CN107205404A - 包含重组芽孢杆菌属细胞和其他生物防治试剂的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种组合物，其包含协同有效量的以下物质：a)表达融合蛋白的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞，所述融合蛋白包含：(i)至少一种植物生长刺激蛋白或肽和(ii)将融合蛋白定位到芽孢杆菌属细胞的孢子外壁上的靶向序列；和b)至少一种其他的生物防治试剂，其选自本文公开的特定微生物和/或本文公开的微生物的特定菌株的、具有各自菌株的所有识别特征的突变体，和/或由各自菌株产生的至少一种代谢物，和/或由各自菌株产生的表现出对抗昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的活性的至少一种代谢物。此外，本发明涉及该组合物的用途以及用于增强植物生长、促进植物健康和/或降低植物和植物部分的整体损害的方法。

Description

包含重组芽孢杆菌属细胞和其他生物防治试剂的组合物
相关申请交叉引用
本申请要求于2014年9月17日提交的美国临时专利申请号62/051,911的优先权，其内容通过引用的方式全部纳入本文中。
引用电子提交的序列表
序列表的正式文本是以2015年9月14日创建的文件名为“BCS149057WO_ST25.txt”的ASCII格式序列表的形式通过EFS-Web电子提交，大小为152千字节，并与说明书同时提交。包含在该ASCII格式的文档中的序列表是说明书的一部分并且以引用的方式全部纳入本文中。
技术领域
本发明涉及一种组合物，其包含协同有效量的以下物质：(i)表达融合蛋白的重组产孢子外壁(exosporium)的芽孢杆菌属(Bacillus)细胞，所述融合蛋白包含：(x)至少一种植物生长刺激蛋白或肽，和(y)将所述融合蛋白定位到芽孢杆菌属细胞的孢子外壁上的靶向序列；和(ii)至少一种其他的生物防治试剂，其选自本文公开的特定微生物和/或本文公开的微生物的特定菌株的、具有各自菌株的所有识别特征的突变体，和/或由各自菌株产生的至少一种代谢物，所述代谢物表现出改善植物生长和/或健康的能力和/或对抗昆虫、螨虫(mite)、线虫和/或植物病原体的活性。此外，本发明涉及该组合物的用途以及用于增强植物生长、促进植物健康和/或降低植物和植物部分的整体损害的方法。
背景技术
在作物保护中，持续需要改善植物健康和/或生长的应用。更健康的植物通常得到植物或其产品的更高的产量和/或更好的质量。
为了促进植物健康，在世界范围内使用基于无机物质和有机物质的肥料。肥料可以是单一物质或组合物，并用于向植物提供营养物质。肥料应用中的一个重大突破是在1840年左右由Justus von Liebig开发了氮基肥料。然而，肥料可导致土壤酸化和土壤中的营养平衡的不稳定，包括矿物质的消耗以及盐和重金属的富集。此外，过量的肥料使用可导致土壤动物区系的改变，并可污染地表水和地下水。此外，如硝酸盐的不健康物质可能在植物和果实中富集。
此外，杀虫剂和杀真菌剂在世界范围内用于防治害虫。合成杀虫剂或杀真菌剂通常是非特异性的并因此可作用于目标生物以外的生物，包括其他自然存在的有益生物。由于它们的化学性质，它们还可能是有毒的且不可生物降解的。全世界的消费者正日益意识到与化学制品残留相关的潜在的环境和健康问题，特别是在食品方面。这使得减少使用化学(即，合成的)农药或至少减少其量的消费者压力不断增大。因此，需要控制食物链需求，同时仍允许有效的害虫防治。
伴随合成杀虫剂或杀真菌剂的使用而出现的另一问题是，重复和单独的应用杀虫剂或杀真菌剂通常会导致选择出抗性动物害虫或微生物。通常，这些菌株还对具有相同作用模式的其他活性成分具有交叉抗性。于是，将不再可能采用所述活性化合物来有效防治病原体。然而，开发具有新作用机理的活性成分是困难且昂贵的。
生物防治试剂(BCA)的使用是肥料和合成农药的替代物。在某些情况下，生物防治试剂的功效尚未达到与肥料或与传统杀虫剂和杀真菌剂相同的水平，特别是在严重感染压力的情况下。因此，在某些情况下，生物防治试剂、它们的突变体和由其产生的代谢物，特别是在低施用率的情况下，并不能完全令人满意。因此，一直需要开发新的、替代的植物健康增强剂和/或植物保护剂，其在某些领域至少有助于满足上述需求。
发明内容
鉴于此，本发明的目的特别是提供一种组合物，其具有增强的改善植物生长和/或增强植物健康的能力或表现出增强的对抗昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的活性。
因此，发现这些目的可使用如下所定义的本发明的组合物实现。通过施用a)表达融合蛋白的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞，所述融合蛋白包含：(i)至少一种植物生长刺激蛋白或肽，其选自参与植物生长刺激化合物的产生或活化的酶；降解或修饰细菌、真菌或植物营养源的酶；及保护植物抵御病原体或害虫的蛋白或肽；和(ii)将所述融合蛋白定位于芽孢杆菌属细胞的孢子外壁上的靶向序列；和b)除了本发明的所述重组芽孢杆菌属细胞以外，至少一种本文公开的特定菌株，优选地以超加和方式增强(i)植物生长、植物产量的能力和/或植物健康和/或(ii)对抗昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的活性。
本文中提及的靶向序列、孢子外壁蛋白、孢子外壁蛋白片段、融合蛋白和表达这种融合蛋白的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞不应被认为是独立的实施方案。相反，在本申请通篇中，提及靶向序列、孢子外壁蛋白、孢子外壁蛋白片段、融合蛋白和表达这种融合蛋白的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞时，应当认为是仅在与一种或多种本文所述的特定生物防治试剂的组合中(并且优选在协同组合中)被公开和要求保护的。此外，提及“本文公开的特定微生物”或“本文所述或公开的特定生物防治试剂”时，旨在包括生物防治试剂和微生物，包括其菌株、突变体和代谢物，如下文[000183]-[000226]段中所述。
本发明涉及一种组合物，其包含协同有效量的以下物质：a)表达融合蛋白的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞，所述融合蛋白包含：(i)至少一种植物生长刺激蛋白或肽，其选自参与植物生长刺激化合物的产生或活化的酶，降解或修饰细菌、真菌或植物营养源的酶或保护植物抵御病原体的蛋白或肽；和(ii)将所述融合蛋白定位于芽孢杆菌属细胞的孢子外壁上的靶向序列；和b)至少一种本文公开的其他的且不同的特定生物防治试剂和/或本文公开的微生物的特定菌株的、具有各自菌株的所有识别特征的突变体，和/或由各自菌株产生的表现出对抗昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的活性的至少一种代谢物。
在一些实施方案中，所述靶向序列包含与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约43％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约54％；包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-35的靶向序列；包含SEQ ID NO:1的氨基酸20-35的靶向序列；包含SEQ ID NO:1的氨基酸22-31的靶向序列；包含SEQ ID NO:1的氨基酸22-33的靶向序列；包含SEQ ID NO:1的氨基酸20-31的靶向序列；包含SEQ ID NO:1的靶向序列；或包含与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性的氨基酸序列的孢子外壁蛋白。
在其他实施方案中，重组芽孢杆菌属细胞是蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)家族成员的细胞，所述蜡状芽孢杆菌例如炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、蜡状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、蕈状芽胞杆菌(Bacillus mycoides)、假蕈状芽胞杆菌(Bacillus pseudomycoides)、Bacillus samanii、Bacillus gaemokensis、韦氏芽孢杆菌(Bacillus weihenstephensis)、东洋芽胞杆菌(Bacillus toyoiensis)及其组合。在另一个实施方案中，重组芽孢杆菌属细胞是苏云金芽孢杆菌BT013A的细胞。
在某些方面，融合蛋白包含选自以下的参与植物生长刺激化合物的产生或活化的酶：3-羟基丁酮还原酶(acetoin reductase)、吲哚-3-乙酰胺水解酶、色氨酸单加氧酶、乙酰乳酸合成酶、α-乙酰乳酸脱羧酶、丙酮酸脱羧酶、二乙酰还原酶、丁二醇脱氢酶、氨基转移酶、色氨酸脱羧酶、胺氧化酶、吲哚-3-丙酮酸脱羧酶、吲哚-3-乙醛脱氢酶、色氨酸侧链氧化酶、腈水解酶(nitrile hydrolase)、腈水解酶(nitrilase)、肽酶、蛋白酶、磷酸腺苷异戊烯基转移酶、磷酸酶、腺苷激酶、腺嘌呤磷酸核糖基转移酶、CYP735A、5'核糖核苷酸磷酸水解酶、腺苷核苷酶、玉米素顺式-反式异构酶、玉米素O-葡萄糖基转移酶、β-萄糖苷酶、顺式羟化酶、CK顺式羟化酶、CK N-葡萄糖基转移酶、2,5-核糖核苷酸磷酸水解酶、腺苷核苷酶、嘌呤核苷磷酸化酶、玉米素还原酶、羟胺还原酶、2-酮戊二酸双加氧酶、赤霉2B/3B水解酶(gibberellic 2B/3B hydrolase)、赤霉素3-氧化酶、赤霉素20-氧化酶、脱乙酰壳多糖酶(chitosanase)、壳多糖酶(chitinase)、β-1,3-葡聚糖酶、β-1,4-葡聚糖酶、β-1,6-葡聚糖酶、氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶，及参与产生结瘤因子(nod factor)的酶。
在其他方面，融合蛋白包含选自以下的降解或修饰细菌、真菌或植物营养源的酶：纤维素酶、脂肪酶、木质素氧化酶、蛋白酶、糖苷水解酶、磷酸酶、固氮酶、核酸酶、酰胺酶、硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、淀粉酶、氨氧化酶、木质素酶、葡糖苷酶、磷脂酶、植酸酶、果胶酶、葡聚糖酶、硫酸酯酶、脲酶、木聚糖酶和铁载体。
在一些实施方案中，所述融合蛋白是在融合蛋白的靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段的天然(native to)孢子形成启动子的控制下表达。融合蛋白可在高表达孢子形成启动子的控制下表达。在某些方面，高表达孢子形成启动子包含σ-K孢子形成特异性聚合酶启动子序列(sigma-K sporulation-specific polymerase promotersequence)。在其他方面，孢子形成启动子包含与SEQ ID NO:85-103中的任一核酸序列具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，孢子形成启动子包含与SEQ ID NO:85-103中的任一核酸序列具有100％同一性的核酸序列。
在其他实施方案中，至少一种生物防治试剂是产生丰原素(fengycin)或大侧柏素(plipastatin)型化合物、伊枯草菌素型化合物和/或枯草菌表面活性素(surfactin)型化合物的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株或解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)菌株。对于背景，参见以下综述文章：Ongena，M.et al.,“BacillusLipopeptides:Versatile Weapons for Plant Disease Biocontrol,”Trends inMicrobiology，Vol 16，No.3，2008年3月，pp.115-125。能够产生脂肽的芽孢杆菌属菌株包括枯草芽孢杆菌QST713、解淀粉芽孢杆菌菌株D747(可作为获自Etec CropSolutions，NZ并且也可作为DOUBLE NICKELTM获自Certis，US)；枯草芽孢杆菌MBI600(可作为获自Becker Underwood，US EPA登记号71840-8)；枯草芽孢杆菌Y1336(可作为WP获自Bion-Tech，台湾，在台湾注册为生物杀真菌剂，登记号为4764、5454、5096和5277)；解淀粉芽孢杆菌，特别是菌株FZB42(可作为获自ABiTEP，DE)；枯草芽孢杆菌变种解淀粉芽孢杆菌FZB24可作为杀真菌剂或ECO(EPA登记号70127-5)获自Novozymes Biologicals Inc.(Salem，Virginia)或Syngenta Crop Protection，LLC(Greensboro，North Carolina)。
在另一实施方案中，所述至少一种生物防治试剂选自短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)菌株QST2808、枯草芽孢杆菌菌株QST713、枯草芽孢杆菌菌株QST30002、枯草芽孢杆菌菌株QST30004、微黄链霉菌(Streptomyces microflavus)菌株NRRL B-50550、微黄链霉菌菌株M、坚强芽孢杆菌菌株I-1582，它们的具有各自菌株的所有识别特征的突变体，以及由各自菌株产生的表现出对抗昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的活性的至少一种代谢物。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含协同有效量的以下物质：a)表达融合蛋白的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞，所述融合蛋白包含：(i)至少一种植物生长刺激蛋白或肽，其选自参与植物生长刺激化合物的产生或活化的酶，和降解或修饰细菌、真菌或植物营养源的酶；或保护植物抵御病原体的蛋白或肽；和(ii)将所述融合蛋白定位于芽孢杆菌属细胞的孢子外壁上的靶向序列；和b)坚强芽孢杆菌菌株I-1582。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含协同有效量的以下物质：a)表达融合蛋白的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞，所述融合蛋白包含：(i)至少一种植物生长刺激蛋白或肽，其选自参与植物生长刺激化合物的产生或活化的酶，和降解或修饰细菌、真菌或植物营养源的酶，或至少一种保护植物抵御病原体的蛋白或肽；和(ii)将所述融合蛋白定位于芽孢杆菌属细胞的孢子外壁上的靶向序列；和b)枯草芽孢杆菌菌株QST713。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含协同有效量的以下物质：a)表达融合蛋白的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞，所述融合蛋白包含：(i)至少一种植物生长刺激蛋白或肽，其选自参与植物生长刺激化合物的产生或活化的酶，和降解或修饰细菌、真菌或植物营养源的酶，或至少一种保护植物抵御病原体的蛋白或肽；和(ii)将所述融合蛋白定位于芽孢杆菌属细胞的孢子外壁上的靶向序列；和b)短小芽孢杆菌菌株QST2808。
在另一实施方案中，所述组合物还包含c)至少一种杀真菌剂和/或d)至少一种杀虫剂。所述至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂可以是合成的。在这种实施方案的一个方面，这种组合物的生物防治试剂和另外的杀虫剂分别包括坚强芽孢杆菌菌株I-1582和噻虫胺(clothianidin)。
在上述实施方案的具体方面，(i)所述生物防治试剂是枯草芽孢杆菌QST713，或具有枯草芽孢杆菌QST713的所有识别特征的突变体，和/或与枯草芽孢杆菌QST713具有至少95％或至少98％序列同一性的突变体；(ii)所述靶向序列包含与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约43％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约54％；(iii)所述植物生长刺激蛋白或肽包含内切葡聚糖酶、磷脂酶或脱乙酰壳多糖酶(chitosinase)，优选地分别与SEQ ID NO:107、108和109具有至少95％的序列同一性；和(iv)所述重组蜡状芽孢杆菌家族成员细胞包括苏云金芽孢杆菌或蕈状芽孢杆菌的细胞。在另一个具体实施方案中，所述重组蜡状芽孢杆菌家族成员细胞是苏云金芽孢杆菌BT013A的细胞。
在上述实施方案的具体方面，(i)所述生物防治试剂是坚强芽孢杆菌I-1582，或具有坚强芽孢杆菌I-1582的所有识别特征的突变体，和/或与坚强芽孢杆菌I-1582具有至少95％或至少98％序列同一性的突变体；(ii)所述靶向序列包含与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约43％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约54％；(iii)所述植物生长刺激蛋白或肽包含内切葡聚糖酶、磷脂酶或脱乙酰壳多糖酶(chitosinase)，优选地分别与SEQ ID NO:107、108和109具有至少95％或至少98％的序列同一性；和(iv)所述重组蜡状芽孢杆菌家族成员细胞包括苏云金芽孢杆菌或蕈状芽孢杆菌的细胞。在另一个具体实施方案中，所述重组蜡状芽孢杆菌家族成员细胞是苏云金芽孢杆菌BT013A的细胞。在该实施方案的另一方面，所述组合物还包含噻虫胺。
在上述实施方案的具体方面，(i)所述生物防治试剂是短小芽孢杆菌QST2808，或具有短小芽孢杆菌QST2808的所有识别特征的突变体，和/或与短小芽孢杆菌QST2808具有至少95％或至少98％序列同一性的突变体；(ii)所述靶向序列包含与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约43％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约54％；(iii)所述植物生长刺激蛋白或肽包含内切葡聚糖酶、磷脂酶或脱乙酰壳多糖酶(chitosinase)，优选地分别与SEQ ID NO:107、108和109具有至少95％或至少98％的序列同一性；和(iv)所述重组蜡状芽孢杆菌家族成员细胞包括苏云金芽孢杆菌或蕈状芽孢杆菌的细胞。在另一个具体实施方案中，所述重组蜡状芽孢杆菌家族成员细胞是苏云金芽孢杆菌BT013A的细胞。
在一些方面，所述组合物还包含至少一种选自增容剂(extender)、溶剂、自发生促进剂(spontaneity promoters)、载体、乳化剂、分散剂、防冻剂(frost protectant)、增稠剂和佐剂的助剂。
在其他方面，本发明涉及使用本文公开的任何组合物处理的种子。
此外，本发明涉及所公开的组合物作为杀真菌剂和/或杀虫剂的用途。在某些方面，所公开的组合物用于降低植物和植物部分的总体损伤以及由昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体引起的收获的水果或蔬菜中的损失。在其他方面，所公开的组合物用于增强植物生长和/或促进植物健康。
此外，本发明涉及一种处理植物、植物部分(例如种子、根、根茎、球茎、鳞茎或块茎)和/或植物或植物部分生长于其上或其附近的场所(例如土壤)，以增强植物生长和/或促进植物健康的方法，其包括同时地或惯序地向植物、植物部分或植物场所施用协同有效量的以下物质的步骤：a)表达融合蛋白的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞，所述融合蛋白包含：(i)至少一种植物生长刺激蛋白或肽，其选自参与植物生长刺激化合物的产生或活化的酶；降解或修饰细菌、真菌或植物营养源的酶；及保护植物抵御病原体的蛋白或肽；和(ii)将所述融合蛋白定位于芽孢杆菌属细胞的孢子外壁上的靶向序列；和b)至少一种本文公开的生物防治试剂和/或本文公开的微生物的特定菌株的、具有各自菌株的所有识别特征的突变体，和/或由各自菌株产生的表现出对抗昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的活性的至少一种代谢物。
在另一个实施方案中，本发明为用于降低植物和植物部分的总体损害以及由昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体引起的收获的水果或蔬菜中的损失的方法，其包括同时地或惯序地向植物、植物部分(例如种子、根、根茎、球茎、鳞茎或块茎)和/或植物或植物部分生长于其上或其附近的场所(例如土壤)施用协同有效量的以下物质的步骤：a)表达融合蛋白的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞，所述融合蛋白包含：(i)至少一种植物生长刺激蛋白或肽，其选自参与植物生长刺激化合物的产生或活化的酶；降解或修饰细菌、真菌或植物营养源的酶；及保护植物抵御病原体的蛋白或肽；和(ii)将所述融合蛋白定位于芽孢杆菌属细胞的孢子外壁上的靶向序列；和b)至少一种本文公开的生物防治试剂和/或本文公开的微生物的特定菌株的、具有各自菌株的所有识别特征的突变体，和/或由各自菌株产生的表现出对抗昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的活性的至少一种代谢物。
在上述段落中，术语“包含”或其任何派生词(例如，含有、包括)可以用“由...组成”或其适用的相应派生词来代替。
附图说明
图1示出了炭疽芽孢杆菌斯特恩菌株(Bacillus anthracis Sterne strain)BclA的氨基末端部分的氨基酸序列与来自蜡状芽孢杆菌家族成员的各种孢子外壁蛋白的相应区域的比对。
具体实施方式
一般而言，“农药”(pesticidal)意指物质提高植物害虫的致死率或抑制其生长速率的能力。该术语在本文中用于描述物质表现出对抗昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的活性的特性。在本发明的意义上，术语“害虫”包括昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体。
本文所用的“生物防治”被定义为通过使用另一生物来防治病原体和/或昆虫和/或螨虫和/或线虫。已知的生物防治的机制包括通过在根部表面与真菌的空间或营养竞争中胜出来防治根腐的细菌。细菌毒素，例如抗生素，已被用于防治病原体。可分离所述毒素并将其直接施用于植物，或者可给予细菌物种以使其原位产生毒素。进行生物防治的其他方法包括施用产生有效对抗目标植物病原体、昆虫、螨虫或线虫的成分的，或攻击目标害虫/病原体的某些真菌。与本发明相关使用的“生物防治”还可包括对植物健康、生长、活力、胁迫反应或产量具有有益效果的微生物。施用途径包括喷雾施用、土壤施用和种子处理。
术语“代谢物”是指所述微生物的发酵的任何化合物、物质或副产物，其具有农药、杀真菌或杀线虫活性或者增强植物健康或增加植物产量的能力。术语“突变体”是指亲代菌株的变体以及用于获得其农药活性高于亲代菌株表现出的农药活性的突变体或变体的方法。“亲代菌株”在本文中被定义为诱变前的原始菌株或保藏菌株。为获得所述突变体，可用化学试剂(例如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍、乙基甲烷砜(ethylmethanesulfone)，或通过使用伽马射线、X-射线或紫外线辐射的辐射，或通过本领域中技术人员公知的其他方法处理亲代菌株。
“变体”为具有如本文所示的NRRL或ATCC登记号的所有识别特征的菌株，并可被鉴定为具有在高严格的条件下同NRRL或ATCC登记号的基因组杂交的基因组。
“杂交”是指其中一个或多个多核苷酸反应形成复合物的反应，所述复合物是通过核苷酸残基的碱基间的氢键合而稳定。氢键合可通过Watson-Crick碱基配对、Hoogstein结合或以任何其他序列特异的方式出现。所述复合物可包括形成双链结构的两条链，形成多链复合物的三条或更多条链，可自杂交的单链，或这些的任何组合。杂交反应可在不同的“严格”条件下进行。一般而言，低严格杂交反应是在约40℃下在10×SSC中，或等同的离子强度/温度的溶液中进行。中严格杂交通常是在约50℃下在6×SSC中进行，高严格杂交反应通常是在约60℃下在1×SSC中进行。
所述NRRL或ATCC登记号的变体还可被定义为这样的菌株，即其基因组序列与所述NRRL或ATCC登记号的基因组的序列具有大于85％、更优选大于90％或更优选大于95％的序列同一性。多核苷酸或多核苷酸区域(或者多肽或多肽区域)与另一序列具有一定的“序列同一性”百分比(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)意指，当对比时，比较所述两个序列时该百分比的碱基(或氨基酸)是相同的。所述对比以及同源性百分比或序列同一性可使用本领域中已知的软件程序测定，例如记载于Current Protocols inMolecular Biology(F.M.Ausubel等,eds.,1987)附录30，第7.7.18部分，表7.7.1中的那些。
NRRL为美国农业研究局培养物保藏中心(Agricultural Research ServiceCulture Collection)的缩写，其地址是：美国伊利诺伊州Peoria市北部大学街1815号，美国农业部农业研究局，农业应用研究国家中心，邮编61604。
ATTC为美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的缩写，其地址是：美国弗吉尼亚州马纳萨斯市大学大道10801号ATCC专利保存中心，邮编10110。
CNCM为法国巴斯德研究所国立微生物保藏中心(CollectionNationale deCultures de Microorganismes)的缩写，其地址是：法国，25Rue du Docteur Roux，F-75724Paris Cedex 15，巴斯德研究所。
本文所述的并具有前缀为NRRL、ATCC或CNCM的登记号的所有菌株均已经根据关于国际承认用于专利程序的微生物保存的布达佩斯条约保藏于上述各自的保藏机构。
“参与植物生长刺激化合物的产生或活化的酶”包括催化用于刺激植物生长或改变植物结构的化合物的生物合成途径中的任何步骤的任何酶，或催化刺激植物生长或改变植物结构的化合物的无活性或较低活性的衍生物转化为该化合物的有活性或更高活性形式的任何酶。这样的化合物包括但不限于，例如小分子植物激素(如植物生长素和细胞***素)、生物活性肽和由根际中的细菌或真菌合成的小的植物生长刺激分子(例如2,3-丁二醇)。
如本文所用的“植物免疫***增强子蛋白或肽”包括对植物的免疫***具有有益效果的任何蛋白或肽。
如本文所用的术语“植物生长刺激蛋白或肽”包括在暴露于所述蛋白或肽的植物中增加植物生长的任何蛋白或肽。
术语“促进植物生长”和“刺激植物生长”在本文中可互换使用，是指增强或增加植物的高度、重量、叶尺寸、根尺寸或茎尺寸中的至少一个，增加植物的蛋白质产量或增加植物的谷物产量的能力。
如本文所用的“保护植物抵御病原体的蛋白或肽”包括使暴露于所述蛋白或肽的植物对病原体感染较不敏感的任何蛋白或肽。
如本文所用的“增强植物的胁迫抗性的蛋白或肽”包括使暴露于所述蛋白或肽的植物对胁迫更有抗性的任何蛋白或肽。
术语“植物结合蛋白或肽”是指能够特异性或非特异性结合至植物的任何部分(例如植物的根或地上部分(aerial portion)，例如叶子、茎、花或果实)或结合至植物物质的任何肽或蛋白质。
如本文所用的术语“靶向序列”是指导致更长的多肽或蛋白质定位于蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子外壁上的多肽序列。
表达融合蛋白的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞
所述融合蛋白含有使融合蛋白靶向至蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子外壁的靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段，和：(a)植物生长刺激蛋白或肽；(b)保护植物抵御病原体的蛋白或肽；(c)增强植物的胁迫抗性的蛋白或肽；(d)植物结合蛋白或肽；或(e)植物免疫***增强子蛋白或肽。当在蜡状芽孢杆菌家族成员细菌中表达时，这些融合蛋白被靶向至孢子的孢子外壁层，并且被物理定向以使得所述蛋白或肽展示于孢子外侧。
这种芽孢杆菌属孢子外壁展示(BEMD)***可用于将肽、酶和其他蛋白质递送至植物(例如，递送至植物叶子、果实、花、茎或根)或递送至植物生长培养基(例如土壤)。以这种方式递送至土壤或另一种植物生长培养基中的肽、酶和蛋白质长时间在土壤中存留和显示活性。将本文所述的表达融合蛋白的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞引入土壤或植物根际中，实现在许多不同土壤条件下的植物生长的有益增强。使用BEMD来产生这些酶使得它们在植物生命的最初几个月持续对植物和根际施加它们的有益结果。
靶向序列、孢子外壁蛋白和孢子外壁蛋白片段
为了便于参考，本文提及的肽和蛋白序列的SEQ ID编号列于下面的表1中。
表1.肽序列和蛋白序列
AA＝氨基酸
*炭疽芽孢杆菌斯特恩菌株BclA与苏云金芽孢杆菌BclA具有100％的序列同一性。因此，SEQ ID NO:1、2和59也分别表示苏云金芽孢杆菌BclA的氨基酸1-41、全长苏云金芽孢杆菌BclA和苏云金芽孢杆菌BclA的氨基酸1-196。同样地，SEQ ID NO:60也表示甲硫氨酸残基加苏云金芽孢杆菌BclA的氨基酸20-35。
**蕈状芽孢杆菌假定蛋白TIGR03720与蕈状芽孢杆菌假定蛋白WP003189234具有100％的序列同一性。因此，SEQ ID NO:57和58也分别表示蕈状芽孢杆菌假定蛋白WP003189234的氨基酸1-136和全长蕈状芽孢杆菌假定蛋白WP003189234。
芽孢杆菌属是棒状细菌属。细菌的蜡状芽孢杆菌家族包括以下种：炭疽芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、蕈状芽胞杆菌、假蕈状芽胞杆菌、Bacillus samanii、Bacillus gaemokensis、东洋芽胞杆菌和韦氏芽孢杆菌。在胁迫环境条件下，蜡状芽孢杆菌家族细菌经历孢子形成并形成可以在很长时间内保持休眠的椭圆形内生孢子。内生孢子的最外层称为孢子外壁，并且包括被毛发状突起的外部细毛(nap)包围的基底层。毛发状细毛上的丝主要由胶原样糖蛋白BclA形成，而基底层由许多不同的蛋白质组成。另一种胶原相关的蛋白BclB也存在于孢子外壁中并在蜡状芽孢杆菌家族成员的内生孢子上暴露。
已证明BclA(表面细毛的主要成分)附着于孢子外壁，其氨基末端(N-末端)位于基底层上并且其羧基末端(C-末端)从孢子向外延伸。
先前已经发现，来自BclA和BclB的N-末端区域的某些序列可用于将肽或蛋白质靶向至蜡状芽孢杆菌内生孢子的孢子外壁(参见美国专利公开2010/0233124和2011/0281316，以及Thompson et al.,“Targeting of the BclA and BclB Proteins to theBacillus anthracis Spore Surface,”Molecular Microbiology，70(2):421–34(2008)，每篇全文均以引用的方式纳入本文中)。还发现炭疽芽孢杆菌的BetA/BAS3290蛋白定位于孢子外壁。
特别地，已经发现来自炭疽芽孢杆菌斯特恩菌株的BclA的氨基酸20-35足以靶向至孢子外壁。BclA的氨基酸1-41(SEQ ID NO:1)与具有相关序列的几个其他蜡状芽孢杆菌家族孢子外壁蛋白和蜡状芽孢杆菌家族蛋白的相应N-末端区域的序列比对示于图1中。由图1可以看出，在对应于BclA的氨基酸20-41的区域中所有蛋白质中存在高同源性的区域。然而，在这些序列中，对应于BclA的氨基酸36-41的氨基酸含有二级结构，并且对于融合蛋白定位至孢子外壁来说不是必需的。BclA的保守性靶向序列区(SEQ ID NO:1的氨基酸20-35)在图1中以粗体显示，并且对应于定位至孢子外壁所需的最小靶向序列。跨越靶向序列内的BclA的氨基酸25-35的更高度保守的区域在图1的序列中加下划线，并且是ExsFA/BxpB/ExsFB和同源物的识别序列，所述ExsFA/BxpB/ExsFB和同源物在孢子外壁表面上引导和组装所述蛋白质。图1中的SEQ ID NO:3、5和7的氨基酸序列分别是炭疽芽孢杆菌斯特恩菌株BetA/BAS3290的氨基酸1-33、甲硫氨酸、其后为炭疽芽孢杆菌斯特恩菌株BAS4623的氨基酸2-43和炭疽芽孢杆菌斯特恩菌株BclB的氨基酸1-34。(对于BAS4623，发现用甲硫氨酸替换天然蛋白质中位置1处存在的缬氨酸导致更好的表达。)由图1可以看出，这些序列中的每一个都含有对应于BclA的氨基酸20-35的保守区(SEQ ID NO:1；以粗体显示)和对应于BclA的氨基酸20-35的更高度保守的区域(下划线)。
来自蜡状芽孢杆菌家族成员的其余蛋白质也含有保守的靶向区。特别地，在图1中，SEQ ID NO:9是炭疽芽孢杆菌斯特恩菌株BAS1882的氨基酸1-30，SEQ ID NO:11是韦氏芽孢杆菌KBAB4 2280基因产物的氨基酸1-39，SEQ ID NO:13是韦氏芽孢杆菌KBAB4 3572基因产物的氨基酸1-39，SEQ ID NO:15是蜡状芽孢杆菌VD200孢子外壁前导肽的氨基酸1-49，SEQ ID NO:17是蜡状芽孢杆菌VD166孢子外壁前导肽的氨基酸1-33，SEQ ID NO:19是蜡状芽孢杆菌VD200假定蛋白IKG_04663的氨基酸1-39，SEQ ID NO:21是韦氏芽孢杆菌KBAB4YVTNβ-螺旋桨蛋白的氨基酸1-39，SEQ ID NO:23是韦氏芽孢杆菌KBAB4假定蛋白bcerkbab4_2363的氨基酸1-30，SEQ ID NO:25是韦氏芽孢杆菌KBAB4假定蛋白bcerkbab4_2131的氨基酸1-30，SEQ ID NO:27是韦氏芽孢杆菌KBAB4含三螺旋重复的胶原蛋白的氨基酸1-36，SEQ ID NO:29是蕈状芽孢杆菌2048假定蛋白bmyco0001_21660的氨基酸1-39，SEQID NO:31是蕈状芽孢杆菌2048假定蛋白bmyc0001_22540的氨基酸1-30，SEQ ID NO:33是蕈状芽孢杆菌2048假定蛋白bmyc0001_21510的氨基酸1-21，SEQ ID NO:35是苏云金芽孢杆菌35646胶原三螺旋重复蛋白的氨基酸1-22，SEQ ID NO:43是蜡状芽孢杆菌假定蛋白WP_69652的氨基酸1-35，SEQ ID NO:45是蜡状芽孢杆菌孢子外壁前导WP016117717的氨基酸1-41，SEQ ID NO:47是蜡状芽孢杆菌孢子外壁肽WP002105192的氨基酸1-49，SEQ ID NO:49是蜡状芽孢杆菌假定蛋白WP87353的氨基酸1-38，SEQ ID NO:51是蜡状芽孢杆菌孢子外壁肽02112369的氨基酸1-39，SEQ ID NO:53是蜡状芽孢杆菌孢子外壁蛋白WP016099770的氨基酸1-39，SEQ ID NO:55是苏云金芽孢杆菌假定蛋白YP006612525的氨基酸1-36，SEQ ID NO:57是蕈状芽孢杆菌假定蛋白TIGR03720的氨基酸1-136。如图1所示，这些蛋白质的每个N-末端区域均含有与BclA的氨基酸20-35(SEQ ID NO:1)保守的区域，以及对应于BclA的氨基酸25-35的更高度保守的区域。
包括氨基酸20-35的BclA的任何部分均可以用作靶向序列。另外，全长孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段可用于将融合蛋白靶向至孢子外壁。因此，全长BclA或包括氨基酸20-35的BclA片段可用于靶向至孢子外壁。例如，全长BclA(SEQ ID NO:2)或缺乏羧基末端的BclA的中等片段如SEQ ID NO:59(BclA的氨基酸1-196)可用于将融合蛋白靶向至孢子外壁。中等片段(例如SEQ ID NO:59的片段)比全长BclA具有更少的二级结构，并且已经发现适合用作靶向序列。靶向序列还可包含包括氨基酸20-35的BclA的更短部分，例如SEQ IDNO:1(BclA的氨基酸1-41)、SEQ ID NO:1的氨基酸1-35、SEQ ID NO:1的氨基酸20-35或SEQID NO:60(与BclA的氨基酸20-35连接的甲硫氨酸残基)。甚至仅包含氨基酸20-35中的一些的更短的BclA片段也表现出将融合蛋白靶向至孢子外壁的能力。例如，靶向序列可包含SEQID NO:1的氨基酸22-31、SEQ ID NO:1的氨基酸22-33或SEQ ID NO:1的氨基酸20-31。
或者，包括对应于BclA的氨基酸20-35的氨基酸的BetA/BAS3290、BAS4623、BclB、BAS1882、KBAB4 2280基因产物、KBAB4 3572基因产物、蜡状芽孢杆菌VD200孢子外壁前导肽、蜡状芽孢杆菌VD166孢子外壁前导肽、蜡状芽孢杆菌VD200假定蛋白IKG_04663、韦氏芽孢杆菌KBAB4YVTNβ-螺旋桨蛋白、韦氏芽孢杆菌KBAB4假定蛋白bcerkbab4_2363、韦氏芽孢杆菌KBAB4假定蛋白bcerkbab4_2131、韦氏芽孢杆菌KBAB4含三螺旋重复的胶原蛋白、蕈状芽孢杆菌2048假定蛋白bmyco0001_21660、蕈状芽孢杆菌2048假定蛋白bmyc0001_22540、蕈状芽孢杆菌2048假定蛋白bmyc0001_21510、苏云金芽孢杆菌35646胶原三螺旋重复蛋白、蜡状芽孢杆菌假定蛋白WP_69652、蜡状芽孢杆菌孢子外壁前导WP016117717、蜡状芽孢杆菌孢子外壁肽WP002105192、蜡状芽孢杆菌假定蛋白WP87353、蜡状芽孢杆菌孢子外壁肽02112369、蜡状芽孢杆菌孢子外壁蛋白WP016099770、苏云金芽孢杆菌假定蛋白YP006612525或蕈状芽孢杆菌假定蛋白TIGR03720的任何部分可以用作靶向序列。从图1可以看出，BetA/BAS3290的氨基酸12-27、BAS4623的氨基酸23-38、BclB的氨基酸13-28、BAS1882的氨基酸9-24、KBAB42280基因产物的氨基酸18-33、KBAB4 3572基因产物的氨基酸18-33、蜡状芽孢杆菌VD200孢子外壁前导肽的氨基酸28-43、蜡状芽孢杆菌VD166孢子外壁前导肽的氨基酸12-27、蜡状芽孢杆菌VD200假定蛋白IKG_04663的氨基酸18-33、韦氏芽孢杆菌KBAB4YVTNβ-螺旋桨蛋白的氨基酸18-33、韦氏芽孢杆菌假定蛋白bcerkbab4_2363的氨基酸9-24、韦氏芽孢杆菌假定蛋白bcerkbab4_2131的氨基酸9-24、韦氏芽孢杆菌KBAB4含三螺旋重复的胶原蛋白的氨基酸15-30、蕈状芽孢杆菌2048假定蛋白bmyco0001_21660的氨基酸18-33、蕈状芽孢杆菌2048假定蛋白bmyc0001_22540的氨基酸9-24、蕈状芽孢杆菌2048假定蛋白bmyc0001_21510的氨基酸1-15、苏云金芽孢杆菌35646胶原三螺旋重复蛋白的氨基酸1-16、蜡状芽孢杆菌假定蛋白WP_69652的氨基酸14-29、蜡状芽孢杆菌孢子外壁前导WP016117717的氨基酸20-35、蜡状芽孢杆菌孢子外壁肽WP002105192的氨基酸28-43、蜡状芽孢杆菌假定蛋白WP87353的氨基酸17-32、蜡状芽孢杆菌孢子外壁肽02112369的氨基酸18-33、蜡状芽孢杆菌孢子外壁蛋白WP016099770的氨基酸18-33、苏云金芽孢杆菌假定蛋白YP006612525的氨基酸15-30和蕈状芽孢杆菌假定蛋白TIGR03720的氨基酸115-130，均对应于BclA的氨基酸20-35。因此，包括上文列出的对应氨基酸的这些蛋白质的任何部分可以用作靶向序列。
此外，包含BclA的氨基酸20-35或任何上述对应氨基酸的任何氨基酸序列可以用作靶向序列。
因此，靶向序列可包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-35、SEQ ID NO:1的氨基酸20-35、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:1的氨基酸22-31、SEQ ID NO:1的氨基酸22-33或SEQ ID NO:1的氨基酸20-31。或者，靶向序列由SEQ ID NO:1的氨基酸1-35、SEQ ID NO:1的氨基酸20-35、SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:60组成。或者，靶向序列可由SEQ ID NO:1的氨基酸22-31、SEQ ID NO:1的氨基酸22-33或SEQ ID NO:1的氨基酸20-31组成。或者，孢子外壁蛋白可包含全长BclA(SEQ ID NO:2)，或孢子外壁蛋白片段可包含缺乏羧基末端的BclA的中等片段，如SEQ ID NO:59(BclA的氨基酸1-196)。或者，孢子外壁蛋白片段可以由SEQ IDNO:59组成。
靶向序列还可包含SEQ ID NO:3的氨基酸1-27、SEQ ID NO:3的氨基酸12-27或SEQID NO:3，或孢子外壁蛋白可包含全长BetA/BAS3290(SEQ ID NO:4)。还已经发现，连接到BetA/BAS3290的氨基酸12-27的甲硫氨酸残基可以用作靶向序列。因此，靶向序列可包含SEQ ID NO:61。靶向序列还可包含SEQ ID NO:3的氨基酸14-23，SEQ ID NO:3的氨基酸14-25或SEQ ID NO:3的氨基酸12-23。
靶向序列还可包含SEQ ID NO:5的氨基酸1-38，SEQ ID NO:5的氨基酸23-38或SEQID NO:5，或孢子外壁蛋白可包含全长BAS4623(SEQ ID NO:6)。
或者，靶向序列可包含SEQ ID NO:7的氨基酸1-28、SEQ ID NO:7的氨基酸13-28或SEQ ID NO:7，或者孢子外壁蛋白可包含全长BclB(SEQ ID NO:8)。
靶向序列还可包含SEQ ID NO:9的氨基酸1-24、SEQ ID NO:9的氨基酸9-24或SEQID NO:9，或者孢子外壁蛋白可包含全长BAS1882(SEQ ID NO:10)。连接至BAS1882的氨基酸9-24的甲硫氨酸残基也可以用作靶向序列。因此，靶向序列可包含SEQ ID NO:69。
靶向序列还可包含SEQ ID NO:11的氨基酸1-33、SEQ ID NO:11的氨基酸18-33或SEQ ID NO:11，或者孢子外壁蛋白可包含全长韦氏芽孢杆菌KBAB4 2280基因产物(SEQ IDNO:12)。连接至韦氏芽孢杆菌KBAB4 2280基因产物的氨基酸18-33的甲硫氨酸残基也可以用作靶向序列。因此，靶向序列可包含SEQ ID NO:62。
靶向序列还可包含SEQ ID NO:13的氨基酸1-33、SEQ ID NO:13的氨基酸18-33或SEQ ID NO:13，或者孢子外壁蛋白可包含全长韦氏芽孢杆菌KBAB4 3572基因产物(SEQ IDNO:14)。连接于韦氏芽孢杆菌KBAB4 3572基因产物的氨基酸18-33的甲硫氨酸残基也可以用作靶向序列。因此，靶向序列可包含SEQ ID NO:63。
或者，靶向序列可包含SEQ ID NO:15的氨基酸1-43、SEQ ID NO:15的氨基酸28-43或SEQ ID NO:15，或孢子外壁蛋白可包含全长蜡状芽孢杆菌VD200孢子外壁前导肽(SEQ IDNO:16)。
靶向序列还可包含SEQ ID NO:17的氨基酸1-27、SEQ ID NO:17的氨基酸12-27或SEQ ID NO:17，或孢子外壁蛋白可包含全长蜡状芽孢杆菌VD166孢子外壁前导肽(SEQ IDNO:18)。连接至蜡状芽孢杆菌VD166孢子外壁前导肽的氨基酸12-27的甲硫氨酸残基也可以用作靶向序列。因此，靶向序列可包含SEQ ID NO:64。
靶向序列还可包含SEQ ID NO:19的氨基酸1-33、SEQ ID NO:19的氨基酸18-33或SEQ ID NO:19，或孢子外壁蛋白可包含全长蜡状芽孢杆菌VD200假定蛋白IKG_04663(SEQID NO:20)。
或者，靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸1-33、SEQ ID NO:21的氨基酸18-33或SEQ ID NO:21，或孢子外壁蛋白可包含全长韦氏芽孢杆菌KBAB4YVTNβ-螺旋桨蛋白(SEQ IDNO:22)。连接至韦氏芽孢杆菌KBAB4YVTNβ-螺旋桨蛋白的氨基酸18-33的甲硫氨酸残基也可以用作靶向序列。因此，靶向序列可包含SEQ ID NO:65。
靶向序列还可包含SEQ ID NO:23的氨基酸1-24、SEQ ID NO:23的氨基酸9-24或SEQ ID NO:23，或者孢子外壁蛋白可包含全长韦氏芽孢杆菌KBAB4假定蛋白bcerkbab4_2363(SEQ ID NO:24)。连接至韦氏芽孢杆菌KBAB4假定蛋白bcerkbab4-2363的氨基酸9-24的甲硫氨酸残基也可以用作靶向序列。因此，靶向序列可包含SEQ ID NO:66。
靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸1-24、SEQ ID NO:25的氨基酸9-24或SEQ IDNO:25，或者孢子外壁蛋白可包含全长韦氏芽孢杆菌KBAB4假定蛋白bcerkbab4_2131(SEQID NO:26)。连接至韦氏芽孢杆菌KBAB4假定蛋白bcerkbab4_2131的氨基酸9-24的甲硫氨酸残基也可以用作靶向序列。因此，靶向序列可包含SEQ ID NO:67。
或者，靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸1-30、SEQ ID NO:27的氨基酸15-30或SEQ ID NO:27，或者孢子外壁蛋白可包含全长韦氏芽孢杆菌KBAB4含三螺旋重复的胶原蛋白(SEQ ID NO:28)。
靶向序列还可包含SEQ ID NO:29的氨基酸1-33、SEQ ID NO:29的氨基酸18-33或SEQ ID NO:29，或者孢子外壁蛋白可包含全长蕈状芽胞杆菌2048假定蛋白bmyco0001_21660(SEQ ID NO:30)。
靶向序列还可包含SEQ ID NO:31的氨基酸1-24、SEQ ID NO:31的氨基酸9-24或SEQ ID NO:31，或者孢子外壁蛋白可包含全长蕈状芽胞杆菌2048假定蛋白bmyc0001_22540(SEQ ID NO:32)。连接至蕈状芽胞杆菌2048假定蛋白bmyc0001_22540的氨基酸9-24的甲硫氨酸残基也可以用作靶向序列。因此，靶向序列可包含SEQ ID NO:68。
或者，靶向序列包含SEQ ID NO:33的氨基酸1-15、SEQ ID NO:33，或者孢子外壁蛋白包含全长蕈状芽胞杆菌2048假定蛋白bmyc0001_21510(SEQ ID NO:34)。
靶向序列还可包含SEQ ID NO:35的氨基酸1-16、SEQ ID NO:35，或者孢子外壁蛋白可包含全长苏云金芽孢杆菌35646胶原三螺旋重复蛋白(SEQ ID NO:36)。
靶向序列可包含SEQ ID NO:43的氨基酸1-29、SEQ ID NO:43的氨基酸14-29或SEQID NO:43，或者孢子外壁蛋白可包含全长蜡状芽孢杆菌假定蛋白WP_69652(SEQ ID NO:44)。
或者，靶向序列可包含SEQ ID NO:45的氨基酸1-35、SEQ ID NO:45的氨基酸20-35或SEQ ID NO:45，或者孢子外壁蛋白可包含全长蜡状芽孢杆菌孢子外壁前导WP016117717(SEQ ID NO:46)。连接至蜡样芽孢杆菌孢子外壁前导WP016117717的氨基酸20-35的甲硫氨酸残基也可以用作靶向序列。因此，靶向序列可包含SEQ ID NO:70。
靶向序列可包含SEQ ID NO:47的氨基酸1-43、SEQ ID NO:47的氨基酸28-43或SEQID NO:47，或者孢子外壁蛋白可包含全长蜡状芽孢杆菌孢子外壁肽WP002105192(SEQ IDNO:48)。
靶向序列可包含SEQ ID NO:49的氨基酸1-32、SEQ ID NO:49的氨基酸17-32或SEQID NO:49，或者孢子外壁蛋白可包含全长蜡状芽孢杆菌假定蛋白WP87353(SEQ ID NO:50)。
或者，靶向序列可包含SEQ ID NO:51的氨基酸1-33、SEQ ID NO:51的氨基酸18-33或SEQ ID NO:51，或者孢子外壁蛋白可包含全长蜡状芽孢杆菌孢子外壁肽02112369(SEQID NO:52)。
靶向序列可包含SEQ ID NO:53的氨基酸1-33、SEQ ID NO:53的氨基酸18-33或SEQID NO:53，或者孢子外壁蛋白可包含全长蜡状芽孢杆菌孢子外壁蛋白WP016099770(SEQ IDNO:54)。
或者，靶向序列可包含SEQ ID NO:55的氨基酸1-30、SEQ ID NO:55的氨基酸15-30或SEQ ID NO:55，或者孢子外壁蛋白可包含全长苏云金芽孢杆菌假定蛋白YP006612525(SEQ ID NO:56)。
靶向序列还可包含SEQ ID NO:57的氨基酸1-130、SEQ ID NO:57的氨基酸115-130或SEQ ID NO:57，或者孢子外壁蛋白可包含全长蕈状芽孢杆菌假定蛋白TIGR03720(SEQ IDNO:58)。
此外，从图1中的序列比对可以容易地看出，尽管BclA的氨基酸20-35是保守的，并且氨基酸25-35是更保守的，但是在该区域中可以发生一定程度的变异，而不影响靶向序列将蛋白质靶向至孢子外壁的能力。图1列出了每个序列的每个对应氨基酸与BclA的氨基酸20-35的百分比同一性(“20-35％同一性”)和BclA的氨基酸25-35的百分比同一性(“25-35％同一性”)。因此，例如，与BclA的氨基酸20-35相比，BetA/BAS3290的对应氨基酸为约81.3％相同、BAS4623的对应氨基酸为约50.0％相同、BclB的对应氨基酸为约43.8％相同、BAS1882的对应氨基酸为约62.5％相同、KBAB4 2280基因产物的对应氨基酸为约81.3％相同、KBAB4 3572基因产物的对应氨基酸为约81.3％相同。其余序列在该区域上的序列同一性列于图1中。
关于BclA的氨基酸25-35，BetA/BAS3290的对应氨基酸为约90.9％相同、BAS4623的对应氨基酸为约72.7％相同、BclB的对应氨基酸为约54.5％相同、BAS1882的对应氨基酸为约72.7％相同、KBAB4 2280基因产物的对应氨基酸为约90.9％相同、KBAB4 3572基因产物的对应氨基酸为约81.8％相同。其余序列在该区域上的序列同一性列于图1中。
因此，靶向序列可包含与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约43％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约54％。或者，靶向序列由与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约43％同一性的氨基酸序列(由16个氨基酸组成)组成，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约54％。
靶向序列还可包含与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约50％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约63％。或者，靶向序列由与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约50％同一性的氨基酸序列(由16个氨基酸组成)组成，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约63％。
靶向序列还可包含与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约50％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约72％。或者，靶向序列由与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约50％同一性的氨基酸序列(由16个氨基酸组成)组成，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约72％。
靶向序列还可包含与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约56％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约63％。或者，靶向序列由与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约56％同一性的氨基酸序列(由16个氨基酸组成)组成，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约63％。
或者，靶向序列可包含与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约62％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约72％。靶向序列还可以由与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约62％同一性的氨基酸序列(由16个氨基酸组成)组成，其中与SEQID NO:1的氨基酸25-35的同一性为至少约72％。
靶向序列可包含与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少68％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约81％。或者，靶向序列由与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少68％同一性的氨基酸序列(由16个氨基酸组成)组成，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约81％。
靶向序列还可包含与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约75％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约72％。或者，靶向序列由与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约75％同一性的氨基酸序列(由16个氨基酸组成)组成，其中与SEQ IDNO:1的氨基酸25-35的同一性为至少约72％。
靶向序列还可包含与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约75％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约81％。或者，靶向序列由与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约75％同一性的氨基酸序列(由16个氨基酸组成)组成，其中与SEQ IDNO:1的氨基酸25-35的同一性为至少约81％。
靶向序列还可包含与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约81％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约81％。或者，靶向序列由与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约81％同一性的氨基酸序列(由16个氨基酸组成)组成，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约81％。
靶向序列可包含与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约81％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约90％。或者，靶向序列由与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约81％同一性的氨基酸序列(由16个氨基酸组成)组成，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约90％。
技术人员将认识到，上述序列的变体也可以用作靶向序列，只要靶向序列包含BclA的氨基酸20-35，BetA/BAS3290、BAS4263、BclB、BAS1882、KBAB4 2280基因产物或KBAB3572基因产物的对应氨基酸，或存在包含任何上述与BclA的氨基酸20-35和25-35的序列同一性的序列。
进一步发现，某些缺乏与BclA的氨基酸25-35具有同源性的区域的蜡状芽孢杆菌家族孢子外壁蛋白也可用于将肽或蛋白质靶向至蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子外壁上。特别地，融合蛋白可包括以下孢子外壁蛋白：包含SEQ ID NO:71(蕈状芽孢杆菌InhA)的孢子外壁蛋白、包含SEQ ID NO:72(炭疽芽孢杆菌斯特恩BAS1141(ExsY))的孢子外壁蛋白、包含SEQ ID NO:73(炭疽芽孢杆菌斯特恩BAS1144(BxpB/ExsFA))、包含SEQ ID NO:74(炭疽芽孢杆菌斯特恩BAS1145(CotY))的孢子外壁蛋白、包含SEQ ID NO:75(炭疽芽孢杆菌斯特恩BAS1140())的孢子外壁蛋白、包含SEQ ID NO:76(炭疽芽孢杆菌H9401ExsFB)的孢子外壁蛋白、包含SEQ ID NO:77(苏云金芽孢杆菌HD74InhA1)的孢子外壁蛋白、包含SEQ ID NO:78(蜡状芽孢杆菌ATCC 10876ExsJ)的孢子外壁蛋白、包含SEQ ID NO:79(蜡状芽孢杆菌ExsH)的孢子外壁蛋白、包含SEQ ID NO:80(炭疽芽孢杆菌Ames YjcA)的孢子外壁蛋白、包含SEQID NO:81(炭疽芽孢杆菌YjcB)的孢子外壁蛋白、包含SEQ ID NO:82(炭疽芽孢杆菌斯特恩BclC)的孢子外壁蛋白、包含SEQ ID NO:83(苏云金芽孢杆菌血清变型konkukian菌株97-27酸性磷酸酶)的孢子外壁蛋白或包含SEQ ID NO:84(苏云金芽孢杆菌HD74InhA2)的孢子外壁蛋白。在本文所述的融合蛋白中包括包含SEQ ID NO:71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83或84的孢子外壁蛋白将导致靶向至蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子外壁上。
此外，与任何上述全长孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段具有高度序列同一性的孢子外壁蛋白也可用于将肽或蛋白质靶向至蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子外壁上。因此，融合蛋白可包含如下孢子外壁蛋白，其包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、59、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83和84中的任一个具有至少85％同一性的氨基酸序列。或者，融合蛋白可包含如下孢子外壁蛋白，其与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、59、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83和84中的任一个具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性。
或者，融合蛋白可包含由与SEQ ID NO:59具有至少85％同一性的氨基酸序列组成的孢子外壁蛋白片段。或者，融合蛋白可包含由与SEQ ID NO:59具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列组成的孢子外壁蛋白片段。
在本文所述的任何靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段中，靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段可以在其羧基末端包含氨基酸序列GXT，其中X是任何氨基酸。
在本文所述的任何靶向序列、孢子外壁蛋白和孢子外壁蛋白片段中，靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段可以在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸20的靶向序列的位置处包含丙氨酸残基。
融合蛋白
融合蛋白可包含靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段，以及至少一种植物生长刺激蛋白或肽。植物生长刺激蛋白或肽可包含肽激素，非激素肽，参与植物生长刺激化合物的产生或活化的酶，或降解或修饰细菌、真菌或植物营养源的酶。靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段可以是任何上述的靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段。
融合蛋白可包含靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段，以及保护植物抵御病原体的至少一种蛋白或肽。靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段可以是任何上述的靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段。
可以使用本领域已知的标准克隆和分子生物学方法制备融合蛋白。例如，可以通过聚合酶链式反应(PCR)扩增编码蛋白或肽的基因(例如，编码植物生长刺激蛋白或肽的基因)，并将其连接到编码任何上述靶向序列的DNA，以形成编码融合蛋白的DNA分子。编码融合蛋白的DNA分子可以被克隆到任何合适的载体中，例如质粒载体。载体适当地包含其中可以容易地***编码融合蛋白的DNA分子的多克隆位点。载体还适当地含有选择性标记物，例如抗生素抗性基因，使得可以容易地鉴定和分离用载体转化、转染或交配(mated)的细菌。当载体是质粒时，质粒还适当地包含复制起点。编码融合蛋白的DNA适当地处于孢子形成启动子的控制下，所述孢子形成启动子将引起融合蛋白在蜡状芽孢杆菌家族成员内生孢子的孢子外壁上表达(例如来自蜡状芽孢杆菌家族成员的天然bclA启动子)。或者，编码融合蛋白的DNA可以整合到蜡状芽孢杆菌家族成员宿主的染色体DNA中。
融合蛋白还可包含额外的多肽序列，所述多肽序列不是靶向序列、孢子外壁蛋白、孢子外壁蛋白片段，或植物生长刺激蛋白或肽、保护植物抵御病原体的蛋白或肽、增强植物胁迫抗性的蛋白或肽，或植物结合蛋白或肽的一部分。例如，融合蛋白可包括标签或标记物以促进融合蛋白的纯化或可视化(例如多组氨酸标签或荧光蛋白，如GFP或YFP)，或表达融合蛋白的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞孢子的可视化。
使用本文所述的靶向序列、孢子外壁蛋白和孢子外壁蛋白片段增强了融合蛋白在孢子外壁上的表达，这是由于这些序列的氨基末端中缺乏二级结构，这允许进行融合蛋白的天然折叠和活性保留。通过在靶向序列、孢子外壁蛋白、孢子外壁蛋白片段和融合伴侣蛋白(fusion partner protein)之间包含短的氨基酸接头，可以进一步增强正确折叠。
因此，本文所述的任何融合蛋白均可包含在靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段与植物生长刺激蛋白或肽、保护植物抵御病原体的蛋白或肽、增强植物胁迫抗性的蛋白或肽、或植物结合蛋白或肽之间的氨基酸接头。
接头可包括多聚丙氨酸接头或多聚甘氨酸接头。也可以使用包含丙氨酸残基和甘氨酸残基的混合物的接头。例如，当靶向序列包含SEQ ID NO:1时，融合蛋白可具有以下结构之一：
无接头：SEQ ID NO:1-融合伴侣蛋白
丙氨酸接头：SEQ ID NO:1-An-融合伴侣蛋白
甘氨酸接头：SEQ ID NO:1-Gn-融合伴侣蛋白
混合的丙氨酸和甘氨酸接头：SEQ ID NO:1-(A/G)n-融合伴侣蛋白
其中An、Gn和(A/G)n分别是任何数量的丙氨酸、任何数量的甘氨酸或任何数量的丙氨酸和甘氨酸的混合物。例如，n可以为1至25，并且优选地为6至10。当接头包含丙氨酸残基和甘氨酸残基的混合物时，可以使用甘氨酸残基和丙氨酸残基的任何组合。在上述结构中，“融合伴侣蛋白”代表植物生长刺激蛋白或肽、保护植物抵御病原体的蛋白或肽、增强植物胁迫抗性的蛋白或肽、或植物结合蛋白或肽。
替代地或额外地，接头可包含蛋白酶识别位点。包含蛋白酶识别位点允许在暴露于识别该蛋白酶识别位点的蛋白酶时定向去除植物生长刺激蛋白或肽、保护植物抵御病原体的蛋白或肽、增强植物胁迫抗性的蛋白或肽、或植物结合蛋白或肽。
植物生长刺激蛋白和肽
如上所述，融合蛋白可包含靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段和至少一种植物生长刺激蛋白或肽。例如，植物生长刺激蛋白或肽可包含肽激素，非激素肽，参与植物生长刺激化合物的产生或活化的酶，或降解或修饰细菌、真菌或植物营养源的酶。
例如，当植物生长刺激蛋白或肽包含肽激素时，肽激素可包含植物磺肽素(phytosulfokine)(例如植物磺肽素-α)、clavata 3(CLV3)、***素、ZmlGF或SCR/SP11。
当植物生长刺激蛋白或肽包含非激素肽时，非激素肽可包含RKN 16D10、Hg-Syv46、eNOD40肽、蜂毒肽、肥大细胞脱粒肽(mastoparan)、Mas7、RHPP、POLARIS或kunitz胰蛋白酶抑制剂(KTI)。
植物生长刺激蛋白或肽可包含参与植物生长刺激化合物的产生或活化的酶。参与植物生长刺激化合物的产生或活化的酶可以是催化刺激植物生长或改变植物结构的化合物的生物合成途径中的任何步骤的任何酶，或催化刺激植物生长或改变植物结构的化合物的无活性或更低活性的衍生物转化为该化合物的有活性或更高活性形式的任何酶。
植物生长刺激化合物可包含由根际中的细菌或真菌产生的化合物，例如2,3-丁二醇。
或者，植物生长刺激化合物可包含植物生长激素，例如细胞***素或细胞***素衍生物、乙烯、生长素或生长素衍生物、赤霉酸或赤霉酸衍生物、脱落酸或脱落酸衍生物、或茉莉酸或茉莉酸衍生物。
当植物生长刺激化合物包含细胞***素或细胞***素衍生物时，细胞***素或细胞***素衍生物可包含激动素、顺式玉米素、反式玉米素、6-苄基氨基嘌呤、二羟基玉米素、N6-(D2-异戊烯基)腺嘌呤、核糖基玉米素、N6-(D2-异戊烯基)腺苷、2-甲硫基-顺式-核糖基玉米素、顺式核糖基玉米素、反式核糖基玉米素、2-甲硫基-反式-核糖基玉米素、核糖基玉米素-5-单磷酸酯、N6-甲基氨基嘌呤、N6-二甲基氨基嘌呤、2’-脱氧玉米素核苷、4-羟基-3-甲基-反式-2-丁烯基氨基嘌呤、邻拓扑林(topolin)、间拓扑林、苄基腺嘌呤、邻甲基拓扑林、间甲基拓扑林，或它们的组合。
当植物生长刺激化合物包含生长素或生长素衍生物时，生长素或生长素衍生物可包括活性生长素、非活性生长素、缀合生长素、天然存在的生长素或合成生长素，或它们的组合。例如，生长素或生长素衍生物可包括吲哚-3-乙酸、吲哚-3-丙酮酸、吲哚-3-乙醛肟、吲哚-3-乙酰胺、吲哚-3-乙腈、吲哚-3-乙醇、吲哚-3-丙酮酸盐、吲哚-3-乙醛肟、吲哚-3-丁酸、苯乙酸、4-氯吲哚-3-乙酸、葡萄糖缀合的生长素，或它们的组合。
参与植物生长刺激化合物的产生或活化的酶可包括3-羟基丁酮还原酶、吲哚-3-乙酰胺水解酶、色氨酸单加氧酶、乙酰乳酸合成酶、α-乙酰乳酸脱羧酶、丙酮酸脱羧酶、二乙酰还原酶、丁二醇脱氢酶、氨基转移酶(例如色氨酸转氨酶)、色氨酸脱羧酶、胺氧化酶、吲哚-3-丙酮酸脱羧酶、吲哚-3-乙醛脱氢酶、色氨酸侧链氧化酶、腈水解酶(nitrilehydrolase)、腈水解酶(nitrilase)、肽酶、蛋白酶、磷酸腺苷异戊烯基转移酶、磷酸酶、腺苷激酶、腺嘌呤磷酸核糖基转移酶、CYP735A、5'核糖核苷酸磷酸水解酶、腺苷核苷酶、玉米素顺式-反式异构酶、玉米素O-葡萄糖基转移酶、β-萄糖苷酶、顺式羟化酶、CK顺式羟化酶、CKN-葡萄糖基转移酶、2,5-核糖核苷酸磷酸水解酶、腺苷核苷酶、嘌呤核苷磷酸化酶、玉米素还原酶、羟胺还原酶、2-酮戊二酸双加氧酶、赤霉2B/3B水解酶、赤霉素3-氧化酶、赤霉素20-氧化酶、脱乙酰壳多糖酶(chitosinase)、壳多糖酶、β-1,3-葡聚糖酶、β-1,4-葡聚糖酶、β-1,6-葡聚糖酶、氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶，及参与产生结瘤因子(例如nodA、nodB或nodI)的酶。
当酶包含蛋白酶或肽酶时，蛋白酶或肽酶可以是切割蛋白质、肽、前蛋白或前原蛋白以产生生物活性肽的蛋白酶或肽酶。生物活性肽可以是发挥生物活性的任何肽。
生物活性肽的实例包括RKN 16D10和RHPP。
切割蛋白质、肽、前蛋白或前原蛋白以产生生物活性肽的蛋白酶或肽酶可包括枯草杆菌蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、蛋白水解酶、内肽酶、外肽酶、嗜热菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、链霉蛋白酶、羧化酶、丝氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。
蛋白酶或肽酶可以切割富含蛋白质的膳食(例如，大豆粉或酵母提取物)中的蛋白质。
植物生长刺激蛋白还可包含降解或修饰细菌、真菌或植物营养源的酶。这些酶包括纤维素酶、脂肪酶、木质素氧化酶、蛋白酶、糖苷水解酶、磷酸酶、固氮酶、核酸酶、酰胺酶、硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、淀粉酶、氨氧化酶、木质素酶、葡糖苷酶、磷脂酶、植酸酶、果胶酶、葡聚糖酶、硫酸酯酶、脲酶、木聚糖酶和铁载体。当被引入植物生长培养基中或施用于植物、种子或者植物或植物种子周围的区域时，包含降解或修饰细菌、真菌或植物营养源的酶的融合蛋白可以帮助加工在植物附近的营养物并且导致植物或植物附近的有益细菌或真菌的营养物吸收增加。
合适的纤维素酶包括内切纤维素酶(endocellulase)(例如内切葡聚糖酶，如枯草芽孢杆菌内切葡聚糖酶、苏云金芽孢杆菌内切葡聚糖酶、蜡状芽孢杆菌内切葡聚糖酶或克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)内切葡聚糖酶)、外切纤维素酶(exocellulase)(例如里氏木霉(Trichoderma reesei)外切纤维素酶)和β-葡糖苷酶(例如，枯草芽孢杆菌β-葡糖苷酶、苏云金芽孢杆菌β-葡糖苷酶、蜡状芽孢杆菌β-葡糖苷酶或克劳氏芽孢杆菌β-葡糖苷酶)。
脂肪酶可包括枯草芽孢杆菌脂肪酶、苏云金芽孢杆菌脂肪酶、蜡状芽孢杆菌脂肪酶或克劳氏芽孢杆菌脂肪酶。
在一个实施方案中，脂肪酶包含枯草芽孢杆菌脂肪酶。枯草芽孢杆菌脂肪酶可以使用以下引物进行PCR扩增：ggatccatggctgaacacaatcc(正向，SEQ ID NO:37)和ggatccttaattcgtattctggcc(反向，SEQ ID NO:38)。
在另一个实施方案中，纤维素酶是枯草芽孢杆菌内切葡聚糖酶。枯草芽孢杆菌内切葡聚糖酶可使用以下引物进行PCR扩增：ggatccatgaaacggtcaatc(正向，SEQ ID NO:39)和ggatccttactaatttggttctgt(反向，SEQ ID NO:40)。
在另一个实施方案中，融合蛋白包含大肠杆菌(E.coli)蛋白酶PtrB。大肠杆菌蛋白酶PtrB可以使用以下引物进行PCR扩增：ggatccatgctaccaaaagcc(正向，SEQ ID NO:41)和ggatccttagtccgcaggcgtagc(反向，SEQ ID NO:42)。
在某些实施方案中，融合蛋白含有衍生自SEQ ID NO:104中的核苷酸序列的内切葡聚糖酶。
可以与靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段和任选的接头序列(例如多聚腺苷酸接头)融合的示例性内切葡聚糖酶的氨基酸序列是以SEQ ID NO:107形式提供的融合蛋白。
在其他实施方案中，融合蛋白含有衍生自SEQ ID NO:105中所示核苷酸序列的磷脂酶。
可以与靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段和任选的接头序列(例如多聚腺苷酸接头)融合的示例性磷脂酶的氨基酸序列是以SEQ IDNO:108形式提供的融合蛋白。
在其他实施方案中，融合蛋白含有衍生自SEQ ID NO:106中所示核苷酸序列的脱乙酰壳多糖酶。在融合蛋白中可以与靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段和任选的接头序列(例如多聚腺苷酸接头)融合的示例性脱乙酰壳多糖酶的氨基酸序列以SEQ IDNO:109形式提供。
为了产生融合构建体，可以使用通过重叠延伸(SOE)技术的剪接将基因与编码BclA的前35个氨基酸(SEQ ID NO:1的氨基酸1-35)的苏云金芽孢杆菌DNA的天然bclA启动子融合。将正确的扩增子克隆到大肠杆菌/芽孢杆菌穿梭载体pHP13中，并通过DNA测序筛选正确的克隆。将正确的克隆电穿孔进入苏云金芽孢杆菌(Cry-、质粒-)并筛选氯霉素抗性。使正确的转化体在30℃下在脑心浸液肉汤中生长过夜，铺至营养琼脂平板上，并在30℃下孵育3天。可通过在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤来从平板中收集表达融合构建体的孢子(BEMD孢子)，并通过离心和在PBS中另外洗涤来纯化。
在这些融合蛋白中，内切葡聚糖酶、磷脂酶或脱乙酰壳多糖酶(chitosinase)可包含编码分别与SEQ ID NO:107、108或109具有至少85％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。
在这些融合蛋白中，内切葡聚糖酶、磷脂酶或脱乙酰壳多糖酶(chitosinase)可包含分别与SEQ ID NO:107、108或109具有至少90％同一性的氨基酸序列。
在这些融合蛋白中，内切葡聚糖酶、磷脂酶或脱乙酰壳多糖酶(chitosinase)可包含分别与SEQ ID NO:107、108或109具有至少95％同一性的氨基酸序列。
在这些融合蛋白中，内切葡聚糖酶、磷脂酶或脱乙酰壳多糖酶(chitosinase)可包含分别与SEQ ID NO:107、108或109具有至少98％同一性的氨基酸序列。
在这些融合蛋白中，内切葡聚糖酶、磷脂酶或脱乙酰壳多糖酶(chitosinase)可包含分别与SEQ ID NO:107、108或109具有至少99％同一性的氨基酸序列。
合适的木质素氧化酶包括木质素过氧化物酶、漆酶、乙二醛氧化酶、木质素酶和锰过氧化物酶。
蛋白酶可包括枯草杆菌蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、蛋白酶、肽酶、内肽酶、外肽酶、嗜热菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、链霉蛋白酶、羧化酶、丝氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。
磷酸酶可包括磷酸单酯水解酶、磷酸单酯酶(例如PhoA4)、磷酸二酯水解酶、磷酸二酯酶、三磷酸单酯水解酶、磷酸酐水解酶、焦磷酸酶、植酸酶(例如枯草芽孢杆菌EE148植酸酶或苏云金芽孢杆菌BT013A植酸酶)、三偏磷酸酶或三磷酸酶。
固氮酶可包含Nif家族固氮酶，例如大豆芽孢杆菌(Paenibacillusmassiliensis)NifBDEHKNXV。
保护植物抵御病原体的蛋白和肽
融合蛋白可包含靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段，以及至少一种保护植物抵御病原体的蛋白或肽。
所述蛋白或肽可包含刺激植物免疫应答的蛋白或肽。例如，刺激植物免疫应答的蛋白或肽可包含植物免疫***增强子蛋白或肽。植物免疫***增强子蛋白或肽可以是对植物的免疫***具有有益作用的任何蛋白或肽。合适的植物免疫***增强子蛋白和肽包括harpin、α-弹性蛋白、β-弹性蛋白、***素、苯丙氨酸氨裂解酶、诱导素、防御素、隐地蛋白(cryptogein)、鞭毛蛋白和鞭毛蛋白肽(例如flg22)。
或者，保护植物抵御病原体的蛋白或肽可以是具有抗细菌活性、抗真菌活性或同时具有抗细菌活性和抗真菌活性的蛋白或肽。这类蛋白和肽的实例包括细菌素、溶菌酶、溶菌酶肽(例如LysM)、铁载体、非核糖体活性肽、伴白蛋白、白蛋白、乳铁蛋白、乳铁蛋白肽(例如LfcinB)、抗生蛋白链菌素和TasA。
保护植物抵御病原体的蛋白或肽也可以是具有杀虫活性、杀蠕虫(helminthicidal)活性、抑制昆虫或蠕虫捕食的蛋白或肽，或其组合。例如，保护植物抵御病原体的蛋白或肽可包括杀虫细菌毒素(例如VIP杀虫蛋白)、内毒素、Cry毒素(例如来自苏云金芽孢杆菌的Cry毒素)、蛋白酶抑制剂蛋白或肽(例如，胰蛋白酶抑制剂或慈姑蛋白酶抑制剂((arrowhead Proteinase Inhibitor))、半胱氨酸蛋白酶或壳多糖酶。当Cry毒素是来自苏云金芽孢杆菌的Cry毒素时，Cry毒素可以是Cry5B蛋白或Cry21A蛋白。Cry5B和Cry21A具有杀虫和杀线虫两种活性。
保护植物抵御病原体的蛋白可包括酶。合适的酶包括蛋白酶和内酯酶。蛋白酶和内酯酶可以是细菌信号转导分子(例如，细菌内酯高丝氨酸信号转导分子)特异性的。
当酶是内酯酶时，所述内酯酶可包括1,4-内酯酶、2-吡喃酮-4,6-二羧酸内酯酶、3-氧代己二酸烯醇-内酯酶、放线菌素内酯酶、脱氧柠檬酸A-环-内酯酶、葡糖酸内酯酶、L-鼠李糖(rhamnono)-1,4-内酯酶、柠檬苦素-D-环-内酯酶、类固醇-内酯酶、三乙酸酯-内酯酶或木糖酸-1,4-内酯酶。
酶也可以是特异性针对细菌或真菌的细胞组分的酶。例如，酶可包括β-1,3-葡聚糖酶、β-1,4-葡聚糖酶、β-1,6-葡聚糖酶、脱乙酰壳多糖酶(chitosinase)、壳多糖酶、脱乙酰壳多糖酶(chitosinase)样酶、溶细胞酶、肽酶、蛋白水解酶、蛋白酶(例如，碱性蛋白酶、酸性蛋白酶或中性蛋白酶)、变溶菌素、葡萄球菌素(stapholysin)或溶菌酶。
增强植物胁迫抗性的蛋白和肽
融合蛋白可包含靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段和至少一种增强植物胁迫抗性的蛋白或肽。
例如，增强植物胁迫抗性的蛋白或肽包括降解胁迫相关化合物的酶。胁迫相关化合物包括但不限于氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)、活性氧簇、一氧化氮、氧脂素类(oxylipins)和酚类。具体的活性氧簇包括羟基、过氧化氢、氧和超氧化物。降解胁迫相关化合物的酶可包括超氧化物歧化酶、氧化酶、过氧化氢酶、氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶、过氧化物酶、抗氧化酶或抗氧化肽。
增强植物胁迫抗性的蛋白或肽也可包括保护植物抵御环境胁迫的蛋白或肽。环境胁迫可包括例如旱灾、水灾、热、冰冻、盐、重金属、低pH、高pH或它们的组合。例如，保护植物抵御环境胁迫的蛋白或肽可包括冰成核蛋白、脯氨酸肽酶、苯丙氨酸氨裂解酶、异分支酸合酶、异分支酸丙酮酸裂解酶或胆碱脱氢酶。
植物结合蛋白和肽
融合蛋白可包含靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段和至少植物结合蛋白或肽。植物结合蛋白或肽可以是能够特异性或非特异性结合至植物的任何部分(例如，植物根或植物的地上部分，例如叶、茎、花或果实)或结合至植物物质的任何蛋白或肽。因此，例如，植物结合蛋白或肽可以是根结合蛋白或肽，或叶结合蛋白或肽。
合适的植物结合蛋白和肽包括粘附素(例如，根钙粘附素(rhicadhesin))、鞭毛蛋白、omptin、植物凝集素、棒曲霉素(expansin)、生物膜结构蛋白(例如，TasA或YuaB)、菌毛蛋白、curlus蛋白、紧密素(intimin)、侵染素、凝集素和非菌毛(afimbrial)蛋白。
表达融合蛋白的重组芽孢杆菌属
本文所述的融合蛋白可以由重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞来表达。融合蛋白可以是上述任何融合蛋白。
重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞可共表达两种或更多种上述任何融合蛋白。例如，重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞可以共表达至少一种包含植物结合蛋白或肽的融合蛋白，以及至少一种包含植物生长刺激蛋白或肽的融合蛋白、至少一种包含保护植物抵御病原体的蛋白或肽的融合蛋白，或至少一种增强植物胁迫抗性的蛋白或肽。
重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞可包括炭疽芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、蕈状芽胞杆菌、假蕈状芽胞杆菌、Bacillus samanii、Bacillus gaemokensis、韦氏芽孢杆菌、东洋芽胞杆菌，或它们的组合。例如，重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞可包括蜡状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、假蕈状芽胞杆菌或蕈状芽胞杆菌。特别地，重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞可包括苏云金芽孢杆菌或蕈状芽孢杆菌。
为了产生表达融合蛋白的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞，可使用本领域已知的标准方法(例如，通过电穿孔)以编码融合蛋白的载体缀合、转导或转化任何蜡状芽孢杆菌家族成员。然后可以通过本领域已知的任何方法筛选细菌以鉴定转化体。例如，当载体包括抗生素抗性基因时，可以筛选细菌的抗生素抗性。或者，可以将编码融合蛋白的DNA整合到蜡状芽孢杆菌家族成员宿主的染色体DNA中。然后可将重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞暴露于将诱导孢子形成的条件下。用于诱导孢子形成的合适条件是本领域中已知的。例如，可以将重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞涂布在琼脂平板上，并在约30℃的温度下孵育几天(例如3天)。
还可以适当地使用任何上述物种的灭活菌株、无毒菌株或经遗传学操作的菌株。例如，可以使用缺乏Cry毒素的苏云金芽孢杆菌。替代地或额外地，一旦产生了表达融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族孢子，可将它们灭活以防止一旦使用时进一步萌芽。可以使用本领域中已知的任何灭活细菌孢子的方法。合适的方法包括但不限于热处理、γ辐射、x射线辐射、UV-A辐射、UV-B辐射、化学处理(例如用戊二醛、甲醛、过氧化氢、乙酸、漂白剂或其任何组合进行的处理)，或它们的组合。或者，可以使用源自非产毒菌株或者遗传上或物理上灭活菌株的孢子。
具有植物生长促进效果和/或其他有益属性的重组产孢子外壁芽孢杆菌属细胞
许多蜡状芽孢杆菌家族成员菌株具有固有的有益属性。例如，一些菌株具有植物生长促进效果。本文所述的任何融合蛋白可以在这样的菌株中表达。
例如，重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞可包含细菌的植物生长促进菌株。
细菌的植物生长促进菌株可包括这样的细菌菌株，即所述细菌菌株产生杀虫毒素(例如Cry毒素)、产生杀真菌化合物(例如β-1,3-葡聚糖酶、脱乙酰壳多糖酶(chitosinase)、溶细胞酶，或它们的组合)、产生杀线虫化合物(例如Cry毒素)、产生杀细菌化合物、对一种或多种抗生素有抗性、包含一种或多种自由复制质粒、结合至植物根、聚集于植物根、形成生物膜、溶解营养素、分泌有机酸，或它们的任何组合。
例如，当重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞包含细菌的植物生长促进菌株时，细菌的植物生长促进菌株可包含蕈状芽孢杆菌BT155(NRRL No.B-50921)、蕈状芽孢杆菌EE118(NRRL No.B-50918)、蕈状芽孢杆菌EE141(NRRL No.B-50916)、蕈状芽孢杆菌BT46-3(NRRL No.B-50922)、蜡状芽孢杆菌家族成员EE128(NRRL No.B-50917)、苏云金芽孢杆菌BT013A(NRRL No.B-50924)或蜡状芽孢杆菌家族成员EE349(NRRL No.B-50928)。苏云金芽孢杆菌BT013A也称为苏云金芽孢杆菌4Q7。这些菌株中的每一种都于2014年3月10日保藏在美国农业部(USDA)农业研究局(ARS)，其地址为美国伊利诺伊州Peoria市北部大学街1815号，邮编61604，并且由括号中提供的NRRL保藏编号识别。
这些植物生长促进菌株是从不同旺盛植物的根际分离，并且通过它们的16S rRNA序列以及通过生物化学测定来鉴定。通过常规生物化学和形态学指标，至少鉴定菌株至它们的属名。用于确认的革兰氏阳性菌株(例如芽孢杆菌属)的生物化学测定包括在PEA培养基和营养琼脂上的生长，显微镜检查，在5％和7.5％NaCl培养基上的生长，在pH 5和pH 9下的生长，在42℃和50℃下的生长，用纤维二糖、乳糖、甘油、葡萄糖、蔗糖、d-甘露醇和淀粉发酵时产生酸的能力；荧光颜料产生；明胶水解；硝酸盐还原；过氧化氢酶产生，淀粉水解；氧化酶反应，脲酶产生和移动性(mobility)。
例如，包含细菌的植物生长促进菌株的重组产孢子外壁芽孢杆菌属细胞可包括蕈状芽孢杆菌BT155、蕈状芽孢杆菌EE141或苏云金芽孢杆菌BT013A。重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞可以表达本文所述的任何融合蛋白，例如包含以下的融合蛋白：SEQ ID NO:60的靶向序列和非激素肽(例如，kunitz胰蛋白酶抑制剂(KTI))，参与植物生长刺激化合物的产生和活化的酶(例如脱乙酰壳多糖酶(chitosinase))、植物结合蛋白或肽(例如TasA)；保护植物抵御病原体的蛋白或肽(例如TasA)，或降解或修饰细菌、真菌或植物营养源的酶(例如磷酸酶(例如PhoA或植酸酶)或内切葡聚糖酶)。
启动子
在本文所述的任何重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞中，融合蛋白可以在融合蛋白的靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段的天然启动子的控制下表达。例如，当融合蛋白包含来源于炭疽芽孢杆菌斯特恩BclA的靶向序列(例如，SEQ ID NO:1的氨基酸20-35、SEQ ID NO:1的氨基酸1-35、SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:60)时，或者当融合蛋白包含全长BclA(SEQ ID NO:2)或全长BclA的片段(例如SEQ ID NO:59)时，融合蛋白可在通常与炭疽芽孢杆菌斯特恩的基因组中的BclA基因相关的启动子(例如，SEQ ID NO:85的启动子)的控制下表达。
或者，融合蛋白可在高表达孢子形成启动子的控制下表达。在一些情况下，靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段的天然启动子将是高表达的孢子形成启动子。在其他情况下，靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段的天然启动子将不是高表达的孢子形成启动子。在后面的情况下，用高表达孢子形成启动子替代天然启动子可能是有利的。融合蛋白在高表达孢子形成启动子控制下的表达使得融合蛋白在蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子外壁上的表达增加。
高表达孢子形成启动子可包含一个或多个σ-K孢子形成特异性聚合酶启动子序列。
用于在蜡状芽孢杆菌家族成员中表达融合蛋白的合适的高表达孢子形成启动子包括下面的表2中所列的那些：
表2.启动子序列
在上表2中列出的启动子序列中，σ-K孢子形成特异性聚合酶启动子序列的位置由粗体和下划线文本表示。Cry1A启动子(苏云金芽孢杆菌HD-73；SEQ ID NO:90)具有总共四个σ-K序列，其中两个彼此重叠，如表2中的双下划线所示。
用于在蜡状芽孢杆菌家族成员中表达融合蛋白的优选的高表达孢子形成启动子包括BetA启动子(炭疽芽孢杆菌斯特恩；SEQ ID NO:86)、BclA启动子(炭疽芽孢杆菌斯特恩；SEQ ID NO:85)、BclA簇糖基转移酶操纵子1和2启动子(炭疽芽孢杆菌斯特恩；SEQ IDNO:101和102)和YVTNβ-螺旋桨蛋白启动子(韦氏芽胞杆菌KBAB 4；SEQ ID NO:89)。
在本文所述的任何重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞中，融合蛋白可以在孢子形成启动子的控制下表达，所述孢子形成启动子包含与SEQ ID NO:85-103中的任一个的核酸序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
当孢子形成启动子包含与SEQ ID NO:85-103中的任一个核酸序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列时，σ-K孢子形成特异性聚合酶启动子序列优选地与SEQ ID NO:85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102或103的相应核苷酸具有100％同一性。例如，如上表2所示，炭疽芽孢杆菌斯特恩(SEQ ID NO:85)的BclA启动子在核苷酸24-32、35-43和129-137处具有σ-K孢子形成特异性聚合酶启动子序列。因此，如果孢子形成启动子包含与SEQ ID NO:85的核酸序列具有至少90％同一性的序列，则优选地对应于SEQ ID NO:85的核苷酸24-32、35-43和129的孢子形成启动子的核苷酸与SEQ ID NO:85的核苷酸24-32、35-43和129-137具有100％同一性。
在本文所述的用于刺激植物生长的任何方法中，在包含重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和选自本文公开的特定微生物的至少一种其他生物防治试剂的植物生长培养基中生长的植物，与在不含有重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞的相同植物生长培养基中的植物生长表相比，现出增加的生长。
在本文所述的用于刺激植物生长的任何组合物和方法中，重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞可包含任何上述细菌的重组植物生长促进菌株。
在本文公开的用于刺激植物生长的任何组合物或方法中，融合蛋白可以在任何上述启动子的控制下表达。
合成的结瘤因子和植物生长刺激剂
在一些实施方案中，包含表达融合蛋白的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和至少一种本文所述的生物防治试剂的组合物还包含合成的结瘤因子和/或植物生长刺激剂。这种合成化合物的非限制性实例是通式(I)的化合物，
其中：
n是2或3；
A是-C(O)-；
B是亚苯基；
C是-O-；
D是包含11个碳的直链烃基链，其在碳4和5之间是饱和的或不饱和的；
E和G独立地选自取代基NHR20；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R9是H；
R8选自H、岩藻糖基、甲基岩藻糖基、SO3H、SO3Li、SO3Na、SO3K和SO3N(C1-8-烷基)4；
R20是C(O)C1-6-烷基；和
其任何农业上可接受的几何和/或光学异构体、对映异构体和/或非对映异构体、互变异构体、盐、N-氧化物、亚砜或砜。
所述盐可以选自锂盐、钠盐、钾盐和四烷基铵盐。
在某些实施方案中，E和G是NHC(O)CH3。
在其他实施方案中，R8选自H、SO3H、SO3Li、SO3Na、SO3K、SO3N(C1-8烷基)4和下式的取代基：
其中：
R26选自H和CH3；和
R27和R28独立地选自H、C(O)CH3、SO3H、SO3Li、SO3Na、SO3K和SO3N(C1-8烷基)4。
在一些方面，R26、R27和R28都是氢。
可用于本发明的合成的结瘤因子和/或植物生长刺激剂的其他非限制性实例包括具有以下结构式的化合物：
其中，当存在时，M选自H+、Li+、Na+、K+和(C1-8烷基)4N+。
在某些方面，合成的结瘤因子和/或植物生长刺激剂是选自以下的化合物：
其他生物防治试剂
生物防治试剂可特别地包括具有各自菌株的所有识别特征的细菌、真菌或酵母、原生动物、病毒、昆虫致病性线虫、接种体和植物，和/或它们的突变体，和/或由各自菌株产生的表现出对抗昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的活性的至少一种代谢物。本发明涉及上述重组芽孢杆菌属细胞与本文所述的特定生物防治试剂的组合，和/或涉及本文所述的微生物的特定菌株的突变体，其中所述突变体具有各自菌株的所有识别特征，和/或由各自菌株产生的表现出对抗昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的活性或促进植物生长和/或增强植物健康的至少一种代谢物。
从本文所述的特定微生物的发酵得到的培养物肉汤(“全肉汤”或“发酵液”)中的细菌细胞、孢子和代谢物可直接使用或通过常规工业方法(例如离心、过滤和蒸发)浓缩，或通过例如喷雾干燥、转鼓干燥和冷冻干燥加工成干粉和颗粒。
如本文所用，术语“全肉汤”和“发酵液”是指在任何下游处理之前由发酵得到的培养物肉汤。全肉汤包含微生物及其组成部分、未使用的原料底物和在发酵期间由微生物产生的代谢物。如本文所用，术语“肉汤浓缩物”是指已经通过如上所述的常规工业方法浓缩但保持液体形式的全肉汤(发酵液)。如本文所用，术语“发酵固体”是指干燥的发酵液。如本文所用，术语“发酵产物”是指全肉汤、肉汤浓缩物和/或发酵固体。本发明的组合物包括发酵产物。在一些实施方案中，例如通过渗滤过程洗涤浓缩的发酵液以除去残余的发酵液和代谢物。
在另一个实施方案中，可以使用常规干燥工艺或方法(如喷雾干燥、冷冻干燥、盘式干燥、流化床干燥、转鼓干燥或蒸发)，在添加或不添加载体、惰性物质或添加剂的情况下干燥发酵液或肉汤浓缩物。
根据本发明，在术语“细菌”下概述的生物防治试剂包括形成孢子的、根部定殖的细菌，或用作生物杀虫剂、生物杀线虫剂、生物杀螨剂或生物杀真菌剂或改善植物健康和生长的土壤改良剂的细菌及其代谢物。根据本发明使用或利用的细菌如下。
蜡状芽孢杆菌菌株，包括菌株CNCM I-1562(参见美国专利号6,406,690)，坚强芽孢杆菌，短小芽孢杆菌，特别是菌株GB34(产品称为YIELD)和菌株QST2808(产品称为QST2808)，枯草芽孢杆菌，特别是菌株GB03(产品称为)、菌株QST713(产品称为QST713)、菌株AQ30002(又称为QST30002；NRRL登记号B-50421，已知于WO 2012/087980，其以引用的形式纳入本文中)、菌株AQ30004(又称为QST30004；NRRL登记号B-50455，已知于WO 2012/087980，其以引用的形式纳入本文中)、菌株AQ743(NRRL登记号B-21665)、菌株AQ153(如WO 98/21964中所述的ATCC登记号55614)，(1.79)鲜黄链霉菌(Streptomyces galbus)菌株AQ 6047(登记号NRRL 30232)，(1.91)球状红球菌(Rhodococcus globerulus)AQ719(NRRL登记号B-21663)，(1.92)芽孢杆菌属种(Bacillus sp.)AQ175(ATCC登记号55608)，(1.93)芽孢杆菌属种AQ 177(ATCC登记号55609)，(1.94)芽孢杆菌属种AQ178(ATCC登记号53522)，(1.95)WO 02/26041 A2中所述的链霉菌属种(Streptomyces sp.)菌株(NRRL登记号B-30145)，(1.96)细黄链霉菌(Streptomyces microflavus)菌株NRRL B-50550，(1.97)细黄链霉菌菌株M(登记号091013-02)，如WO2014/059275中所述，链霉菌属的含有谷氏菌素的发酵产物和鲜黄链霉菌QST6047(记载于美国专利6,682,925中)。
在具体实施方案中，以下细菌与上述产孢子外壁的重组芽孢杆菌属细胞组合使用：
坚强芽孢杆菌，特别是菌株I-1582(产品称为Bionem，Votivo，Flocter)，
短小芽孢杆菌，特别是菌株GB34(产品称为YIELD)和菌株QST2808(产品称为QST2808)，
枯草芽孢杆菌，特别是菌株GB03(产品称为)、菌株QST713(产品称为QST713)；NRRL登记号B-50455，已知于WO 2012/087980，其以引用的方式纳入本文中)，或枯草芽孢杆菌变种解淀粉芽孢杆菌菌株(Bacillus subtilisvar.amyloliquefaciens)FZB24(产品称为)、菌株AQ743(NRRL登记号B-21665)、菌株AQ153(如WO 98/21964中所述的ATCC登记号55614)，
在一个实施方案中，本发明的组合物包含至少一种本文所述的特定生物防治试剂和至少一种选自以下的其他生物防治试剂的组合：壳质孢子芽孢杆菌(Bacilluschitinosporus)AQ746(NRRL登记号B-21618)、蕈状芽孢杆菌AQ726(NRRL登记号B-21664)、短小芽孢杆菌QST2808(NRRL登记号B-30087)、短小芽孢杆菌AQ717(NRRL登记号B-21662)、芽孢杆菌属种(Bacillus sp.)AQ175(ATCC登记号55608)、芽孢杆菌属种AQ177(ATCC登记号55609)、芽孢杆菌属种AQ178(ATCC登记号53522)、枯草芽孢杆菌AQ743(NRRL登记号B-21665)、枯草芽孢杆菌AQ713(NRRL登记号B-21661)、枯草芽孢杆菌AQ153(ATCC登记号55614)、白色产气霉(Muscodor albus)620(NRRL登记号30547)、粉红产气霉(Muscodorroseus)A3-5(NRRL登记号30548)、球状红球菌AQ719(NRRL登记号B-21663)、鲜黄链霉菌(NRRL登记号30232)、链霉菌属种(NRRL登记号B-30145)、枯草芽孢杆菌AQ30002(NRRL登记号B-50421)及枯草芽孢杆菌AQ30004(NRRL登记号B-50455)和/或具有各自菌株的所有识别特征的这些菌株的突变体，和/或由各自菌株产生的表现出对抗昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的活性的至少一种代谢物。
如下的所述其他生物防治试剂在本领域中是已知的：
壳质孢子芽孢杆菌AQ746(NRRL登记号B-21618)已知于WO 98/2166 A2。其对线虫及昆虫具有特异性活性并在其上清液中产生非外毒素、非蛋白质的活性代谢物。这些代谢物对线虫和蟑螂具有活性，但对苍蝇、玉米根虫或甜菜粘虫(armyworm)不具有活性。
蕈状芽孢杆菌AQ726(NRRL登记号B-21664)及其水溶性代谢物杀死昆虫或阻碍昆虫发育，所述昆虫例如玉米根虫幼虫和蚜虫(WO 99/09820 A1)。
如WO 00/58442 A1中所述，短小芽孢杆菌QST2808(NRRL登记号B-30087)能够在体内抑制众多的真菌植物病害。该菌株的市售制剂以来自Bayer CropScience LP(NorthCarolina，USA)的商品名和PLUS销售。
短小芽孢杆菌AQ717(NRRL登记号B-21662)已知于WO 99/10477A1。它产生表现出对玉米根虫、线虫和甜菜粘虫的农药活性的代谢物。
WO 98/21967 A1中描述的细菌菌株芽孢杆菌属种AQ175(ATCC登记号55608)、芽孢杆菌属种AQ177(ATCC登记号55609)和芽孢杆菌属种AQ178(ATCC登记号53522)在处理和保护植物抵御地上真菌和细菌感染方面是有效的。
产代谢物菌株枯草芽孢杆菌AQ743(NRRL登记号B-21665)杀死玉米根虫幼虫、甜菜粘虫幼虫、蝇成虫和线虫或阻碍其发育(参见WO 99/09819)。
枯草芽孢杆菌AQ713(登记号B-21661)，也称为枯草芽孢杆菌QST713，表现出广泛的杀真菌和杀细菌活性，并且还表现出玉米根虫活性(WO 98/50422 A1)。该菌株的市售制剂可以从Bayer CropScience LP(North Carolina，USA)以商品名MAX、SERENADEASO、CPB和MAX获得。产品(美国EPA登记号69592-12)含有枯草芽孢杆菌的专利菌株(菌株QST713)和许多不同的脂肽，它们协同作用以破坏病害病原体并提供优异的抗微生物活性。产品用于保护植物(例如蔬菜作物、水果作物、坚果作物和藤本作物)抵御病害(例如火疫病、葡萄孢属、酸腐病、锈病、核盘菌属、白粉病、细菌性斑点病和白霉)。产品可以以液体制剂或干燥制剂的形式得到，可以以叶面处理和/或土壤处理的形式施用。产品(包括ASO、MAX和)的美国EPA主标签(master label)的副本可通过国家农药信息检索***(NPIRSv)USEPA/OPP农药产品标签***(PPLS)公开获得。
ASO(水性悬浮液-有机)含有1.34％的作为活性成分的干燥的QST713和98.66％的其他成分。配制ASO使其含有最少1×109cfu/g的QST713，而QST713的最大量已确定为3.3×1010cfu/g。有关更多信息，参见2010年1月4日的ASO的美国EPA主标签，其全部内容以引用的方式纳入本文中。
MAX含有14.6％的作为活性成分的干燥的QST713和85.4％的其他成分。配制MAX使其含有最少7.3×109cfu/g的QST713，而QST713的最大量已确定为7.9×1010cfu/g。有关更多信息，参见MAX的美国EPA主标签，其全部内容以引用的方式纳入本文中。
如WO 98/21964 A1中所述的枯草芽孢杆菌AQ153(ATCC登记号55614)有效抑制植物病原性细菌和真菌的生长。
WO 02/02082898A1记载了包括白色产气霉(Muscodor albus)620，也称为白色产气霉QST20799(NRRL登记号30547)和粉红产气霉(Muscodor roseus)A3-5(NRRL登记号30548)的植物内生真菌，其产生具有对抗真菌、细菌、昆虫和线虫的活性的挥发性抗生素的混合物。
球状红球菌AQ719(NRRL登记号B-21663)产生对玉米根虫表现出农药活性的代谢物(美国专利号6,027,723A)。
WO 01/79480 A2描述了鲜黄链霉菌的菌株(NRRL登记号30232)，其表现出对鳞翅目(Lepidoptera)的杀虫活性。
记载于WO 02/26041 A2的链霉菌属种菌株(NRRL登记号B-30145)表现出对特定植物病原体(例如链格孢属(Alternaria)、疫霉属
(Phytophthora)、葡萄孢属(Botrytis)、丝核菌属(Rhizoctonia)和核盘菌属(Sclerotinia)的抗真菌活性。
菌株枯草芽孢杆菌AQ30002(也称为QST30002)(NRRL登记号B-50421，保藏于2010年10月5日)和枯草芽孢杆菌AQ30004(也称为QST30004)(NRRL登记号B-50455，保藏2010年10月5日)已知于WO 2012/087980 A1，其以引用的方式纳入本文中。如本文中所述，这些BCA表现出广泛的杀真菌和杀细菌活性。B19和B20在swrA基因中具有突变，导致与含野生型swrA基因的菌株相比，损伤的丛集能力(swarming ability)和增强的植物健康促进(planthealth promotion)。所述突变导致这些BCA形成与野生型菌株相比更强健的生物膜，从而增强其杀真菌及杀细菌活性。
在一些实施方案中，生物防治试剂是枯草芽孢杆菌菌株，例如枯草芽孢杆菌QST713，其产生丰原素型化合物、伊枯草菌素型化合物和/或枯草菌表面活素型化合物。在一些方面，脂肽是丰原素型化合物，例如大侧柏素A1、大侧柏素B1、大侧柏素B2、丰原素A、丰原素B、阿瓜斯他汀(agrastatin)1或阿瓜斯他汀2。在其他方面，脂肽是伊枯草菌素型化合物，例如伊枯草菌素A、抗霉枯草菌素或杆菌抗霉素。
适用于本发明的组合物和方法的其他产脂肽的菌株包括解淀粉芽孢杆菌菌株D747(可作为获自Etec Crop Solutions，NZ，并且也可作为DOUBLE NICKELTM获自Certis，US)；枯草芽孢杆菌MBI600(可作为获自Becker Underwood，美国EPA登记号71840-8)；枯草芽孢杆菌Y1336(可作为WP获自Bion-Tech，台湾，在台湾登记为生物杀真菌剂，登记号为4764、5454、5096和5277)；解淀粉芽孢杆菌，特别是菌株FZB42(可作为获自ABiTEP，DE)；枯草芽孢杆菌变种解淀粉芽孢杆菌FZB24作为杀真菌剂或ECO(EPA登记号70127-5)获自Novozymes Biologicals Inc.(Salem，Virginia)或Syngenta Crop Protection，LLC(Greensboro，North Carolina)。
在一些实施方案中，本发明的协同组合中的生物防治试剂是：
坚强芽孢杆菌，其包括菌株I-1582(产品称为Bionem，Votivo，Flocter)，公开于美国专利号6,406,690(其以引用的方式纳入本文中)并于1995年5月29日保藏在CNCM，登记号为CNCM I-1582，
短小芽孢杆菌，包括菌株GB34(产品称为YIELD)和菌株QST2808(产品称为QST2808)，
枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌，包括产生脂肽，特别是大侧柏素或丰原素、枯草菌表面活素和/或伊枯草菌素的组合的那些。此外，对于枯草芽孢杆菌，特别是菌株GB03(产品称为参见美国EPA，Pesticide Fact Sheet--枯草芽孢杆菌GB03 1992)、菌株QST713(产品称为QST713)、菌株AQ30002(又称为QST30002；NRRL登记号B-50421，已知于WO 2012/087980，其以引用的形式纳入本文中)和菌株AQ30004(又称为QST30004；NRRL登记号B-50455，已知于WO 2012/087980，其以引用的形式纳入本文中)。
根据本发明，可包含在本发明的组合物中并且概括在术语“真菌”或“酵母”下的生物防治试剂是下列生物体和/或具有各自菌株的所有识别特征的它们的突变体和/或由各自菌株产生的表现出对抗昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的活性的代谢物(编号在完整描述中使用)：
白色产气霉，特别是菌株QST20799(产品称为ARABESQUETM或ANDANTETM)，盾壳霉(Coniothyrium minitans)，特别是菌株CON/M/91-8(产品称为)，大链壶菌(Lagenidium giganteum)(产品称为由AgraQuest，Inc.生产)，淡紫色拟青霉(Paecilomyces lilacinus)，特别是淡紫色拟青霉菌株251的孢子(产品称为参见Crop Protection 2008，27，352-361)。
根据本发明的一个实施方案，生物防治试剂不仅包括各自微生物的纯培养物，还包括它们于全肉汤培养物中的悬液，或含代谢物的上清液，或从菌株的全肉汤培养物中所获得的纯化的代谢物。“全肉汤培养物”是指含细胞及培养基两者的液体培养物。“上清液”是指当通过离心、过滤、沉降或现有技术中公知的其他方式除去肉汤中生长的细胞时剩余的液体肉汤。
上述由非致病性微生物产生的代谢物包括抗生素、酶、铁载体(siderophore)及生长促进剂，例如双效菌素-A(zwittermicin-A),卡那胺(kanosamine)，多抗霉素(polyoxine)，酶如α-淀粉酶、壳多糖酶和果胶酶(pektinase)，植物激素及其前体如植物生长素、类赤霉素物质、类细胞***素化合物，脂肽如伊枯草菌素(iturins)、大侧柏素或表面活性素，例如阿瓜斯他汀A(agrastatin A)、芽孢菌霉素D(bacillomycin D)、杆菌溶素(bacilysin)、地非西丁(difficidin)、大环内酰亚胺(macrolactin)、丰原素、杆菌溶素及bacilaene。
根据本发明，本文所述的生物防治试剂可以在任何生理状态如活化状态或休眠状态下采用或使用。
本发明的组合物
根据本发明，所述组合物包含协同有效量的a)表达融合蛋白的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞，所述融合蛋白包含：(i)至少一种选自以下的植物生长刺激蛋白或肽：参与植物生长刺激化合物的产生或活化的酶；降解或修饰细菌、真菌或植物营养源的酶；和保护植物抵御病原体的蛋白或肽；和(ii)将融合蛋白定位至蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子外壁上的靶向序列；和b)至少一种本文公开的另外的且不同的特定生物防治试剂和/或本文公开的微生物的特定菌株的突变体(其具有各自菌株的所有识别特征)，和/或由各自菌株产生的表现出对抗昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的活性的至少一种代谢物。
根据本发明的“协同有效量”表示表达融合蛋白的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和至少一种本文所述的其他的特定生物防治试剂的组合的量，其比单独的表达融合蛋白的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞或此类其他生物防治试剂更有效地抵抗昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体。根据本发明的“协同有效量”还表示表达融合蛋白的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和至少一种本文所述的其他的特定生物防治试剂的组合的量，其比单独的表达融合蛋白的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞或此类其他生物防治试剂更有效地增强植物生长和/或促进植物健康。
本发明包括每种本文所述的其他特定生物防治试剂与重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞的每一种组合。
在优选的实施方案中，本发明的组合物包含至少一种另外的杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂，条件是所述重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞、杀虫剂和杀真菌剂不相同。
术语“活性化合物”或“活性成分”用于本说明书中来指所述重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞，所述至少一种其他生物防治试剂和/或其具有各自菌株的所有识别特征的突变体，和/或由各自菌株产生的表现出对抗昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的活性的至少一种代谢物，所述至少一种杀虫剂和所述至少一种杀真菌剂。
其他添加剂
本发明的一方面提供一种上述组合物，其还包含至少一种选自填充剂(extender)、溶剂、自发生促进剂、载体、乳化剂、分散剂、防冻剂、增稠剂及佐剂的助剂。那些组合物被称为制剂。
因此，本发明的一方面提供所述制剂及由其制备的施用形式(application form)作为作物保护剂和/或农药剂(例如浸透、滴注及喷雾液体)，其包含本发明的组合物。所述施用形式可包含其他作物保护剂和/或农药剂，和/或增强活性的佐剂如渗透剂，实例为植物油(例如油菜籽油、葵花籽油)、矿物油(例如液体石蜡)、植物脂肪酸的烷基酯(例如油菜籽油甲酯或大豆油甲酯)、或烷醇烷氧基化物、和/或展着剂(spreader)例如烷基硅氧烷和/或盐类，实例为有机或无机铵盐或鏻盐(例如硫酸铵或磷酸氢二铵)、和/或保持促进剂(retention promoter)例如磺基琥珀酸二辛酯(dioctyl sulphosuccinate)或羟丙基瓜尔胶聚合物、和/或保湿剂(例如丙三醇)和/或肥料(例如铵肥、钾肥或磷肥)。
典型制剂的实例包括水溶性液剂(SL)、可乳化浓缩剂(EC)、水乳剂(emulsions inwater，EW)、悬液浓缩剂(SC、SE、FS、OD)、水分散性颗粒剂(WG)、颗粒剂(GR)和胶囊浓缩剂(CS)；这些制剂及其他可能的制剂类型被例如国际作物生命(Crop Life International)组织在以下文献中描述：Pesticide Specifications、Manual on Development and Useof FAO and WHO Specifications for Pesticides、FAO Plant Production andProtection Papers–173(由***粮农组织/世界卫生组织关于农药手册的联合会议制订，2004，ISBN：9251048576)。所述制剂可包含除本发明的一种或多种活性化合物之外的活性农业化学化合物。
正在研究的制剂或施用形式优选地包含助剂，例如填充剂、溶剂、自发生促进剂、载体、乳化剂、分散剂、防冻剂、杀微生物剂(biocides)、增稠剂和/或其他助剂，例如佐剂。在本文中，佐剂是增强制剂的生物功效的组分，而该组分本身不具有生物功效。佐剂的实例为促进保留、扩散、附着至叶子表面，或渗透的试剂。
这些制剂是以已知的方式制备的，例如通过将活性化合物与助剂(例如填充剂、溶剂和/或固体载体和/或其他助剂(例如表面活性剂))混合。所述制剂是在合适的设备(plant)中制备的或在施用前或施用过程中制备。
适合于用作助剂的是这样的物质，它们适合于赋予活性化合物的制剂或从这些制剂制备的施用形式(例如可用的作物保护剂，如喷雾液剂或拌种剂)以特定性质(例如某些物理的、技术的和/或生物学性质)。
合适的填充剂为，例如水、极性和非极性有机化学液体，例如来自以下种类：芳族烃和非芳族烃(例如石蜡(paraffins)、烷基苯、烷基萘、氯苯)、醇和多元醇(如果合适的话，其还可被取代、醚化和/或酯化)、酮类(例如丙酮、环己酮)、酯类(包括脂肪和油)以及(聚)醚，未取代和取代的胺、酰胺、内酰胺(例如N-烷基吡咯烷酮)以及内酯、砜和亚砜(例如二甲基亚砜)。
如果所用的填充剂为水，还可使用例如有机溶剂作为助溶剂。基本上，合适的液体溶剂为：芳族化合物，如二甲苯、甲苯或烷基萘；氯代芳族化合物和氯代脂肪族烃，如氯苯、氯乙烯或二氯甲烷；脂肪族烃如环己烷或石蜡(paraffins)，例如石油馏分、矿物油和植物油；醇，例如丁醇或乙二醇，及其醚和酯；酮，如丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮或环己酮；强极性溶剂，例如二甲基甲酰胺和二甲基亚砜，以及水。
原则上，可使用所有合适的溶剂。合适的溶剂为，例如，芳族烃，例如二甲苯、甲苯或烷基萘；氯代芳族化合物或氯代脂肪族烃，例如氯苯、氯乙烯或二氯甲烷；脂肪族烃，例如环己烷、石蜡(paraffins)、石油馏分、矿物油和植物油；醇，例如甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇或乙二醇，及其醚和酯；酮，如丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮或环己酮；强极性溶剂，例如二甲基亚砜，以及水。
原则上可使用所有合适的载体。合适的载体特别是：例如，铵盐和磨碎的天然矿物，例如高岭土、粘土、滑石、白垩、石英、绿坡缕石、蒙脱石或硅藻土；以及磨碎的合成矿物，例如细碎的二氧化硅、氧化铝及天然或合成的硅酸盐；树脂；蜡和/或固体肥料。同样也可使用所述载体的混合物。适合于颗粒剂的载体包括下列载体：例如，压碎并分级分离的天然矿物，例如方解石、大理石、浮石、海泡石、白云石，以及无机和有机粉的合成颗粒，以及有机材料的颗粒，例如锯屑、纸、椰壳、玉米穗轴及烟草秸秆。
还可使用液化的气体填充剂或溶剂。特别合适的是在标准温度及标准压力下为气态的那些填充剂或载体，实例为气溶胶喷射剂，例如卤代烃、以及丁烷、丙烷、氮气和二氧化碳。
具有离子或非离子特性的乳化剂和/或发泡剂、分散剂或润湿剂、或这些表面活性物质的混合物的实例为：聚丙烯酸盐，木质素磺酸盐，酚磺酸盐或萘磺酸盐，环氧乙烷与脂肪醇或与脂肪酸或与脂肪胺、与取代的酚(优选烷基酚或芳基酚)的缩聚物，磺基琥珀酸酯的盐，牛磺酸衍生物(优选烷基牛磺酸盐(alkyltaurates))，聚乙氧基化醇或酚的磷酸酯，多元醇的脂肪酸酯，以及含有硫酸盐、磺酸盐和磷酸盐的化合物的衍生物，实例为烷基芳基聚乙二醇醚、烷基磺酸盐、烷基硫酸盐、芳基磺酸盐、蛋白质水解产物、木质素亚硫酸盐废液及甲基纤维素。如果活性化合物中的一种和/或惰性载体中的一种不溶于水并且在水中进行施用，则表面活性物质的存在是有利的。
可存在于所述制剂及由其衍生的施用形式中的其他助剂包括着色剂如无机颜料，实例为氧化铁、氧化钛和普鲁士蓝，和有机染料，例如茜素染料、偶氮染料及金属酞菁染料，以及营养素和微量营养素，例如铁盐、锰盐、硼盐、铜盐、钴盐、钼盐和锌盐。
还可存在稳定剂，例如低温稳定剂、防腐剂、抗氧化剂、光稳定剂或其他改进化学和/或物理稳定性的试剂。还可存在发泡剂或消泡剂。
此外，所述制剂及由其衍生的施用形式还可包含作为额外助剂的粘着剂(sticker)(例如羧甲基纤维素)，粉末、颗粒或胶乳形式的天然及合成聚合物(例如***树胶、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯)，和天然磷脂(例如脑磷脂和卵磷脂)，以及合成磷脂。其他可能的助剂包括矿物油和植物油。
所述制剂及由其衍生的施用形式中可能存在其他助剂。所述添加剂的实例包括香料、保护胶体、粘结剂(binder)、胶粘剂(adhesive)、增稠剂、触变性物质、渗透剂、保持促进剂、稳定剂、螯合剂、络合剂、湿润剂及展着剂。一般而言，活性化合物可与任何常用于制剂目的的固体或液体添加剂组合。
合适的保持促进剂包括降低动力学表面张力(例如磺基琥珀酸二辛酯)或增加粘弹性(例如羟丙基瓜尔胶聚合物)的所有物质。
在本文中合适的渗透剂包括通常用于增强活性农业化学化合物向植物中的渗透的所有物质。在本文中渗透剂被定义为，它们能够从(通常为含水的)施用液剂和/或从喷雾涂层开始渗透植物的角质层，从而提高活性化合物在角质层中的迁移率的物质。这种特性可使用文献(Baur et al.，1997，Pesticide Science 51，131-152)中记载的方法测定。实例包括醇烷氧基化物例如椰子脂肪乙氧基化物(10)或异十三烷基乙氧基化物(12)、脂肪酸酯例如油菜籽油甲酯或大豆油甲酯、脂肪胺烷氧基化物例如牛脂胺乙氧基化物(15)、或者铵盐和/或鏻盐例如硫酸铵或磷酸氢二铵。
所述制剂优选地包含0.0001重量％至98重量％的活性化合物，或特别优选地0.01重量％至95重量％的活性化合物，更优选0.5重量％至90重量％的活性化合物，以所述制剂的重量计。如果存在的话，活性化合物的含量被定义为重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和本文所述的其他特定生物防治试剂和/或本文所述的具有各自菌株的所有识别特征的特定微生物菌株的突变体，和/或由各自菌株产生的表现出对抗昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的活性的至少一种代谢物，以及杀真菌剂和/或杀虫剂的总和。
由所述制剂制备的的施用形式(作物保护产品)中的活性化合物含量可在较宽的范围内变化。所述施用形式中的活性化合物浓度通常可为0.0001重量％至95重量％的活性化合物，优选0.0001重量％至1重量％，以所述施用形式的重量计。以适于施用形式的常规方式进行施用。
此外，在本发明的一个方面，提供了组件试剂盒，其包含在空间上分隔布置的协同有效量的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和至少一种本文公开的其他特定生物防治试剂和/或本文公开的具有各自菌株的所有识别特征的特定微生物菌株的突变体，和/或由各自菌株产生的表现出对抗昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的活性的至少一种代谢物。
在本发明的另一实施方案中，上述组件试剂盒还包含至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂，条件是重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞、杀虫剂和杀真菌剂不相同。杀真菌剂和/或杀虫剂可存在于在空间上分隔的组件试剂盒的基于重组产孢子外壁的蜡状芽孢杆菌家族成员的生物防治试剂组分中，或存在于包含本文公开的特定生物防治试剂的组件试剂盒的组分中，或存在于这两种组分中。在一个实施方案中，杀真菌剂和杀虫剂存在于基于重组产孢子外壁的蜡状芽孢杆菌家族成员的生物防治试剂组分中。
此外，本发明的组件试剂盒可额外地包含至少一种选自以下的助剂：如下所述的填充剂、溶剂、自发生促进剂、载体、乳化剂、分散剂、防冻剂、增稠剂及佐剂。所述至少一种助剂可存在于在空间上分隔的组件试剂盒中的基于重组产孢子外壁的蜡状芽孢杆菌家族成员的生物防治试剂组分中，或存在于包含本文公开的特定生物防治试剂的中组件试剂盒的组分中或存在于这两种组分中。
在本发明的另一方面，上述组合物用于减少由昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体引起的植物及植物部分的总体损害以及采收的果实或蔬菜的损失。
此外，在本发明的另一方面，上述组合物提高了总体的植物健康。
术语“植物健康”通常包含与害虫防治无关的各种植物改进。例如，可提及的有利特性为改进的作物特性，其包括：出苗、作物产量、蛋白含量、油含量、淀粉含量、更发达的根系、改进的根部生长、改进的根部尺寸维持、改善的根部效率、改进的胁迫耐受性(例如耐干旱、热、盐、紫外线、水、寒冷)、乙烯减少(减少产生和/或抑制接受)、分蘖增加、植物高度增加、更大的叶片、更少的死基生叶、更强壮的分蘖、更绿的叶片颜色、色素含量、光合活性、需要更少的输入(如肥料或水)、需要更少的种子、更高产的分蘖、开花更早、谷粒成熟更早、植物倒逆(倒伏)减少、枝条生长加快、增强的植物活力、增加的植物直立性以及早且更好的萌芽。
关于本发明的用途，改进的植物健康优选地指改进的植物特性，其包括：作物产量、更发达的根系(改进的根部生长)、改进的根部尺寸维持、改善的根部效率、分蘖增加、植物高度增加、更大的叶片、更少的死基生叶、更强壮的分蘖、更绿的叶片颜色、光合活性、更高产的分蘖、增强的植物活力及增加的植物直立性(plant stand)。
关于本发明，改进的植物健康特别优选地指的是改进的植物特性，其选自：作物产量、更发达的根系、改进的根部生长、改进的根部尺寸维持、改进的根部效率、分蘖增加以及植物高度增加。
本发明的组合物对本文所定义的植物健康的作用可通过比较在相同环境条件下生长的植物而确定，其中所述植物的一部分用本发明的组合物处理而所述植物的另一部分不用本发明的组合物处理。相反，所述其他部分完全没有处理或者用安慰剂处理(即没有施用本发明的组合物，例如没有施用所有的活性成分(即，没有本文所述的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞且没有本文所述的其他特定生物防治试剂)，或者没有施用本文所述的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞，或者没有施用本文公开的其他特定生物防治试剂)。
本发明的组合物可以任何所需的方式施用，例如以种子包衣、土壤浸透的形式、和/或直接施用于犁沟中、和/或作为叶面喷雾，并可在出苗前、出苗后或者出苗前后均施用。换言之，可将所述组合物施用于种子、植物或收获的果实及蔬菜，或施用于其中正生长有所述植物或期望生长所述植物的土壤(植物的生长位点)中。
减少植物及植物部分的总体损害通常导致植物更健康和/或植物活力及产量提高。
优选地，本发明的组合物用于处理常规植物或转基因植物或其种子。
本发明还涉及使用任何上述组合物刺激植物生长的方法，所述组合物包含表达融合蛋白的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和至少一种本文所述的其他的特定生物防治试剂。用于刺激植物生长的方法包括将组合物施用于植物、植物部分，施用于植物周围的场所或其中将种植所述植物的场所(例如土壤或其他生长培养基)，所述组合物包含协同有效量的表达融合蛋白的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞，所述融合蛋白包含：(i)至少一种植物生长刺激蛋白或肽；和(ii)靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段，以及至少一种本文公开的其他的特定生物防治试剂和/或本文公开的微生物的特定菌株的突变体(其具有各自菌株的所有识别特征)，和/或由各自菌株产生的表现出对抗昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的活性的至少一种代谢物。
在本发明的另一方面，提供用于减少由昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体引起的植物及植物部分的总体损害以及收获的果实或蔬菜的损失的方法，其包含同时地或惯序地施用协同有效量的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和至少一种本文所述的其他特定生物防治试剂的步骤。
在本发明方法的一个实施方案中，所述组合物还包含至少一种杀真菌剂。在一个方面，所述至少一种杀真菌剂是合成杀真菌剂。在该实施方案的另一方面，所述至少一种杀真菌剂选自以下组：联苯***醇(bitertanol)、比沙芬(bixafen)、糠菌唑(bromuconazole)、多菌灵(carbendazim)、环丙菌酰胺(carpropamid)、抑菌灵(dichlofluanid)、咪唑菌酮(fenamidone)、环酰菌胺(fenhexamid)、三苯基乙酸锡(fentinacetate)、三苯基氢氧化锡(fentin hydroxide)、氟吡菌胺(fluopicolide)、氟吡菌酰胺(fluopyram)、氟嘧菌酯(fluoxastrobin)、氟喹唑(fluquinconazole)、三乙膦(fosetyl)、异菌脲(iprodione)、异丙菌胺(iprovalicarb)、异噻菌胺(isotianil)、苯氧菌胺(metominostrobin)、甲呋酰胺(ofurace)、戊菌隆(pencycuron)、戊苯吡菌胺(penflufen)、丙氯灵(prochloraz)、霜霉威(propamocarb)、丙森锌(propineb)、丙硫菌唑(prothioconazole)、嘧霉胺(pyrimethanil)、螺环菌胺(spiroxamine)、戊唑醇(tebuconazole)、对甲抑菌灵(tolylfluanid)、***醇(triadimefon)、***醇(triadimenol)、咪唑嗪(triazoxide)和肟菌酯(trifloxystrobin)。
在另一个实施方案中，除了杀真菌剂之外或代替杀真菌剂，所述组合物还包含至少一种杀虫剂，条件是本文公开的杀虫剂、杀真菌剂、重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和特定生物防治试剂是不相同的。
在一个实施方案中，所述至少一种杀虫剂是合成杀虫剂。在另一个实施方案中，所述至少一种杀虫剂选自以下组：啶虫脒(acetamiprid)、涕灭威(aldicarb)、双甲咪(amitraz)、β-氟氯氰菊酯(beta-cyfluthrin)、胺甲奈(carbaryl)、噻虫胺(clothianidin)、氟氯氰菊酯(cyfluthrin)、氯氰菊酯(cypermethrin)、溴氰菊酯(deltamethrin)、硫丹(endosulfan)、乙硫磷(ethion)、乙虫腈(ethiprole)、灭线磷(ethoprophos)、苯线磷(fenamiphos)、仲丁威(fenobucarb)、倍硫磷(fenthion)、氟虫腈(fipronil)、氟虫酰胺(flubendiamide)、氟吡菌酰胺(fluopyram)、flupyradifurone、伐虫脒(formetanate)、heptanophos、吡虫啉(imidacloprid)、甲胺磷(methamidophos)、甲硫威(methiocarb)、灭多虫(methomyl)、氯硝柳胺(niclosamide)、砜吸磷(oxydemeton-methyl)、伏杀磷(phosalone)、灭虫硅醚(silafluofen)、螺螨酯(spirodiclofen)、螺甲螨酯(spiromesifen)、螺虫乙酯(spirotetramat)、噻虫啉(thiacloprid)、硫双威(thiodicarb)、四溴菊酯(tralomethrin)、***磷(triazophos)、杀铃脲(triflumuron)和蚜灭磷(vamidothion)。
本发明的方法包括以下施用方法，即可将所述重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和所述至少一种本文公开的其他特定生物防治试剂两者配制成具有农业上可接受的保质期的单一、稳定的组合物(所谓的“单一制剂”)，或在使用前或使用时组合(所谓的“组合制剂”)。
如未另作说明，词语“组合”代表所述重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和所述至少一种本文公开的其他特定生物防治试剂及任选地所述至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂的各种组合，该组合以单一制剂的形式、以单个的“预混(ready-mix)”形式、以由各单一制剂构成的组合喷雾混合物(如“桶混(tank-mix)”)的形式，并且特别是将单个活性成分以惯序方式施用时的组合使用形式，即在合理的短时段内(例如数小时或数天，例如2小时至7天)内一个接一个地施用。本发明组合物的施用顺序不是实施本发明的关键。因此，术语“组合”还涵盖在待处理植物或其环境、生境或储存空间之上或之中存在重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和至少一种本文公开的其他特定生物防治试剂，以及任选地至少一种杀真菌剂和/或杀虫剂，例如，在同时或连续地将重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和至少一种本文公开的其他特定生物防治试剂，以及任选地至少一种杀真菌剂和/或杀虫剂施用于植物或其环境、生境或储存空间后。
如果以惯序方式利用或使用重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和至少一种本文所述的其他特定生物防治试剂，以及任选地至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂，则优选地根据以下方法处理植物或植物部分(包括种子及从种子中萌发的植物)、采收的果实和蔬菜：首先，将至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂施用于植物或植物部分；其次，将本文所述的其他特定生物防治试剂和重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞施用于相同的植物或植物部分。通过这种施用方式，收获时杀虫剂/杀真菌剂残留在植物上的量尽可能低。在(作物)生长周期内的第一施用与第二施用之间的时间段可不同并取决于所要实现的效果。例如，进行第一施用以防止昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体侵袭植物或植物部分(处理种子时尤其如此)或对抗昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的侵袭(处理植物或植物部分时尤其如此)，并进行第二施用以防止或防治昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的侵袭和/或促进植物生长。在本文中“防治”意指包含重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和本文公开的特定生物防治试剂的组合物不能完全根除害虫或植物病原性真菌，但能将侵袭保持在可接受的水平上。
本发明还提供通过多次施用来增强本发明组合物的杀死、抑制、预防和/或驱除活性的方法。在一些其他实施方案中，在任何需要的发育阶段期间或在任何预定的害虫压力下，将本发明的组合物以约1小时、约5小时、约10小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约1周、约10天、约2周、约3周、约1个月或更长的间隔施用于植物和/或植物部分两次。仍在一些实施方案中，在任何需要的发育阶段期间或在任何预定的害虫压力下，将本发明的组合物以约1小时、约5小时、约10小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约1周、约10天、约2周、约3周、约1个月或更长的间隔施用于植物和/或植物部分多于两次，例如3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次。如果需要的话，每次施用之间的间隔可以变化。本领域技术人员将能够根据植物物种、植物害虫物种和其他因素确定施用次数和间隔长度。
按照上述步骤，可实现所述至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂在所处理的植物、植物部分、及采收的果实和蔬菜上非常低水平的残留。
如未另作说明，使用本发明的组合物对植物或植物部分(包括种子及从种子中萌发的植物)、及采收的果实和蔬菜的处理是直接进行的或通过作用于其环境、生境或储存空间进行的，所述处理使用常规的处理方法，例如浸渍、喷雾、雾化、灌溉、蒸发、撒粉、弥雾(fogging)、撒播、发泡、涂抹、涂布(spreading-on)、浇水(浸湿)、滴灌。还可通过超低容量法施用作为单一制剂或组合制剂形式的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞、至少一种本文所述的其他特定生物防治试剂、及任选地至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂，或将本发明的组合物作为组合物或作为单一制剂注入至土壤中(犁沟中)。
术语“待处理的植物”涵盖植物的每个部分，包括其根系及材料——例如土壤或营养培养基——其分别在围绕待处理植物的主茎或树干的至少10cm、20cm、30cm半径内或围绕所述待处理植物的根系至少10cm、20cm、30cm。
任选地在至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂的存在下，与至少一种本文所述的其他特定生物防治试剂组合使用或利用的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞的量取决于最终制剂以及待处理的植物、植物部分、采收的果实和蔬菜的大小或种类。通常，本发明所用的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞在其单一制剂或与至少一种本文所述的其他特定生物防治试剂和任选的杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂的组合制剂中的存在量为约1％至约80％(重量/重量)、优选地约1％至约60％(重量/重量)、更优选地约10％至约50％(重量/重量)。
同样，任选地在至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂的存在下，与重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞组合使用或利用的至少一种本文公开的其他特定生物防治试剂的量取决于最终制剂以及待处理的植物、植物部分、采收的果实和蔬菜的大小和种类。通常，本发明所用的本文所述的其他特定生物防治试剂在其单一制剂或与重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和任选的至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂的组合制剂中的存在量为约0.1％至约80％(重量/重量)、优选地约1％至约60％(重量/重量)、更优选地约10％至约50％(重量/重量)。
重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞的施用可以以叶面喷雾、以土壤处理和/或以种子处理/敷料的形式进行。当用作叶面处理时，在一个实施方案中，每英亩施用约1/16至约5加仑的全肉汤。当用作土壤处理时，在一个实施方案中，每英亩施用约1至约5加仑的全肉汤。当用于种子处理时，每英亩施用约1/32至约1/4加仑的整体发酵液。对于种子处理，最终使用的制剂含有至少1×104、至少1×105、至少1×106、1×107、至少1×108、至少1×109、至少1×1010菌落形成单位/克。
以协同重量比使用或利用重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和至少一种本文公开的其他特定生物防治试剂，以及如果存在的话，优选地还有杀真菌剂和/或杀虫剂。技术人员能够通过常规方法找到本发明的协同重量比。技术人员应理解这些比值是指本文所述的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和至少一种本文公开的其他特定生物防治试剂在组合制剂中的比值以及这两种组分作为单一制剂施用于待处理植物时的计算比值。因为重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和至少一种本文公开的其他特定生物防治试剂分别在单一制剂中的体积和量是技术人员已知的，因此，技术人员能够通过简单的数学运算而计算出该比值。
所述比值可基于以下数值而计算：在将本发明的组合的所述组分施用于植物或植物部分的时间点时的至少一种本文公开的其他特定生物防治试剂的量，以及在将本发明的组合的所述组分施用于植物或植物部分的时间点之前不久(例如，48h、24h、12h、6h、2h、1h)或当时的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞的量。
可同时或在不同时间将重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和至少一种本文公开的其他特定生物防治试剂施用于植物或植物部分，只要在施用后这两种组分都存在于植物上或植物中即可。当在不同时间施用重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和本文公开的其他特定生物防治试剂且在重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞之前施用本文公开的其他特定生物防治试剂的情况下，技术人员可通过本领域中已知的化学分析方法，在施用重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞的时间点或之前不久测定植物上/中的本文公开的其他特定生物防治试剂的浓度。反之亦然，当重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞首先施用于植物上时，可使用本领域中已知的测试，在施用本文公开的其他特定生物防治试剂的时间点或之前不久测定重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞的浓度。
特别地，在一个实施方案中，重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞(即未配制的孢子制剂)和至少一种本文公开的其他特定生物防治试剂的协同重量比在1:1000至1000:1的范围内；在1:500至500:1的范围内；在1:300至500:1的范围内。额外的比例在20:1和1:20之间，如10:1、5:1或2:1。在其中生物防治试剂是基于芽孢杆菌属的实施方案中，重量与重量的比例应当适用于未配制的芽孢杆菌属孢子制剂。在该实施方案的一个方面，重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和基于芽孢杆菌属的生物防治试剂两者的孢子制剂均是含有至少约1×104cfu/g、至少约1×105cfu/g、至少约1×106cfu/g、至少约1×107cfu/g、至少约1×108cfu/g、至少约1×109cfu/g、至少约1×1010cfu/g和至少约1×1011cfu/g的干燥孢子制剂。在另一个实施方案中，重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和本文所述的基于芽孢杆菌属的特定生物防治试剂的菌落形成单位与菌落形成单位的比率在1:100000至100000:1的范围内，在1:10000至10000:1的范围内，在1:1000至1000:1的范围内，在1:500至500:1的范围内，在1:100至100:1的范围内，在1:10至10:1的范围内，在1:5至5:1的范围内，在1:1的范围内。
在本发明的一个实施方案中，分散后基于重组产孢子外壁的蜡状芽孢杆菌家族成员的生物防治试剂的浓度为至少50g/ha，例如50-7500g/ha、50-2500g/ha、50-1500g/ha；至少250g/ha(公顷)、至少500g/ha或至少800g/ha。
本发明的待利用或使用的组合物的施用率可不同。技术人员能够通过常规实验找到合适的施用率。
在本发明的另一方面，提供采用上面描述的组合物处理过的种子。
通过处理植物的种子来防治昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体是长期以来已知的并且是持续改进的主题。然而，种子处理存在一系列一直无法以令人满意的方式解决的问题。因此，期望开发出用于保护种子及发芽植物的方法，其去除或至少显著减少在储存过程中、播种后或植物出土后额外递送作物保护组合物的需求。此外，期望以这样的方式优化所使用的活性成分的量，以便为种子及发芽植物提供最可能的保护抵御昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的侵袭，而所使用的活性成分不会对植物本身造成损害。特别地，用于处理种子的方法还应考虑抵抗害虫或耐受害虫的转基因植物固有的杀虫和/或杀线虫特性，以便在最少使用作物保护组合物的情况下实现对种子及发芽植物的最佳保护。
因此，本发明还特别地涉及用于保护种子及发芽植物抵御害虫侵袭的方法，其通过采用如上所定义的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和至少一种本文公开的选自特定微生物的其他生物防治试剂和/或具有各自菌株所有识别特征的本文公开的微生物的具体菌株的突变体、和/或由各自菌株所产生的表现出对抗昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的活性的至少一种代谢物以及本发明的任选地至少一种杀真菌剂和/或任选地至少一种杀虫剂处理种子。本发明用于保护种子及发芽植物抵御害虫侵袭的方法涵盖在一次操作中采用重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和至少一种本文所述的其他特定生物防治试剂，及任选地至少一种杀真菌剂和/或任选地至少一种杀虫剂同时处理种子的方法。它还涵盖采用重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和至少一种本文公开的其他特定生物防治试剂，及任选地至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂在不同的时间处理种子的方法。
同样，本发明涉及本发明组合物用于处理种子以保护种子和所得植物抵御昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的用途。
本发明还涉及已经同时被重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和至少一种本文所述的其他特定生物防治试剂，及任选地至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂处理过的种子。本发明还涉及已经被重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和至少一种本文公开的其他特定生物防治试剂及任选地至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂在不同时间处理过的种子。在已经被重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和至少一种本文公开的其他特定生物防治试剂及任选地至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂于不同时间处理过的种子的情况中，本发明组合物中的各个活性成分可存在于该种子的不同层中。
此外，本发明涉及这样的种子，其在采用本发明的组合物处理后进行涂膜过程以防止灰尘磨损种子。
本发明的优势之一是，由于本发明组合物的特有的***性特性，采用这些组合物对种子的处理不仅为种子本身还为来源自种子的植物(在其出苗后)提供保护以抵御昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体。如此一来，可不必在播种时或其后不久直接处理作物。
事实上可看出另一优势在于，通过采用本发明的组合物处理种子，可促进经处理的种子的发芽和出苗。
同样被认为有利的是，本发明的组合物还可特别用于转基因种子。
还声明，本发明的组合物可与信号转导技术的试剂组合使用，其结果是，例如，改进了与共生生物的定殖(colonization)，例如增强了根瘤菌、菌根和/或植物内生细菌，和/或优化了固氮作用。
本发明的组合物适合于保护用于农业、温室、林业或园艺中的任何植物变种的种子。更具体而言，所研究的种子为谷物(例如，小麦、大麦、黑麦、燕麦和黍)、玉米、棉花、大豆、稻、马铃薯、向日葵、咖啡、烟草、加拿大油菜(canola)、油菜、甜菜(例如，糖用甜菜和饲用甜菜(fodder beet))、花生、蔬菜(例如，番茄、黄瓜、豆、芸苔属植物、洋葱和莴苣)、果实植物、草坪和观赏植物的种子。特别重要的是处理谷物(例如小麦、大麦、黑麦和燕麦)、玉米、大豆、棉花、加拿大油菜、油菜和稻的种子。
如上面所提及的，采用本发明的组合物处理转基因种子是特别重要的。本文所研究的种子是通常含有至少一种控制多肽(特别是具有杀虫和/或杀线虫特性的多肽)表达的异源基因的植物的种子。转基因种子中的这些异源基因可源自微生物，例如芽孢杆菌属、根瘤菌属(Rhizobium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙雷氏菌属(Serratia)、木霉属(Trichoderma)、棒形杆菌属(Clavibacter)、球囊霉属(Glomus)或者粘帚霉属(Gliocladium)。本发明特别适合于处理含有至少一种源自芽孢杆菌属种的异源基因的转基因种子。特别优选地，所研究的异源基因源自苏云金芽孢杆菌。
为本发明的目的，本发明的组合物单独或于合适的制剂中施用于种子。优选地在这样的状态下处理种子：即种子的稳定性使得在处理过程中不发生损伤。一般而言，可在采收与播种之间的任何时间点处理种子。通常，所用的种子是已经从植物中分离并且已去除穗轴、外壳、茎、荚、毛或果肉。因此，例如，可使用已采收、净化并干燥至水分含量小于15重量％的种子。或者，例如，还可使用干燥后已用水处理，然后再干燥的种子。
一般而言，在处理种子时，必须确保选择施用于种子的本发明的组合物和/或其他添加剂的量，以使得种子的发芽未受到不利的影响，和/或以使得从种子中萌发的植物未受到损伤。特别是使用在一定施用率下可表现出植物毒性作用的活性成分时。
可直接施用本发明的组合物，换言之，不含有其他组分且不经稀释。通常，优选地将所述组合物以合适的制剂形式施用于种子。合适的制剂和用于处理种子的方法是技术人员已知的且记载于例如以下文献中：美国专利4,272,417 A；4,245,432 A；4,808,430 A；5,876,739 A；美国专利公开2003/0176428 A1；WO 2002/080675 A1；WO 2002/028186 A2。
可依据本发明使用的组合可转化为常规的拌种制剂，如溶液剂、乳剂、悬剂、粉剂、泡沫剂、浆液剂和其他种子包衣组合物，以及ULV制剂。
可以已知的方式通过将组合物与常规佐剂混合而制备这些制剂，所述佐剂为，例如，常规填充剂以及溶剂或稀释剂、着色剂、润湿剂、分散剂、乳化剂、消泡剂、防腐剂、二次增稠剂、粘着剂(stickers)、赤霉素以及水。
可存在于可根据本发明使用的拌种制剂中的着色剂包括常规用于此目的的所有着色剂。在本文中，不仅可使用低水溶性的颜料，还可使用水溶性的染料。实例包括已知的命名为罗丹明B(Rhodamine B)、C.I.颜料红112和C.I.溶剂红1的着色剂。
可存在于可根据本发明使用的拌种制剂中的润湿剂包括促进润湿且常规用于活性农业化学成分制剂中的所有物质。可优选地使用烷基萘磺酸酯，例如二异丙基萘磺酸酯或二异丁基萘磺酸酯。
可存在于可根据本发明使用的拌种制剂中的分散剂和/或乳化剂包括常规用于活性农业化学成分制剂中的所有非离子、阴离子或阳离子分散剂。可优选地使用非离子或阴离子分散剂，或非离子或阴离子分散剂的混合物。合适的非离子分散剂特别地为环氧乙烷-环氧丙烷嵌段聚合物、烷基酚聚乙二醇醚以及三苯乙烯基酚聚乙二醇醚，及其磷酸化或硫酸化衍生物。合适的阴离子分散剂特别地为木质素磺酸盐、聚丙烯酸盐和芳基磺酸盐-甲醛缩合物。
可存在于可根据本发明使用的拌种制剂中的消泡剂包括常规用于活性农业化学成分制剂中的所有泡沫抑制剂。可优选地使用硅酮消泡剂和硬脂酸镁。
可存在于可根据本发明使用的拌种制剂中的防腐剂包括可在农业化学组合物中用于此目的的所有物质。实例包括二氯酚和苄醇半缩甲醛。
可存在于可根据本发明使用的拌种制剂中的二次增稠剂包括可在农业化学组合物中用于此目的的所有物质。优选考虑的那些二次增稠剂包括纤维素衍生物、丙烯酸衍生物、黄原胶、改性粘土及高度分散的二氧化硅。
可存在于可根据本发明使用的拌种制剂中的粘着剂包括可用于拌种产品的所有常规粘结剂。可优选地提及聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇和甲基纤维素(tylose)。
可存在于可根据本发明使用的拌种制剂中的赤霉素优选地包括赤霉素A1、A3(＝赤霉酸)、A4和A7；特别优选地使用赤霉酸。赤霉素是已知的(参见R.Wegler，“Chemie derPflanzenschutz-und”，卷2，Springer Verlag，1970，pp.401-412)。
可根据本发明使用的拌种制剂可直接用于或先用水稀释后再用于处理多种类型的任何种子。因此，可利用浓缩剂或通过用水稀释而从它们获得的制剂对谷物(如小麦、大麦、黑麦、燕麦和黑小麦(triticale))的种子，以及玉米、稻、油菜、豌豆、大豆、棉花、向日葵和甜菜的种子，或各种不同蔬菜中任一种的种子进行拌种。可根据本发明使用的拌种制剂或其稀释制剂也可用于对转基因植物的种子进行拌种。在此情况下，在与通过表达形成的物质相互作用中可发生额外的协同作用。
对于采用可根据本发明使用的拌种制剂或采用通过加水而由其制得的制剂处理种子而言，适合的混合设备包括常用于拌种的所有设备。更特别地，进行拌种的过程是将种子置于混合机内，加入特定需要量的拌种制剂(以其本身或预先以水稀释后)，并进行混合直至制剂在种子上均匀分布。随后可进行干燥操作。
可根据本发明使用的拌种制剂的施用率可在相对宽的范围内变化。施用率是由制剂中的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和至少一种本文所述的其他特定生物防治试剂的具体量和种子所决定。在组合物的情况中，施用率通常在0.001-50g/kg种子的范围内，优选在0.01-15g/kg种子的范围内。
此外，本发明的组合物优选地具有有效的杀微生物活性并可在作物保护和材料保护中用于防治不需要的微生物，如真菌和细菌。
本发明还涉及用于防治不需要的微生物的方法，其特征在于将本发明的组合物施用于植物病原真菌、植物病原细菌和/或其生境。
杀真菌剂可用于在作物保护中防治植物病原真菌。杀真菌剂的特征在于具有对抗广谱植物病原真菌的显著功效，所述植物病原真菌包括土壤传播的病原体，特别是根肿菌纲(Plasmodiophoromycetes)、卵菌纲(Peronosporomycetes)(同义词：卵菌纲(Oomycetes))、壶菌纲(Chytridiomycetes)、接合菌纲(Zygomycetes)、子囊菌纲(Ascomycetes)、担子菌纲(Basidiomycetes)和半知菌纲(Deuteromycetes)(同义词：半知菌纲(Fungi imperfecti))的成员。一些杀真菌剂具有***活性且可作为叶片、种子拌种或土壤杀真菌剂用于植物保护中。此外，它们适合用于对抗真菌，特别是侵扰植物的木材或根部的真菌。
杀细菌剂可用于在作物保护中防治假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)和链霉菌科(Streptomycetaceae)。
可根据本发明处理的真菌性病害的病原体的非限制性实例包括：
由白粉病病原体引起的病害，所述白粉病病原体例如，布氏白粉菌属(Blumeria)种，例如禾本科布氏白粉菌(Blumeria graminis)；叉丝单囊壳属(Podosphaera)种，例如苹果白粉菌(Podosphaera leucotricha)；单丝壳属(Sphaerotheca)种，例如黄瓜白粉菌(Sphaerotheca fuliginea)；钩丝壳属(Uncinula)种，例如葡萄白粉菌(Uncinulanecator)；
由锈病病原体引发的病害，所述锈病病原体例如，裸孢子囊菌属(Gymnosporangium)种，例如梨锈菌(Gymnosporangium sabinae)；驼孢锈菌属(Hemileia)种，例如咖啡锈菌(Hemileia vastatrix)；层锈菌属(Phakopsora)种，例如豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)和山马蝗层锈菌(Phakopsora meibomiae)；柄锈菌属(Puccinia)种，例如小麦隐匿柄锈菌(Puccinia recondite)、小麦叶锈菌(P.triticina)、禾柄锈菌(P.graminis)或小麦条锈病菌(P.striiformis)或麦芽柄锈菌(P.hordei)；单孢锈菌属(Uromyces)种，例如疣顶单孢锈菌(Uromyces appendiculatus)；
由卵菌纲(Oomycetes)病原体引起的病害，所述病原体例如白锈菌属(Albugo)种，例如白锈病菌(Albugo candida)；盘梗霉属(Bremia)种，例如莴苣盘梗霉菌(Bremialactcae)；斜尖状孢子菌属(Peronospora)种，例如豌豆霜霉(Peronospora pisi)、寄生霜霉(P.parasitica)或芸苔霜霉(P.brassicae)；疫霉属(Phytophthora)种，例如马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)；单轴霉属(Plasmopara)种，例如葡萄单轴霉(Plasmoparaviticola)；假霜霉属(Pseudoperonospora)种，例如葎草假霜霉(Pseudoperonosporahumuli)或黄瓜霜霉病菌(Pseudoperonospora cubensis)；腐霉菌属(Pythium)种，例如终极腐霉菌(Pythium ultimum)；
由例如以下病原体引起的叶斑病和叶萎蔫病：链格孢属(Alternaria)种，例如索兰尼链格孢(Alternaria solani)；尾孢属(Cercospora)种，例如病原菌甜菜尾孢菌(Cercospora beticola)；枝孢属(Cladiosporium)种，例如黄瓜叶霉病菌(Cladiosporiumcucumerinum)；旋孢腔菌属(Cochliobolus)种，例如禾旋孢腔菌(Cochliobolus sativus)(分生孢子形式：德氏霉属(Drechslera)，同义词：长蠕孢属(Helminthosporium))、水稻旋孢腔菌(Cochliobolus miyabeanus)；毛盘孢属(Colletotrichum)种，例如豆刺盘孢菌(Colletotrichum lindemuthanium)；环黑星霉属(Cycloconium)种，例如油橄榄孔雀斑菌(Cycloconium oleaginum)；间座壳属(Diaporthe)种，例如柑橘褐色蒂腐病菌(Diaporthecitri)；痂囊腔菌属(Elsinoe)种，例如疮痂病的柑桔痂囊腔菌(Elsinoe fawcettii)；盘长孢属(Gloeosporium)种，例如桃树腐烂病菌(Gloeosporium laeticolor)；小丛壳属(Glomerella)种，例如炭疽病菌(Glomerella cingulata)；球座菌属(Guignardia)种，例如葡萄球座菌(Guignardia bidwelli)；小球腔菌属(Leptosphaeria)种，例如十字花科小球腔菌(Leptosphaeria maculans)、颖枯壳小球腔菌(Leptosphaeria nodorum)；间座壳属(Magnaporthe)种，例如稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)；微结节菌属(Microdochium)种，例如雪霉叶枯菌(Microdochium nivale)；球腔菌属(Mycosphaerella)种，例如禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)、花生球腔菌(M.arachidicola)和斐济球腔菌(M.fijiensis)；球腔菌属(Phaeosphaeria)种，例如小麦叶枯病菌(Phaeosphaerianodorum)；核腔菌属(Pyrenophora)种，例如圆核腔菌(Pyrenophora teres)、偃麦草核腔菌(Pyrenophora tritici repentis)；柱隔孢属(Ramularia)种，例如柱隔孢叶斑病菌(Ramularia collo-cygni)、白斑柱隔孢(Ramularia areola)；喙孢属(Rhynchosporium)种，例如大麦云纹病菌(Rhynchosporium secalis)；壳针孢属(Septoria)种，例如芹菜壳针孢菌(Septoria apii)、番茄壳针孢菌(Septoria lycopersii)；核瑚菌属(Typhula)种，例如肉孢核瑚菌(Typhula incarnata)；黑星菌属(Venturia)种，例如苹果黑星菌(Venturiainaequalis)；
由例如以下病原体引起的根和茎的病害：伏革菌属(Corticium)种，例如禾伏革菌(Corticium graminearum)；镰刀菌属(Fusarium)种，例如尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)；禾顶囊壳属(Gaeumannomyces)种，例如小麦全蚀病菌(Gaeumannomycesgraminis)；丝核菌属(Rhizoctonia)种，诸如，例如立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)；例如由稻帚枝霉(Sarocladium oryzae)引起的帚枝霉属(Sarocladium)病害；例如由小球菌核菌(Sclerotium oryzae)引起的小核菌属(Sclerotium)病害；Tapesia属种，例如Tapesiaacuformis；根串珠霉属(Thielaviopsis)种，例如烟草根黑腐病菌(Thielaviopsisbasicola)；
由例如以下病原体引起的肉穗花序和圆锥花序病害(包括玉米穗轴)：链格孢属(Alternaria)种，例如链格孢属种(Alternaria spp.)；曲霉菌属(Aspergillus)种，例如黄曲霉菌(Aspergillus flavus)；分枝孢子菌属(Cladosporium)种，例如支孢样支孢霉(Cladosporium cladosporioides)；麦角菌属(Claviceps)种，例如紫色麦角菌(Clavicepspurpurea)；镰刀菌属(Fusarium)种，例如大刀镰刀菌(Fusarium culmorum)；赤霉菌(Gibberella)种，例如玉米赤霉(Gibberella zeae)；小画线壳属(Monographella)种，例如雪腐小画线壳(Monographella nivalis)；壳针孢属(Septoria)种，例如小麦颖枯壳针孢菌(Septoria nodorum)；
由黑粉菌引起的病害，所述黑粉菌例如轴黑粉菌属(Sphacelotheca)种，例如玉米丝黑穗病菌(Sphacelotheca reiliana)；腥黑粉菌属(Tilletia)种，例如小麦腥黑穗病菌(Tilletia caries)、小麦矮腥黑穗病菌(T.controversa)；条黑粉菌属(Urocystis)种，例如黑麦杆黑穗病菌(Urocystis occulta)；黑粉菌属(Ustilago)种，例如裸黑粉菌(Ustilago nuda)、散黑穗病菌(U.nuda tritici)；
由例如以下病原体引起的果实腐烂：曲霉菌属(Aspergillus)种，例如黄曲霉菌(Aspergillus flavus)；葡萄孢属(Botrytis)种，例如灰霉病菌(Botrytis cinerea)；青霉属(Penicillium)种，例如扩展青霉菌(Penicillium expansum)、产紫青霉(P.purpurogenum)；核盘菌属(Sclerotinia)种，例如核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)；轮枝孢属(Verticilium)种，例如黑白轮枝孢(Verticilium alboatrum)；
由例如以下病原体引起的种传的和土传的腐败、发霉、萎蔫、腐烂和猝倒病害：链格孢属(Alternaria)种，例如由甘蓝链格孢菌(Alternaria brassicicola)引起的；丝囊霉属(Aphanomyces)种，例如由根腐丝囊霉(Aphanomyces euteiches)引起的；壳二孢属(Ascochyta)种，例如由晶状体壳二孢(Ascochyta lentis)引起的；曲霉菌属(Aspergillus)种，例如由黄曲霉菌(Aspergillus flavus)引起的；分枝孢子菌属(Cladosporium)种，例如由分支胞子菌(Cladosporium herbarum)引起的；旋孢腔菌(Cochliobolus)种，例如由禾旋孢腔菌(Cochliobolus sativus)引起的；(分生孢子形式：德氏霉属(Drechslera)、双极霉属(Bipolaris)，同义词：长蠕孢属(Helminthosporium))；毛盘孢属(Colletotrichum)种，例如由球炭疽菌(Colletotrichum coccodes)引起的；镰刀菌属(Fusarium)种，例如由镰刀菌属(Fusarium culmorum)引起的；赤霉菌(Gibberella)属种，例如由玉米赤霉(Gibberella zeae)引起的；亚大茎点霉属(Macrophomina)种，例如由菜豆壳球孢菌(Macrophomina phaseolina)引起的；小画线壳属(Monographella)种，例如由雪腐小画线壳(Monographella nivalis)引起的；青霉属(Penicillium)种，例如由扩展青霉菌(Penicillium expansum)引起的；茎点霉属(Phoma)种，例如由病原黑胫茎点霉(Phoma lingam)引起的；拟茎点霉属(Phomopsis)种，例如由大豆拟茎点霉(Phomopsissojae)引起的；疫霉属(Phytophthora)种，例如由恶疫霉(Phytophthora cactorum)引起的；核腔菌属(Pyrenophora)种，例如由麦类核腔菌(Pyrenophora graminea)引起的；梨孢属(Pyricularia)种，例如由稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)引起的；腐霉菌属(Pythium)种，例如由终极腐霉(Pythium ultimum)引起的；丝核菌属(Rhizoctonia)种，例如由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)引起的；根霉菌属(Rhizopus)种，例如由稻根霉菌(Rhizopusoryzae)引起的；小菌核属(Sclerotium)种，例如由齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)引起的；壳针孢属(Septoria)种，例如由小麦颖枯壳针孢菌(Septoria nodorum)引起的；核瑚菌属(Typhula)种，例如由肉孢核瑚菌(Typhula incarnata)引起的；轮枝孢属(Verticillium)种，例如由棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)引起的；
由例如以下病原体引起的癌症(cancer)、虫瘿和扫帚病(witches’broom)病害：丛赤壳属(Nectria)种，例如仁果干癌丛赤壳菌(Nectria galligena)；
由例如以下病原体引起的萎蔫病害：链核盘菌属(Monilinia)种，例如核果链核盘菌(Monilinia laxa)；
由例如以下病原体引起的叶疱病或卷叶病病害，外担子菌属(Exobasidium)种，例如坏损外担菌(Exobasidium vexans)；
外囊菌属(Taphrina)种，例如畸形外囊菌(Taphrina deformans)；
木本植物的退行性病害：由例如根霉格孢菌(Phaemoniella clamydospora)、Phaeoacremonium aleophilium和Fomitiporia mediterranea引起的Esca病害；由例如侧弯孢壳属(Eutypa lata)引起的葡萄顶枯病(Eutypa dyeback)；由例如岛灵芝(Ganodermaboninense)引起的灵芝属(Ganoderma)病害；由例如木硬孔菌(Rigidoporus lignosus)引起的硬孔菌属(Rigidoporus)病害；
由例如以下病原体引起的花和种子的病害：葡萄孢属(Botrytis)种，例如灰葡萄孢(Botrytis cinerea)；
由例如以下病原体引起的植物块茎病害：丝核菌属(Rhizoctonia)种，例如立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)；长蠕孢菌属(Helminthosporium)种，例如茄病长蠕孢(Helminthosporium solani)；
由例如以下病原体引起的根肿病病害：根肿菌属(Plasmodiophora)种，例如芸薹根肿菌(Plamodiophora brassicae)；
由细菌性病原体引起的病害，所述细菌性病原体例如，黄单胞菌属(Xanthomonas)种，例如稻黄单胞菌白叶枯致病变种(Xanthomonas campestris pv.oryzae)；假单胞菌属(Pseudomonas)种，例如丁香假单胞菌黄瓜致病变种(pseudomonas syringaepv.lachrymans)；欧文氏(Erwinia)种，例如噬淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)。
优选地可防治以下大豆病害：
由例如以下病原体引起的位于叶、茎、荚和种子上的真菌病害，如链格孢属叶斑病(Alternaria leaf spot)(Alternaria spec.atrans tenuissima)、炭疽病(Colletotrichum gloeosporoides dematium var.truncatum)、褐斑病(大豆壳针孢(Septoria glycines))、尾孢属叶斑病和叶枯病(Cercospora leaf spot and blight)(菊池尾孢(Cercospora kikuchii))、笄霉属(Choanephora)叶枯病(漏斗笄霉(Choanephorainfundibulifera trispora(Syn.))、dactuliophora叶斑病(Dactuliophora glycines)、霜霉病(downy mildew)(东北霜霉(Peronospora manshurica))、德氏霉属(drechslera)枯萎病(Drechslera glycini)、蛙眼病叶斑病(大豆尾孢(Cercospora sojina))、小光壳属(leptosphaerulina)叶斑病(三叶草小光壳(Leptosphaerulina trifolii))、叶点霉属(phyllostica)叶斑病(大豆生叶点霉(Phyllosticta sojaecola))、荚和茎枯萎病(大豆拟茎点霉(Phomopsis sojae))；白粉病(扩散叉丝壳(Microsphaera diffusa))、棘壳孢属(pyrenochaeta)叶斑病(Pyrenochaeta glycines)、丝核菌属地上部分、叶枯病和立枯病(立枯丝核菌(Rhizoctonia solani))、锈病(豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)、山马蝗层锈菌(Phakopsora meibomiae))、痂病(大豆痂圆孢(Sphaceloma glycines))、匍柄霉属(stemphylium)叶枯病(匍柄霉(Stemphylium botryosum))、靶斑病(target spot)(山扁豆生棒孢(Corynespora cassiicola))。
由例如以下病原体引起的根部和茎基部的真菌病害，如黑根腐病(black rootrot)(Calonectria crotalariae)、炭腐病(菜豆生壳球孢(Macrophomina phaseolina))、镰孢属枯萎病或萎蔫、根腐病以及荚和根颈腐烂((尖镰孢(Fusarium oxysporum)、直喙镰孢(Fusarium orthoceras)、半裸镰孢(Fusarium semitectum)、木贼镰孢(Fusariumequiseti))、mycoleptodiscus根腐病(Mycoleptodiscus terrestris)、新赤壳属(neocosmospora)(侵菅新赤壳(Neocosmopspora vasinfecta))、荚和茎枯病(菜豆间座壳(Diaporthe phaseolorum))、茎溃疡(大豆北方茎溃疡病菌(Diaporthe phaseolorumvar.caulivora))、疫霉属腐病(大雄疫霉(Phytophthora megasperma))、褐茎腐病(大豆茎褐腐病菌(Phialophora gregata))、腐霉菌属腐病(瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)、畸雌腐霉(Pythium irregulare)、德巴利腐霉(Pythium debaryanum)、群结腐霉(Pythiummyriotylum)、终极腐霉(Pythium ultimum))、丝核菌属根腐病、茎腐和猝倒病(立枯丝核菌(Rhizoctonia solani))、核盘菌茎腐病(核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum))、核盘菌白绢病(Sclerotinia rolfsii)、根串珠霉属根腐病(根串珠霉(Thielaviopsis basicola))。
本发明的组合物可用于治疗性或保护性/预防性地防治植物致病真菌。因此，本发明还涉及通过使用本发明的组合物而防治植物致病真菌的治疗性和保护性方法，其中将本发明的组合物施用于种子、植物或植物部分、果实或植物生长的土壤。
所述组合物在防治植物病害所需的浓度下具有良好的植物耐受性，这一事实使得其能够处理植物的地上部分、繁殖的根状茎和种子以及土壤。
根据本发明可处理所有的植物和植物部分。植物意指所有的植物和植物种群，例如需要和不需要的野生植物、栽培种和植物变种(无论是否受植物品种或植物育种者权利的保护)。栽培种和植物变种可以是通过常规的繁殖和育种方法而获得的植物，所述常规的繁殖和育种方法可通过一种或多种生物技术方法来辅助或补充，例如通过使用双单倍体、原生质体融合、随机和定向诱变、分子或遗传标记物，或通过生物工程和基因工程方法。植物部分意指植物的所有的地上和地下部分和器官，例如芽、叶、花和根，据此列出例如叶、针叶、茎、枝、花、子实体、果实和种子以及根、球茎和根茎。作物以及无性和有性繁殖材料，例如插条、球茎、根茎、匍匐茎和种子也属于植物部分。
当具有良好的植物耐受性时，本发明的组合物具有有利的恒温动物毒性且可被环境完全耐受，适用于保护植物和植物器官，用于提高采收产量，改善采收材料的品质。优选地将它用作作物保护组合物。它对一般敏感及具有抗性的物种具有活性，并且对所有的或一些发育阶段具有活性。
可依照本发明进行处理的植物包括以下主要作物植物：玉米、大豆、苜蓿、棉花、向日葵、芸苔属(Brassica)油料种子(例如欧洲油菜(Brassica napus)(例如加拿大油菜、油菜籽)、芜青(Brassica rapa)、芥菜(B.juncea)(例如(田)芥子)和埃塞俄比亚芥(Brassicacarinata))、槟榔科种(Arecaceae sp.)(例如油棕，椰子)、稻、小麦、甜菜、甘蔗、燕麦、黑麦、大麦、粟和高粱、小黑麦、亚麻、坚果、葡萄和藤本植物以及来自各种植物分类单位的各种水果和蔬菜，例如蔷薇科种(Rosaceae sp.)(如仁果类水果(如苹果和梨)，还有核果类水果(如杏、樱桃、扁桃、李子和桃)，以及浆果类水果(如草莓、覆盆子、红加仑和黑茶藨子以及醋粟))、茶藨子科种(Ribesioidae sp.)、胡桃科种(Juglandaceae sp.)、桦木科种(Betulaceae sp.)、漆树科种(Anacardiaceae sp.)、壳斗科种(Fagaceae sp.)、桑科种(Moraceae sp.)、木犀科种(Oleaceae sp.)(例如橄榄树)、猕猴桃科种(Actinidaceaesp.)、樟科种(Lauraceae sp.)(例如油梨、桂皮、樟脑)、芭蕉科种(Musaceae sp.)(例如香蕉树和香蕉种植园)、茜草科种(Rubiaceae sp.)(例如咖啡)、山茶科种(Theaceae sp.)(例如茶)、梧桐科种(Sterculiceae sp.)、芸香科种(Rutaceae sp.)(例如柠檬、橙、桔和葡萄柚)；茄科种(Solanaceae sp.)(例如，番茄、马铃薯、胡椒、辣椒、茄子、烟草)、百合科种(Liliaceae sp.)、菊科种(Compositae sp.)(例如莴苣、朝鲜蓟和菊苣-包括根菊苣、菊苣或普通菊苣)、伞形科种(Umbelliferae sp.)(例如胡萝卜、荷兰芹、芹菜和根芹菜)、葫芦科种(Cucurbitaceae sp.)(例如黄瓜-包括腌食用小黄瓜、西葫芦、西瓜、葫芦和木瓜)、葱科种(Alliaceae sp.)(例如韭、洋葱)、十字花科种(Cruciferae sp.)(例如白甘蓝、红甘蓝、青花菜、花椰菜、抱子甘蓝、小白菜、球茎甘蓝、小萝卜、山葵、水芹和大白菜)、豆科种(Leguminosae sp.)(例如花生、豌豆、扁豆和菜豆–例如刀豆和蚕豆)、藜科种(Chenopodiaceae sp.)(例如唐莴苣、饲用甜菜、菠菜、甜菜根)、亚麻科种(Linaceae sp.)(例如***)、***科种(Cannabeacea sp.)(例如印度***)、锦葵科种(Malvaceae sp.)(例如黄秋葵、可可)、罂粟科(Papaveraceae)(例如罂粟)、百合科(Asparagaceae)(例如芦笋)；园艺和森林中的有用植物和观赏植物，包括草地、草坪、牧草和甜叶菊(Steviarebaudiana)；以及在每种情况下，这些植物各自的基因修饰型。
根据植物种或植物栽培种，其位置和生长条件(土壤、气候、生长期、营养)，使用或采用本发明的组合物，本发明的处理还可导致超加和(“协同”)效应。因此，例如，通过在本发明的处理中使用或采用本发明的组合物，可取得以下超过实际预期的效果：降低施用率和/或拓宽活性谱和/或提高活性、改善植物生长、提高对高温或低温的耐受性、提高对干旱或对水或土壤含盐量的耐受性、提高开花性能、使采收较容易、加速成熟、采收产量更高、果实更大、植株更高、叶色更绿、开花更早、采收产品的品质和/或其营养价值更高、果实中糖的浓度更高、采收产品的储存稳定性和/或加工性更好。
在本发明的组合物的某些施用率下，在本发明的处理中也可在植物中具有强化作用。调动植物的防御体系以抵抗不需要的植物病原真菌和/或微生物和/或病毒。在本文中，植物强化(抗性诱导)物质应理解为意指能够以这样一种方式刺激植物防御体系的那些物质或物质的组合，即当随后接种不需要的植物病原真菌和/或微生物和/或病毒时，经处理的植物对这些植物病原真菌和/或微生物和/或病毒表现出很大程度的抗性。因此，通过在本发明的处理中使用或采用本发明的组合物，可保护植物在处理后的一定时期内抵御上述病原体的侵害。在采用所述活性化合物处理植物后，实现保护作用的时间段通常持续1-10天，优选1-7天。
同样优选地，依据本发明处理的植物和植物栽培种对一种或多种生物胁迫具有抗性，即所述植物对动物和微生物害虫(如对线虫、昆虫、螨虫类、植物致病真菌、细菌、病毒和/或类病毒)显示出更好的防御。
还可依据本发明处理的植物和植物栽培种是对一种或多种非生物胁迫具有抗性的那些植物，即针对胁迫耐受性已经表现出增加的植物健康的那些植物。非生物胁迫条件可包括，例如干旱、低温暴露、热暴露、渗透胁迫、水涝、增加的土壤含盐量、增强的矿物质暴露、臭氧暴露、强光暴露、有限的氮营养素利用度、有限的磷营养素利用度、避荫。优选地，用本发明的组合物对这些植物和栽培种的处理额外增加总体植物健康(参见上文)。
还可依据本发明处理的植物和植物栽培种是以增强的产量特性为特征的那些植物，即针对该特征已经表现出增加的植物健康的那些植物。所述植物的提高的产量可由以下因素导致：例如，改进的植物生理机能、生长和发育，如用水效率、持水效率、改进的氮利用、增强的碳同化作用、改善的光合作用、提高的发芽率和加速的成熟。
产量还可受到改进的植物构造(plant architecture)的影响(在胁迫和非胁迫条件下)，包括但不限于：提早开花、对杂种制种的开花控制、秧苗活力、植株大小、节间数和节间距、根系生长、种子大小、果实大小、荚果大小、荚果数或穗数、每个荚果或穗的种子数目、种子质量、提高的种子饱满度、减少的种子散布、减少的荚开裂以及抗倒伏性。其他产量特征包括种子组成，如碳水化合物含量、蛋白质含量、油含量及组成、营养价值、抗营养化合物的减少、改进的加工性和更好的贮存稳定性。优选地，用本发明的组合物对这些植物和栽培种的处理额外增加总体植物健康(参见上述)。
可依据本发明处理的植物为已经表达出杂种优势或杂种活力特征的杂种植物，所述杂种优势或杂种活力通常导致更高的产量、活力、健康和对生物胁迫因素和非生物胁迫因素更好的抗性。这种植物通常是通过将一种自交雄性不育亲代系(母本)与另一种自交雄性能育亲代系(父本)杂交而制得。杂种种子通常采收自雄性不育植物并出售给种植者。雄性不育植物有时(例如在玉米中)可通过去雄(即机械移除雄性生殖器官或雄花)而制得，但是，更通常地，雄性不育性是由植物基因组中的遗传决定因子导致的。在这种情况下，特别是当种子是待从杂交植物上采收的所需产品时，确保杂交植物中的雄性能育性(fertility)的完全恢复通常是有用的。这可通过确保父本具有合适的能育性恢复基因而完成，该基因能够恢复含有负责雄性不育性的遗传决定因子的杂种植物中的雄性能育性。负责雄性不育性的遗传决定因子可位于细胞质中。细胞质雄性不育性(CMS)的实例例如在芸苔属(Brassica)种中描述过。然而，负责雄性不育性的遗传决定因子也可位于细胞核基因组中。雄性不育植物还可通过植物生物技术方法如基因工程获得。一种获取雄性不育植物的特别有用的方法记载于WO 89/10396中，其中，例如，在雄蕊中的绒毡层细胞中选择性表达核糖核酸酶例如芽孢杆菌RNA酶(barnase)。随后可通过在绒毡层细胞中表达核糖核酸酶抑制剂如芽孢杆菌RNA酶抑制剂(barstar)来恢复能育性。
可依据本发明处理的植物或植物栽培种(通过植物生物技术方法如基因工程而获得)是除草剂耐受性植物，即对一种或多种给定的除草剂耐受的植物。这些植物可通过遗传转化或通过选择含有赋予所述除草剂耐受性的突变的植物而获得。
提供以下非限制性实施例以进一步举例说明本发明。
实施例
实施例1：多个活性成分的组合的功效的公式
当活性成分的组合的活性超过活性成分在单独施用时的活性的总和时，则存在活性成分的协同效应。两种活性成分的给定组合的预期活性可按照如下方式计算(参考Colby，S.R.，“Calculating Synergistic and Antagonistic Responses of HerbicideCombinations,”Weeds 1967，15，20-22):
如果
X为活性成分A以m ppm(或g/ha)的施用率施用时的功效，
Y为活性成分B以n ppm(或g/ha)的施用率施用时的功效，
E为活性成分A和B分别以m和n ppm(或g/ha)的施用率施用时的功效，
则
如果实际活性超过计算值，则所述组合的活性为超加和的，即存在协同效应。在这种情况下，实际观察到的功效必定大于由上述公式计算出的预期功效(E)的值。
例如，所述公式和分析可以应用于植物生长促进的评估。这样的测定在施用于植物后几天进行评估。100％是指对应于未处理的对照植物的植物重量。功效是指在这种情况下与未处理的对照的植物重量相比的植物重量的额外％。例如，导致与未处理的对照植物相比植物重量为120％的处理将具有20％的功效。如果所述组合的植物生长促进效果(即对于用所述组合处理的植物的％芽重的观察功效)超过计算值，那么所述组合的活性是超加和的，即存在协同效应。
所述公式和分析也可以用于评估病害控制测定中的协同作用。以％表示的功效程度。0％表示对应于对照的功效，而100％的功效表示未观察到病害。
如果实际的杀虫或杀真菌活性超过计算值，那么所述组合的活性是超加和的，即存在协同效应。在这种情况下，实际观察到的功效必须大于由上述公式计算的预期功效(E)的值。
证明协同效应的另一种方法是Tammes的方法(参见“Isoboles，A GraphicRepresentation of Synergism in Pesticides,”Neth.J.Plant Path.，1964，70，73-80)。
实施例2：使用枯草芽孢杆菌QST713和表达磷脂酶C的重组苏云金芽孢杆菌细胞的植物生长促进
进行实验以分析基于枯草芽孢杆菌QST713的产品和表达磷脂酶C的重组苏云金芽孢杆菌细胞(“BEPC”)的发酵产物的组合的功效。在25-28℃和50％湿度下的植物生长室中，将玉米种子种植于在灯架上的小型三英寸方形盆中的合成培养基和沙子的无菌混合物中，生长约14天。在每个盆中种植两粒种子。在种植时，用下述处理浸透每个盆中的生长培养基。14天后，测量植物的全植物生物量。在一些实验中，使用WinRhizoRoot扫描仪分析根。在这些实施例的所有表中，UTC是指未处理的对照。“计算的”是指使用上述Colby方程计算的预期效果，“功效”是指观察到的实际效果。
将ASO产品在水中稀释(1％和5％体积/体积)，并将稀释的溶液用于浸透生长培养基。ASO的施用率是指产品ASO中包含的枯草芽孢杆菌QST713(即孢子制剂)的量，其为1.34％。所配制的产品的最小孢子浓度为1×109cfu/g。
在其孢子外壁上表达磷脂酶C的重组蜡状芽孢杆菌家族成员(苏云金芽胞杆菌BT013A)(BEPC)为按照以下方式产生。为了产生用于在蜡状芽孢杆菌家族成员中表达融合蛋白的质粒，产生编码BclA启动子(SEQ ID NO:85)、甲硫氨酸起始密码子和BclA的氨基酸20-35(SEQ ID NO:1)，之后是在框中融合至苏云金芽孢杆菌BT013A磷脂酶C(SEQ ID NO:108)的6个丙氨酸接头序列的PCR片段。将这些PCR片段用XhoI消化并连接到pSUPER质粒的SalI位点以产生质粒pSUPER-BclA 20-35-磷脂酶。通过将pUC57质粒(含有氨苄青霉素抗性盒)与来自芽孢杆菌属的pBC16-1质粒(含有四环素抗性)融合来产生pSUPER质粒。该5.5kbp质粒可以在大肠杆菌和芽孢杆菌属种中复制。将pSUPER-BclA 20-35-磷脂酶质粒转化至dam甲基化酶阴性大肠杆菌菌株中并在其中繁殖，并最终转化至苏云金芽孢杆菌BT013A中。
为了获得BEPC的全肉汤培养物，用BEPC接种含有脑心浸液培养基(BHI)的15mL锥形瓶，并在约30℃下在300rpm的振荡器设置下生长7-8小时。第二天，将来自每个***250μl等分试样接种到含有50mL基于酵母提取物的培养基的250mL烧瓶中，并在约30℃下生长。在约2天的孵育后，当孢子形成完成至少95％时，收集培养物肉汤并计算菌落形成单位。将发酵液在50mL水中稀释至5％，并将以下菌落形成单位施用于每个盆。
表3
如上所述重复实验，但使用ASO产品的1％稀释液。结果示于下表4中。
表4
使用WinRhizo根扫描仪进行的根体积测量结果示于表5中。
表5
结果表明当组合ASO和BEPC时的超加和的植物产量效果。
实施例3：使用枯草芽孢杆菌QST713和表达内切葡聚糖酶的重组苏云金芽孢杆菌细胞的植物生长促进
使用表达内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:107)的重组苏云金芽孢杆菌细胞(在这些实施例中称为BEE)进行类似于实施例2的实验。除了使用内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:107)，而不是磷脂酰脂酶以外，如上所述产生BEE的全肉汤培养物。BEE与ASO的组合对植物产量的影响示于下表中。
表6
表7
表8
上述结果表明当枯草芽孢杆菌QST713和BEE组合施用时对植物产量的超加和效应。
实施例4：使用坚强芽孢杆菌菌株I-1582和重组苏云金芽孢杆菌细胞的植物生长促进
玉米种子在20℃和70％湿度下的温室中的壤砂土中生长约11天。从处理时起约11天后，在土壤上切除幼苗并测定鲜重。
表达由SEQ ID NO:107编码的内切葡聚糖酶或由SEQ ID NO:108编码的磷脂酶C以及如上所述制备的重组苏云金芽孢杆菌细胞以约50μg/粒(kernel)施用。坚强芽孢杆菌菌株I-1582也将以约50μg/粒施用。
预期用重组苏云金芽孢杆菌与坚强芽孢杆菌菌株I-1582的组合处理的玉米植物的％芽重将超过基于用两个活性成分单独处理的玉米植物的％芽重的计算值，即，观察到协同效应。
序列表
<110> Bayer CropScience LP
<120> 包含重组芽孢杆菌属细胞和其他生物控制剂的组合物
<130> BCS149057 WO
<150> US 62/051,911
<151> 2014-09-17
<160> 109
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 41
<212> PRT
<213> 炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）
<400> 1
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40
<210> 2
<211> 332
<212> PRT
<213> 炭疽芽孢杆菌
<400> 2
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20 25 30
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<212> PRT
<213> 炭疽芽孢杆菌
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Gly
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<211> 209
<212> PRT
<213> 炭疽芽孢杆菌
<400> 4
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Leu Ser Leu Asn Gln Gly Asp Val Leu Arg Val Arg Ile Arg Glu Ala
180 185 190
Thr Gly Asp Ile Ile Tyr Ser Asn Ala Ser Leu Val Val Ser Lys Val
195 200 205
Asp
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<212> PRT
<213> 炭疽芽孢杆菌
<400> 5
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<212> PRT
<213> 炭疽芽孢杆菌
<400> 6
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65 70 75 80
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<213> 炭疽芽孢杆菌
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<212> PRT
<213> 炭疽芽孢杆菌
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1 5 10 15
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20 25 30
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65 70 75 80
Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Ile Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr
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<210> 9
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<212> PRT
<213> 炭疽芽孢杆菌
<400> 9
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<212> PRT
<213> 炭疽芽孢杆菌
<400> 10
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<210> 11
<211> 39
<212> PRT
<213> 韦氏芽孢杆菌（Bacillus weihenstephensis）
<400> 11
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35
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<212> PRT
<213> 韦氏芽孢杆菌
<400> 12
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1 5 10 15
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100 105 110
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<210> 13
<211> 39
<212> PRT
<213> 韦氏芽孢杆菌
<400> 13
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1 5 10 15
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20 25 30
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35
<210> 14
<211> 289
<212> PRT
<213> 韦氏芽孢杆菌
<400> 14
Met Phe Asp Lys Asn Glu Met Lys Lys Thr Asn Glu Val Leu Gln Ala
1 5 10 15
Asn Ala Leu Asp Pro Asn Ile Ile Gly Pro Thr Leu Pro Pro Ile Pro
20 25 30
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50 55 60
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65 70 75 80
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115 120 125
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Ile Ala Asp Ala Pro Asn Val Ala Pro Arg Phe Phe Leu Phe Asn Ile
145 150 155 160
Thr Ser Val Asn Asp Phe Leu Val Thr Val Thr Asp Pro Val Ser Asn
165 170 175
Thr Thr Phe Val Val Asn Ile Ser Asp Val Ile Gly Val Gly Phe Ser
180 185 190
Leu Thr Val Pro Pro Leu Thr Leu Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gly Cys
195 200 205
Glu Cys Asp Cys Arg Glu Arg Pro Ile Arg Glu Leu Leu Asp Thr Leu
210 215 220
Ile Gly Ser Thr Val Asn Leu Leu Val Ser Asn Gly Ser Ile Ala Thr
225 230 235 240
Gly Phe Asn Val Glu Gln Thr Ala Leu Gly Ile Val Ile Gly Thr Leu
245 250 255
Pro Ile Pro Ile Asn Pro Pro Pro Pro Thr Leu Phe Arg Phe Ala Ile
260 265 270
Ser Thr Cys Lys Ile Thr Ala Val Asp Ile Thr Pro Thr Pro Thr Ala
275 280 285
Thr
<210> 15
<211> 49
<212> PRT
<213> 蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）
<400> 15
Met Ser Arg Lys Asp Lys Phe Asn Arg Ser Arg Met Ser Arg Lys Asp
1 5 10 15
Arg Phe Asn Ser Pro Lys Ile Lys Ser Glu Ile Ser Ile Ser Pro Asp
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Leu Val Gly Pro Thr Phe Pro Pro Ile Pro Ser Phe Thr Leu Pro Thr
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Gly
<210> 16
<211> 189
<212> PRT
<213> 蜡状芽孢杆菌
<400> 16
Met Ser Arg Lys Asp Lys Phe Asn Arg Ser Arg Met Ser Arg Lys Asp
1 5 10 15
Arg Phe Asn Ser Pro Lys Ile Lys Ser Glu Ile Ser Ile Ser Pro Asp
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Leu Val Gly Pro Thr Phe Pro Pro Ile Pro Ser Phe Thr Leu Pro Thr
35 40 45
Gly Ile Thr Gly Pro Thr Phe Asn Ile Asn Phe Arg Ala Glu Lys Asn
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65 70 75 80
Asn Ile Ile Phe Asn Asn Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Val Thr Asn Thr
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Phe Thr Ala Pro Ile Asn Gly Ile Tyr Leu Phe Ser Ala Ser Ile Gly
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Phe Asn Pro Thr Leu Gly Thr Thr Ser Thr Leu Arg Ile Thr Ile Arg
115 120 125
Lys Asn Leu Val Ser Val Ala Ser Gln Thr Gly Thr Ile Thr Thr Gly
130 135 140
Gly Thr Pro Gln Leu Glu Ile Thr Thr Ile Ile Asp Leu Leu Ala Ser
145 150 155 160
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165 170 175
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<210> 17
<211> 33
<212> PRT
<213> 蜡状芽孢杆菌
<400> 17
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1 5 10 15
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Gly
<210> 18
<211> 84
<212> PRT
<213> 蜡状芽孢杆菌
<400> 18
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<211> 39
<212> PRT
<213> 蜡状芽孢杆菌
<400> 19
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1 5 10 15
Phe Arg Ile Pro Pro Glu Leu Ile Gly Pro Thr Phe Pro Pro Val Pro
20 25 30
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35
<210> 20
<211> 1056
<212> PRT
<213> 蜡状芽孢杆菌
<400> 20
Met Lys Asn Arg Asp Asn Asn Arg Lys Gln Asn Ser Leu Ser Ser Asn
1 5 10 15
Phe Arg Ile Pro Pro Glu Leu Ile Gly Pro Thr Phe Pro Pro Val Pro
20 25 30
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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130 135 140
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145 150 155 160
Thr Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Ala Gln Gly Ile Gln Gly Thr Pro
165 170 175
Gly Pro Ser Gly Asn Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly
180 185 190
Gln Gly Ile Thr Gly Pro Thr Gly Ile Thr Gly Pro Thr Gly Ile Thr
195 200 205
Gly Pro Ser Gly Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr
210 215 220
Gly Pro Gly Gly Gly Pro Ser Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr
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Gly Asn Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly
245 250 255
Ser Thr Gly Pro Thr Gly Ser Thr Gly Ala Gln Gly Leu Gln Gly Ile
260 265 270
Gln Gly Ile Gln Gly Pro Ile Gly Pro Thr Gly Pro Glu Gly Ser Gln
275 280 285
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Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Val Ile Gly Pro Gln Gly Val Thr
325 330 335
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420 425 430
Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly Val Gln Gly Ala Thr Gly Ile Gln Gly
435 440 445
Ile Gln Gly Glu Ile Gly Ala Thr Gly Pro Glu Gly Pro Gln Gly Val
450 455 460
Gln Gly Ala Gln Gly Ala Ile Gly Pro Thr Gly Pro Met Gly Pro Gln
465 470 475 480
Gly Val Gln Gly Val Gln Gly Ile Gln Gly Ala Thr Gly Ala Gln Gly
485 490 495
Val Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Ile Gln Gly Pro Thr Gly Ala
500 505 510
Thr Gly Asp Met Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Glu Gly Thr Thr Gly
515 520 525
Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Ser Gly Gly
530 535 540
Pro Ala Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Ser Gly Pro Ala Gly Val
545 550 555 560
Thr Gly Pro Ser Gly Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala
565 570 575
Thr Gly Val Thr Gly Asp Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Val Thr
580 585 590
Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly Leu Gln Gly
595 600 605
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610 615 620
Gln Gly Val Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Val Thr Gly Ala Thr
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Gly Asp Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Pro Gln Gly Asp Ile Gly
645 650 655
Pro Thr Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Pro Gln Gly Ser Gln Gly Ile
660 665 670
Gln Gly Ala Thr Gly Gly Thr Gly Ala Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln
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Gly Ala Gln Gly Val Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Val Gln Gly
835 840 845
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850 855 860
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865 870 875 880
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885 890 895
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900 905 910
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915 920 925
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Gly Leu Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Val Gln Gly Glu Ile Gly
945 950 955 960
Pro Thr Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Val
965 970 975
Thr Gly Ala Thr Gly Ala Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Pro Gln
980 985 990
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1010 1015 1020
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1025 1030 1035
Pro Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly
1040 1045 1050
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1055
<210> 21
<211> 39
<212> PRT
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<400> 21
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35
<210> 22
<211> 365
<212> PRT
<213> 韦氏芽孢杆菌
<400> 22
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1 5 10 15
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20 25 30
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165 170 175
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180 185 190
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210 215 220
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225 230 235 240
Thr Asn Leu Ile Tyr Val Val Asn Asn Ser Pro His Asn Val Ser Val
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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325 330 335
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<211> 30
<212> PRT
<213> 韦氏芽孢杆菌
<400> 23
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1 5 10 15
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<210> 24
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<212> PRT
<213> 韦氏芽孢杆菌
<400> 24
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1 5 10 15
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145 150 155 160
<210> 25
<211> 30
<212> PRT
<213> 韦氏芽孢杆菌
<400> 25
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<210> 26
<211> 69
<212> PRT
<213> 韦氏芽孢杆菌
<400> 26
Met Asp Glu Phe Leu Ser Ser Thr Ala Leu Asn Pro Cys Ser Ile Gly
1 5 10 15
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20 25 30
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65
<210> 27
<211> 36
<212> PRT
<213> 韦氏芽孢杆菌
<400> 27
Met Lys Glu Arg Asp Arg Gln Asn Ser Leu Asn Ser Asn Phe Arg Ile
1 5 10 15
Ser Pro Asn Leu Ile Gly Pro Thr Phe Pro Pro Val Pro Thr Gly Phe
20 25 30
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35
<210> 28
<211> 934
<212> PRT
<213> 韦氏芽孢杆菌
<400> 28
Met Lys Glu Arg Asp Arg Gln Asn Ser Leu Asn Ser Asn Phe Arg Ile
1 5 10 15
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20 25 30
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145 150 155 160
Gln Gly Ile Gln Gly Ala Gln Gly Ile Gln Gly Pro Gln Gly Pro Ser
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Ser Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Asn Thr Gly Val Thr
225 230 235 240
Gly Ser Ala Gly Val Thr Gly Asn Thr Gly Ser Thr Gly Ser Thr Gly
245 250 255
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260 265 270
Ile Gly Pro Thr Gly Pro Glu Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Ile Pro
275 280 285
Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Glu Gln Gly Ile Gln Gly Val Gln Gly
290 295 300
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305 310 315 320
Gln Gly Ala Ile Gly Pro Gln Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly Asp Gln
325 330 335
Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Val Pro Gly Pro Thr Gly Asp Thr Gly
340 345 350
Ser Gln Gly Val Gln Gly Ile Gln Gly Pro Met Gly Asp Ile Gly Pro
355 360 365
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Gly Val Pro Gly Pro Ala Gly Ala Thr Gly Pro Glu Gly Pro Gln Gly
385 390 395 400
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405 410 415
Gln Gly Ile Gln Gly Ile Gln Gly Ile Gln Gly Ile Thr Gly Ala Thr
420 425 430
Gly Ala Gln Gly Ala Thr Gly Val Gln Gly Val Gln Gly Asn Ile Gly
435 440 445
Ala Thr Gly Pro Glu Gly Pro Gln Gly Val Gln Gly Thr Gln Gly Asp
450 455 460
Ile Gly Pro Thr Gly Pro Met Gly Pro Gln Gly Val Gln Gly Ile Gln
465 470 475 480
Gly Ile Gln Gly Pro Thr Gly Ala Gln Gly Val Gln Gly Pro Gln Gly
485 490 495
Ile Gln Gly Ile Gln Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Asp Thr Gly Thr
500 505 510
Thr Gly Ala Thr Gly Glu Gly Thr Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly
515 520 525
Pro Ser Gly Val Thr Gly Pro Ser Gly Gly Pro Ala Gly Pro Thr Gly
530 535 540
Pro Thr Gly Pro Ser Gly Pro Thr Gly Leu Thr Gly Pro Ser Gly Gly
545 550 555 560
Pro Pro Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly Gly Val Gly Asp
565 570 575
Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr
580 585 590
Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Leu Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly
595 600 605
Val Gln Gly Asp Ile Gly Pro Thr Gly Pro Gln Gly Val Gln Gly Pro
610 615 620
Gln Gly Ile Gln Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly Asp Gln Gly Pro Gln
625 630 635 640
Gly Ile Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Pro Thr Gly Pro Gln Gly
645 650 655
Ile Gln Gly Gly Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Ala Thr Gly Ala
660 665 670
Thr Gly Ala Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Ile Gln Gly Val Gln
675 680 685
Gly Pro Thr Gly Pro Gln Gly Pro Thr Gly Ile Gln Gly Val Gln Gly
690 695 700
Glu Ile Gly Pro Thr Gly Pro Gln Gly Val Gln Gly Leu Gln Gly Pro
705 710 715 720
Gln Gly Pro Thr Gly Asp Thr Gly Pro Thr Gly Pro Gln Gly Pro Gln
725 730 735
Gly Ile Gln Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ser Gln Gly
740 745 750
Ile Gln Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ser Gln Gly Ile
755 760 765
Gln Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr
770 775 780
Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly Val Ser Thr
785 790 795 800
Thr Ala Thr Tyr Ser Phe Ala Asn Asn Thr Ser Gly Ser Ala Ile Ser
805 810 815
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820 825 830
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835 840 845
Asn Ala Gly Asn Tyr Tyr Ile Ala Tyr Thr Ile Asn Ile Thr Ala Ala
850 855 860
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865 870 875 880
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885 890 895
Ile Ser Asn Leu Ala Ala Gly Ser Ala Ile Ser Leu Gln Leu Phe Gly
900 905 910
Leu Leu Ala Val Ala Thr Leu Ser Thr Thr Thr Pro Gly Ala Thr Leu
915 920 925
Thr Ile Ile Arg Leu Ser
930
<210> 29
<211> 39
<212> PRT
<213> 蕈状芽孢杆菌（Bacillus mycoides）
<400> 29
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1 5 10 15
Asn Ala Leu Asn Pro Asn Leu Ile Gly Pro Thr Leu Pro Pro Ile Pro
20 25 30
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35
<210> 30
<211> 287
<212> PRT
<213> 蕈状芽孢杆菌
<400> 30
Val Phe Asp Lys Asn Glu Ile Gln Lys Ile Asn Gly Ile Leu Gln Ala
1 5 10 15
Asn Ala Leu Asn Pro Asn Leu Ile Gly Pro Thr Leu Pro Pro Ile Pro
20 25 30
Pro Phe Thr Leu Pro Thr Gly Pro Thr Gly Gly Thr Gly Pro Thr Gly
35 40 45
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65 70 75 80
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165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Ser Ile Ala Ala Asp Phe Ser Val Glu Gln Thr Gly Leu Gly Ile Val
245 250 255
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260 265 270
Ser Thr Cys Lys Ile Thr Ala Val Asn Ile Thr Pro Ile Thr Met
275 280 285
<210> 31
<211> 30
<212> PRT
<213> 蕈状芽孢杆菌
<400> 31
Met Asp Glu Phe Leu Tyr Phe Ala Ala Leu Asn Pro Gly Ser Ile Gly
1 5 10 15
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20 25 30
<210> 32
<211> 190
<212> PRT
<213> 蕈状芽孢杆菌
<400> 32
Met Asp Glu Phe Leu Tyr Phe Ala Ala Leu Asn Pro Gly Ser Ile Gly
1 5 10 15
Pro Thr Leu Pro Pro Val Gln Pro Phe Gln Phe Pro Thr Gly Pro Thr
20 25 30
Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Ser Thr Gly Ser Thr Gly
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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180 185 190
<210> 33
<211> 21
<212> PRT
<213> 蕈状芽孢杆菌
<400> 33
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1 5 10 15
Asn Phe Pro Thr Gly
20
<210> 34
<211> 335
<212> PRT
<213> 蕈状芽孢杆菌
<400> 34
Met Asp Ser Lys Asn Ile Gly Pro Thr Phe Pro Pro Leu Pro Ser Ile
1 5 10 15
Asn Phe Pro Thr Gly Val Thr Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr
20 25 30
Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly
35 40 45
Glu Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Glu
50 55 60
Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Ala Gly Ala Thr
65 70 75 80
Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly
85 90 95
Ala Thr Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly Glu Thr Gly Ala
100 105 110
Thr Gly Glu Thr Gly Ala Ala Gly Glu Thr Gly Ile Thr Gly Val Thr
115 120 125
Gly Pro Thr Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly
130 135 140
Ala Thr Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly Ile Thr Gly Val Ala Gly Ala
145 150 155 160
Thr Gly Glu Thr Gly Ala Ala Gly Glu Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr
165 170 175
Gly Ala Ile Gly Ala Ile Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ile Thr Gly
180 185 190
Val Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Ala Ala Gly Ala Thr Gly Ile
195 200 205
Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Ala Ala Gly Ala Thr
210 215 220
Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly Ile Thr Gly Val Ala Gly Ala Thr Gly
225 230 235 240
Ile Thr Gly Pro Thr Gly Ile Pro Gly Thr Ile Pro Thr Thr Asn Leu
245 250 255
Leu Tyr Phe Thr Phe Ser Asp Gly Glu Lys Leu Ile Tyr Thr Asn Ala
260 265 270
Asp Gly Ile Ala Gln Tyr Gly Thr Thr Gln Ile Leu Ser Pro Ser Glu
275 280 285
Val Ser Tyr Ile Asn Leu Phe Ile Asn Gly Ile Leu Gln Pro Gln Pro
290 295 300
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305 310 315 320
Pro Ser Gln Gly Ser Ser Ile Ile Leu Gln Phe Ile Ile Ile Asn
325 330 335
<210> 35
<211> 22
<212> PRT
<213> 苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）
<400> 35
Met Ile Gly Pro Glu Asn Ile Gly Pro Thr Phe Pro Ile Leu Pro Pro
1 5 10 15
Ile Tyr Ile Pro Thr Gly
20
<210> 36
<211> 234
<212> PRT
<213> 苏云金芽孢杆菌
<400> 36
Met Ile Gly Pro Glu Asn Ile Gly Pro Thr Phe Pro Ile Leu Pro Pro
1 5 10 15
Ile Tyr Ile Pro Thr Gly Glu Thr Gly Pro Thr Gly Ile Thr Gly Ala
20 25 30
Thr Gly Glu Thr Gly Pro Thr Gly Ile Thr Gly Pro Thr Gly Ile Thr
35 40 45
Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Ser Thr Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly
50 55 60
Glu Thr Gly Ser Thr Gly Ile Thr Gly Pro Ile Gly Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Thr Gly Glu Thr Gly Pro Ile Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr
85 90 95
Gly Pro Thr Gly Ile Thr Gly Ser Thr Gly Ile Thr Gly Leu Thr Gly
100 105 110
Val Thr Gly Leu Thr Gly Glu Thr Gly Pro Ile Gly Ile Thr Gly Pro
115 120 125
Thr Gly Ile Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr
130 135 140
Gly Gly Ile Gly Pro Ile Thr Thr Thr Asn Leu Leu Tyr Tyr Thr Phe
145 150 155 160
Ala Asp Gly Glu Lys Leu Ile Tyr Thr Asp Thr Asp Gly Ile Pro Gln
165 170 175
Tyr Gly Thr Thr Asn Ile Leu Ser Pro Ser Glu Val Ser Tyr Ile Asn
180 185 190
Leu Phe Val Asn Gly Ile Leu Gln Pro Gln Pro Leu Tyr Glu Val Ser
195 200 205
Thr Gly Lys Leu Thr Leu Leu Asp Thr Gln Pro Pro Ser Gln Gly Ser
210 215 220
Ser Ile Ile Leu Gln Phe Ile Ile Ile Asn
225 230
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 37
ggatccatgg ctgaacacaa tcc 23
<210> 38
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 38
ggatccttaa ttcgtattct ggcc 24
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 39
ggatccatga aacggtcaat c 21
<210> 40
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 40
ggatccttac taatttggtt ctgt 24
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 41
ggatccatgc taccaaaagc c 21
<210> 42
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<213> 蜡状芽孢杆菌
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<213> 蜡状芽孢杆菌
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<213> 蜡状芽孢杆菌
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<213> 蜡状芽孢杆菌
<400> 46
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<213> 蜡状芽孢杆菌
<400> 47
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Gly
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<213> 蜡状芽孢杆菌
<400> 48
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<213> 蜡状芽孢杆菌
<400> 49
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<213> 蜡状芽孢杆菌
<400> 50
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<213> 蜡状芽孢杆菌
<400> 51
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<212> PRT
<213> 蜡状芽孢杆菌
<400> 52
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<213> 蜡状芽孢杆菌
<400> 53
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<212> PRT
<213> 蜡状芽孢杆菌
<400> 54
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Gly Gly Pro Ser Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Asn Thr
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<212> PRT
<213> 苏云金芽孢杆菌
<400> 55
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<212> PRT
<213> 苏云金芽孢杆菌
<400> 56
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<212> PRT
<213> 蕈状芽孢杆菌
<400> 57
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<211> 384
<212> PRT
<213> 蕈状芽孢杆菌
<400> 58
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Arg Val Val Ser Lys Val Asn Ile Leu Arg Phe Tyr Asp Ala Arg Ser
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Cys Gln Asp Lys Asp Val Asp Gly Phe Val Asp Val Gly Glu Leu Phe
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260 265 270
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Leu Leu Asp Ala Phe Ile Gly Ser Thr Val Ser Leu Leu Ala Ser Asn
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340 345 350
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355 360 365
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<211> 196
<212> PRT
<213> 炭疽芽孢杆菌
<400> 59
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Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Asp Thr Gly Thr Thr Gly Pro
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Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr
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Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Phe Thr Pro Thr Gly Pro
100 105 110
Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Asp Thr Gly Thr Thr Gly Pro Thr
115 120 125
Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Asp Thr Gly
130 135 140
Thr Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro
145 150 155 160
Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Phe Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly
165 170 175
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180 185 190
Ser Gly Leu Gly
195
<210> 60
<211> 17
<212> PRT
<213> 炭疽芽孢杆菌
<400> 60
Met Ala Phe Asp Pro Asn Leu Val Gly Pro Thr Leu Pro Pro Ile Pro
1 5 10 15
Pro
<210> 61
<211> 17
<212> PRT
<213> 炭疽芽孢杆菌
<400> 61
Met Ala Leu Glu Pro Asn Leu Ile Gly Pro Thr Leu Pro Pro Ile Pro
1 5 10 15
Pro
<210> 62
<211> 17
<212> PRT
<213> 韦氏芽孢杆菌
<400> 62
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1 5 10 15
Pro
<210> 63
<211> 17
<212> PRT
<213> 韦氏芽孢杆菌
<400> 63
Met Ala Leu Asp Pro Asn Ile Ile Gly Pro Thr Leu Pro Pro Ile Pro
1 5 10 15
Pro
<210> 64
<211> 17
<212> PRT
<213> 蜡状芽孢杆菌
<400> 64
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1 5 10 15
Pro
<210> 65
<211> 17
<212> PRT
<213> 韦氏芽孢杆菌
<400> 65
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Pro
<210> 66
<211> 17
<212> PRT
<213> 韦氏芽孢杆菌
<400> 66
Met Ala Leu Asn Pro Gly Ser Ile Gly Pro Thr Leu Pro Pro Val Pro
1 5 10 15
Pro
<210> 67
<211> 17
<212> PRT
<213> 韦氏芽孢杆菌
<400> 67
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1 5 10 15
Pro
<210> 68
<211> 17
<212> PRT
<213> 蕈状芽孢杆菌
<400> 68
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Pro
<210> 69
<211> 17
<212> PRT
<213> 炭疽芽孢杆菌
<400> 69
Met Ala Leu Asn Pro Gly Ser Val Gly Pro Thr Leu Pro Pro Met Gln
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Pro
<210> 70
<211> 17
<212> PRT
<213> 蜡状芽孢杆菌
<400> 70
Met Ala Leu Asp Pro Asn Leu Ile Gly Pro Thr Phe Pro Pro Ile Pro
1 5 10 15
Ser
<210> 71
<211> 799
<212> PRT
<213> 蕈状芽孢杆菌
<400> 71
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Gly Lys Val Pro Thr Ser Pro Ala Lys Gln Ala Pro Tyr Asn Gly Ala
145 150 155 160
Val Arg Thr Asp Lys Val Leu Val Leu Leu Val Glu Phe Ser Asp Tyr
165 170 175
Lys His Asn Asn Ile Glu Gln Ser Pro Gly Tyr Met Tyr Ala Asn Asp
180 185 190
Phe Ser Arg Glu His Tyr Gln Lys Met Leu Phe Gly Asn Glu Pro Phe
195 200 205
Thr Leu Phe Asp Gly Ser Lys Val Lys Thr Phe Lys Gln Tyr Tyr Glu
210 215 220
Glu Gln Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Thr Asp Gly Tyr Val Thr Glu Trp
225 230 235 240
Leu Thr Val Pro Gly Lys Ala Ala Asp Tyr Gly Ala Asp Gly Lys Thr
245 250 255
Gly His Asp Asn Lys Gly Pro Lys Gly Ala Arg Asp Leu Val Lys Glu
260 265 270
Ala Leu Lys Ala Ala Ala Glu Lys Gly Leu Asp Leu Ser Gln Phe Asp
275 280 285
Gln Phe Asp Arg Tyr Asp Thr Asn Gly Asp Gly Asn Gln Asn Glu Pro
290 295 300
Asp Gly Val Ile Asp His Leu Met Val Ile His Ala Gly Val Gly Gln
305 310 315 320
Glu Ala Gly Gly Gly Lys Leu Gly Asp Asp Ala Ile Trp Ser His Arg
325 330 335
Ser Lys Leu Ala Gln Asp Pro Val Ala Ile Glu Gly Thr Lys Ser Lys
340 345 350
Val Ser Tyr Trp Asp Gly Lys Val Ala Ala His Asp Tyr Thr Ile Glu
355 360 365
Pro Glu Asp Gly Ala Val Gly Val Phe Ala His Glu Phe Gly His Asp
370 375 380
Leu Gly Leu Pro Asp Glu Tyr Asp Thr Asn Tyr Thr Gly Ala Gly Ser
385 390 395 400
Pro Val Glu Ala Trp Ser Leu Met Ser Gly Gly Ser Trp Thr Gly Arg
405 410 415
Ile Ala Gly Thr Glu Pro Thr Ser Phe Ser Pro Gln Asn Lys Asp Phe
420 425 430
Leu Gln Lys Asn Met Asp Gly Asn Trp Ala Lys Ile Val Glu Val Asp
435 440 445
Tyr Asp Lys Ile Lys Arg Gly Val Gly Phe Pro Thr Tyr Ile Asp Gln
450 455 460
Ser Val Thr Lys Ser Asn Arg Pro Gly Leu Val Arg Val Asn Leu Pro
465 470 475 480
Glu Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Thr Gly Phe Gly Lys His Ala Tyr
485 490 495
Tyr Ser Thr Arg Gly Asp Asp Met His Thr Thr Leu Glu Thr Pro Leu
500 505 510
Phe Asp Leu Thr Lys Ala Ala Asn Ala Lys Phe Asp Tyr Lys Ala Asn
515 520 525
Tyr Glu Leu Glu Ala Glu Cys Asp Phe Ile Glu Val His Ala Val Thr
530 535 540
Glu Asp Gly Thr Lys Thr Leu Ile Asp Lys Leu Gly Asp Lys Val Val
545 550 555 560
Lys Gly Asp Gln Asp Thr Thr Glu Gly Lys Trp Ile Asp Lys Ser Tyr
565 570 575
Asp Leu Ser Gln Phe Lys Gly Lys Lys Val Lys Leu Gln Phe Asp Tyr
580 585 590
Ile Thr Asp Pro Ala Leu Thr Tyr Lys Gly Phe Ala Met Asp Asn Val
595 600 605
Asn Val Thr Val Asp Gly Lys Val Val Phe Ser Asp Asp Ala Glu Gly
610 615 620
Gln Ala Lys Met Lys Leu Asn Gly Phe Val Val Ser Asp Gly Thr Glu
625 630 635 640
Lys Lys Pro His Tyr Tyr Tyr Leu Glu Trp Arg Asn Tyr Ala Gly Ser
645 650 655
Asp Glu Gly Leu Lys Val Gly Arg Gly Pro Val Tyr Asn Thr Gly Leu
660 665 670
Val Val Trp Tyr Ala Asp Asp Ser Phe Lys Asp Asn Trp Val Gly Arg
675 680 685
His Pro Gly Glu Gly Phe Leu Gly Val Val Asp Ser His Pro Glu Ala
690 695 700
Val Val Gly Asn Leu Asn Gly Lys Pro Val Tyr Gly Asn Thr Gly Leu
705 710 715 720
Gln Ile Ala Asp Ala Ala Phe Ser Leu Asp Gln Thr Pro Ala Trp Asn
725 730 735
Val Asn Ser Phe Thr Arg Gly Gln Phe Asn Tyr Pro Gly Leu Pro Gly
740 745 750
Val Ala Thr Phe Asp Asp Ser Lys Val Tyr Ser Asn Thr Gln Ile Pro
755 760 765
Asp Ala Gly Arg Lys Val Pro Gln Leu Gly Leu Lys Phe Gln Val Val
770 775 780
Gly Gln Ala Asp Asp Lys Ser Ala Gly Ala Ile Trp Ile Arg Arg
785 790 795
<210> 72
<211> 152
<212> PRT
<213> 炭疽芽孢杆菌
<400> 72
Met Ser Cys Asn Glu Asn Lys His His Gly Ser Ser His Cys Val Val
1 5 10 15
Asp Val Val Lys Phe Ile Asn Glu Leu Gln Asp Cys Ser Thr Thr Thr
20 25 30
Cys Gly Ser Gly Cys Glu Ile Pro Phe Leu Gly Ala His Asn Thr Ala
35 40 45
Ser Val Ala Asn Thr Arg Pro Phe Ile Leu Tyr Thr Lys Ala Gly Ala
50 55 60
Pro Phe Glu Ala Phe Ala Pro Ser Ala Asn Leu Thr Ser Cys Arg Ser
65 70 75 80
Pro Ile Phe Arg Val Glu Ser Val Asp Asp Asp Ser Cys Ala Val Leu
85 90 95
Arg Val Leu Ser Val Val Leu Gly Asp Ser Ser Pro Val Pro Pro Thr
100 105 110
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115 120 125
Ser Thr Ser Thr Cys Ile Thr Val Asp Leu Ser Cys Phe Cys Ala Ile
130 135 140
Gln Cys Leu Arg Asp Val Thr Ile
145 150
<210> 73
<211> 167
<212> PRT
<213> 炭疽芽孢杆菌
<400> 73
Met Phe Ser Ser Asp Cys Glu Phe Thr Lys Ile Asp Cys Glu Ala Lys
1 5 10 15
Pro Ala Ser Thr Leu Pro Ala Phe Gly Phe Ala Phe Asn Ala Ser Ala
20 25 30
Pro Gln Phe Ala Ser Leu Phe Thr Pro Leu Leu Leu Pro Ser Val Ser
35 40 45
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50 55 60
Gly Asp Gly Ile Arg Ile Leu Arg Ala Gly Ile Tyr Gln Ile Ser Tyr
65 70 75 80
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85 90 95
Arg Phe Phe Leu Ser Leu Gly Thr Pro Ala Asn Ile Ile Pro Gly Ser
100 105 110
Gly Thr Ala Val Arg Ser Asn Val Ile Gly Thr Gly Glu Val Asp Val
115 120 125
Ser Ser Gly Val Ile Leu Ile Asn Leu Asn Pro Gly Asp Leu Ile Arg
130 135 140
Ile Val Pro Val Glu Leu Ile Gly Thr Val Asp Ile Arg Ala Ala Ala
145 150 155 160
Leu Thr Val Ala Gln Ile Ser
165
<210> 74
<211> 156
<212> PRT
<213> 炭疽芽孢杆菌
<400> 74
Met Ser Cys Asn Cys Asn Glu Asp His His His His Asp Cys Asp Phe
1 5 10 15
Asn Cys Val Ser Asn Val Val Arg Phe Ile His Glu Leu Gln Glu Cys
20 25 30
Ala Thr Thr Thr Cys Gly Ser Gly Cys Glu Val Pro Phe Leu Gly Ala
35 40 45
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50 55 60
Lys Ala Gly Ala Pro Phe Glu Ala Phe Ala Pro Ser Ala Asn Leu Thr
65 70 75 80
Ser Cys Arg Ser Pro Ile Phe Arg Val Glu Ser Ile Asp Asp Asp Asp
85 90 95
Cys Ala Val Leu Arg Val Leu Ser Val Val Leu Gly Asp Thr Ser Pro
100 105 110
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115 120 125
Ala Arg Leu Ile Ser Thr Asn Thr Cys Leu Thr Val Asp Leu Ser Cys
130 135 140
Phe Cys Ala Ile Gln Cys Leu Arg Asp Val Thr Ile
145 150 155
<210> 75
<211> 182
<212> PRT
<213> 炭疽芽孢杆菌
<400> 75
Met Glu Val Gly Gly Thr Ser Val Lys Asn Lys Asn Lys Ser Ser Thr
1 5 10 15
Val Gly Lys Pro Leu Leu Tyr Ile Ala Gln Val Ser Leu Glu Leu Ala
20 25 30
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35 40 45
Arg Lys Glu Glu Ser Asn Arg Asn Glu Asn Val Val Ser Ser Ala Val
50 55 60
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130 135 140
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Pro Asn Ser Met Arg Asp Ile Arg Leu Ser Ile Glu Glu Ile Lys Ser
165 170 175
Ile Asp Met Ala Gly Phe
180
<210> 76
<211> 174
<212> PRT
<213> 炭疽芽孢杆菌
<400> 76
Met Lys Glu Arg Ser Glu Asn Met Arg Ser Ser Ser Arg Lys Leu Thr
1 5 10 15
Asn Phe Asn Cys Arg Ala Gln Ala Pro Ser Thr Leu Pro Ala Leu Gly
20 25 30
Phe Ala Phe Asn Ala Thr Ser Pro Gln Phe Ala Thr Leu Phe Thr Pro
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Pro Val Thr Pro Glu Ala Ala Arg Phe Phe Leu Thr Leu Asn Ser Ser
100 105 110
Thr Asn Ile Ile Ala Gly Ser Gly Thr Ala Val Arg Ser Asn Ile Ile
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Val Asp Ile Arg Ser Ala Ala Leu Thr Val Ala Gln Ile Arg
165 170
<210> 77
<211> 796
<212> PRT
<213> 苏云金芽孢杆菌
<400> 77
Met Ser Lys Lys Pro Phe Lys Val Leu Ser Ser Ile Ala Leu Thr Ala
1 5 10 15
Val Leu Gly Leu Ser Phe Gly Ala Gly Thr Gln Ser Ala Tyr Ala Glu
20 25 30
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35 40 45
Pro Glu Glu Arg Leu Ala Asp Ala Leu Lys Lys Arg Gly Val Ile Asp
50 55 60
Ser Lys Ala Ser Glu Thr Glu Thr Lys Lys Ala Val Glu Lys Tyr Val
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Lys Ala Asp Thr Lys Glu Lys Leu Asn Gln Pro Ala Thr Gly Thr Pro
115 120 125
Ala Ala Thr Gly Pro Val Lys Gly Gly Leu Asn Gly Lys Val Pro Thr
130 135 140
Ser Pro Ala Lys Gln Lys Asp Tyr Asn Gly Glu Val Arg Lys Asp Lys
145 150 155 160
Val Leu Val Leu Leu Val Glu Tyr Ala Asp Phe Lys His Asn Asn Ile
165 170 175
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180 185 190
Tyr Glu Lys Met Leu Phe Gly Asn Glu Pro Phe Thr Leu Asp Asp Gly
195 200 205
Ser Lys Ile Glu Thr Phe Lys Gln Tyr Tyr Glu Glu Gln Ser Gly Gly
210 215 220
Ser Tyr Thr Val Asp Gly Thr Val Thr Lys Trp Leu Thr Val Pro Gly
225 230 235 240
Lys Ala Ala Asp Tyr Gly Ala Asp Ala Pro Gly Gly Gly His Asp Asn
245 250 255
Lys Gly Pro Lys Gly Pro Arg Asp Leu Val Lys Asp Ala Leu Lys Ala
260 265 270
Ala Val Asp Ser Gly Ile Asp Leu Ser Glu Phe Asp Gln Phe Asp Gln
275 280 285
Tyr Asp Val Asn Gly Asp Gly Asn Lys Asn Gln Pro Asp Gly Leu Ile
290 295 300
Asp His Leu Met Ile Ile His Ala Gly Val Gly Gln Glu Ala Gly Gly
305 310 315 320
Gly Lys Leu Gly Asp Asp Ala Ile Trp Ser His Arg Trp Thr Val Gly
325 330 335
Pro Lys Pro Phe Pro Ile Glu Gly Thr Gln Ala Lys Val Pro Tyr Trp
340 345 350
Gly Gly Lys Met Ala Ala Phe Asp Tyr Thr Ile Glu Pro Glu Asp Gly
355 360 365
Ala Val Gly Val Phe Ala His Glu Tyr Gly His Asp Leu Gly Leu Pro
370 375 380
Asp Glu Tyr Asp Thr Gln Tyr Ser Gly Gln Gly Glu Pro Ile Glu Ala
385 390 395 400
Trp Ser Ile Met Ser Gly Gly Ser Trp Ala Gly Lys Ile Ala Gly Thr
405 410 415
Thr Pro Thr Ser Phe Ser Pro Gln Asn Lys Glu Phe Phe Gln Lys Thr
420 425 430
Ile Gly Gly Asn Trp Ala Asn Ile Val Glu Val Asp Tyr Glu Lys Leu
435 440 445
Asn Lys Gly Ile Gly Leu Ala Thr Tyr Leu Asp Gln Ser Val Thr Lys
450 455 460
Ser Ala Arg Pro Gly Met Ile Arg Val Asn Leu Pro Asp Lys Asp Val
465 470 475 480
Lys Thr Ile Glu Pro Ala Phe Gly Lys Gln Tyr Tyr Tyr Ser Thr Lys
485 490 495
Gly Asp Asp Leu His Thr Lys Met Glu Thr Pro Leu Phe Asp Leu Thr
500 505 510
Asn Ala Thr Ser Ala Lys Phe Asp Phe Lys Ser Leu Tyr Glu Ile Glu
515 520 525
Ala Gly Tyr Asp Phe Leu Glu Val His Ala Val Thr Glu Asp Gly Lys
530 535 540
Gln Thr Leu Ile Glu Arg Leu Gly Glu Lys Ala Asn Ser Gly Asn Ala
545 550 555 560
Asp Ser Thr Asn Gly Lys Trp Ile Asp Lys Ser Tyr Asp Leu Ser Gln
565 570 575
Phe Lys Gly Lys Lys Val Lys Leu Thr Phe Asp Tyr Ile Thr Asp Gly
580 585 590
Gly Leu Ala Leu Asn Gly Phe Ala Leu Asp Asn Ala Ser Leu Thr Val
595 600 605
Asp Gly Lys Val Val Phe Ser Asp Asp Ala Glu Gly Thr Pro Gln Leu
610 615 620
Lys Leu Asp Gly Phe Val Val Ser Asn Gly Thr Glu Lys Lys Lys His
625 630 635 640
Asn Tyr Tyr Val Glu Trp Arg Asn Tyr Ala Gly Ala Asp Asn Ala Leu
645 650 655
Lys Phe Ala Arg Gly Pro Val Phe Asn Thr Gly Met Val Val Trp Tyr
660 665 670
Ala Asp Ser Ala Tyr Thr Asp Asn Trp Val Gly Val His Pro Gly His
675 680 685
Gly Phe Leu Gly Val Val Asp Ser His Pro Glu Ala Ile Val Gly Thr
690 695 700
Leu Asn Gly Lys Pro Thr Val Lys Ser Ser Thr Arg Phe Gln Ile Ala
705 710 715 720
Asp Ala Ala Phe Ser Phe Asp Lys Thr Pro Ala Trp Lys Val Val Ser
725 730 735
Pro Thr Arg Gly Thr Phe Thr Tyr Asp Gly Leu Ala Gly Val Pro Lys
740 745 750
Phe Asp Asp Ser Lys Thr Tyr Ile Asn Gln Gln Ile Pro Asp Ala Gly
755 760 765
Arg Ile Leu Pro Lys Leu Gly Leu Lys Phe Glu Val Val Gly Gln Ala
770 775 780
Asp Asp Asn Ser Ala Gly Ala Val Arg Leu Tyr Arg
785 790 795
<210> 78
<211> 430
<212> PRT
<213> 蜡状芽孢杆菌
<400> 78
Met Lys His Asn Asp Cys Phe Asp His Asn Asn Cys Asn Pro Ile Val
1 5 10 15
Phe Ser Ala Asp Cys Cys Lys Asn Pro Gln Ser Val Pro Ile Thr Arg
20 25 30
Glu Gln Leu Ser Gln Leu Ile Thr Leu Leu Asn Ser Leu Val Ser Ala
35 40 45
Ile Ser Ala Phe Phe Ala Asn Pro Ser Asn Ala Asn Arg Leu Val Leu
50 55 60
Leu Asp Leu Phe Asn Gln Phe Leu Ile Phe Leu Asn Ser Leu Leu Pro
65 70 75 80
Ser Pro Glu Val Asn Phe Leu Lys Gln Leu Thr Gln Ser Ile Ile Val
85 90 95
Leu Leu Gln Ser Pro Ala Pro Asn Leu Gly Gln Leu Ser Thr Leu Leu
100 105 110
Gln Gln Phe Tyr Ser Ala Leu Ala Gln Phe Phe Phe Ala Leu Asp Leu
115 120 125
Ile Pro Ile Ser Cys Asn Ser Asn Val Asp Ser Ala Thr Leu Gln Leu
130 135 140
Leu Phe Asn Leu Leu Ile Gln Leu Ile Asn Ala Thr Pro Gly Ala Thr
145 150 155 160
Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Ala Gly
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr
210 215 220
Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly
225 230 235 240
Ala Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala
245 250 255
Thr Gly Leu Thr Gly Ala Thr Gly Ala Ala Gly Gly Gly Ala Ile Ile
260 265 270
Pro Phe Ala Ser Gly Thr Thr Pro Ser Ala Leu Val Asn Ala Leu Val
275 280 285
Ala Asn Thr Gly Thr Leu Leu Gly Phe Gly Phe Ser Gln Pro Gly Val
290 295 300
Ala Leu Thr Gly Gly Thr Ser Ile Thr Leu Ala Leu Gly Val Gly Asp
305 310 315 320
Tyr Ala Phe Val Ala Pro Arg Ala Gly Thr Ile Thr Ser Leu Ala Gly
325 330 335
Phe Phe Ser Ala Thr Ala Ala Leu Ala Pro Ile Ser Pro Val Gln Val
340 345 350
Gln Ile Gln Ile Leu Thr Ala Pro Ala Ala Ser Asn Thr Phe Thr Val
355 360 365
Gln Gly Ala Pro Leu Leu Leu Thr Pro Ala Phe Ala Ala Ile Ala Ile
370 375 380
Gly Ser Thr Ala Ser Gly Ile Ile Ala Glu Ala Ile Pro Val Ala Ala
385 390 395 400
Gly Asp Lys Ile Leu Leu Tyr Val Ser Leu Thr Ala Ala Ser Pro Ile
405 410 415
Ala Ala Val Ala Gly Phe Val Ser Ala Gly Ile Asn Ile Val
420 425 430
<210> 79
<211> 437
<212> PRT
<213> 蜡状芽孢杆菌
<400> 79
Met Lys His Asn Asp Cys Phe Gly His Asn Asn Cys Asn Asn Pro Ile
1 5 10 15
Val Phe Thr Pro Asp Cys Cys Asn Asn Pro Gln Thr Val Pro Ile Thr
20 25 30
Ser Glu Gln Leu Gly Arg Leu Ile Thr Leu Leu Asn Ser Leu Ile Ala
35 40 45
Ala Ile Ala Ala Phe Phe Ala Asn Pro Ser Asp Ala Asn Arg Leu Ala
50 55 60
Leu Leu Asn Leu Phe Thr Gln Leu Leu Asn Leu Leu Asn Glu Leu Ala
65 70 75 80
Pro Ser Pro Glu Gly Asn Phe Leu Lys Gln Leu Ile Gln Ser Ile Ile
85 90 95
Asn Leu Leu Gln Ser Pro Asn Pro Asn Leu Gly Gln Leu Leu Ser Leu
100 105 110
Leu Gln Gln Phe Tyr Ser Ala Leu Ala Pro Phe Phe Phe Ser Leu Ile
115 120 125
Leu Asp Pro Ala Ser Leu Gln Leu Leu Leu Asn Leu Leu Ala Gln Leu
130 135 140
Ile Gly Val Thr Pro Gly Gly Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr
145 150 155 160
Gly Pro Gly Gly Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Gly
165 170 175
Gly Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Asp Thr
180 185 190
Gly Leu Ala Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Asp Thr Gly
195 200 205
Val Ala Gly Pro Ala Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Asp Thr Gly Leu
210 215 220
Ala Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Asp Thr Gly Leu Ala
225 230 235 240
Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Leu Ala Gly Ala Thr Gly
245 250 255
Pro Thr Gly Ala Thr Gly Leu Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala
260 265 270
Ala Gly Gly Gly Ala Ile Ile Pro Phe Ala Ser Gly Thr Thr Pro Ala
275 280 285
Ala Leu Val Asn Ala Leu Ile Ala Asn Thr Gly Thr Leu Leu Gly Phe
290 295 300
Gly Phe Ser Gln Pro Gly Ile Gly Leu Ala Gly Gly Thr Ser Ile Thr
305 310 315 320
Leu Ala Leu Gly Val Gly Asp Tyr Ala Phe Val Ala Pro Arg Asp Gly
325 330 335
Val Ile Thr Ser Leu Ala Gly Phe Phe Ser Ala Thr Ala Ala Leu Ser
340 345 350
Pro Leu Ser Pro Val Gln Val Gln Ile Gln Ile Leu Thr Ala Pro Ala
355 360 365
Ala Ser Asn Thr Phe Thr Val Gln Gly Ala Pro Leu Leu Leu Thr Pro
370 375 380
Ala Phe Ala Ala Ile Ala Ile Gly Ser Thr Ala Ser Gly Ile Ile Pro
385 390 395 400
Glu Ala Ile Pro Val Val Ala Gly Asp Lys Ile Leu Leu Tyr Val Ser
405 410 415
Leu Thr Ala Ala Ser Pro Ile Ala Ala Val Ala Gly Phe Val Ser Ala
420 425 430
Gly Ile Asn Ile Val
435
<210> 80
<211> 119
<212> PRT
<213> 炭疽芽孢杆菌
<400> 80
Met Leu Phe Thr Ser Trp Leu Leu Phe Phe Ile Phe Ala Leu Ala Ala
1 5 10 15
Phe Arg Leu Thr Arg Leu Ile Val Tyr Asp Lys Ile Thr Gly Phe Leu
20 25 30
Arg Arg Pro Phe Ile Asp Glu Leu Glu Ile Thr Glu Pro Asp Gly Ser
35 40 45
Val Ser Thr Phe Thr Lys Val Lys Gly Lys Gly Leu Arg Lys Trp Ile
50 55 60
Gly Glu Leu Leu Ser Cys Tyr Trp Cys Thr Gly Val Trp Val Ser Ala
65 70 75 80
Phe Leu Leu Val Leu Tyr Asn Trp Ile Pro Ile Val Ala Glu Pro Leu
85 90 95
Leu Ala Leu Leu Ala Ile Ala Gly Ala Ala Ala Ile Ile Glu Thr Ile
100 105 110
Thr Gly Tyr Phe Met Gly Glu
115
<210> 81
<211> 61
<212> PRT
<213> 炭疽芽孢杆菌
<400> 81
Met Phe Ala Val Ser Asn Asn Pro Arg Gln Asn Ser Tyr Asp Leu Gln
1 5 10 15
Gln Trp Tyr His Met Gln Gln Gln His Gln Ala Gln Gln Gln Ala Tyr
20 25 30
Gln Glu Gln Leu Gln Gln Gln Gly Phe Val Lys Lys Lys Gly Cys Asn
35 40 45
Cys Gly Lys Lys Lys Ser Thr Ile Lys His Tyr Glu Glu
50 55 60
<210> 82
<211> 481
<212> PRT
<213> 炭疽芽孢杆菌
<400> 82
Met Ser Arg Tyr Asp Asp Ser Gln Asn Lys Phe Ser Lys Pro Cys Phe
1 5 10 15
Pro Ser Ser Ala Gly Arg Ile Pro Asn Thr Pro Ser Ile Pro Val Thr
20 25 30
Lys Ala Gln Leu Arg Thr Phe Arg Ala Ile Ile Ile Asp Leu Thr Lys
35 40 45
Ile Ile Pro Lys Leu Phe Ala Asn Pro Ser Pro Gln Asn Ile Glu Asp
50 55 60
Leu Ile Asp Thr Leu Asn Leu Leu Ser Lys Phe Ile Cys Ser Leu Asp
65 70 75 80
Ala Ala Ser Ser Leu Lys Ala Gln Gly Leu Ala Ile Ile Lys Asn Leu
85 90 95
Ile Thr Ile Leu Lys Asn Pro Thr Phe Val Ala Ser Ala Val Phe Ile
100 105 110
Glu Leu Gln Asn Leu Ile Asn Tyr Leu Leu Ser Ile Thr Lys Leu Phe
115 120 125
Arg Ile Asp Pro Cys Thr Leu Gln Glu Leu Leu Lys Leu Ile Ala Ala
130 135 140
Leu Gln Thr Ala Leu Val Asn Ser Ala Ser Phe Ile Gln Gly Pro Thr
145 150 155 160
Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Ala Gly Ala Thr Gly
165 170 175
Ala Thr Gly Pro Gln Gly Val Gln Gly Pro Ala Gly Ala Thr Gly Ala
180 185 190
Thr Gly Pro Gln Gly Val Gln Gly Pro Ala Gly Ala Thr Gly Ala Thr
195 200 205
Gly Pro Gln Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly
210 215 220
Pro Gln Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Pro
225 230 235 240
Gln Gly Ile Gln Gly Pro Ala Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Pro Gln
245 250 255
Gly Val Gln Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ile Gly Val Thr Gly Pro
260 265 270
Thr Gly Pro Ser Gly Gly Pro Ala Gly Ala Thr Gly Pro Gln Gly Pro
275 280 285
Gln Gly Asn Thr Gly Ala Thr Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Pro Ala
290 295 300
Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Pro Gln Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly
305 310 315 320
Ala Thr Gly Ala Thr Gly Pro Gln Gly Val Gln Gly Pro Thr Gly Ala
325 330 335
Thr Gly Ile Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Pro Ser Gly Pro Ser Phe
340 345 350
Pro Val Ala Thr Ile Val Val Thr Asn Asn Ile Gln Gln Thr Val Leu
355 360 365
Gln Phe Asn Asn Phe Ile Phe Asn Thr Ala Ile Asn Val Asn Asn Ile
370 375 380
Ile Phe Asn Gly Thr Asp Thr Val Thr Val Ile Asn Ala Gly Ile Tyr
385 390 395 400
Val Ile Ser Val Ser Ile Ser Thr Thr Ala Pro Gly Cys Ala Pro Leu
405 410 415
Gly Val Gly Ile Ser Ile Asn Gly Ala Val Ala Thr Asp Asn Phe Ser
420 425 430
Ser Asn Leu Ile Gly Asp Ser Leu Ser Phe Thr Thr Ile Glu Thr Leu
435 440 445
Thr Ala Gly Ala Asn Ile Ser Val Gln Ser Thr Leu Asn Glu Ile Thr
450 455 460
Ile Pro Ala Thr Gly Asn Thr Asn Ile Arg Leu Thr Val Phe Arg Ile
465 470 475 480
Ala
<210> 83
<211> 275
<212> PRT
<213> 苏云金芽孢杆菌
<400> 83
Met Lys Met Lys Arg Gly Ile Thr Thr Leu Leu Ser Val Ala Val Leu
1 5 10 15
Ser Thr Ser Leu Val Ala Cys Ser Gly Ile Thr Glu Lys Thr Val Ala
20 25 30
Lys Glu Glu Lys Val Lys Leu Thr Asp Gln Gln Leu Met Ala Asp Leu
35 40 45
Trp Tyr Gln Thr Ala Gly Glu Met Lys Ala Leu Tyr Tyr Gln Gly Tyr
50 55 60
Asn Ile Gly Gln Leu Lys Leu Asp Ala Val Leu Ala Lys Gly Thr Glu
65 70 75 80
Lys Lys Pro Ala Ile Val Leu Asp Leu Asp Glu Thr Val Leu Asp Asn
85 90 95
Ser Pro His Gln Ala Met Ser Val Lys Thr Gly Lys Gly Tyr Pro Tyr
100 105 110
Lys Trp Asp Asp Trp Ile Asn Lys Ala Glu Ala Glu Ala Leu Pro Gly
115 120 125
Ala Ile Asp Phe Leu Lys Tyr Thr Glu Ser Lys Gly Val Asp Ile Tyr
130 135 140
Tyr Ile Ser Asn Arg Lys Thr Asn Gln Leu Asp Ala Thr Ile Lys Asn
145 150 155 160
Leu Glu Arg Val Gly Ala Pro Gln Ala Thr Lys Glu His Ile Leu Leu
165 170 175
Gln Asp Pro Lys Glu Lys Gly Lys Glu Lys Arg Arg Glu Leu Val Ser
180 185 190
Gln Thr His Asp Ile Val Leu Phe Phe Gly Asp Asn Leu Ser Asp Phe
195 200 205
Thr Gly Phe Asp Gly Lys Ser Val Lys Asp Arg Asn Gln Ala Val Ala
210 215 220
Asp Ser Lys Ala Gln Phe Gly Glu Lys Phe Ile Ile Phe Pro Asn Pro
225 230 235 240
Met Tyr Gly Asp Trp Glu Gly Ala Leu Tyr Asp Tyr Asp Phe Lys Lys
245 250 255
Ser Asp Ala Glu Lys Asp Lys Ile Arg Arg Asp Asn Leu Lys Ser Phe
260 265 270
Asp Thr Lys
275
<210> 84
<211> 795
<212> PRT
<213> 苏云金芽孢杆菌
<400> 84
Met Lys Lys Lys Lys Lys Leu Lys Pro Leu Ala Val Leu Thr Thr Ala
1 5 10 15
Ala Val Leu Ser Ser Thr Phe Ala Phe Gly Gly His Ala Ala Tyr Ala
20 25 30
Glu Thr Pro Thr Ser Ser Leu Pro Ile Asp Glu His Leu Ile Pro Glu
35 40 45
Glu Arg Leu Ala Glu Ala Leu Lys Gln Arg Gly Val Ile Asp Gln Ser
50 55 60
Ala Ser Gln Ala Glu Thr Ser Lys Ala Val Glu Lys Tyr Val Glu Lys
65 70 75 80
Lys Lys Gly Glu Asn Pro Gly Lys Glu Ile Leu Thr Gly Asp Ser Leu
85 90 95
Thr Gln Glu Ala Ser Asp Phe Met Lys Lys Val Lys Asp Ala Lys Met
100 105 110
Arg Glu Asn Glu Gln Ala Gln Gln Pro Glu Val Gly Pro Val Ala Gly
115 120 125
Gln Gly Ala Ala Leu Asn Pro Gly Lys Leu Asn Gly Lys Val Pro Thr
130 135 140
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145 150 155 160
Val Leu Val Leu Leu Val Glu Phe Ser Asp Phe Lys His Asn Asn Ile
165 170 175
Asp Gln Glu Pro Gly Tyr Met Tyr Ser Lys Asp Phe Asn Arg Glu His
180 185 190
Tyr Gln Lys Met Leu Phe Gly Asp Glu Pro Phe Thr Leu Phe Asp Gly
195 200 205
Ser Lys Ile Asn Thr Phe Lys Gln Tyr Tyr Glu Glu Gln Ser Gly Gly
210 215 220
Ser Tyr Thr Val Asp Gly Thr Val Thr Glu Trp Leu Thr Val Pro Gly
225 230 235 240
Lys Ala Ser Asp Tyr Gly Ala Asp Ala Gly Thr Gly His Asp Asn Lys
245 250 255
Gly Pro Leu Gly Pro Lys Asp Leu Val Lys Glu Ala Leu Lys Ala Ala
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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Lys Leu Lys Asp Asp Ala Ile Trp Ser His Arg Ser Lys Leu Gly Ser
325 330 335
Lys Pro Tyr Ala Ile Asp Gly Thr Lys Ser Ser Val Ser Asn Trp Gly
340 345 350
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370 375 380
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450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
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Lys Tyr Asp Phe Leu Asp Val Tyr Ala Ile Ala Glu Asp Gly Thr Lys
530 535 540
Thr Arg Ile Asp Arg Met Gly Glu Lys Asp Ile Lys Gly Gly Ala Asp
545 550 555 560
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Tyr Ala Arg Gly Pro Val Phe Asn Thr Gly Met Val Val Trp Tyr Ala
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<210> 85
<211> 169
<212> DNA
<213> 炭疽芽孢杆菌
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taatcaccct cttccaaatc aatcatatgt tatacatata ctaaactttc cattttttta 60
aattgttcaa gtagtttaag atttcttttc aataattcaa atgtccgtgt cattttcttt 120
cggttttgca tctactatat aatgaacgct ttatggaggt gaatttatg 169
<210> 86
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<212> DNA
<213> 炭疽芽孢杆菌
<400> 86
atttatttca ttcaattttt cctatttagt acctaccgca ctcacaaaaa gcacctctca 60
ttaatttata ttatagtcat tgaaatctaa tttaatgaaa tcatcatact atatgtttta 120
taagaagtaa aggtaccata cttaattaat acatatctat acacttcaat atcacagcat 180
gcagttgaat tatatccaac tttcatttca aattaaataa gtgcctccgc tattgtgaat 240
gtcatttact ctccctacta catttaataa ttatgacaag caatcatagg aggttactac 300
atg 303
<210> 87
<211> 173
<212> DNA
<213> 炭疽芽孢杆菌
<400> 87
aattacataa caagaactac attagggagc aagcagtcta gcgaaagcta actgcttttt 60
tattaaataa ctattttatt aaatttcata tatacaatcg cttgtccatt tcatttggct 120
ctacccacgc atttactatt agtaatatga atttttcaga ggtggatttt att 173
<210> 88
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<212> DNA
<213> 韦氏芽孢杆菌
<400> 88
ctatgattta agatacacaa tagcaaaaga gaaacatatt atataacgat aaatgaaact 60
tatgtatatg tatggtaact gtatatatta ctacaataca gtatactcat aggaggtagg 120
tatg 124
<210> 89
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<212> DNA
<213> 韦氏芽孢杆菌
<400> 89
ggtaggtaga tttgaaatat gatgaagaaa aggaataact aaaaggagtc gatatccgac 60
tccttttagt tataaataat gtggaattag agtataattt tatataggta tattgtatta 120
gatgaacgct ttatccttta attgtgatta atgatggatt gtaagagaag gggcttacag 180
tccttttttt atggtgttct ataagccttt ttaaaagggg taccacccca cacccaaaaa 240
cagggggggt tataactaca tattggatgt tttgtaacgt acaagaatcg gtattaatta 300
ccctgtaaat aagttatgtg tatataaggt aactttatat attctcctac aataaaataa 360
aggaggtaat aaagtg 376
<210> 90
<211> 225
<212> DNA
<213> 苏云金芽孢杆菌
<400> 90
aacccttaat gcattggtta aacattgtaa agtctaaagc atggataatg ggcgagaagt 60
aagtagattg ttaacaccct gggtcaaaaa ttgatattta gtaaaattag ttgcactttg 120
tgcatttttt cataagatga gtcatatgtt ttaaattgta gtaatgaaaa acagtattat 180
atcataatga attggtatct taataaaaga gatggaggta actta 225
<210> 91
<211> 125
<212> DNA
<213> 苏云金芽孢杆菌
<400> 91
taattccacc ttcccttatc ctctttcgcc tatttaaaaa aaggtcttga gattgtgacc 60
aaatctcctc aactccaata tcttattaat gtaaatacaa acaagaagat aaggagtgac 120
attaa 125
<210> 92
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<212> DNA
<213> 苏云金芽孢杆菌
<400> 92
aggatgtctt tttttatatt gtattatgta catccctact atataaattc cctgctttta 60
tcgtaagaat taacgtaata tcaaccatat cccgttcata ttgtagtagt gtatgtcaga 120
actcacgaga aggagtgaac ataa 144
<210> 93
<211> 126
<212> DNA
<213> 苏云金芽孢杆菌
<400> 93
ttaatgtcac tccttatctt cttgtttgta tttacattaa taagatattg gagttgagga 60
gatttggtca caatctcaag accttttttt taaataggcg aaagaggata agggaaggtg 120
gaatta 126
<210> 94
<211> 103
<212> DNA
<213> 苏云金芽孢杆菌
<400> 94
atatattttc ataatacgag aaaaagcgga gtttaaaaga atgagggaac ggaaataaag 60
agttgttcat atagtaaata gacagaattg acagtagagg aga 103
<210> 95
<211> 169
<212> DNA
<213> 苏云金芽孢杆菌
<400> 95
aaactaaata atgagctaag catggattgg gtggcagaat tatctgccac ccaatccatg 60
cttaacgagt attattatgt aaatttctta aaattgggaa cttgtctaga acatagaacc 120
tgtccttttc attaactgaa agtagaaaca gataaaggag tgaaaaaca 169
<210> 96
<211> 111
<212> DNA
<213> 苏云金芽孢杆菌
<400> 96
attcactaca acggggatga gtttgatgcg gatacatatg agaagtaccg gaaagtgttt 60
gtagaacatt acaaagatat attatctcca tcataaagga gagatgcaaa g 111
<210> 97
<211> 273
<212> DNA
<213> 炭疽芽孢杆菌
<400> 97
cgcgcaccac ttcgtcgtac aacaacgcaa gaagaagttg gggatacagc agtattctta 60
ttcagtgatt tagcacgcgg cgtaacagga gaaaacattc acgttgattc agggtatcat 120
atcttaggat aaatataata ttaattttaa aggacaatct ctacatgttg agattgtcct 180
ttttatttgt tcttagaaag aacgattttt aacgaaagtt cttaccacgt tatgaatata 240
agtataatag tacacgattt attcagctac gta 273
<210> 98
<211> 303
<212> DNA
<213> 炭疽芽孢杆菌
<400> 98
tgaagtatct agagctaatt tacgcaaagg aatctcagga caacactttc gcaacaccta 60
tattttaaat ttaataaaaa aagagactcc ggagtcagaa attataaagc tagctgggtt 120
caaatcaaaa atttcactaa aacgatatta tcaatacgca gaaaatggaa aaaacgcctt 180
atcataaggc gttttttcca ttttttcttc aaacaaacga ttttactatg accatttaac 240
taatttttgc atctactatg atgagtttca ttcacattct cattagaaag gagagattta 300
atg 303
<210> 99
<211> 240
<212> DNA
<213> 炭疽芽孢杆菌
<400> 99
tatatcatat gtaaaattag ttcttattcc cacatatcat atagaatcgc catattatac 60
atgcagaaaa ctaagtatgg tattattctt aaattgttta gcaccttcta atattacaga 120
tagaatccgt cattttcaac agtgaacatg gatttcttct gaacacaact ctttttcttt 180
ccttatttcc aaaaagaaaa gcagcccatt ttaaaatacg gctgcttgta atgtacatta 240
<210> 100
<211> 267
<212> DNA
<213> 苏云金芽孢杆菌
<400> 100
tatcacataa ctctttattt ttaatatttc gacataaagt gaaactttaa tcagtggggg 60
ctttgttcat ccccccactg attattaatt gaaccaaggg ataaaaagat agagggtctg 120
accagaaaac tggagggcat gattctataa caaaaagctt aatgtttata gaattatgtc 180
tttttatata gggagggtag taaacagaga tttggacaaa aatgcaccga tttatctgaa 240
ttttaagttt tataaagggg agaaatg 267
<210> 101
<211> 124
<212> DNA
<213> 苏云金芽孢杆菌
<400> 101
attttttact tagcagtaaa actgatatca gttttactgc tttttcattt ttaaattcaa 60
tcattaaatc ttccttttct acatagtcat aatgttgtat gacattccgt aggaggcact 120
tata 124
<210> 102
<211> 170
<212> DNA
<213> 苏云金芽孢杆菌
<400> 102
acataaattc acctccataa agcgttcatt atatagtaga tgcaaaaccg aaagaaaatg 60
acacggacat ttgaattatt gaaaagaaat cttaaactac ttgaacaatt taaaaaaatg 120
gaaagtttag tatatgtata acatatgatt gatttggaag agggtgatta 170
<210> 103
<211> 212
<212> DNA
<213> 苏云金芽孢杆菌
<400> 103
ttctattttc caacataaca tgctacgatt aaatggtttt ttgcaaatgc cttcttggga 60
agaaggatta gagcgttttt ttatagaaac caaaagtcat taacaatttt aagttaatga 120
cttttttgtt tgcctttaag aggttttatg ttactataat tatagtatca ggtactaata 180
acaagtataa gtatttctgg gaggatatat ca 212
<210> 104
<211> 1500
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 104
atgaaacggt caatctcgat ttttattacg tgtttattga ttacgttatt gacaatgggc 60
ggcatgatag cttcgccggc atcagcagca gggacaaaaa cgccagtagc caagaatggc 120
cagcttagca taaaaggtac acagctcgtt aaccgagacg gtaaagcggt acagctgaag 180
gggatcagtt cacacggatt gcaatggtat ggagaatatg tcaataaaga cagcttaaaa 240
tggctgagag atgattgggg tatcaccgtt ttccgtgcag cgatgtatac ggcagatggc 300
ggttatattg acaacccgtc cgtgaaaaat aaagtaaaag aagcggttga agcggcaaaa 360
gagcttggga tatatgtcat cattgactgg catatcttaa atgacggtaa tccaaaccaa 420
aataaagaga aggcaaaaga attcttcaag gaaatgtcaa gcctttacgg aaacacgcca 480
aacgtcattt atgaaattgc aaacgaacca aacggtgatg tgaactggaa gcgtgatatt 540
aaaccatatg cggaagaagt gatttcagtt atccgcaaaa atgatccaga caacatcatc 600
attgtcggaa ccggtacatg gagccaggat gtgaatgatg ctgccgatga ccagctaaaa 660
gatgcaaacg ttatgtacgc acttcatttt tatgccggca cacacggcca atttttacgg 720
gataaagcaa actatgcact cagcaaagga gcacctattt ttgtgacaga gtggggaaca 780
agcgacgcgt ctggcaatgg cggtgtattc cttgatcaat cgagggaatg gctgaaatat 840
ctcgacagca agaccattag ctgggtgaac tggaatcttt ctgataagca ggaatcatcc 900
tcagctttaa agccgggggc atctaaaaca ggcggctggc ggttgtcaga tttatctgct 960
tcaggaacat tcgttagaga aaacattctc ggcaccaaag attcgacgaa ggacattcct 1020
gaaacgccat caaaagataa acccacacag gaaaatggta tttctgtaca gtacagagca 1080
ggggatggga gtatgaacag caaccaaatc cgtccgcagc ttcaaataaa aaataacggc 1140
aataccacgg ttgatttaaa agatgtcact gcccgttact ggtataaagc gaaaaacaaa 1200
ggccaaaact ttgactgtga ctacgcgcag attggatgcg gcaatgtgac acacaagttt 1260
gtgacgttgc ataaaccaaa gcaaggtgca gatacctatc tggaacttgg atttaaaaac 1320
ggaacgttgg caccgggagc aagcacaggg aatattcagc tccgtcttca caatgatgac 1380
tggagcaatt atgcacaaag cggcgattat tcctttttca aatcaaatac gtttaaaaca 1440
acgaaaaaaa tcacattata tgatcaagga aaactgattt ggggaacaga accaaattag 1500
<210> 105
<211> 852
<212> DNA
<213> 苏云金芽孢杆菌
<400> 105
atgaaaaaga aagtacttgc tttagcggca gctattacat tggttgctcc attacaaagt 60
gttgcatttg ctcatgaaaa tgatggggga cagagatttg gagttattcc gcgctggtct 120
gctgaagata aacataaaga aggcgtgaat tctcatttat ggattgtaaa tcgtgcaatt 180
gatattatgt ctcgtaatac aacacttgta aaacaagatc gagttgcact attaaatgaa 240
tggcgtactg agttagagaa cggtatttat gctgctgact atgaaaatcc ttattatgat 300
aatagcacat ttgcttcaca tttctatgac cctgacaatg ggaaaactta tattccgtat 360
gcaaagcagg caaaggaaac tggagctaaa tattttaaat tagctggtga gtcttacaaa 420
aataaagata tgcaacaagc attcttctat ttaggattat ctcttcatta tctaggggat 480
gtaaaccaac cgatgcatgc agcaaacttt acaaaccttt cgtatccaca agggttccat 540
tctaaatatg aaaactttgt agatacgata aaagataact ataaagtaac ggatggaaat 600
ggatattgga actggaaagg tacgaatcca gaagattgga ttcatggagc ggcagtagtt 660
gcgaaacaag attacgctgg cattgtaaat gataatacga aagattggtt cgtgagagct 720
gctgtatcac aagaatatgc agataaatgg cgcgctgaag ttacaccaat gacaggtaag 780
cgtttaatgg atgcacaacg tgttactgct ggatatattc agctttggtt tgatacgtac 840
ggagatcgtt aa 852
<210> 106
<211> 729
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 106
gcgggactga ataaagatca aaagcgccgg gcggaacagc tgacaagtat ctttgaaaac 60
ggcacaacgg agatccaata tggatatgta gagcgattgg atgacgggcg aggctataca 120
tgcggacggg caggctttac aacggctacc ggggatgcat tggaagtagt ggaagtatac 180
acaaaggcag ttccgaataa caaactgaaa aagtatctgc ctgaattgcg ccgtctggcc 240
aaggaagaaa gcgatgatac aagcaatctc aagggattcg cttctgcctg gaagtcgctt 300
gcaaatgata aggaatttcg cgccgctcaa gacaaagtaa atgaccattt gtattatcag 360
cctgccatga aacgatcgga taatgccgga ctaaaaacag cattggcaag agctgtgatg 420
tacgatacgg ttattcagca tggcgatggt gatgaccctg actcttttta tgccttgatt 480
aaacgtacga acaaaaaagc gggcggatca cctaaagacg gaatagacga gaagaagtgg 540
ttgaataaat tcttggacgt acgctatgac gatctgatga atccggccaa tcatgacacc 600
cgtgacgaat ggagagaatc agttgcccgt gtggacgtgc ttcgctctat cgccaaggag 660
aacaactata atctaaacgg accgattcat gttcgttcaa acgagtacgg taattttgta 720
atcaaataa 729
<210> 107
<211> 499
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 107
Met Lys Arg Ser Ile Ser Ile Phe Ile Thr Cys Leu Leu Ile Thr Leu
1 5 10 15
Leu Thr Met Gly Gly Met Ile Ala Ser Pro Ala Ser Ala Ala Gly Thr
20 25 30
Lys Thr Pro Val Ala Lys Asn Gly Gln Leu Ser Ile Lys Gly Thr Gln
35 40 45
Leu Val Asn Arg Asp Gly Lys Ala Val Gln Leu Lys Gly Ile Ser Ser
50 55 60
His Gly Leu Gln Trp Tyr Gly Glu Tyr Val Asn Lys Asp Ser Leu Lys
65 70 75 80
Trp Leu Arg Asp Asp Trp Gly Ile Thr Val Phe Arg Ala Ala Met Tyr
85 90 95
Thr Ala Asp Gly Gly Tyr Ile Asp Asn Pro Ser Val Lys Asn Lys Val
100 105 110
Lys Glu Ala Val Glu Ala Ala Lys Glu Leu Gly Ile Tyr Val Ile Ile
115 120 125
Asp Trp His Ile Leu Asn Asp Gly Asn Pro Asn Gln Asn Lys Glu Lys
130 135 140
Ala Lys Glu Phe Phe Lys Glu Met Ser Ser Leu Tyr Gly Asn Thr Pro
145 150 155 160
Asn Val Ile Tyr Glu Ile Ala Asn Glu Pro Asn Gly Asp Val Asn Trp
165 170 175
Lys Arg Asp Ile Lys Pro Tyr Ala Glu Glu Val Ile Ser Val Ile Arg
180 185 190
Lys Asn Asp Pro Asp Asn Ile Ile Ile Val Gly Thr Gly Thr Trp Ser
195 200 205
Gln Asp Val Asn Asp Ala Ala Asp Asp Gln Leu Lys Asp Ala Asn Val
210 215 220
Met Tyr Ala Leu His Phe Tyr Ala Gly Thr His Gly Gln Phe Leu Arg
225 230 235 240
Asp Lys Ala Asn Tyr Ala Leu Ser Lys Gly Ala Pro Ile Phe Val Thr
245 250 255
Glu Trp Gly Thr Ser Asp Ala Ser Gly Asn Gly Gly Val Phe Leu Asp
260 265 270
Gln Ser Arg Glu Trp Leu Lys Tyr Leu Asp Ser Lys Thr Ile Ser Trp
275 280 285
Val Asn Trp Asn Leu Ser Asp Lys Gln Glu Ser Ser Ser Ala Leu Lys
290 295 300
Pro Gly Ala Ser Lys Thr Gly Gly Trp Arg Leu Ser Asp Leu Ser Ala
305 310 315 320
Ser Gly Thr Phe Val Arg Glu Asn Ile Leu Gly Thr Lys Asp Ser Thr
325 330 335
Lys Asp Ile Pro Glu Thr Pro Ser Lys Asp Lys Pro Thr Gln Glu Asn
340 345 350
Gly Ile Ser Val Gln Tyr Arg Ala Gly Asp Gly Ser Met Asn Ser Asn
355 360 365
Gln Ile Arg Pro Gln Leu Gln Ile Lys Asn Asn Gly Asn Thr Thr Val
370 375 380
Asp Leu Lys Asp Val Thr Ala Arg Tyr Trp Tyr Lys Ala Lys Asn Lys
385 390 395 400
Gly Gln Asn Phe Asp Cys Asp Tyr Ala Gln Ile Gly Cys Gly Asn Val
405 410 415
Thr His Lys Phe Val Thr Leu His Lys Pro Lys Gln Gly Ala Asp Thr
420 425 430
Tyr Leu Glu Leu Gly Phe Lys Asn Gly Thr Leu Ala Pro Gly Ala Ser
435 440 445
Thr Gly Asn Ile Gln Leu Arg Leu His Asn Asp Asp Trp Ser Asn Tyr
450 455 460
Ala Gln Ser Gly Asp Tyr Ser Phe Phe Lys Ser Asn Thr Phe Lys Thr
465 470 475 480
Thr Lys Lys Ile Thr Leu Tyr Asp Gln Gly Lys Leu Ile Trp Gly Thr
485 490 495
Glu Pro Asn
<210> 108
<211> 283
<212> PRT
<213> 苏云金芽孢杆菌
<400> 108
Met Lys Lys Lys Val Leu Ala Leu Ala Ala Ala Ile Thr Leu Val Ala
1 5 10 15
Pro Leu Gln Ser Val Ala Phe Ala His Glu Asn Asp Gly Gly Gln Arg
20 25 30
Phe Gly Val Ile Pro Arg Trp Ser Ala Glu Asp Lys His Lys Glu Gly
35 40 45
Val Asn Ser His Leu Trp Ile Val Asn Arg Ala Ile Asp Ile Met Ser
50 55 60
Arg Asn Thr Thr Leu Val Lys Gln Asp Arg Val Ala Leu Leu Asn Glu
65 70 75 80
Trp Arg Thr Glu Leu Glu Asn Gly Ile Tyr Ala Ala Asp Tyr Glu Asn
85 90 95
Pro Tyr Tyr Asp Asn Ser Thr Phe Ala Ser His Phe Tyr Asp Pro Asp
100 105 110
Asn Gly Lys Thr Tyr Ile Pro Tyr Ala Lys Gln Ala Lys Glu Thr Gly
115 120 125
Ala Lys Tyr Phe Lys Leu Ala Gly Glu Ser Tyr Lys Asn Lys Asp Met
130 135 140
Gln Gln Ala Phe Phe Tyr Leu Gly Leu Ser Leu His Tyr Leu Gly Asp
145 150 155 160
Val Asn Gln Pro Met His Ala Ala Asn Phe Thr Asn Leu Ser Tyr Pro
165 170 175
Gln Gly Phe His Ser Lys Tyr Glu Asn Phe Val Asp Thr Ile Lys Asp
180 185 190
Asn Tyr Lys Val Thr Asp Gly Asn Gly Tyr Trp Asn Trp Lys Gly Thr
195 200 205
Asn Pro Glu Asp Trp Ile His Gly Ala Ala Val Val Ala Lys Gln Asp
210 215 220
Tyr Ala Gly Ile Val Asn Asp Asn Thr Lys Asp Trp Phe Val Arg Ala
225 230 235 240
Ala Val Ser Gln Glu Tyr Ala Asp Lys Trp Arg Ala Glu Val Thr Pro
245 250 255
Met Thr Gly Lys Arg Leu Met Asp Ala Gln Arg Val Thr Ala Gly Tyr
260 265 270
Ile Gln Leu Trp Phe Asp Thr Tyr Gly Asp Arg
275 280
<210> 109
<211> 244
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 109
Leu Glu Ala Gly Leu Asn Lys Asp Gln Lys Arg Arg Ala Glu Gln Leu
1 5 10 15
Thr Ser Ile Phe Glu Asn Gly Thr Thr Glu Ile Gln Tyr Gly Tyr Val
20 25 30
Glu Arg Leu Asp Asp Gly Arg Gly Tyr Thr Cys Gly Arg Ala Gly Phe
35 40 45
Thr Thr Ala Thr Gly Asp Ala Leu Glu Val Val Glu Val Tyr Thr Lys
50 55 60
Ala Val Pro Asn Asn Lys Leu Lys Lys Tyr Leu Pro Glu Leu Arg Arg
65 70 75 80
Leu Ala Lys Glu Glu Ser Asp Asp Thr Ser Asn Leu Lys Gly Phe Ala
85 90 95
Ser Ala Trp Lys Ser Leu Ala Asn Asp Lys Glu Phe Arg Ala Ala Gln
100 105 110
Asp Lys Val Asn Asp His Leu Tyr Tyr Gln Pro Ala Met Lys Arg Ser
115 120 125
Asp Asn Ala Gly Leu Lys Thr Ala Leu Ala Arg Ala Val Met Tyr Asp
130 135 140
Thr Val Ile Gln His Gly Asp Gly Asp Asp Pro Asp Ser Phe Tyr Ala
145 150 155 160
Leu Ile Lys Arg Thr Asn Lys Lys Ala Gly Gly Ser Pro Lys Asp Gly
165 170 175
Ile Asp Glu Lys Lys Trp Leu Asn Lys Phe Leu Asp Val Arg Tyr Asp
180 185 190
Asp Leu Met Asn Pro Ala Asn His Asp Thr Arg Asp Glu Trp Arg Glu
195 200 205
Ser Val Ala Arg Val Asp Val Leu Arg Ser Ile Ala Lys Glu Asn Asn
210 215 220
Tyr Asn Leu Asn Gly Pro Ile His Val Arg Ser Asn Glu Tyr Gly Asn
225 230 235 240
Phe Val Ile Lys

Claims (31)

1.一种组合物，其包含协同有效量的以下物质：
a)表达融合蛋白的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞，所述融合蛋白包含：
(i)至少一种植物生长刺激蛋白或肽；和
(ii)靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段；和
b)至少一种生物防治试剂，其选自产脂肽的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株、产脂肽的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株、坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)菌株和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)菌株。
2.权利要求1的组合物，其中所述至少一种植物生长刺激蛋白或肽选自参与植物生长刺激化合物的产生或活化的酶以及降解或修饰细菌、真菌或植物营养源的酶。
3.权利要求1的组合物，其中所述产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞是蜡状芽孢杆菌(Bacillus Cereus)家族成员的细胞。
4.权利要求3的组合物，其中所述蜡状芽孢杆菌家族成员选自炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)、蜡状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、蕈状芽胞杆菌(Bacillus mycoides)、假蕈状芽胞杆菌(Bacillus pseudmycoides)、Bacillus samanii、Bacillus gaemokensis、韦氏芽孢杆菌、东洋芽孢杆菌(Bacillus toyoiensis)及其组合。
5.权利要求1至4中任一项的组合物，其中所述靶向序列或孢子外壁蛋白包括：
与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约43％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约54％；
包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-35的靶向序列；
包含SEQ ID NO:1的氨基酸20-35的靶向序列；
包含SEQ ID NO:1的氨基酸22-31的靶向序列；
包含SEQ ID NO:1的氨基酸22-33的靶向序列；
包含SEQ ID NO:1的氨基酸20-31的靶向序列；
包含SEQ ID NO:1的靶向序列；或
孢子外壁蛋白，其包含与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性的氨基酸序列。
6.权利要求2至5中任一项的组合物，其中所述参与植物生长刺激化合物的产生或活化的酶选自3-羟基丁酮还原酶、吲哚-3-乙酰胺水解酶、色氨酸单加氧酶、乙酰乳酸合成酶、α-乙酰乳酸脱羧酶、丙酮酸脱羧酶、二乙酰还原酶、丁二醇脱氢酶、氨基转移酶、色氨酸脱羧酶、胺氧化酶、吲哚-3-丙酮酸脱羧酶、吲哚-3-乙醛脱氢酶、色氨酸侧链氧化酶、腈水解酶(nitrile hydrolase)、腈水解酶(nitrilase)、肽酶、蛋白酶、磷酸腺苷异戊烯基转移酶、磷酸酶、腺苷激酶、腺嘌呤磷酸核糖基转移酶、CYP735A、5'核糖核苷酸磷酸水解酶、腺苷核苷酶、玉米素顺式-反式异构酶、玉米素O-葡萄糖基转移酶、β-萄糖苷酶、顺式羟化酶、CK顺式羟化酶、CK N-葡萄糖基转移酶、2,5-核糖核苷酸磷酸水解酶、腺苷核苷酶、嘌呤核苷磷酸化酶、玉米素还原酶、羟胺还原酶、2-酮戊二酸双加氧酶、赤霉2B/3B水解酶、赤霉素3-氧化酶、赤霉素20-氧化酶、脱乙酰壳多糖酶、壳多糖酶、β-1,3-葡聚糖酶、β-1,4-葡聚糖酶、β-1,6-葡聚糖酶、氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶，以及参与产生结瘤因子的酶。
7.权利要求6的组合物，其中所述参与植物生长刺激化合物的产生或活化的酶是脱乙酰壳多糖酶。
8.权利要求7的组合物，其中融合蛋白包含SEQ ID NO:109。
9.权利要求2至5中任一项的组合物，其中所述降解或修饰细菌、真菌或植物营养源的酶选自纤维素酶、脂肪酶、木质素氧化酶、蛋白酶、糖苷水解酶、磷酸酶、固氮酶、核酸酶、酰胺酶、硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、淀粉酶、氨氧化酶、木质素酶、葡糖苷酶、磷脂酶、植酸酶、果胶酶、葡聚糖酶、硫酸酯酶、脲酶、木聚糖酶和铁载体。
10.权利要求9的组合物，其中所述酶是选自内切纤维素酶、外切纤维素酶和β-葡糖苷酶的纤维素酶。
11.权利要求10的组合物，其中所述融合蛋白包含枯草芽孢杆菌内切葡聚糖酶。
12.权利要求11的组合物，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO:107。
13.权利要求12的组合物，其中所述重组芽孢杆菌属细胞来源于苏云金芽孢杆菌BT013A。
14.权利要求9的组合物，其中所述酶是磷脂酶。
15.权利要求14的组合物，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO:108。
16.权利要求1至15中任一项的组合物，其中所述融合蛋白是在融合蛋白的靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段的天然孢子形成启动子的控制下表达。
17.权利要求1至16中任一项的组合物，其中所述融合蛋白是在高表达孢子形成启动子的控制下表达。
18.权利要求17的组合物，其中所述高表达孢子形成启动子包含σ-K孢子形成特异性聚合酶启动子序列。
19.权利要求16至18中任一项的组合物，其中所述孢子形成启动子包含与SEQ ID NO:85-103中任一核酸序列具有至少80％同一性的核酸序列。
20.权利要求1至19中任一项的组合物，其中所述至少一种生物防治试剂是产脂肽的枯草芽孢杆菌菌株或产脂肽的解淀粉芽孢杆菌菌株。
21.权利要求20的组合物，其中所述枯草芽孢杆菌菌株或解淀粉芽孢杆菌菌株是枯草芽孢杆菌QST713、枯草芽孢杆菌MBI600、解淀粉芽孢杆菌D747、解淀粉芽孢杆菌FZB42、枯草芽孢杆菌变种解淀粉芽孢杆菌FZB24，或其具有各自菌株的所有识别特征的突变体。
22.权利要求1至19中任一项的组合物，其中所述至少一种生物防治试剂是坚强芽孢杆菌菌株I-1582。
23.使用权利要求1至22中任一项的组合物处理的种子。
24.权利要求1至23中任一项的组合物用于增强植物生长和/或促进植物健康的用途。
25.权利要求24的用途，其用于处理常规或转基因植物或其种子。
26.一种处理植物、植物部分或植物周围的场所以增强植物生长和/或促进植物健康的方法，其包括同时地或惯序地施用协同有效量的以下物质的步骤：
a)表达融合蛋白的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞，所述融合蛋白包含：
(i)至少一种植物生长刺激蛋白或肽；和
(ii)靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段；和
b)至少一种生物防治试剂，其选自产脂肽的枯草芽孢杆菌菌株、产脂肽的解淀粉芽孢杆菌菌株、坚强芽孢杆菌菌株和短小芽孢杆菌菌株。
27.权利要求26的方法，其中所述靶向序列或孢子外壁蛋白包括：
与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约43％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约54％；
包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-35的靶向序列；
包含SEQ ID NO:1的氨基酸20-35的靶向序列；
包含SEQ ID NO:1的氨基酸22-31的靶向序列；
包含SEQ ID NO:1的氨基酸22-33的靶向序列；
包含SEQ ID NO:1的氨基酸20-31的靶向序列；
包含SEQ ID NO:1的靶向序列；或
孢子外壁蛋白，其包含与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性的氨基酸序列。
28.一种组合物，其包含协同有效量的以下物质：
a)表达融合蛋白的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞，所述融合蛋白包含：
(i)至少一种植物生长刺激蛋白或肽；和
(ii)靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段；和
b)至少一种生物防治试剂，其选自本文中第[00183]-[00226]段中公开的任何特定生物防治试剂。
29.权利要求28的组合物，其中所述融合蛋白包含内切葡聚糖酶或磷脂酶；所述靶向序列是与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约43％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约54％；并且所述重组芽孢杆菌属细胞来源于苏云金芽孢杆菌或蕈状芽孢杆菌。
30.权利要求29的组合物，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO:107；所述靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸20-35；并且所述苏云金芽孢杆菌是苏云金芽孢杆菌BT013A。
31.权利要求29的组合物，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO:108；所述靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸20-35；并且所述苏云金芽孢杆菌是苏云金芽孢杆菌BT013A。
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