CN107190092B - 用于鉴定结球甘蓝开花早晚的分子标记、引物对及分子标记方法与应用 - Google Patents

用于鉴定结球甘蓝开花早晚的分子标记、引物对及分子标记方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学领域，具体涉及用于鉴定结球甘蓝开花早晚的分子标记、引物对及分子标记方法与应用，所述分子标记、引物对能够用于结球甘蓝耐抽薹晚开花育种材料、品种的快速鉴定和耐抽薹晚开花材料转育的分子辅助选择，在甘蓝类蔬菜育种实践及耐抽薹理论研究上均具有重要意义。

Description

用于鉴定结球甘蓝开花早晚的分子标记、引物对及分子标记 方法与应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及用于鉴定结球甘蓝开花早晚的分子标记、引物对及分子标记方法与应用。
背景技术
结球甘蓝(Brassica oleracea var.capitata)，以下简称甘蓝，是十字花科芸薹属的二年生蔬菜作物，为绿体春化型植物，第一年生长到一定大小形成叶球，完成营养生长，经过冬季春化过程，第二年春、夏开花结实，完成生殖生长。结球甘蓝的食用器官主要是叶球，但在结球甘蓝的生产中，由于甘蓝品种耐抽薹性差、加上春季经常出现倒春寒现象等，结球甘蓝在叶球成熟前感受低温春化而出现未熟抽薹现象，一旦出现抽薹，就会阻止叶球的生长而直接抽薹开花，进入生殖生长阶段，给生产上带来巨大的经济损失。因此，选育低温春化不敏感的甘蓝品种是解决该问题的重要途径，而实现该育种目标的前提是选育耐抽薹的晚开花甘蓝亲本材料。
目前育种材料的筛选方法主要有两种，一种是传统的育种方法，该方法需要跨年度进行耐抽薹性状的选择鉴定，周期长，操作程序繁琐，工作量大，且由于耐抽薹晚开花性状除了受遗传因素影响外，还和环境因素密切相关，因此依靠表型鉴定存在较大的不准确性；另一种方法是近年来发展起来的分子标记辅助方法，将分子标记技术与传统育种学相结合，用稳定、可靠的DNA分子标记代替易受环境影响的表型标记，对育种材料进行筛选。因此，开发一种能够鉴别结球甘蓝开花早晚的分子标记，对苗期筛选晚开花的育种材料，提高育种效率具有重要意义。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种用于鉴定结球甘蓝开花早晚的分子标记，所述分子标记能够用于结球甘蓝耐抽薹晚开花育种材料、品种的快速鉴定和耐抽薹晚开花材料转育的分子辅助选择。
本发明的第二个目的在于提供上述分子标记的引物对。
本发明的第三个目的在于提供上述分子标记的获得方法。
本发明的第四个目的在于提供上述分子标记及其引物对的应用。
为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种用于鉴定结球甘蓝开花早晚的InDel分子标记，命名为InDel-FLC2，其核苷酸序列如Seq ID No.1所示。
根据本发明的分子标记，晚开花结球甘蓝的BoFLC2基因缺失所述分子标记，早开花结球甘蓝的BoFLC2基因含有所述分子标记；具体地，晚开花结球甘蓝的BoFLC2基因编码区序列缺失所述分子标记，早开花结球甘蓝的BoFLC2基因编码区序列含有所述分子标记；进一步具体地，晚开花结球甘蓝的BoFLC2基因编码区序列第一个内含子区域缺失所述分子标记，早开花结球甘蓝的BoFLC2基因编码区序列第一个内含子区域含有所述分子标记。
第二方面，本发明提供扩增上述用于鉴定结球甘蓝开花早晚的分子标记的引物对，上游引物序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物序列如SEQ ID NO.3所示。
第三方面，本发明提供上述用于鉴定结球甘蓝开花早晚的分子标记的获得方法，包括以下步骤：
步骤(1)：锚定早开花和晚开花结球甘蓝的BoFLC2基因的差异区段；
步骤(2)：测序获得早开花和晚开花结球甘蓝的BoFLC2基因核苷酸序列，结合步骤(1)锚定的差异区段，比较获得差异区段的核苷酸序列信息；
步骤(3)：根据差异区段核苷酸序列信息，设计引物对，对结球甘蓝进行基因型分析；
步骤(4)：结合早开花、晚开花结球甘蓝的开花期表型数据和其基因型，获得分子标记。
优选地，本发明分子标记的获得方法，包括以下步骤：
步骤(1)：设计结球甘蓝BoFLC2基因上游的启动子区域引物对和BoFLC2基因编码区引物对，选取样本数大于10的早开花、晚开花结球甘蓝，分别进行PCR扩增，比较获得早开花、晚开花结球甘蓝的BoFLC2基因中具有统计学差异的区段；
步骤(2)：测序获得早开花和晚开花结球甘蓝的BoFLC2基因核苷酸序列，结合步骤(1)获得的具有统计学差异的区段，比较获得差异区段核苷酸序列信息；
步骤(3)：根据步骤(2)获得的差异区段核苷酸序列信息，设计引物对，对结球甘蓝进行基因型分析；
步骤(4)：结合早开花、晚开花结球甘蓝的开花期表型数据和基因型，鉴定获得分子标记，所述分子标记位于BoFLC2基因编码区第一个内含子区域，长度为215bp，晚开花结球甘蓝BoFLC2基因编码区第一个内含子区域缺失所述分子标记，早开花结球甘蓝BoFLC2基因编码区第一个内含子区域含有所述分子标记。
进一步优选地，本发明分子标记的获得方法，包括以下步骤：
步骤(1)：设计结球甘蓝BoFLC2基因上游的启动子区域引物对和BoFLC2基因编码区引物对，选取样本数大于10的早开花、晚开花结球甘蓝，分别进行PCR扩增，比较早开花、晚开花结球甘蓝的BoFLC2基因中具有统计学差异的区段；如果早开花、晚开花结球甘蓝BoFLC2基因存在统计学差异的区段为编码区片段，可以进一步设计BoFLC2基因编码区序列前段、中段和后段区域引物对，分别对样本数大于10的早开花、晚开花结球甘蓝DNA进行PCR扩增，比较锚定早开花和晚开花结球甘蓝的BoFLC2基因存在统计学差异的区段；
步骤(2)：测序获得早开花和晚开花结球甘蓝的BoFLC2基因核苷酸序列，结合步骤(1)锚定的存在统计学差异的区段，比较获得差异区段的核苷酸序列信息；
步骤(3)：根据步骤(2)获得的差异区段核苷酸序列信息，设计引物对，对结球甘蓝进行基因型分析；
步骤(4)：结合早开花、晚开花结球甘蓝的开花期表型数据和基因型，鉴定获得分子标记，所述分子标记位于BoFLC2基因编码区第一个内含子区域，长度为215bp，晚开花结球甘蓝BoFLC2基因编码区第一个内含子区域缺失所述分子标记，早开花结球甘蓝BoFLC2基因编码区第一个内含子区域含有所述分子标记。
本发明的构思如下：
鉴于FLC是春化过程中调控结球甘蓝开花的一类MADS-box负调控转录因子，主要表现为植物感受低温春化后，FLC基因的表达受到抑制，促使植物开花。文献Schranz 2002；Lin et al.2005等报道，甘蓝类蔬菜中有5个FLC同源基因：BoFLC1，BoFLC2，BoFLC3，BoFLC4，BoFLC5，其中BoFLC2和BoFLC4的同源性高，文献Okazaki et al.2007进一步报道，BoFLC2是与开花时间最紧密关联的基因。因此，本发明以BoFLC2为目标基因，扩增晚开花结球甘蓝和早开花结球甘蓝的BoFLC2基因，通过比较来自不同甘蓝育种材料的BoFLC2基因扩增产物的差异，筛选出与开花时间性状密切相关的分子标记，设计分子标记的引物，对晚开花结球甘蓝、早开花结球甘蓝DNA进行PCR扩增，并与其连续3年的开花期单标记分析，确证该分子标记与开花时间性状密切相关，利用该分子标记的引物对实现在甘蓝苗期阶段晚开花、早开花结球甘蓝的早期快速分子标记鉴定，提高甘蓝耐抽薹晚开花品种的育种效率。
本发明提供一种鉴定结球甘蓝开花早晚的分子标记方法，包括以下步骤：
步骤a：以待鉴定材料的DNA作为模板，用本发明的分子标记的引物对进行PCR扩增，上游引物序列如SEQ ID NO.2，下游引物序列如SEQ ID NO.3所示；
步骤b：将PCR产物进行凝胶电泳分离成像，扩增产物大小为490-510bp者为早开花结球甘蓝，扩增产物大小为270-290bp者为晚开花结球甘蓝。
本发明的有益效果在于：
未熟抽薹开花严重影响结球甘蓝乃至十字花科叶球类蔬菜的品质与产量，给生产带来巨大的损失。本发明提供的鉴定结球甘蓝开花早晚的分子标记及其引物对，可用于早期耐抽薹晚开花结球甘蓝育种材料的快速鉴定，克服了传统方法所需时间周期长、不准确性高等缺点；同时还有利于结球甘蓝耐抽薹晚开花分子标记辅助育种体系的建立。因此，本发明在甘蓝类蔬菜育种实践及耐抽薹理论研究上均具有重要意义。
附图说明
图1是实施例3F11引物PCR扩增的BoFLC2基因启动子区域序列产物；
图2是实施例3FLC2引物PCR扩增的BoFLC2基因编码区域序列产物；
图3a是实施例3(FLC2F+F2)引物组合PCR扩增BoFLC2基因编码区域前段序列产物；
图3b是实施例3(F6+F5)引物组合PCR扩增BoFLC2基因编码区域中段序列产物；
图3c是实施例3(F4+F3)引物组合PCR扩增BoFLC2基因编码区域后段序列产物；
图4是实施例3涉及引物在BoFLC2基因序列上的位置；
图5是实施例4早开花、晚开花结球甘蓝差异片段序列比对图，虚线部分为晚开花结球甘蓝缺失的215bp片段；
图6是实施例4涉及的差异区段位置，其中黑色区域表示外显子区域；
图7是实施例5F12引物组合PCR扩增BoFLC2基因编码区域前段产物；
图8a是Seq ID No.1所示序列；
图8b是Seq ID No.2所示序列；
图8c是Seq ID No.3所示序列；
其中，M代表DL5000DNAMarker，E和Early代表早开花结球甘蓝，L和Late代表晚开花结球甘蓝。
具体实施例
实施例1早开花结球甘蓝和晚开花结球甘蓝的统计
对不同结球甘蓝的田间开花时间调查，筛选出26份早开花结球甘蓝和24份晚开花结球甘蓝。统计早开花、晚开花结球甘蓝连续三年的开花时间，结果如下：2015年早开花结球甘蓝开花时间均值为193.23±8.10天，晚开花结球甘蓝开花时间均值为203.5±9.57天，晚开花结球甘蓝比早开花结球甘蓝推迟开花时间为约10天；2016年早开花结球甘蓝开花时间均值为199.77±8.32天，晚开花结球甘蓝开花时间均值为215.96±7.77天，晚开花结球甘蓝较早开花结球甘蓝推迟开花时间为约16天；2017年早开花结球甘蓝开花时间均值为198.29±11.75天，晚开花结球甘蓝开花时间均值为214.80±9.05天，晚开花结球甘蓝较早开花结球甘蓝推迟开花时间为约16天；晚开花结球甘蓝的开花时间显著晚于早开花结球甘蓝的开花时间(P<0.01)。
实施例2甘蓝基因组DNA的提取
(1)取实施例1筛选的50份结球甘蓝的幼嫩叶片，分别存于1.5mL离心管中，于液氮中研磨成粉碎状；
(2)向每个装有样品的离心管中加入65℃、由700μl CTAB提取液和14μlβ-巯基乙醇混合制备的混合液，65℃水浴45min，中间混匀3-4次；
(3)向每个装有样品的离心管中加入步骤(2)所得混合液等体积的体积比为24:1的氯仿/异戊醇混合溶液，轻摇，混匀，乳化10min，10000rpm离心10min，取上清液于新的离心管中；
(4)于步骤(3)所得装有上清液的新的离心管中加入与步骤(3)所得上清液等体积的体积比为24:1的氯仿/异戊醇混合溶液，重复步骤(3)，再次离心，取上清液于新的离心管中；
(5)向步骤(4)所得上清液中加入于上清液等体积的冷冻异丙醇，迅速混匀至出现白色絮状沉淀，-20℃保存约20min，10000rpm离心2min，收集沉淀；
(6)分别用75％乙醇、95％乙醇、无水乙醇漂洗步骤(5)所得沉淀，将漂洗后的沉淀于超净工作台干燥10-20min，加入50μl ddH2O溶解，放置-20℃冰箱保存。
利用NanoDrop2000仪器检测DNA浓度，根据需要稀释成100ng/μl待用。
实施例3BoFLC2基因差异片段的锚定
(1)根据BoFLC2参考基因组序列，采用Primer3在线引物设计软件，设计引物F11(Forward primer：5’-ATTCGCCCACCGATTCGTAT-3’，Reversed primer 5’-GCCGGCGGAGAAGTTGTATA-3’)，20μl反应体系(ddH2O：4.2μl；2×Phanta Max buffer：10μl；dNTPMix(10mM each)：0.4μl；Primer F(10μM)：1μl；Primer R(10μM)：1μl；Phanta maxsuper-fidelity DNAPolymerase(1U/μl)：0.4μl；DNA(100ng/μl)：3μl)，采用PCR反应程序(98℃30s，{98℃15s，62℃15s，72℃3min}×7cycles，{98℃15s，55℃15s，72℃3min}×22cycles，72℃10min，16℃保存)，扩增BoFLC2基因启动子区域，1％琼脂糖凝胶电泳成像，结果见图1，早开花和开晚花结球甘蓝启动子区域扩增片段大小约2.0kb，大小无差异；
(2)根据BoFLC2参考基因组序列，采用Primer3在线引物设计软件，设计引物FLC2(Forwardprimer：5’-GAACCGAACCTCAGGATCAA-3’，Reversed primer：5’-GTGGGAGAGTTACCGGACAA-3’)，20μl反应体系(ddH2O：4.2μl；2×Phanta Max buffer：10μl；dNTP Mix(10mM each)：0.4μl；Primer F(10μM)：1μl；Primer R(10μM)：1μl；Phanta maxsuper-fidelity DNAPolymerase(1U/μl)：0.4μl；DNA(100ng/μl)：3μl)，采用PCR反应程序(98℃30s，{98℃15s，62℃15s，72℃3min}×7cycles，{98℃15s，55℃15s，72℃3min}×22cycles，72℃10min，16℃保存)，扩增BoFLC2基因编码区域序列，1％琼脂糖凝胶电泳成像，结果见图2，早开花与晚开花结球甘蓝的存在较小的扩增片段大小差异，扩增片段大小差异约为3.5kb；
(3)根据BoFLC2参考基因序列，分别设计BoFLC2基因的前段(FLC2F+F2，forwardprimer：FLC2F，5’-GAACCGAACCTCAGGATCAA-3’，reversedprimer：F2，5’-TCACCAACCAAATCCAGACC-3’)、中段(F6+F5，forwardprimer：F6，5’-TTCAGCTGGAGAACCACCTT-3’，reversedprimer：F5，5’-GTGGGAGAGTTACCGGACA-3’)和末段(F4+F3，forwardprimer：F4，5’-GAGCTCAAGGGTCCTCCTTC-3’，reversedprimer：F3，5’-GCCGAAGCTGATAAAATGGA-3’)引物，进行BoFLC2基因编码区前段、中段和末段片段大小分析。针对编码区前段的FLC2F+F2引物，中段的F6+F5引物采用20μl反应体系(ddH2O：4.2μl；2×Phanta Max buffer：10μl；dNTPMix(10mM each)：0.4μl；Primer F(10μM)：1μl；Primer R(10μM)：1μl；Phanta max super-fidelity DNAPolymerase(1U/μl)：0.4μl；DNA(100ng/μl)：3μl)体系；针对编码区末端区域的F4+F3引物采用PCR反应体系(ddH2O：12.2μl；10×Taq buffer：2μl；dNTPMix(10mMeach)：0.4μl；Primer F(10μM)：1μl；Primer R(10μM)：1μl；Taq DNAPolymerase(1U/μl)：0.4μl；DNA(100ng/μl)：3μl)体系。上述PCR体系均采用PCR反应程序(98℃30s，{98℃15s，62℃15s，72℃3min}×7cycles，{98℃15s，55℃15s，72℃3min}×22cycles，72℃10min，16℃保存)进行PCR扩增，1％琼脂糖凝胶电泳成像，结果见图3，利用F6+F5引物扩增BoFLC2基因中段，早开花结球甘蓝和晚开花结球甘蓝均出现大小1.8kb片段，大小无差异；利用F3+F4引物扩增BoFLC2基因末段，早开花结球甘蓝和晚开花结球甘蓝均出现大小900bp片段，大小无差异；利用引物FLC2F+F2扩增BoFLC2基因前段，出现大小约2.5kb片段，但早开花与晚开花结球甘蓝的前段片段大小存在有较小的大小差异。
实施例4BoFLC2基因全长的测序
分别选择4份早开花和4份晚开花甘蓝材料扩增的BoFLC2基因编码区PCR产物，送华大基因测序，以已知的BoFLC2基因序列为参考，采用引物(FLC2F：5’-GAACCGAACCTCAGGATCAA-3’；FLC2R：5’-GTGGGAGAGTTACCGGACAA-3’；F2：5’-TCACCAACCAAATCCAGACC-3’；F6：5’-TTCAGCTGGAGAACCACCTT-3’；F5：5’-GTGGGAGAGTTACCGGACA-3’；F4：5’-GAGCTCAAGGGTCCTCCTTC-3’；F3：5’-GCCGAAGCTGATAAAATGGA-3’)(位置见图4)，进行步移测序，采用CLC Sequence Viewer 6比对拼接序列，测序结果发现早开花和晚开花甘蓝材料之间有SNP差异，结合其开花期表型数据发现其与早开花和晚开花性状间不关联；4份晚开花甘蓝材料比4份早开花甘蓝材料在BoFLC2基因的第一个内含子区域缺失了215bp大小的片段，结果见图5，初步推测这215bp大小的差异片段可能影响甘蓝开花期。
实施例5鉴定结球甘蓝早开花和晚开花性状的分子标记筛选
根据测序及序列比对结果，针对215bp的差异，设计出特异引物F12(Forwardprimer：5’AAGGTCTTTTTGATAACCTGTGATGC 3’，reversedprimer：5’AGGTTAATGGCTGCACAATGT3’)，采用20μl PCR反应体系(ddH2O：12.2μl；10×Taqbuffer：2μl；dNTP Mix(10mM each)：0.4μl；Primer F(10μM)：1μl；Primer R(10μM)：1μl；Taq DNAPolymerase(1U/μl)：0.4μl；DNA(100ng/μl)：3μl)，PCR反应程序(98℃30s，{98℃15s，62℃15s，72℃3min}×7cycles，{98℃15s，55℃15s，72℃3min}×22cycles，72℃10min，16℃保存)，扩增26份早开花结球甘蓝和24份晚开花结球甘蓝，1％琼脂糖凝胶电泳成像，结果见图7，早开花材料的扩增产物500bp左右，晚开花材料的扩增产物是280bp左右，符合预期的片段大小(早花：501bp；晚花：286bp)。将扩增产物类型与开花期进行单标记分析发现，500bp条带与三年的开花期都显著负相关(r2015＝-0.56；r2016＝-0.70；r2017＝-0.61，P<0.01)，而280bp的条带与三年的开花期显著正相关(r2015＝0.53；r2016＝0.76；r2017＝0.64，P<0.01)，结果说明了501bp的扩增产物可用于鉴定早开花甘蓝材料，286bp的扩增产物可用于鉴定晚开花甘蓝。
SEQUENCE LISTING
<110> 西南大学
<120> 用于鉴定结球甘蓝开花早晚的分子标记、引物对及分子标记方法与应用
<130> 2017
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 215
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcacttcggg gagatctata aaaaaatgtg ggattaatgc ttaataatag atcaagagtt 60
ttaattcgaa tgtatgccac attgtgcagc aaatgtgaac tccgtagaac tccttaagta 120
tctgaagagt tccttaatta taagaataaa taatgattaa tgtttctatt tttagagtaa 180
ttcaagtcaa tgaatctctt ggagtttgat gcaat 215
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aaggtctttt tgataacctg tgatgc 26
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aggttaatgg ctgcacaatg t 21

Claims (10)

1.一种用于鉴定结球甘蓝开花早晚的InDel分子标记，命名为InDel-FLC2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的分子标记，其特征在于：晚开花结球甘蓝的BoFLC2基因缺失所述分子标记，早开花结球甘蓝的BoFLC2基因含有所述分子标记。
3.如权利要求2所述的分子标记，其特征在于：晚开花结球甘蓝的BoFLC2基因编码区序列缺失所述分子标记，早开花结球甘蓝的BoFLC2基因编码区序列含有所述分子标记。
4.如权利要求3所述的分子标记，其特征在于：晚开花结球甘蓝的BoFLC2基因编码区序列第一个内含子区域缺失所述分子标记，早开花结球甘蓝的BoFLC2基因编码区序列第一个内含子区域含有所述分子标记。
5.扩增权利要求1所述分子标记的引物对，其特征在于：上游引物序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物序列如SEQ ID NO.3所示。
6.权利要求1所述分子标记的获得方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤（1）：锚定早开花和晚开花结球甘蓝的BoFLC2基因的差异区段；
步骤（2）：测序获得早开花和晚开花结球甘蓝的BoFLC2基因核苷酸序列，结合步骤（1）锚定的差异区段，比较获得差异的核苷酸序列信息；
步骤（3）：根据差异区段核苷酸序列信息，设计引物对，对结球甘蓝进行基因型分析；
步骤（4）：结合早开花、晚开花结球甘蓝的开花期表型数据和其基因型，获得分子标记。
7.如权利要求6所述的获得方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤（1）：设计结球甘蓝BoFLC2基因上游的启动子区域引物对和BoFLC2基因编码区引物对，选取样本数大于10的早开花、晚开花结球甘蓝，分别进行PCR扩增，比较获得早开花、晚开花结球甘蓝的BoFLC2基因中具有统计学差异的区段；
步骤（2）：测序获得早开花和晚开花结球甘蓝的BoFLC2基因核苷酸序列，结合步骤（1）获得的具有统计学差异的区段，比较获得差异区段核苷酸序列信息；
步骤（3）：根据步骤（2）获得的差异区段核苷酸序列信息，设计引物对，对结球甘蓝进行基因型分析；
步骤（4）：结合早开花、晚开花结球甘蓝的开花期表型数据和基因型，鉴定获得分子标记，所述分子标记位于BoFLC2基因编码区第一个内含子区域，长度为215bp，晚开花结球甘蓝BoFLC2基因编码区第一个内含子区域缺失所述分子标记，早开花结球甘蓝BoFLC2基因编码区第一个内含子区域含有所述分子标记。
8.如权利要求6或7所述的获得方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤（1）：设计结球甘蓝BoFLC2基因上游的启动子区域引物对和BoFLC2基因编码区引物对，选取样本数大于10的早开花、晚开花结球甘蓝，分别进行PCR扩增，比较早开花、晚开花结球甘蓝的BoFLC2基因中具有统计学差异的区段；如果早开花、晚开花结球甘蓝的BoFLC2基因中具有统计学差异的区段为编码区段时，可以进一步设计BoFLC2基因编码区序列前段、中段和后段区域引物对，分别对样本数大于10的早开花、晚开花结球甘蓝DNA进行PCR扩增，比较锚定早开花和晚开花结球甘蓝的BoFLC2基因存在统计学差异的区段；
步骤（2）：测序获得早开花和晚开花结球甘蓝的BoFLC2基因序列，结合步骤（1）锚定的存在统计学差异的区段，比较获得差异区段的核苷酸序列信息；
步骤（3）：根据步骤（2）获得的差异区段核苷酸序列信息，设计引物对，对结球甘蓝进行基因型分析；
步骤（4）：结合早开花、晚开花结球甘蓝的开花期表型数据和基因型，鉴定获得分子标记，所述分子标记位于BoFLC2基因编码区第一个内含子区域，长度为215bp，晚开花结球甘蓝BoFLC2基因编码区第一个内含子区域缺失所述分子标记，早开花结球甘蓝BoFLC2基因编码区第一个内含子区域含有所述分子标记。
9.权利要求1～4任一项所述分子标记和/或权利要求5所述分子标记引物对在选育晚开花结球甘蓝育种材料和/或品种中的用途。
10.应用权利要求1～4任一项所述分子标记和/或权利要求5所述分子标记引物对鉴定结球甘蓝开花早晚的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤a：以待鉴定材料的DNA作为模板，用权利要求5所述的分子标记引物对进行PCR扩增，上游引物序列如SEQ ID NO.2，下游引物序列如SEQ ID NO.3所示；
步骤b：将PCR产物进行凝胶电泳分离成像，扩增产物大小为490-510bp者为早开花结球甘蓝，扩增产物大小为270-290bp者为晚开花结球甘蓝。
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