CN107177605A - 一种用于培育抗氧化微生物的基因 - Google Patents

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Abstract

本发明发现了一种用于培育抗氧化微生物的基因。本发明构建了含该基因的重组质粒，将其导入原核宿主细胞大肠杆菌表达菌株BL21中。实验证明，本发明发现的基因在原核生物中表达后，能够提高细胞的抗氧化能力。

Description

一种用于培育抗氧化微生物的基因
技术领域
本发明涉及一种用于培育抗氧化微生物的基因。
背景技术
耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans R1,DR)具有对电离辐射、UV辐射、DNA损伤试剂等抗性，是研究微生物非生物胁迫适应机制的理想菌株。曾有人对耐辐射异常球菌中大量功能未知基因(如IrrE、Csp等蛋白)进行研究，比如，将D.radiodurans R1中4个与植物抗旱相关的基因在原核宿主细胞和植物中表达后，能够增强宿主的耐盐抗性等。
然而，对本研究发现的来源于D.radiodurans R1新基因dwh，并未见其在提高细胞抗氧化能力方面的研究报道。
发明内容
本发明的目的是从D.radiodurans R1中发现一种用于培育抗氧化微生物的新基因。
本发明通过如下研究发现：
1、耐辐射异常球菌R1中含有编码Why(Water stress and Hypersensitive response)类似蛋白的基因，命名为dwh，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该基因编码的蛋白(Dwh蛋白)具有抗氧化的功能，可用于培育抗氧化微生物，进而为培育具有抗氧化性状的植物提供参考依据，其蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2、利用http://web.expasy.org/protparam/对Dwh蛋白氨基酸序列进行在线预测，该蛋白由99个氨基酸组成，分子式C466H772N134O138，其分子量为10.46kDa，理论等电点为9.94，不稳定指数29.04，属于稳定蛋白质；对Dwh蛋白氨基酸序列分析发现，该蛋白富含Leu(15.15％)、Val(12.12％)、Ala(10.1％)、Thr(10.1％)，带负电氨基酸残基总数(Asp+Glu)为7，带正电氨基酸残基总数(Arg+Lys)为9，其中疏水氨基酸残基含量为50.5％，总平均疏水指数(GRAVY)为0.165，同时，采用Kyte&Doolittle方法对Dwh蛋白进行疏水性分析也显示出其高度的疏水特性(图1)。因此，推测该蛋白是一类典型的疏水蛋白。此外，二级结构预测显示(图2)，Dwh蛋白由6个β折叠和靠近C端的1个α螺旋组成。
3、获得D.radiodurans R1dwh基因的缺失突变株Δdwh
通过PCR获得dwh基因上下游基因片段(dwh-U和dwh-D)，同时获得编码卡那霉素抗性蛋白的Km基因片段(K)(图3)，采用融合PCR技术将dwh-U、K、dwh-D三片段融合，获得dwh-UKD重组片段。然后将重组片段通过同源重组技术转化D.radiodurans R1感受态细胞，在含有Km抗性的TGY平板上进行压力筛选，获得dwh基因的缺失突变株Δdwh，并进行PCR及测序验证(图4)(见实施例1)。
4、D.radiodurans R1 dwh基因缺失突变株Δdwh的抗氧化实验
1)对野生型DR及突变株Δdwh分别进行氧化胁迫处理(80mM H2O2处理30min)，观察不同菌株在氧化胁迫条件下的存活能力。结果显示，氧化胁迫条件下试验菌株存活能力均有下降，缺失dwh基因的突变株Δdwh与野生型DR菌株相比更加敏感，菌株存活能力下降1个数量级(见实施例2和图5、6)。结果表明dwh基因编码的蛋白对D.radioduransR1耐受氧化胁迫具有重要贡献。
2)对野生型DR及突变株Δdwh分别进行50mM H2O2处理30min，收集并洗涤菌体，用适量的磷酸缓冲液重悬菌体，超声破碎细胞，离心获得上清液总蛋白，并测定各样品总蛋白浓度。测定野生型DR及突变株Δdwh细胞内的抗氧化酶活性(CAT、POD、SOD)。结果显示，氧化胁迫条件下，突变株Δdwh的抗氧化酶活性与野生型DR菌株相比，均有所下降，CAT和POD下降更加明显(见实施例2和图7)。
以上结果表明，dwh基因在D.radiodurans R1中表达能够增强细胞的抗氧化能力，可能通过保护细胞内抗氧化酶避免氧自由基的损伤，从而发挥保护功能。
5、获得含有D.radiodurans R1dwh基因的重组工程菌株
1)通过PCR从D.radiodurans R1(CGMCC 1.633)菌株基因组扩增dwh基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。核苷酸长度为297bp(图8)，该基因编码99个氨基酸，将其克隆于载体pJET1.2/Blunt上，构建了含有完整dwh基因的重组质粒pJET-dwh(图9)；
2)将dwh基因连接于pET28a表达载体上，构建含有完整dwh基因的重组质粒pET28a-dwh；
3)将导入dwh基因的重组质粒pET28a-dwh转入原核宿主细胞受体大肠杆菌BL21中，获得重组工程菌株pET28a-dwh/BL21(见实施例3)；
6、含有D.radiodurans R1dwh基因工程菌株的抗氧化实验
实验证实，经30mM H2O2处理10min后，含有D.radiodurans R1 dwh基因的pET28a-dwh/BL21重组菌株生长状况良好，菌落生存能力远高于只含空质粒的对照pET28a/BL21菌株(见实施例4及图10、11)。结果显示该工程菌株具有耐受高浓度H2O2胁迫的能力。
此实验表明：D.radiodurans R1dwh基因具有提高大肠杆菌抗氧化的能力。
附图说明：
图1是D.radiodurans R1Dwh蛋白的亲/疏水性分析图谱(其中横坐标表示氨基酸序列，纵坐标表示疏水性分值，疏水性分值越大表明该氨基酸疏水性越强；Hydrophilic——亲水，Hydrophobic——疏水)；
图2是D.radiodurans R1Dwh蛋白的二级结构分析图谱；
图3是dwh基因上游dwh-U(1)、下游dwh-D(2)及抗性基因K(3)片段的PCR产物电泳图谱；
图4是突变株Δdwh的PCR验证图谱(泳道1-3:引物YZdwh-F/R分别以突变株Δdwh、野生型DR、无菌水为模板扩增dwh片段，验证dwh缺失完全；泳道4-6:引物YZdwh-U-F/D-R分别以突变株Δdwh、野生型DR、无菌水为模板扩增重组片段，验证dwh-UKD***位置)；
图5是H2O2冲击试验前的野生型DR和突变株Δdwh生存能力的菌落照片，其中：
a是野生型的D.radiodurans R1菌株(DR)；
b是缺失dwh基因的D.radiodurans R1突变体菌株(Δdwh)；
图6是野生型DR和突变株Δdwh经80mM H2O2处理30min后，在TGY固体培养基中生长情况的菌落照片，其中：
a是野生型的D.radiodurans R1菌株(DR)；
b是缺失dwh基因的D.radiodurans R1突变体菌株(Δdwh)；
图7是野生型DR和突变株Δdwh经50mM H2O2处理30min后，细胞内的抗氧化酶活性的变化，其中：
a是突变株Δdwh在H2O2处理前后与野生型DR相比，细胞内的过氧化氢酶(CAT)活性的变化；
b是突变株Δdwh在H2O2处理前后与野生型DR相比，细胞内的过氧化物酶(POD)活性的变化；
c是突变株Δdwh在H2O2处理前后与野生型DR相比，细胞内的超氧化物歧化酶(SOD)活性的变化；
图8含有D.radiodurans R1dwh基因的PCR产物的验证电泳图谱；
图9是含有D.radiodurans R1dwh基因的原核重组表达质粒的构建验证电泳图谱；
图10是在H2O2冲击试验前的含有空质粒和含有D.radiodurans R1dwh基因的原核表达质粒的大肠杆菌的生长状况的菌落照片，其中：
a是含有空表达质粒的大肠杆菌BL21菌株；
b是含有D.radiodurans R1dwh基因表达质粒的大肠杆菌重组菌株；
图11是含有D.radiodurans R1dwh基因的原核表达质粒及空质粒的大肠杆菌(E.coli)经受30mM H2O2处理10min后，在LB固体培养基中的生长情况的菌落照片，其中：
a是含有空表达质粒的对照大肠杆菌菌株(pET28a/BL21)；
b是含有D.radiodurans R1dwh基因表达质粒的大肠杆菌重组菌株(pET28a-dwh/BL21)。
具体实施方式
以下实施例中所举的质粒、菌株只是用于对本发明作进一步详细说明，并不对本发明的实质内容加以限制。凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例中所举的质粒、菌株及试剂如下：
(1)质粒：
平末端克隆载体pJET1.2/Blunt(Amp)购自Thermo Scientific公司，pKatAPH3(携带Km抗性基因)质粒由本实验保存，表达载体pET28a由本实验室保存，pJET-dwh(dwh基因片段与克隆载体pJET1.2/Blunt连接)、pET28a-dwh(dwh基因片段与克隆载体pET28a通过酶切连接)重组质粒由本研究构建。
(2)实验菌株：
耐辐射异常球菌Deinococcus radiodurans Rl野生型菌株(CGMCC 1.633)由中国普通微生物菌种保藏中心提供；突变株Δdwh(缺失dwh基因的D.radiodurans Rl菌株)由本研究构建，D.radiodurans Rl及其突变菌株均在TGY培养基中生长，最适培养温度为30℃；
大肠杆菌Escherichia coli trans 109及BL21菌株购自北京全式金生物技术公司；pET28a/BL21(空载体pET28a转化大肠杆菌BL21菌株获得的重组菌株)、pET28a-dwh/BL21(重组质粒pET28a-dwh转化大肠杆菌BL21菌株获得的重组菌株)由本研究构建，E.coli及其重组菌株均在LB培养基中生长，培养温度为37℃。
(3)生化试剂：限制性内切酶购自NEB公司；dNTPs、高保真Primestar HS DNApolymerase、T4DNA连接酶等购自大连宝生物公司(TaKaRa)；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、普通DNA产物纯化试剂盒、普通质粒小提试剂盒均购自天根生化科技公司(TIANGEN)；30％H2O2、IPTG、抗生素等购自阿拉丁(aladdin)；实验中所用引物合成及测序均由华大基因公司完成。
(4)培养基：
LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，pH调至7.0，固体培养基中加入agar 15g/L。高压蒸汽(121℃,1.034×105Pa)灭菌30min。
TGY培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，葡萄糖1g/L，固体培养基中加入agar 15g/L。高压蒸汽(112℃,1.034×105Pa)灭菌30min。
(5)抗生素及主要溶液配制：
氨苄青霉素(Amp)(50mg/mL)：称取0.5g氨苄青霉素粉末，溶于10mL双蒸水中，滤膜过滤除杂后分装，保存于-20℃冰箱；
卡那霉素(Km)(50mg/mL)：称取0.5g卡那霉素粉末，溶于10mL双蒸水中，滤膜过滤除杂后分装，保存于-20℃冰箱；
IPTG(100mmol/L)：称取0.24g IPTG，溶于10mL双蒸水中，滤膜过滤除菌后分装，保存于-20℃冰箱；
CaCl2(0.3mol/L)：称取4.5g CaCl2·2H2O粉末，溶解于80mL双蒸水中，定容至100mL，高压蒸汽(121℃)灭菌；
0.1mol/L H2O2：30％的H2O2溶液5.68mL稀释至1000mL；
130mmol/L甲硫氨酸Met溶液：称1.9399g Met用磷酸缓冲液定容至100mL；
750μmol/L氮蓝四唑NBT溶液：称0.06133g NBT用磷酸缓冲液定容至100mL，避光保存；
100μmol/L EDTA-Na2溶液：称0.03721g EDTA-Na2，用磷酸缓冲液定容至1000mL；
20μmol/L核黄素溶液：称0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000mL，避光保存；
0.05mol/L愈创木酚溶液：称取6.2065g(124.13g/mol×0.05mol)，然后溶于1L 95％乙醇中，即为1L的0.05mol/L愈创木酚溶液；
2％H2O2：吸取20mL 30％H2O2溶于280mL蒸馏水中，即为300mL的2％H2O2。
所用PBS溶液按照分子克隆手册配备。
实施例1获得D.radiodurans R1dwh基因的缺失突变株Δdwh
从NCBI的GeneBank中获得D.radiodurans R1全基因组序列和质粒pKatAPH3序列，
根据dwh基因序列和卡那抗性基因序列设计引物(见表1)。
表1基因片段扩增所用的引物
采用融合PCR方法构建突变株Δdwh。以D.radiodurans R1基因组DNA为模板，分别用表1中合成的引物U-F/U-R扩增dwh基因上游片段，扩增产物dwh-U长度为749bp；用D-F/D-R引物扩增dwh基因下游片段，扩增产物dwh-D长度为595bp；以pKatAPH3质粒为模板，用K-F/K-R引物扩增卡那抗性基因片段，扩增产物K长度为1007bp。分别对各扩增产物进行纯化回收，条带单一(图3)，在反应体系中加入等摩尔的三片段产物，引物U-F/D-R，采用一步融合法进行融合PCR反应，得到三片段的融合产物dwh-UKD(2268bp)。PCR反应条件为：94℃10min；94℃1min；60℃1min；72℃5min；17个循环；94℃1min；60℃1min；72℃3min；30个循环；72℃10min。
对融合产物dwh-UKD(2268bp)进行测序验证，完全与实验设计的序列一致。通过同源重组转化野生型D.radiodurans R1。在含有10μg/mL的Km平板上筛选缺失突变株Δdwh。通过PCR方法对Δdwh进行鉴定。以突变株Δdwh基因组DNA为模板，用YZdwh-F/YZdwh-R引物扩增dwh基因片段，未获得346bp条带，而在阴性对照D.radiodurans R1基因组DNA中能够扩增出346bp大小条带；用YZdwh-U-F/YZdwh-D-R引物扩增YZdwh-UKD片段仅获得2591bp条带，以D.radiodurans R1基因组DNA为模板扩增获得1985bp条带，同时以无菌水作空白对照。结果表明卡那抗性基因完全替代了dwh基因，完整的整合到dwh基因在D.radiodurans R1基因组DNA上所在的位置(图4)。
实施例2D.radiodurans R1dwh基因缺失突变株Δdwh的抗氧化实验
一、实验方法
(1)菌株的抗氧化表型实验
分别从划线培养的TGY平板上挑取野生型DR与突变株Δdwh单菌落接种到2mLTGY液体培养基中(突变株培养基中含有10μg/mL Km抗生素)，30℃振荡培养至对数中期，1％分别转接到新鲜的50mL TGY液体培养基中(突变株培养基中含有10μg/mL Km抗生素)，培养至对数初期(OD600约为0.6)，各取1mL菌液，分别加入8μL 30％H2O2溶液，至菌液的H2O2终浓度为80mM(10mM H2O2≈1μL 30％H2O2)，并设置对照组(未加入H2O2)，30℃摇床分别温育30min后，立即用无菌去离子水等比稀释(10-1至10-5)。每个稀释度各取10μL点在TGY固体培养基表面，经30℃恒温培养2-3天，观察野生型和突变株在TGY培养基平板上的生长情况。分别进行三次独立重复实验。
(2)细胞内抗氧化酶活测定
分别从划线培养的TGY平板上挑取野生型DR与突变株Δdwh单菌落接种到20mLTGY液体培养基中(突变株培养基中含有10μg/mL Km抗生素)，30℃振荡培养至对数中期，1％分别转接到200mL新鲜TGY液体培养基中(突变株培养基中含有10μg/mL Km抗生素)，30℃220rpm培养至对数初期(OD600约为0.6)，分别用50mM H2O2处理野生型DR与突变株Δdwh，并设置对照组(未加入H2O2的野生型DR与突变株Δdwh)，摇床避光处理30min后，立即收菌(4℃8000rpm 10min)，用无菌水洗涤菌体两次，最后重悬于5mL 50mM pH 7.0的PBS缓冲液中；于冰上进行超声破碎处理细胞(功率不超过200W，工作2s，间隔3s，处理时间45～60min，变幅杆Φ3)，4℃12000rpm 20min离心，于冰上分装后测定各个样品总蛋白浓度(Bradford方法)，并保存总蛋白于-20℃。
A细胞内过氧化氢酶(CAT)活性测定
①室温条件下(25℃)，取1.5mL EP管，其中一个为样品测定管(每个样品1个)，另一个为空白对照管(CK)，按表2顺序加入试剂。
表2过氧化氢酶(CAT)活性测定各组分配方表
试剂 对照管CK 样品管
0.2M pH7.8PBS(μL) 100 90～95
0.1M H2O2(μL) 100 100
粗酶液(μL) 0 5～10
总体积(μL) 200 200
用UV-3010分光光度计测定，关掉钨灯WI(340～1200nm)，打开氘灯D2(190～340nm)，先调零，内侧比色皿加入1mL 0.2M pH 7.8PBS，外侧比色皿先加入CK溶液(200μL)，迅速调零；
②样品测定时，按表2顺序加入各成分，并迅速混合，立即开始计时，240nm下测定其吸光度，分别于15s、30s、45s、1min、1.5min、2min、3min读数。
③待所有样品全部测完后，按下列公式计算酶活性。以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位(Unit)。
CAT活性(Unit/μg·μL-1·min)＝ΔA240·V1/(0.1·V2·t·C)
式中：ΔA240为样品管吸光值的绝对值；V1为反应液总体积(μL)；V2为测定用粗酶提取液体积(μL)；C为粗酶提取液总蛋白浓度(μg·μL-1)；0.1为A240每下降0.1为1个酶活单位(U)；t为过氧化氢到最后一次读数时间(min)。
B细胞内过氧化物酶(POD)活性测定
①酶活性测定显色反应体系如下：
表3过氧化物酶(POD)活性测定各组分配方表
试剂 对照管CK 样品管
0.05M pH5.5PBS(μL) 300 290～295
2％H2O2(μL) 100 100
0.05mol/L愈创木酚 100 100
粗酶液(μL) 0 5～10
总体积(μL) 500 500
②首先调零：按照反应体系设置对照组CK，34℃保温3min后加入500μL 0.05M pH5.5PBS，分别于内侧石英比色皿加入1mL 0.05M pH 5.5PBS，外侧比色皿加入CK溶液(200μL)，470nm波长下调零；
③同样，样品测定时首先按照表1-2的样品管加入各组分，待加入酶液后，立即于34℃保温3min。然后立即加入500μL 0.05M pH 5.5PBS，迅速稀释1倍，470nm波长下测定，每隔1min记录1次吸光度，分别测定1、2、3、4、5、6、7、8min的吸光值；
④待所有样品全部测完后，按下列公式计算酶活性。以每分钟内A470变化0.01为1个酶活性单位(Unit)。
⑤按下列公式计算出过氧化物酶活性Unit/(μg·μL-1·min)。
POD活性＝ΔA470·V1/(0.01·V2·t·C)
ΔA470为反应时间内吸光度的变化，即所测得的A470读数；V1为反应液总体积(μL)；V2为测定用粗酶提取液体积(μL)；C为粗酶提取液总蛋白浓度(μg·μL-1)；0.01为A470每变化0.01为1个酶活单位(U)；t为反应时间(min)。
C细胞内过氧化物酶(POD)活性测定
①SOD酶活性测定反应体系，在具塞试管(10mL)中按表4依次加入以下溶液：
表4超氧化物歧化酶(SOD)活性测定各组分配方表
试剂 对照管CK 样品管
0.05mol/L pH 7.8PBS(mL) 1.5 1.45～1.47
130mmol/L甲硫氨酸Met溶液(mL) 0.3 0.3
750μmol/L氮蓝四唑NBT溶液(mL) 0.3 0.3
100μmol/L EDTA-Na2溶液(mL) 0.3 0.3
20μmol/L核黄素溶液(mL) 0.3 0.3
蒸馏水(mL) 0.25 0.25
酶液(mL) 0 0.05～0.03
总体积(mL) 3 3
②混匀后将1支对照管置暗处不照光，其他各管于4000lx日光下反应20min。
③至反应结束后，以不照光的对照管设置空白，分别取样品200μL于酶标板中，测定各管在560nm处的吸光值。
④按下列公式计算出SOD活性U/(μg·μL-1)。SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活性单位表示。
SOD活性＝(ACK-AE)·V1/(0.5·ACK·C·V2)
ACK为照光对照管的吸光值，AE为样品管的吸光值，V1为反应液总体积(μL)，V2为测定用粗酶提取液体积(μL)，C为粗酶提取液总蛋白浓度(μg·μL-1)。
二、实验结果
(1)氧化胁迫对菌株具有强烈的杀伤作用，利用过氧化氢溶液进行氧化冲击处理，分析高浓度H2O2对野生型DR和突变株Δdwh生长的影响。图5和图6是H2O2冲击试验前后的D.radiodurans R1菌株的生长状况的菌落照片，其中：a是野生型DR菌株；b是缺失dwh基因的D.radiodurans R1突变株Δdwh；从图中可清楚看出：
H2O2处理前：
野生型DR菌株与缺失dwh基因的突变株Δdwh生长能力基本一致(见图5)；
H2O2处理后：
经80mM H2O2处理后，野生型DR菌株与缺失dwh基因的突变株Δdwh的生存能力均有所下降，而突变株Δdwh对氧化胁迫更加敏感；突变株Δdwh较野生型DR菌株的菌落形成相差至少一个数量级，其生存能力远低于野生型DR菌株(见图6)。
(2)分别用50mM H2O2处理野生型DR菌株与缺失dwh基因的突变株Δdwh 30min，测定四个不同菌株样品(DR、DR-H2O2、Δdwh、Δdwh-H2O2)细胞内抗氧化酶(CAT、POD、SOD)活性(图7)，结果显示，未处理的Δdwh细胞内的三种抗氧化酶活性均低于野生型DR菌株，表明dwh基因缺失导致D.radiodurans R1细胞内的抗氧化酶活性下降；经50mMH2O2处理的野生型(DR-H2O2)和突变株(Δdwh-H2O2)与未处理的对照相比，抗氧化酶活性均有所下降(SOD活性除外)(图7c)，突变株Δdwh的抗氧化酶活性下降更加显著，尤其是H2O2处理的突变株Δdwh中CAT(图7a)和POD(图7b)的酶活性下降为野生型DR的6％-10％，表明氧化胁迫条件下，缺失dwh基因的突变株Δdwh清除氧自由基的能力下降。
三、实验结论
野生型DR菌株对氧化胁迫的抗性高于缺失dwh基因的突变株Δdwh，dwh基因的缺失减弱了D.radiodurans R1清除氧自由基(ROS)的能力。
实施例3D.radiodurans R1dwh基因在大肠杆菌中的表达
根据已公布的D.radiodurans R1基因组中的dwh基因序列设计1对PCR特异性引物，从D.radiodurans R1基因组DNA中扩增完整的核苷酸序列：
Up 5′CGGGATCCATGCTCACGAGTTTCAGTTT3′；
Down 5′CCCAAGCTTTCACGTCAGAGTTCCGTCCA3′。
通过PCR方法从D.radiodurans R1的基因组中扩增出目的基因片段，反应条件：95℃10min，[95℃30sec，62℃30sec，72℃30sec]35个循环，72℃10min，PCR产物经胶回收后，克隆于平末端载体pJET1.2/Blunt上，命名为pJET-dwh，并测序验证；然后通过BamH I/Hind III双酶切获得含有粘性末端的pET28a表达载体及dwh基因片段，将dwh片段连接于pET28a载体上，构建大肠杆菌重组表达质粒pET28a-dwh，将该表达质粒转化大肠杆菌BL21，经PCR、质粒酶切、测序验证***序列正确(见图8,9)，将该重组菌株命名为pET28a-dwh/BL21。
将含有pET28a空质粒的E.coli BL21命名为pET28a/BL21。
实施例4含D.radiodurans R1dwh基因重组菌株的抗氧化实验
一、实验方法
1、将实施例3中获得的含有D.radiodurans R1dwh基因的pET28a-dwh/BL21菌株与含空质粒的pET28a/BL21菌株分别接种于20mL LB液体培养基(含Km抗生素)中，摇瓶过夜(37℃)培养后，再分别转接于100mL的LB液体培养基中，保持接种量的一致，培养30min后加入终浓度为0.1mM的IPTG，继续培养至OD600≈0.5即可。
2、取1mL的菌液，加入30％的H2O2溶液3μL使菌液终浓度为30mM，处理10min后，每个样品立即用无菌去离子水倍比稀释至10-5，取10μL点在LB固体培养基表面，经37℃培养16h，观察菌落形成情况并照相。
二、实验结果
图10和图11是H2O2冲击试验前后的大肠杆菌的生长状况的菌落照片，其中：a是含有空表达质粒的大肠杆菌BL21菌株；b是含有D.radiodurans R1dwh基因表达质粒的大肠杆菌重组菌株；从图中可清楚看出：
H2O2处理前：
含有D.radiodurans R1dwh基因的pET28a-dwh/BL21菌株与含空质粒的pET28a/BL21菌株生长能力基本一致(见图10)；
H2O2处理后：
经30mM H2O2处理后，只含空质粒的pET28a/BL21菌株几乎不能正常生长；
含有D.radiodurans R1dwh基因的pET28a-dwh/BL21重组菌株生长状况良好，其生存能力远高于只含空质粒的pET28a/BL21菌株，对照菌株pET28a/BL21几乎不能正常生长(见图11)。
三、实验结论
含有D.radiodurans R1dwh基因的重组菌株对氧化胁迫的抗性远高于只含空质粒的菌株，该基因的表达提高了大肠杆菌的抗氧化能力。

Claims (8)

1.一种用于培育抗氧化微生物的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述基因培育抗氧化微生物的用途。
3.含权利要求1所述基因的重组质粒。
4.权利要求3所述的重组质粒培育抗氧化微生物的用途。
5.用权利要求3所述的重组质粒转化的原核宿主细胞。
6.含权利要求3所述的重组质粒的重组工程菌株。
7.一种能够提高微生物抗氧化能力的蛋白，其氨基酸序列SEQ ID NO.2所示。
8.权利要求1所述蛋白培育抗氧化微生物的用途。
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