例如，至少一种dsRNA分子，包括靶向包含SEQ ID NO:1的基因的dsRNA分子)，对于这样的转基因玉米植物，通过土壤杆菌或WHISKERSTM方法(参见Petolino和Arnold(2009)Methods Mol.Biol.526:59-67)进行二次转化以产生一种或多种杀虫蛋白分子，例如，Cry3、或Cry34和Cry35Ab1杀虫蛋白。基本上如实施例3中所述制备植物转化质粒载体，经由土壤杆菌或WHISKERSTM-介导的转化方法递送到获自转基因B104玉米植物的玉米悬浮细胞或未成熟玉米胚中，所述玉米植物在其基因组中包含被转录成靶向鞘翅目害虫生物的iRNA分子的异源编码序列。获得产生用于控制鞘翅目害虫的iRNA分子和杀虫蛋白的双重转化植物。
实施例12
与ROP具有同源性的其他叶甲属序列
ROP蛋白(SEQ ID NO:2)含有Sec1家族(pfam00995)的保守结构域。已知Sec1家族蛋白涉及突触传导和普通分泌。利用hmmscan在WCR转录组序列中进行PFAM结构域预测。利用Sec1结构域的蛋白质同源性分析鉴定了42个其他的玉米根萤叶甲序列(SEQ ID NO:70到111)，这些序列编码的蛋白质含有Sec1结构域，因此可能与ROP蛋白共享结构和/或功能特性。因此，编码这些蛋白质的基因(即，SEQ ID NO:70--111)是通过本文中描述的方法用于叶甲属物种的RNAi介导的控制的其他候选者，所述物种包括WCR、NCR、SCR、MCR、玉米根萤叶甲、D.u.tenella、和D.u.undecimpunctata Mannerheim中的至少一种。
实施例13
在rop RNAi注射之后的新热带区布朗椿象(英雄美洲蝽)的死亡率
昆虫饲养用如下制备的BSB人工饵料(在制备好的两周内使用)饲养新热带区布朗椿象(BSB；英雄美洲蝽)。在MAGIC混合器中将冻干绿豆混合成细粉，同时在另一台MAGIC混合器中将生(有机)花生混合。在大的MAGIC混合器中合并混合的干成分(重量百分比：绿豆35％；花生35％；蔗糖5％；维生素复合物(例如用于昆虫的Vanderzant维生素混合物，SIGMA-ALDRICH,目录号V1007)0.9％)，加盖并充分振摇以将这些成分混合。然后将混合的干成分添加到混合碗。在另一容器中，将水和苯菌灵抗真菌剂(50ppm；25μL 20,000ppm溶液/50mL饵料液)充分混合，然后添加到干成分混合物中。人工混合所有成分，直到溶液完全混合时为止。将饵料成形为期望的大小，松散地包装在铝箔中，在60℃加热4小时，然后冷却，在4℃储存。
RNAi靶选择选择六个BSB发育期用于mRNA文库制备。从冷冻在-70℃的昆虫提取总RNA，并将其在设备(MP BIOMEDICALS)上的溶解MATRIX A 2mL管(MPBIOMEDICALS,Santa Ana,CA)中的10倍体积的溶解/结合缓冲液中均质化。使用mirVanaTMmiRNA分离试剂盒(AMBION；INVITROGEN)根据制造商的方案提取总mRNA。使用HiSeqTM***(San Diego,CA)的RNA测序提供了用于在RNAi昆虫控制技术中使用的候选靶基因序列。HiSeqTM生成针对六个样品的总共约3.78亿个读段。使用TRINITY汇编程序软件(Grabherr等人，(2011)Nature Biotech.29:644-652)针对每个样品将读段逐一汇编。合并汇编的转录物以生成汇集的转录组。这个BSB汇集的转录组含有378,457个序列。
BSB rop直系同源物鉴定使用查询序列果蝇属ROP蛋白(ROP--PA；登录号AAF47844.1)进行BSB汇集的转录组的tBLASTn搜索。BSB rop(SEQ ID NO:115)被鉴定为布朗椿象候选靶基因。
模板制备和dsRNA合成使用试剂(LIFE TECHNOLOGIES)，从提取自单一年轻成虫(约90mg)的总BSB RNA制备cDNA。使用微量管研磨棒(pellet pestle)(FISHERBRAND目录号12-141-363)和研磨棒混合器(Pestle Motor Mixer)(COLE-PARMER,Vernon Hills,IL)，在装有200μL的的1.5mL微量离心管中将昆虫均质化。均质化之后，再添加800μL的使匀浆涡旋，然后在室温下温育五分钟。通过离心去除细胞碎片，上清液转移到新的管中。添加200μL的氯仿，将混合物涡旋15秒。在室温下让提取物静置2-3分钟之后，通过在4℃以12,000x g离心15分钟分离各个相。将上层水相小心转移到另一个无核酸酶的1.5mL微量离心管中，并用500μL的室温异丙醇使RNA沉淀。在室温下温育十分钟之后，如上文所述将混合物离心10分钟。RNA离心沉淀用1mL的室温的75％乙醇冲洗，如上文所述另外离心10分钟。将RNA离心沉淀在室温下干燥，并使用洗脱缓冲液4型(即，10mM Tris-HCl，pH8.0)重悬在来自GFX PCR DNA AND GEL EXTRACTION KIT(illustraTM；GEHEALTHCARE LIFE SCIENCES)的200μL的Tris缓冲液中。使用分光光度计(THERMO SCIENTIFIC,Wilmington,DE)确定RNA浓度。
使用针对RT-PCR的SUPERSCRIPT III FIRST-STRAND SYNTHESIS SYSTEMTM(INVITROGEN)，根据供应商的推荐方案，从5μg的BSB总RNA模板和寡dT引物反向转录而成cDNA。用无核酸酶的水将转录反应的终体积调节为100μL。
使用引物BSB_Rop-1-For(SEQ ID NO:117)和BSB_Rop-1-Rev(SEQ ID NO:118)进行触地(touch-down)PCR(退火温度以1℃/循环递减，从60℃降低到50℃)中，用1μL的cDNA(上文)作为模板。在35个PCR循环过程中生成了包含rop的499bp区段(即，BSB rop区1；SEQID NO:119)的片段。BSB_Rop引物在其5'端包含T7噬菌体启动子序列(SEQ ID NO:5)，因此dsRNA转录能够使用BSB rop reg1DNA片段。
利用MEGAscriptTM RNAi试剂盒(AMBION)，根据制造商的说明，使用2μL的PCR产物(上文)作为模板合成dsRNA。(参见图1)。在分光光度计上将dsRNA定量并在无核酸酶的0.1X TE缓冲液(1mM Tris HCL，0.1mM EDTA，pH7.4)中稀释到500ng/μL。
dsRNA注射到BSB血腔中在27℃培养箱中，在65％相对湿度和16:8小时的光:暗光周期下，用人工饵料(上文)喂养BSB。用小刷子轻轻操作第二龄若虫(每只重1到1.5mg)以防损伤，并将它们置于冰上培养皿中，以使昆虫预冷和固定。给每只昆虫注射55.2nL的500ng/μL dsRNA溶液(即，27.6ng dsRNA；18.4到27.6μg/g体重的剂量)。注射使用配备有从Drummond 8.9cms#3-000＝203-G/X玻璃毛细管拉制而成的注射针的NANOJECTTMII注入器(DRUMMOND SCIENTIFIC,Broomhall,PA)。将针尖打破，用轻矿油装填毛细管，然后充填2到3μL的dsRNA。将dsRNA注射到若虫的腹部(每次试验每dsRNA注射10个昆虫)，在不同的三天重复试验。经过注射的昆虫(每孔5个)被转移到含有一团人工BSB饵料并覆盖有Pull-N-PeelTM盖片(BIO-CV-4；BIO-SERV)的32孔托盘(Bio-RT-32Rearing Tray；BIO-SERV,Frenchtown,NJ)中。借助于带有棉花芯的装有1.25mL水的1.5mL微量离心管提供水分。将这些托盘在26.5℃、60％湿度和16:8光:暗光周期下温育。在注射之后7天，获取生存力计数和重量。
注射鉴定的BSB rop作为致死性dsRNA靶与YFP编码区(如实施例2中制备)同源的dsRNA用作BSB注射实验中的阴性对照。如表13中总结的，将27.6ng的BSB_rop reg1dsRNA注射到第二龄BSB若虫的血腔中，在七天内产生了高死亡率。由BSB_rop reg1dsRNA引起的死亡率与用相同量的注射的YFP dsRNA(阴性对照)所见到的显著不同。
表13.BSB_rop reg1dsRNA注射到第二龄布朗椿象若虫的血腔中注射七天之后的结果。
处理* 平均死亡率％ SEM 试验次数 t检验(p)
BSB_rop reg1dsRNA 90 5.8 3 6.08E-04
YFP v2dsRNA 13 3.3 3 6.43E-01
未注射 10 5.8 3
*对于每种dsRNA每试验注射十个昆虫。
实施例14
包含半翅目害虫序列的转基因玉米
如实施例6中所述，生成10到20个包含表达载体的转基因T0玉米植物，所述表达载体含有EQ ID NO:115和/或SEQ ID NO 119的核酸。获得另外的10-20个T1玉米独立系，其表达针对RNAi构建体的发夹dsRNA，用于BSB攻击。获得的发夹dsRNA可以如SEQ ID NO:119中所示，或者可以进一步包含SEQ ID NO:115。这些通过RT--PCR或其他分子分析方法得以证实。任选地用选定的独立T1系的总RNA制备物进行RT--PCR，其中引物设计为结合每个RNAi构建体中的发夹表达盒的ST-LS1内含子中。另外，任选地用针对RNAi构建体中每个靶基因的特异性引物进行扩增，并且在植物体内确认产生siRNA所需要的预加工mRNA的产生。每个靶基因的各期望条带的扩增可确认每个转基因玉米植物中发夹RNA的表达。随后任选地在独立转基因系中利用RNA印迹杂交来确认靶基因的dsRNA发夹加工成siRNA。
而且，与靶基因具有80％以上序列同一性的具有错配序列的RNAi分子以类似于与靶基因具有100％序列同一性的RNAi分子所见的方式影响玉米根虫。错配序列与天然序列的配对在同一个RNAi构建体中形成发夹dsRNA，从而投放出能够影响摄食的半翅目害虫的生长、发育和生存力的植物加工的siRNA。
在植物内投放对应于靶基因的dsRNA、siRNA、shRNA、或miRNA，随后被半翅目害虫通过摄食而摄取，结果导致半翅目害虫中的靶基因由于RNA介导基因沉默作用而下调。当靶基因在所影响的半翅目害虫的发育、生长、发育和生殖的一个或多个阶段中发挥重要功能时，并且在英雄美洲蝽、盖德拟壁蝽、茶翅蝽、稻绿蝽、拟绿蝽、和褐臭蝽中至少一者的情况下，可导致半翅目害虫无法成功侵染、进食、发育、和/或生殖，或导致其死亡。然后选定的靶基因的和RNAi的成功应用可用来控制半翅目害虫。
转基因RNAi系和非转化玉米的表型比较选用于创建发夹dsRNA的靶半翅目害虫基因或序列与任何已知的植物基因序列都没有相似性。因此可以预期，靶向这些半翅目害虫基因或序列的构建体的(***性)RNAi的产生或者激活不会对转基因植物产生任何有害影响。尽管如此，将转基因系的发育和形态特征与非转化植物、以及用没有发夹表达基因的“空”载体转化的转基因系进行比较。比较植物根、芽、叶和生殖特征。转基因植物和非转化植物在根长和生长模式上没有可观察到的差异。诸如高度、叶数和大小、开花时间、花大小和外观之类的植物地上部特征是相似的。总的来说，在体外以及在温室土壤中培养时，在转基因品系和没有表达靶iRNA分子的品系之间没有可观察到的形态差异。
实施例15
包含半翅目害虫序列的转基因大豆
生成10到20个包含表达载体的转基因T0大豆植物，所述表达载体含有SEQ ID NO:115和/或SEQ ID NO 119的核酸，所述植物按照本领域已知的方式生成，例如通过如下所述的土壤杆菌介导的转化。用氯气将成熟大豆(Glycine max)种子消毒十六小时过夜。用氯气消毒之后，将种子置于LAMINARTM层流罩内的开放容器中以驱散氯气。接着，使用黑盒，在黑暗中24℃下使消毒过的种子吸收无菌H2O十六小时。
分割种子大豆的制备。包含部分胚轴的大豆种子分割方案需要制备纵向切开的大豆种子材料，纵向切开使用固定在解剖刀上的10号刀片，沿着种子的种脐分离并去除种皮，并将种子分开为两个子叶部分。小心地移除部分胚轴，其中约1/2-1/3的胚轴仍然附着在子叶的节端。
接种。然后将包含部分胚轴的分割大豆种子在根癌土壤杆菌(例如，菌株EHA 101或EHA 105)溶液中浸没约30分钟，根癌土壤杆菌携带包含SEQ ID NO:115和/或SEQ ID NO119的二元质粒。在浸入带胚轴的子叶之前，将根癌土壤杆菌溶液稀释到λ＝0.6OD650的终浓度。
共培养。接种后，将分割的大豆种子与根癌土壤杆菌菌株在共培养基(Wang,Kan.Agrobacterium Protocols.2.1.New Jersey:Humana Press,2006.Print.)上共培养5天，共培养基置于培养皿中，培养皿用一片滤纸覆盖。
芽诱导。在共培养5天之后，将分割的大豆种子在含有B5盐、B5维生素、28mg/L二价铁、38mg/L Na2EDTA、30g/L蔗糖、0.6g/L MES、1.11mg/L BAP、100mg/L TIMENTINTM、200mg/L头孢噻肟、和50mg/L万古霉素的液体芽诱导(SI)(pH 5.7)培养基中洗涤。然后将分割的大豆种子在含有B5盐、B5维生素、7g/L Noble琼脂、28mg/L二价铁、38mg/L Na2EDTA、30g/L蔗糖、0.6g/L MES、1.11mg/L BAP、50mg/L TIMENTINTM、200mg/L头孢噻肟、50mg/L万古霉素的芽诱导I(SI I)培养基(pH 5.7)上培养，其中子叶的平坦一侧向上，而子叶的节端埋入培养基中。在培养2周之后，将来自转化的分割大豆种子的外植体转移到芽诱导II(SI II)培养基中，该培养基含有补充了6mg/L草丁膦的SI I培养基。
芽伸长。在SI II培养基上培养2周之后，将子叶从外植体移除，通过在子叶的基部做切口切下含有胚轴的齐平的(flush)芽垫。将分离自子叶的芽垫转移到芽伸长(SE)培养基上。该SE培养基含有MS盐、28mg/L二价铁、38mg/L Na2EDTA、30g/L蔗糖和0.6g/L MES、50mg/L天冬酰胺、100mg/L L--焦谷氨酸、0.1mg/L IAA、0.5mg/L GA3、1mg/L玉米素核苷、50mg/L TIMENTINTM、200mg/L头孢噻肟、50mg/L万古霉素、6mg/L草丁膦、7g/L Noble琼脂，(pH 5.7)。每2周将培养物转移到新鲜的SE培养基上。培养物在CONVIRONTM生长室中在24℃下培养，使用18h光周期，光强为80-90μmol/m2sec。
生根。对于从子叶芽垫发出的伸长芽，通过在子叶芽垫基部切割伸长芽加以分离，并将伸长芽浸入1mg/L IBA(吲哚-3-丁酸)中1-3分钟促进生根。接着，将伸长芽转移到Phyta托盘中的生根培养基(MS盐、B5维生素、28mg/L二价铁、38mg/L Na2EDTA、20g/L蔗糖和0.59g/L MES、50mg/L天冬酰胺、100mg/L L-焦谷氨酸、7g/L Noble琼脂，pH 5.6)中。
培养。在CONVIRONTM生长室24℃、18h光周期培养1-2周之后，将已经生根的芽转移到带盖的圣代杯内的土壤混合物中，放到CONVIRONTM生长室(型号CMP4030和CMP3244,Controlled Environments Limited,Winnipeg,Manitoba,Canada)内，置于长的白昼条件下(16小时光照/8小时黑暗)，光强度为120-150μmol/m2sec，温度(22℃)和湿度(40-50％)恒定，以驯化小植物。生根的小植物在圣代杯中驯化数周之后，转移到温室中进行进一步的驯化并定植强健的转基因大豆植物。
获得另外的10-20个表达针对RNAi构建体的发夹dsRNA的T1大豆独立系用于BSB攻击。衍生的发夹dsRNA可以如SEQ ID NO:119所示，或者可进一步包含SEQ ID NO:115。这些通过RT-PCR或其他分子分析方法加以确认。任选用来自选择的独立T1系的总RNA制备物进行RT-PCR，其中引物设计为结合每个RNAi构建体中的发夹表达盒中的ST-LS1内含子。另外，任选地用针对RNAi构建体中每个靶基因的特异性引物进行扩增，并且在植物体内确认产生siRNA所需要的预加工mRNA的产生。每个靶基因的各期望条带的扩增可确认每个转基因玉米植物中发夹RNA的表达。随后任选地在独立转基因系中利用RNA印迹杂交来确认靶基因的dsRNA发夹加工成siRNA。
而且，与靶基因具有80％以上序列同一性的具有错配序列的RNAi分子以类似于与靶基因具有100％序列同一性的RNAi分子所见的方式影响玉米根虫。错配序列与天然序列的配对在同一个RNAi构建体中形成发夹dsRNA，从而投放出能够影响摄食的半翅目害虫的生长、发育和生存力的植物加工的siRNA。
在植物内投放对应于靶基因的dsRNA、siRNA、shRNA、或miRNA，随后被半翅目害虫通过摄食而摄取，结果导致半翅目害虫中的靶基因由于RNA介导基因沉默作用而下调。当靶基因在所影响的半翅目害虫的发育、生长、发育和生殖的一个或多个阶段中发挥重要功能时，并且在英雄美洲蝽、盖德拟壁蝽、茶翅蝽、稻绿蝽、拟绿蝽、和褐臭蝽中至少一者的情况下，可导致半翅目害虫无法成功侵染、进食、发育、和/或生殖，或导致其死亡。然后选定的靶基因的和RNAi的成功应用可用来控制半翅目害虫。
转基因RNAi系和非转化玉米的表型比较选用于创建发夹dsRNA的靶半翅目害虫基因或序列与任何已知的植物基因序列都没有相似性。因此可以预期，靶向这些半翅目害虫基因或序列的构建体的(***性)RNAi的产生或者激活不会对转基因植物产生任何有害影响。尽管如此，将转基因系的发育和形态特征与非转化植物、以及用没有发夹表达基因的“空”载体转化的转基因系进行比较。比较植物根、芽、叶和生殖特征。转基因植物和非转化植物在根长和生长模式上没有可观察到的差异。诸如高度、叶数和大小、开花时间、花大小和外观之类的植物地上部特征是相似的。总的来说，在体外以及在温室土壤中培养时，在转基因品系和没有表达靶iRNA分子的品系之间没有可观察到的形态差异。
实施例16
花粉甲虫转录组
昆虫：从开花油菜植株的田地(Giessen,Germany)采集幼虫和成体花粉甲虫。通过注射两种不同的细菌(金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌)、一种酵母(酿酒酵母)和细菌LPS的混合物攻击年轻成体甲虫(按照每个处理组：n＝20；3个重复)。细菌培养物在搅拌下在37℃培养，并监测600nm的光密度(OD600)。通过离心收获OD600～1的细胞，并重悬在磷酸盐缓冲盐水中。使用在10mg/ml LPS(纯化的大肠杆菌内毒素；Sigma,Taufkirchen,Germany)的水溶液以及细菌和酵母培养物中蘸过的解剖针，通过刺穿花粉甲虫成虫的腹部从腹外侧导入该混合物。在相同的时间点与免疫攻击的甲虫一起采集初次接受试验的甲虫和幼虫(每一次n＝20，且每一次3个重复)。
RNA分离：在免疫之后8小时使用TriReagent(Molecular Research Centre,Cincinnati,OH,USA)从冰冻的甲虫和幼虫提取总RNA，并使用RNeasy Micro Kit(Qiagen,Hilden,Germany)进行纯化，均遵循制造商的指南进行。使用Agilent 2100Bioanalyzer和RNA 6000Nano Kit(Agilent Technologies,Palo Alto,CA,USA)验证RNA的完整性。使用ND-1000分光光度计确定RNA的量。从成虫的免疫诱导的处理组、成虫对照组、和幼虫组分别单独地提取RNA，随后按照样品(免疫攻击的成虫、对照成虫和幼虫)将等量的总RNA合并成一个池，用于测序。
转录组信息：对于从免疫攻击的甲虫成虫、初次接受试验的(对照)甲虫成虫、以及和未处理的幼虫分离的各5μg总RNA，分别进行RNA-Seq数据生成和装配单读段100-bp RNA-Seq。使用Illumina HiSeq-2000平台，通过Eurofins MWG Operon进行测序。这样，成虫对照甲虫样品生成了2080万个读段，LPS攻击的甲虫成虫样品生成了2150万个读段，幼虫样品生成了2510万个读段。使用Velvet/Oases汇编软件(M.H.Schulz等人，(2012)Bioinformatics.28:1086-92；Zerbino&E.Birney(2008)Genome Research.18:821-9)将汇集的读段(6750万个)汇编。该转录组含有55648个序列。
花粉甲虫rop鉴定：利用转录组的tblastn搜索来鉴定匹配的重叠群。使用来自赤拟谷盗(Tribolium castaneum)的rop的肽序列(NP_001164155.1)作为查询序列。鉴定出两个重叠群(RGK_contig6910、RGK_contig46722)。使用一种受专有权保护的工具，用未汇编的读段补全两个重叠群之间的空位。GAP5(Bonfield JK&Whitwham(2010).Bioinformatics 26:1699–1703)用于序列验证。
实施例17
在用rop RNAi处理后的花粉甲虫(油菜花露尾甲)死亡率
利用基因特异性引物，这些引物在5'端包含T7聚合酶启动子序列，通过PCR产生了约500bp的PCR产物(SEQ ID NO:129-130)。根据制造商的方案将PCR片段克隆到pGEM-TEasy载体中，并送到测序公司验证序列。然后从经过测序的质粒产生PCR构建体，从PCR构建体通过T7RNA聚合酶(RNAi Kit,Applied Biosystems)按照制造商的规程产生dsRNA。
在解剖立体显微镜下，用显微操作器对幼虫和甲虫成虫注射～100nl dsRNA(1μg/μl)(n＝10，3个生物学重复)。将动物在冰上麻醉，然后固定到双面胶带(double-sticktape)上。对照组放相同或体积的水。实施了IMPI(鳞翅目大蜡螟的昆虫金属蛋白酶抑制剂基因)的阴性对照dsRNA。由于动物不足，不能测试所有阶段的所有对照。
用干花粉和湿纸巾将花粉甲虫维持在培养皿中。幼虫饲养在塑料盒中，以琼脂/水培养基中的芥花(canola)花序为食。
表14.成虫花粉甲虫注射生物测定的结果。
*标准差
表15.花粉甲虫幼虫注射生物测定的结果。
*标准差
由于可用的昆虫有限，对照在不同的日期实施。
摄食生物测定：在处理之前24小时，将甲虫保持在空的Falcon管中，不使其接触到水。将一滴dsRNA(约5μl)置于小的培养皿中，并将5到8个甲虫放入该培养皿中。在立体显微镜下观察动物，选择那些摄入了含有dsRNA的饵料液的动物用于生物测定。将甲虫转移到放有干花粉和湿纸巾的培养皿中。对照组接受相同或体积的水。实施了IMPI(鳞翅目大蜡螟的昆虫金属蛋白酶抑制剂基因)的阴性对照dsRNA。由于动物不足，无法测试所有阶段的所有对照。表16.成虫进食生物测定的结果。
*标准差
由于可用的昆虫有限，对照在不同的日期实施。
实施例18
土壤杆菌介导的芥花(欧洲油菜)下胚轴转化
土壤杆菌的制备
将含有二元质粒的土壤杆菌菌株划线接种在含有链霉素(100mg/ml)和大观霉素(50mg/mL)的YEP培养基(Bacto PeptoneTM20.0gm/L和酵母提取物10.0gm/L)平板上，并在28℃温育2天。使用无菌接种环从2天的划线平板刮下含有二元质粒的经繁殖的土壤杆菌菌株。然后将刮下的含有二元质粒的土壤杆菌菌株接种到在无菌的500mL带挡板烧瓶中的含链霉素(100mg/ml)和大观霉素(50mg/ml)的150mL改良YEP液中，并在200rpm在28℃振摇。将培养物离心并重悬在M-培养基(LS盐、3％葡萄糖、改良的B5维生素、1μM激动素、1μM 2,4-D，pH 5.8)中并且稀释到适当的密度(如使用分光光度计测量的50克莱特单位)，然后进行芥花下胚轴的转化。
芥花转化
种子萌发：将芥花种子(品种NEXERA 710TM)在10％CloroxTM中表面消毒10分钟，并用无菌蒸馏水冲洗三次(在这个过程中种子盛在钢制滤网中)。种子播布在1/2MS芥花培养基(1/2MS、2％蔗糖、0.8％琼脂)上以供萌发，培养基容纳在PhytatraysTM中(每个PhytatraysTM25粒种子)，置于PercivalTM生长室中，生长方案设置为25℃，16小时光照和8小时黑暗的光周期，萌发5天。
预处理：在第5天，无菌切下长度约3mm的下胚轴节段，弃去剩余的根和芽节段(在切除过程中将下胚轴节段浸没在10mL的无菌milliQTM水中以防止下胚轴干燥)。将下胚轴节段水平放置在无菌滤纸上的愈伤组织诱导培养基MSK1D1(1X MS、1mg/L激动素、1mg/L 2,4-D、3.0％蔗糖，0.7％植物琼脂)上，在PercivalTM生长室中预处理3天，生长方案为22-23℃、以及16小时光照和8小时黑暗的光周期。
与土壤杆菌共培养：在土壤杆菌共培养之前一天，用含有二元质粒的土壤杆菌菌株接种含有适当抗生素的YEP培养基烧瓶。将下胚轴节段从滤纸愈伤组织诱导培养基MSK1D1转移到一块含10mL液体M培养基的100x 25mm etriTM的空培养皿中，以防下胚轴节段干燥。在这个阶段，使用刮铲舀起节段，并转移到新的培养基上。用移液管移除液体M培养基，添加40mL土壤杆菌悬液到PetriTM培养皿中(500个节段，40mL土壤杆菌液)。将下胚轴节段处理30分钟，期间定时旋转PetriTM培养皿，使得下胚轴节段保持浸没在土壤杆菌液中。在处理期结束时，将土壤杆菌液吸移到废液烧杯中，高压灭菌并丢弃(完全移除土壤杆菌液以防土壤杆菌过度生长)。用镊子将处理过的下胚轴移回到含MSK1D1培养基的覆盖有滤纸的原平板上(仔细地确保节段不干燥)。将转化的下胚轴节段和非转化的对照下胚轴节段送回到PercivalTM生长室中降低光强度下(通过用铝箔覆盖平板)，将处理过的下胚轴节段与土壤杆菌共培养3天。
在选择培养基上诱导愈伤组织：在共培养3天之后，用镊子将下胚轴节段一一转移到愈伤组织诱导培养基MSK1D1H1(MS、1mg/L激动素、1mg/L 2,4-D、0.5gm/L MES、5mg/LAgNO3、300mg/L TimentinTM、200mg/L羧苄青霉素、1mg/L HerbiaceTM、3％蔗糖、0.7％植物琼脂)上，生长方案设置在22-26℃。将下胚轴节段***培养基，但并不深埋到培养基中。
选择和芽再生：在愈伤组织诱导培养基上7天之后，将形成愈伤组织的下胚轴节段转移到具有选择的芽再生培养基1，即，MSB3Z1H1(MS、3mg/L BAP、1mg/L玉米素、0.5gm/LMES、5mg/L AgNO3、300mg/L TimentinTM、200mg/L羧苄青霉素、1mg/L HerbiaceTM、3％蔗糖、0.7％植物琼脂)上。在14天之后，将发芽的下胚轴节段转移到具有增加的选择的再生培养基2，即，SB3Z1H3(MS、3mg/L BAP、1mg/L玉米素、0.5gm/L MES、5mg/L AgNO3、300mg/lTimentinTM、200mg/L羧苄青霉素、3mg/L HerbiaceTM、3％蔗糖、0.7％植物琼脂)上，生长方案设置在22-26℃。
芽伸长：在14天之后，将发芽的下胚轴节段从再生培养基2转移到芽伸长培养基MSMESH5(MS、300mg/L TimentinTM,5mg/l HerbiaceTM、2％蔗糖、0.7％TC琼脂)上，生长方案设置在22-26℃。从下胚轴节段分离已经伸长的芽，并转移到MSMESH5。在14天之后，在芽伸长培养基上其余的第一轮培养中未伸长的芽转移到新鲜的芽伸长培养基MSMESH5上。弃去在此阶段剩余的所有未产生芽的下胚轴节段。
诱导生根：在芽伸长培养基上培养14天之后，将分离的芽转移到MSMEST培养基(MS、0.5g/L MES、300mg/L TimentinTM、2％蔗糖、0.7％TC琼脂)上用于在22-26℃进行诱导生根。将任何在第一次转移到MSMEST培养基上进行温育之后未产生根的任何芽转移到MSMEST培养基上进行第二或第三轮温育，直到芽产生根为止。
PCR分析：对于再生成为带根的芽的转化芥花下胚轴节段，进一步通过PCR分子验证测定来分析。从绿色芽获得叶组织并通过PCR测试所述叶组织的的pat选择标志物基因的存在。弃去任何萎黄芽，对其不进行PCR分析。鉴定pat选择标志物基因的存在为阳性的样品予以保留并在MSMEST培养基上进行培养，以便芽和根继续发育和伸长。弃去根据PCR分析鉴定为不含pat选择标志物基因的阴性的样品。
将包含pat选择标志物基因存在为PCR阳性的芽和根的转化芥花植物转移到温室土壤中。芥花植物在土壤中定植之后，通过InvaderTM定量PCR测定和Southern印迹进一步分析芥花植物，以定量pat基因表达盒的拷贝数。经确认含有至少一个拷贝的pat基因表达盒的转基因T0芥花植物继续用于进一步的种子分析。分析从这些转基因T0芥花植物获得的种子，即，T1芥花种子，以检测靶基因的存在。
虽然本公开可容许不同的修改和替代形式，但通过举例在本文详细地描述了具体的实施方案。然而应当理解的是，本公开并不意图局限于所公开的具体形式。相反，本公开将覆盖落入由下列所附权利要求书所定义的本发明公开的范围内的所有修改、等同物、和替代方案及它们的法律上的等同物。

Claims (29)

1.一种包含至少15个连续核苷酸的RNA，该RNA在其全长上与编码Ras对立物(ROP)的至少一部分的DNA序列具有至少80％同一性。
2.权利要求1的RNA，其中该RNA包含双链RNA(dsRNA)。
3.权利要求1的RNA，其中所述核酸进一步包含与所述至少15个连续核苷酸互补的序列。
4.权利要求2的RNA，其中该dsRNA包含茎和环。
5.权利要求4的RNA，其中被表达的RNA的茎-环的茎的至少一部分是通过所述至少15个连续核苷酸与该至少15个连续核苷酸的互补序列结合而形成的。
6.权利要求1的RNA，其中该RNA是iRNA。
7.权利要求6的RNA，其中该iRNA是dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、或hpRNA。
8.权利要求1的RNA，其中该RNA包含核酸类似物。
9.权利要求1的RNA，其中该RNA能够抑制ROP在鞘翅目昆虫或半翅目昆虫中表达。
10.权利要求9的RNA，其中ROP表达的抑制是通过转录后基因沉默实现的。
11.权利要求1的RNA，其中ROP是玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera virgifera)ROP或英雄美洲蝽(Euschistus heros)ROP或油菜花露尾甲(Meligethes aeneus)ROP。
12.权利要求1的RNA，其中该ROP由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:120、SEQID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:131、或SEQ ID NO:133编码。
13.权利要求1的RNA，其中编码ROP的至少一部分的序列选自下组：SEQ ID NO:3、4、114、119、和128。
14.权利要求1的RNA，其中所述至少15个连续核苷酸选自下组：19、21、25、29、30、40、50、70、和100个连续核苷酸。
15.权利要求1的RNA，其中所述至少80％同一性选自下组：85％、90％、95％、和100％同一性。
16.一种植物细胞，其包含权利要求1的RNA。
17.权利要求16的植物细胞，其中该植物选自下组。
18.一种核酸，其编码权利要求1的RNA。
19.权利要求18的核酸，其中该核酸包含选自下组的序列：SEQ ID NO:3、4、114、119、和128。
20.权利要求18的核酸，其中该核酸与启动子可操作连接。
21.一种载体，其包含权利要求17的核酸。
22.一种植物细胞，其包含权利要求17的核酸。
23.权利要求16的植物细胞，其中该植物选自下组。
24.权利要求16的植物细胞，其中权利要求17的核酸整合到该植物细胞的基因组中。
25.一种控制昆虫害虫的方法，该方法包括在植物中表达权利要求18的核酸。
26.根据权利要求25的方法，其中该昆虫害虫是鞘翅目昆虫或半翅目昆虫。
27.根据权利要求25的方法，其中该昆虫害虫选自下组：玉米根萤叶甲(Diabroticavirgifera virgifera)、巴氏根萤叶甲(Diabrotica barberi)、十一星根萤叶甲(Diabrotica undecimpunctata howardi)、墨西哥玉米根萤叶甲(Diabrotica virgiferazeae)、黄瓜条叶甲(Diabrotica balteata)、黄瓜十一星叶甲(Diabroticaundecimpunctata tenella)、黄瓜十一星叶甲亚种(Diabrotica undecimpunctataundecimpunctata)、英雄美洲蝽(Euschistus heros)、稻绿蝽(Nezara viridula)、盖德拟壁蝽(Piezodorus guildinii)、茶翅蝽(Halyomorpha halys)、拟绿蝽(Acrosternumhilare)、褐臭蝽(Euschistus servus)、和油菜花露尾甲(Meligethes aeneus)。
28.一种用于昆虫害虫的食物源，其包含权利要求1的RNA。
29.一种控制昆虫害虫的方法，该方法包括给昆虫害虫喂食权利要求28的食物源。
CN201480075840.2A 2013-12-20 2014-12-19 赋予鞘翅目和半翅目害虫抗性的ras对立物(rop)及相关核酸分子 Pending CN106028796A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911165408.3A CN111088255A (zh) 2013-12-20 2014-12-19 赋予鞘翅目和半翅目害虫抗性的ras对立物(rop)及相关核酸分子

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361919322P 2013-12-20 2013-12-20
US61/919,322 2013-12-20
PCT/US2014/071628 WO2015095774A1 (en) 2013-12-20 2014-12-19 Ras opposite (rop) and related nucleic acid molecules that confer resistance to coleopteran and/or hemipteran pests

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911165408.3A Division CN111088255A (zh) 2013-12-20 2014-12-19 赋予鞘翅目和半翅目害虫抗性的ras对立物(rop)及相关核酸分子

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106028796A true CN106028796A (zh) 2016-10-12

Family

ID=53399364

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480075840.2A Pending CN106028796A (zh) 2013-12-20 2014-12-19 赋予鞘翅目和半翅目害虫抗性的ras对立物(rop)及相关核酸分子
CN201911165408.3A Pending CN111088255A (zh) 2013-12-20 2014-12-19 赋予鞘翅目和半翅目害虫抗性的ras对立物(rop)及相关核酸分子

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911165408.3A Pending CN111088255A (zh) 2013-12-20 2014-12-19 赋予鞘翅目和半翅目害虫抗性的ras对立物(rop)及相关核酸分子

Country Status (18)

Country Link
US (2) US10647994B2 (zh)
EP (1) EP3082404A4 (zh)
JP (1) JP2017510245A (zh)
KR (1) KR20160093727A (zh)
CN (2) CN106028796A (zh)
AP (1) AP2016009318A0 (zh)
AR (1) AR098918A1 (zh)
AU (1) AU2014368952B2 (zh)
BR (1) BR102014031844A2 (zh)
CA (1) CA2933362C (zh)
CL (1) CL2016001533A1 (zh)
IL (1) IL246283A0 (zh)
MX (1) MX2016008261A (zh)
PH (1) PH12016501191A1 (zh)
RU (1) RU2016129283A (zh)
UY (1) UY35912A (zh)
WO (1) WO2015095774A1 (zh)
ZA (1) ZA201604497B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107858405A (zh) * 2017-10-12 2018-03-30 华南农业大学 一种测定外源dsRNA对瓢虫毒性影响的方法

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160264991A1 (en) 2015-03-13 2016-09-15 Dow Agrosciences Llc Rna polymerase i1 nucleic acid molecules to control insect pests
CA3013199A1 (en) * 2016-02-03 2017-08-10 Dow Agrosciences Llc Rpb7 nucleic acid molecules to control insect pests
EP3411487A4 (en) * 2016-02-03 2019-07-17 Dow Agrosciences LLC GAWKY NUCLEIC ACID (GW) MOLECULES FOR CONTROLLING HARMFUL INSECTS
EP3342780A1 (en) 2016-12-30 2018-07-04 Dow AgroSciences LLC Pre-mrna processing factor 8 (prp8) nucleic acid molecules to control insect pests
CN110662840A (zh) * 2017-03-21 2020-01-07 美国陶氏益农公司 突触融合蛋白7核酸分子用来控制鞘翅目和半翅目害虫
GB201719680D0 (en) 2017-11-27 2018-01-10 Devgen Nv Improvements in or relating to gene silencing
WO2020081486A1 (en) * 2018-10-15 2020-04-23 Greenlight Biosciences, Inc. Control of insect infestation
CN112640774B (zh) * 2021-01-10 2023-04-25 贵州省旱粮研究所 一种阶梯式改良策略选育温热玉米自交系方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1330140A (zh) * 2001-06-15 2002-01-09 中国科学院武汉病毒研究所 一株杀鞘翅目害虫的苏云金芽孢杆菌
CN101243637A (zh) * 2005-08-24 2008-08-13 朗迅科技公司 用于在无线通信***中控制重传的方法和设备
EP2330107A2 (en) * 2008-09-18 2011-06-08 CJ CheilJedang Corporation Improved production method for adefovir dipivoxil
US20120164205A1 (en) * 2004-04-09 2012-06-28 Baum James A Compositions and methods for control of insect infestations in plants

Family Cites Families (101)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US757089A (en) 1903-10-30 1904-04-12 Henry Brown Drover's whip.
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4415732A (en) 1981-03-27 1983-11-15 University Patents, Inc. Phosphoramidite compounds and processes
US4973679A (en) 1981-03-27 1990-11-27 University Patents, Inc. Process for oligonucleo tide synthesis using phosphormidite intermediates
US4693977A (en) 1982-08-23 1987-09-15 Queen's University At Kingston Enzyme immobilization for producing cephalosporin antibiotics
US4536475A (en) 1982-10-05 1985-08-20 Phytogen Plant vector
US5352605A (en) 1983-01-17 1994-10-04 Monsanto Company Chimeric genes for transforming plant cells using viral promoters
NL8300698A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; agrobacterium tumefaciens bacterien en werkwijze voor het produceren daarvan; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
NZ207765A (en) 1983-04-15 1987-03-06 Lubrizol Genetics Inc Plant expression of transferred dna(t-dna)from plasmids associated with agrobacterium sp
DE3329892A1 (de) 1983-08-18 1985-03-07 Köster, Hubert, Prof. Dr., 2000 Hamburg Verfahren zur herstellung von oligonucleotiden
US4886937A (en) 1985-05-20 1989-12-12 North Carolina State University Method for transforming pine
US5453566A (en) 1986-03-28 1995-09-26 Calgene, Inc. Antisense regulation of gene expression in plant/cells
US5107065A (en) 1986-03-28 1992-04-21 Calgene, Inc. Anti-sense regulation of gene expression in plant cells
FR2596761B1 (fr) 1986-04-08 1988-05-20 Commissariat Energie Atomique Derives de nucleosides et leur utilisation pour la synthese d'oligonucleotides
EP0270496B1 (de) 1986-12-05 1993-03-17 Ciba-Geigy Ag Verbessertes Verfahren zur Transformation von pflanzlichen Protoplasten
US5015580A (en) 1987-07-29 1991-05-14 Agracetus Particle-mediated transformation of soybean plants and lines
US5359142A (en) 1987-01-13 1994-10-25 Monsanto Company Method for enhanced expression of a protein
US5322938A (en) 1987-01-13 1994-06-21 Monsanto Company DNA sequence for enhancing the efficiency of transcription
US5789214A (en) 1988-03-08 1998-08-04 Novartis Finance Corporation Method of inducing gene transcription in a plant
US5614395A (en) 1988-03-08 1997-03-25 Ciba-Geigy Corporation Chemically regulatable and anti-pathogenic DNA sequences and uses thereof
EP0342926B1 (en) 1988-05-17 1994-09-28 Mycogen Plant Science, Inc. Plant ubiquitin promoter system
US5416011A (en) 1988-07-22 1995-05-16 Monsanto Company Method for soybean transformation and regeneration
US5110732A (en) 1989-03-14 1992-05-05 The Rockefeller University Selective gene expression in plants
US5231020A (en) 1989-03-30 1993-07-27 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
US5302523A (en) 1989-06-21 1994-04-12 Zeneca Limited Transformation of plant cells
US5501967A (en) 1989-07-26 1996-03-26 Mogen International, N.V./Rijksuniversiteit Te Leiden Process for the site-directed integration of DNA into the genome of plants
US5550318A (en) 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US7705215B1 (en) 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US6051753A (en) 1989-09-07 2000-04-18 Calgene, Inc. Figwort mosaic virus promoter and uses
DE69033628T2 (de) 1989-10-31 2001-04-19 Monsanto Co Promotor für transgene Pflanzen
US5641876A (en) 1990-01-05 1997-06-24 Cornell Research Foundation, Inc. Rice actin gene and promoter
HU220773B1 (hu) 1990-01-22 2002-05-28 Dekalb Genetics Corporation Eljárás termő transzgenikus kukoricanövények előállítására
US5484956A (en) 1990-01-22 1996-01-16 Dekalb Genetics Corporation Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin
US5837848A (en) 1990-03-16 1998-11-17 Zeneca Limited Root-specific promoter
US5639949A (en) 1990-08-20 1997-06-17 Ciba-Geigy Corporation Genes for the synthesis of antipathogenic substances
US6403865B1 (en) 1990-08-24 2002-06-11 Syngenta Investment Corp. Method of producing transgenic maize using direct transformation of commercially important genotypes
US5633435A (en) 1990-08-31 1997-05-27 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases
EP0955371B1 (en) 1990-11-23 2006-02-22 Bayer BioScience N.V. Process for transforming monocotyledonous plants
US5384253A (en) 1990-12-28 1995-01-24 Dekalb Genetics Corporation Genetic transformation of maize cells by electroporation of cells pretreated with pectin degrading enzymes
US5459252A (en) 1991-01-31 1995-10-17 North Carolina State University Root specific gene promoter
US5593874A (en) 1992-03-19 1997-01-14 Monsanto Company Enhanced expression in plants
DE69321122D1 (de) 1992-07-02 1998-10-22 Hybridon Inc Selbststabilisierte oligonukleotide als therapeutika
ATE398679T1 (de) 1992-07-07 2008-07-15 Japan Tobacco Inc Verfahren zur transformation einer monokotyledon pflanze
US7060876B2 (en) 1992-07-07 2006-06-13 Japan Tobacco Inc. Method for transforming monocotyledons
HUT70467A (en) 1992-07-27 1995-10-30 Pioneer Hi Bred Int An improved method of agrobactenium-mediated transformation of cultvred soyhean cells
US6118047A (en) 1993-08-25 2000-09-12 Dekalb Genetic Corporation Anthranilate synthase gene and method of use thereof for conferring tryptophan overproduction
US5362865A (en) 1993-09-02 1994-11-08 Monsanto Company Enhanced expression in plants using non-translated leader sequences
DK0672752T3 (da) 1993-09-03 2004-10-04 Japan Tobacco Inc Fremgangsmåde til transformering af monocotyledoner ved anvendelse af scutella af uudviklede embryoner
US5659026A (en) 1995-03-24 1997-08-19 Pioneer Hi-Bred International ALS3 promoter
US5693512A (en) 1996-03-01 1997-12-02 The Ohio State Research Foundation Method for transforming plant tissue by sonication
US6083499A (en) 1996-04-19 2000-07-04 Mycogen Corporation Pesticidal toxins
US5850019A (en) 1996-08-06 1998-12-15 University Of Kentucky Research Foundation Promoter (FLt) for the full-length transcript of peanut chlorotic streak caulimovirus (PCLSV) and expression of chimeric genes in plants
DE19631919C2 (de) 1996-08-07 1998-07-16 Deutsches Krebsforsch Anti-Sinn-RNA mit Sekundärstruktur
CA2236770A1 (en) 1996-09-05 1998-03-12 Unilever Plc Salt-inducible promoter derivable from a lactic acid bacterium, and its use in a lactic acid bacterium for production of a desired protein
BR9807488A (pt) 1997-01-20 2000-03-21 Plant Genetic Systems Nv Promotores de planta induzidos por agentes patogênicos.
US5981840A (en) 1997-01-24 1999-11-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for agrobacterium-mediated transformation
US5922564A (en) 1997-02-24 1999-07-13 Performance Plants, Inc. Phosphate-deficiency inducible promoter
CA2293738A1 (en) 1997-06-12 1998-12-17 Dow Agrosciences Llc Regulatory sequences for transgenic plants
US5874288A (en) 1997-07-31 1999-02-23 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis toxins with improved activity
ZA991528B (en) 1998-02-26 1999-08-31 Pioneer Hi Bred Int Constitutive maize promoters.
CA2315549A1 (en) 1998-02-26 1999-09-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Family of maize pr-1 genes and promoters
US6635806B1 (en) 1998-05-14 2003-10-21 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for expression of transgenes in plants
US6307123B1 (en) 1998-05-18 2001-10-23 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for transgene identification
JP2000083680A (ja) 1998-07-16 2000-03-28 Nippon Paper Industries Co Ltd 光誘導型プロモ―タ―の制御下に置かれた不定芽再分化遺伝子を選抜マ―カ―遺伝子とする植物への遺伝子導入方法及びこれに用いる植物への遺伝子導入用ベクタ―
AU768246B2 (en) 1998-10-23 2003-12-04 Mycogen Corporation Plant-optimized polynucleotides encoding approximately 15 kDa and approximately 45 kDa pesticidal proteins
AU2848800A (en) 1999-01-14 2000-08-01 Monsanto Technology Llc Soybean transformation method
US6232526B1 (en) 1999-05-14 2001-05-15 Dekalb Genetics Corp. Maize A3 promoter and methods for use thereof
US6207879B1 (en) 1999-05-14 2001-03-27 Dekalb Genetics Corporation Maize RS81 promoter and methods for use thereof
US6194636B1 (en) 1999-05-14 2001-02-27 Dekalb Genetics Corp. Maize RS324 promoter and methods for use thereof
US6429357B1 (en) 1999-05-14 2002-08-06 Dekalb Genetics Corp. Rice actin 2 promoter and intron and methods for use thereof
US6677503B1 (en) 1999-06-23 2004-01-13 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Sunflower anti-pathogene proteins and genes and their uses
US6501009B1 (en) 1999-08-19 2002-12-31 Monsanto Technology Llc Expression of Cry3B insecticidal protein in plants
US6388170B1 (en) 2000-04-07 2002-05-14 University Of Kentucky Research Foundation Bidirectional promoters and methods related thereto
US7109393B2 (en) 2000-08-15 2006-09-19 Mendel Biotechnology, Inc. Methods of gene silencing using inverted repeat sequences
US20020048814A1 (en) 2000-08-15 2002-04-25 Dna Plant Technology Corporation Methods of gene silencing using poly-dT sequences
US7612194B2 (en) 2001-07-24 2009-11-03 Monsanto Technology Llc Nucleic acid sequences from Diabrotica virgifera virgifera LeConte and uses thereof
US7230167B2 (en) 2001-08-31 2007-06-12 Syngenta Participations Ag Modified Cry3A toxins and nucleic acid sequences coding therefor
US7179902B2 (en) 2002-06-27 2007-02-20 Dow Agrosciences Llc Use of regulatory sequences in transgenic plants
WO2004039999A2 (en) * 2002-10-30 2004-05-13 Syngenta Participations Ag Essential dna enclosed proteins of drosphophilia melanogaster
PL1687435T3 (pl) * 2003-11-17 2012-02-29 Bayer Cropscience Nv Odporność na owady z użyciem hamowania ekspresji genów
EP2308976B2 (en) 2004-04-30 2017-05-10 Dow AgroSciences LLC Novel herbicide resistance gene
EP1794308B1 (en) 2004-09-29 2013-08-28 Pioneer-Hi-Bred International, Inc. Corn event das-59122-7 and methods for detection thereof
US20060200878A1 (en) 2004-12-21 2006-09-07 Linda Lutfiyya Recombinant DNA constructs and methods for controlling gene expression
EP1824967B1 (en) 2004-12-21 2014-11-05 Monsanto Technology, LLC Recombinant dna constructs and methods for controlling gene expression
EP3508582B1 (en) 2005-09-16 2021-01-13 Monsanto Technology LLC Methods for genetic control of insect infestations in plants and compositions thereof
US20090298787A1 (en) * 2006-01-12 2009-12-03 Devgen N.V. Dsrna as Insect Control Agent
JP2008069646A (ja) 2006-09-12 2008-03-27 Yamaha Marine Co Ltd 船舶推進機およびその運転方法
US8383786B2 (en) 2009-02-11 2013-02-26 Dow Agrosciences, Llc. Pesticidal compositions
UA106885C2 (uk) 2009-04-17 2014-10-27 Дау Агросайансіз Елелсі Dig-3 інсектицидні cry-токсини
UA116081C2 (uk) 2010-04-23 2018-02-12 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі ТРАНСГЕННА РОСЛИНА КУКУРУДЗИ, ЯКА ПРОДУКУЄ БІЛКИ Cry34Ab1, Cry35Ab1 і Cry3Aa ДЛЯ ЗАПОБІГАННЯ РОЗВИТКУ СТІЙКОСТІ У КУКУРУДЗЯНОГО КОРЕНЕВОГО ЖУКА
US8530440B2 (en) * 2010-05-03 2013-09-10 Board Of Regents Of The University Of Nebraska dsRNA delivery composition and methods of use
RU2611188C2 (ru) 2010-07-29 2017-02-21 ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи Штаммы agrobacterium, модифицированные для увеличения частоты трансформации растений
KR20120139794A (ko) 2010-12-03 2012-12-27 파나소닉 주식회사 전지 팩
CA2823367A1 (en) 2010-12-30 2012-07-05 Dow Agrosciences Llc Nucleic acid molecules that target the rho1 small gtp-binding protein and confer resistance to coleopteran pests
EP2658975A4 (en) 2010-12-30 2014-10-22 Dow Agrosciences Llc NUCLEIC ACID MOLECULES PROVIDED TO THE V ATPASE H SUB-UNIT AND RESISTANT TO COLEOPTERAN PENGUES
MX342845B (es) 2010-12-30 2016-10-14 Dow Agrosciences Llc Moleculas de acido nucleico dirigidas a la subunidad de atpasa c vacuolar y que confieren resistencia a las plagas de coleopteros.
CA2822958A1 (en) 2010-12-30 2012-07-05 Dow Agrosciences Llc Nucleic acid molecules that confer resistance to coleopteran pests
WO2013052870A2 (en) 2011-10-06 2013-04-11 Dow Agrosciences Llc Nucleic acid molecules that target pp1-87b and confer resistance to coleopteran pests
TW201321508A (zh) 2011-10-06 2013-06-01 Dow Agrosciences Llc 靶定ｒｐａ７０且賦予對鞘翅目害蟲抗性之核酸分子
US9534232B2 (en) 2011-10-06 2017-01-03 Dow Agrosciences Llc Nucleic acid molecules that target RPS6 and confer resistance to coleopteran pests
AR090981A1 (es) 2012-05-08 2014-12-17 Monsanto Technology Llc Evento de maiz mon 87411

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1330140A (zh) * 2001-06-15 2002-01-09 中国科学院武汉病毒研究所 一株杀鞘翅目害虫的苏云金芽孢杆菌
US20120164205A1 (en) * 2004-04-09 2012-06-28 Baum James A Compositions and methods for control of insect infestations in plants
CN101243637A (zh) * 2005-08-24 2008-08-13 朗迅科技公司 用于在无线通信***中控制重传的方法和设备
EP2330107A2 (en) * 2008-09-18 2011-06-08 CJ CheilJedang Corporation Improved production method for adefovir dipivoxil

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EMBL: "CV748534.1", 《EMBL》 *
EMBL: "EW775191.1", 《EMBL》 *
EMBL: "GT346238.1", 《EMBL》 *
GENBANK: "NM_214669.1", 《GENBANK》 *
STEPHEN D ET AL.: "mutations in the Drosophila Rop gene suggest a function in general secretion and synaptic transmission", 《NEURON》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107858405A (zh) * 2017-10-12 2018-03-30 华南农业大学 一种测定外源dsRNA对瓢虫毒性影响的方法
CN107858405B (zh) * 2017-10-12 2021-09-24 华南农业大学 一种测定外源dsRNA对瓢虫毒性影响的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN111088255A (zh) 2020-05-01
CA2933362C (en) 2022-08-30
CA2933362A1 (en) 2015-06-25
MX2016008261A (es) 2017-05-09
US20210115467A1 (en) 2021-04-22
AP2016009318A0 (en) 2016-07-31
ZA201604497B (en) 2017-09-27
US20150176025A1 (en) 2015-06-25
UY35912A (es) 2015-07-31
JP2017510245A (ja) 2017-04-13
KR20160093727A (ko) 2016-08-08
PH12016501191A1 (en) 2016-07-25
CL2016001533A1 (es) 2016-10-28
BR102014031844A2 (pt) 2015-10-06
US10647994B2 (en) 2020-05-12
WO2015095774A1 (en) 2015-06-25
RU2016129283A (ru) 2018-01-25
IL246283A0 (en) 2016-07-31
AU2014368952A1 (en) 2016-07-07
EP3082404A1 (en) 2016-10-26
EP3082404A4 (en) 2017-05-31
AU2014368952B2 (en) 2017-12-21
AR098918A1 (es) 2016-06-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210403939A1 (en) Copi coatomer gamma subunit nucleic acid molecules that confer resistance to coleopteran and hemipteran pests
CN107148218A (zh) 赋予鞘翅目和半翅目害虫抗性的copi外被体delta亚单位核酸分子
CN107148426A (zh) 赋予鞘翅目和半翅目害虫抗性的copi外被体alpha亚单位核酸分子
CN107148477A (zh) 赋予鞘翅目和半翅目害虫抗性的copi外被体beta亚单位核酸分子
CN103403163B (zh) 靶向液泡atp酶c亚基并赋予对鞘翅目有害生物的抗性的核酸分子
CN106028796A (zh) 赋予鞘翅目和半翅目害虫抗性的ras对立物(rop)及相关核酸分子
CN106661590A (zh) 赋予鞘翅目害虫抗性的dre4核酸分子
CN106471123A (zh) 赋予鞘翅目和半翅目害虫抗性的sec23核酸分子
CN106028838A (zh) 赋予鞘翅目害虫抗性的rnapii-140核酸分子
CN107208098A (zh) 用于控制鞘翅目害虫染色质重塑基因亲代rnai抑制
CN107278228A (zh) 用于控制半翅目害虫的HUNCHBACK基因的亲代RNAi抑制
CN107532170A (zh) 控制昆虫害虫的rna聚合酶ii33核酸分子
CN107208097A (zh) 用于控制鞘翅目害虫kruppel基因亲代rnai抑制
US20160264992A1 (en) Rna polymerase ii215 nucleic acid molecules to control insect pests
CN107849580A (zh) 控制昆虫害虫的prp8核酸分子
CN107109412A (zh) 用于控制鞘翅目害虫hunchback基因亲代rnai抑制
CN107109409A (zh) 用于控制鞘翅目和半翅目害虫的gho/sec24b2和sec24b1核酸分子
CN108431207A (zh) 赋予对鞘翅目和半翅目害虫的抗性的wupa核酸分子
CN108350413A (zh) 赋予对鞘翅目和半翅目害虫的抗性的rab5核酸分子
CN107912048A (zh) 控制昆虫害虫的spt5核酸分子
CN107683088A (zh) 赋予对半翅目害虫的耐性的thread核酸
CN107406850A (zh) 用于控制半翅目害虫的KRUPPEL基因的亲代RNAi抑制
US10329581B2 (en) Ribosomal protein L40 (RPL40) nucleic acid molecules that confer resistance to coleopteran and hemipteran pests
CN108064296A (zh) 控制昆虫害虫的spt6核酸分子

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20161012

RJ01 Rejection of invention patent application after publication