CN107177605A - 一种用于培育抗氧化微生物的基因 - Google Patents
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Abstract
本发明发现了一种用于培育抗氧化微生物的基因。本发明构建了含该基因的重组质粒,将其导入原核宿主细胞大肠杆菌表达菌株BL21中。实验证明,本发明发现的基因在原核生物中表达后,能够提高细胞的抗氧化能力。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于培育抗氧化微生物的基因。
背景技术
耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans R1,DR)具有对电离辐射、UV辐射、DNA损伤试剂等抗性,是研究微生物非生物胁迫适应机制的理想菌株。曾有人对耐辐射异常球菌中大量功能未知基因(如IrrE、Csp等蛋白)进行研究,比如,将D.radiodurans R1中4个与植物抗旱相关的基因在原核宿主细胞和植物中表达后,能够增强宿主的耐盐抗性等。
然而,对本研究发现的来源于D.radiodurans R1新基因dwh,并未见其在提高细胞抗氧化能力方面的研究报道。
发明内容
本发明的目的是从D.radiodurans R1中发现一种用于培育抗氧化微生物的新基因。
本发明通过如下研究发现:
1、耐辐射异常球菌R1中含有编码Why(Water stress and Hypersensitive response)类似蛋白的基因,命名为dwh,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,该基因编码的蛋白(Dwh蛋白)具有抗氧化的功能,可用于培育抗氧化微生物,进而为培育具有抗氧化性状的植物提供参考依据,其蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2、利用http://web.expasy.org/protparam/对Dwh蛋白氨基酸序列进行在线预测,该蛋白由99个氨基酸组成,分子式C466H772N134O138,其分子量为10.46kDa,理论等电点为9.94,不稳定指数29.04,属于稳定蛋白质;对Dwh蛋白氨基酸序列分析发现,该蛋白富含Leu(15.15%)、Val(12.12%)、Ala(10.1%)、Thr(10.1%),带负电氨基酸残基总数(Asp+Glu)为7,带正电氨基酸残基总数(Arg+Lys)为9,其中疏水氨基酸残基含量为50.5%,总平均疏水指数(GRAVY)为0.165,同时,采用Kyte&Doolittle方法对Dwh蛋白进行疏水性分析也显示出其高度的疏水特性(图1)。因此,推测该蛋白是一类典型的疏水蛋白。此外,二级结构预测显示(图2),Dwh蛋白由6个β折叠和靠近C端的1个α螺旋组成。
3、获得D.radiodurans R1dwh基因的缺失突变株Δdwh
通过PCR获得dwh基因上下游基因片段(dwh-U和dwh-D),同时获得编码卡那霉素抗性蛋白的Km基因片段(K)(图3),采用融合PCR技术将dwh-U、K、dwh-D三片段融合,获得dwh-UKD重组片段。然后将重组片段通过同源重组技术转化D.radiodurans R1感受态细胞,在含有Km抗性的TGY平板上进行压力筛选,获得dwh基因的缺失突变株Δdwh,并进行PCR及测序验证(图4)(见实施例1)。
4、D.radiodurans R1 dwh基因缺失突变株Δdwh的抗氧化实验
1)对野生型DR及突变株Δdwh分别进行氧化胁迫处理(80mM H2O2处理30min),观察不同菌株在氧化胁迫条件下的存活能力。结果显示,氧化胁迫条件下试验菌株存活能力均有下降,缺失dwh基因的突变株Δdwh与野生型DR菌株相比更加敏感,菌株存活能力下降1个数量级(见实施例2和图5、6)。结果表明dwh基因编码的蛋白对D.radioduransR1耐受氧化胁迫具有重要贡献。
2)对野生型DR及突变株Δdwh分别进行50mM H2O2处理30min,收集并洗涤菌体,用适量的磷酸缓冲液重悬菌体,超声破碎细胞,离心获得上清液总蛋白,并测定各样品总蛋白浓度。测定野生型DR及突变株Δdwh细胞内的抗氧化酶活性(CAT、POD、SOD)。结果显示,氧化胁迫条件下,突变株Δdwh的抗氧化酶活性与野生型DR菌株相比,均有所下降,CAT和POD下降更加明显(见实施例2和图7)。
以上结果表明,dwh基因在D.radiodurans R1中表达能够增强细胞的抗氧化能力,可能通过保护细胞内抗氧化酶避免氧自由基的损伤,从而发挥保护功能。
5、获得含有D.radiodurans R1dwh基因的重组工程菌株
1)通过PCR从D.radiodurans R1(CGMCC 1.633)菌株基因组扩增dwh基因,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。核苷酸长度为297bp(图8),该基因编码99个氨基酸,将其克隆于载体pJET1.2/Blunt上,构建了含有完整dwh基因的重组质粒pJET-dwh(图9);
2)将dwh基因连接于pET28a表达载体上,构建含有完整dwh基因的重组质粒pET28a-dwh;
3)将导入dwh基因的重组质粒pET28a-dwh转入原核宿主细胞受体大肠杆菌BL21中,获得重组工程菌株pET28a-dwh/BL21(见实施例3);
6、含有D.radiodurans R1dwh基因工程菌株的抗氧化实验
实验证实,经30mM H2O2处理10min后,含有D.radiodurans R1 dwh基因的pET28a-dwh/BL21重组菌株生长状况良好,菌落生存能力远高于只含空质粒的对照pET28a/BL21菌株(见实施例4及图10、11)。结果显示该工程菌株具有耐受高浓度H2O2胁迫的能力。
此实验表明:D.radiodurans R1dwh基因具有提高大肠杆菌抗氧化的能力。
附图说明:
图1是D.radiodurans R1Dwh蛋白的亲/疏水性分析图谱(其中横坐标表示氨基酸序列,纵坐标表示疏水性分值,疏水性分值越大表明该氨基酸疏水性越强;Hydrophilic——亲水,Hydrophobic——疏水);
图2是D.radiodurans R1Dwh蛋白的二级结构分析图谱;
图3是dwh基因上游dwh-U(1)、下游dwh-D(2)及抗性基因K(3)片段的PCR产物电泳图谱;
图4是突变株Δdwh的PCR验证图谱(泳道1-3:引物YZdwh-F/R分别以突变株Δdwh、野生型DR、无菌水为模板扩增dwh片段,验证dwh缺失完全;泳道4-6:引物YZdwh-U-F/D-R分别以突变株Δdwh、野生型DR、无菌水为模板扩增重组片段,验证dwh-UKD***位置);
图5是H2O2冲击试验前的野生型DR和突变株Δdwh生存能力的菌落照片,其中:
a是野生型的D.radiodurans R1菌株(DR);
b是缺失dwh基因的D.radiodurans R1突变体菌株(Δdwh);
图6是野生型DR和突变株Δdwh经80mM H2O2处理30min后,在TGY固体培养基中生长情况的菌落照片,其中:
a是野生型的D.radiodurans R1菌株(DR);
b是缺失dwh基因的D.radiodurans R1突变体菌株(Δdwh);
图7是野生型DR和突变株Δdwh经50mM H2O2处理30min后,细胞内的抗氧化酶活性的变化,其中:
a是突变株Δdwh在H2O2处理前后与野生型DR相比,细胞内的过氧化氢酶(CAT)活性的变化;
b是突变株Δdwh在H2O2处理前后与野生型DR相比,细胞内的过氧化物酶(POD)活性的变化;
c是突变株Δdwh在H2O2处理前后与野生型DR相比,细胞内的超氧化物歧化酶(SOD)活性的变化;
图8含有D.radiodurans R1dwh基因的PCR产物的验证电泳图谱;
图9是含有D.radiodurans R1dwh基因的原核重组表达质粒的构建验证电泳图谱;
图10是在H2O2冲击试验前的含有空质粒和含有D.radiodurans R1dwh基因的原核表达质粒的大肠杆菌的生长状况的菌落照片,其中:
a是含有空表达质粒的大肠杆菌BL21菌株;
b是含有D.radiodurans R1dwh基因表达质粒的大肠杆菌重组菌株;
图11是含有D.radiodurans R1dwh基因的原核表达质粒及空质粒的大肠杆菌(E.coli)经受30mM H2O2处理10min后,在LB固体培养基中的生长情况的菌落照片,其中:
a是含有空表达质粒的对照大肠杆菌菌株(pET28a/BL21);
b是含有D.radiodurans R1dwh基因表达质粒的大肠杆菌重组菌株(pET28a-dwh/BL21)。
具体实施方式
以下实施例中所举的质粒、菌株只是用于对本发明作进一步详细说明,并不对本发明的实质内容加以限制。凡未注明具体实验条件的,均为按照本领域技术人员熟知的常规条件,例如Sambrook等分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例中所举的质粒、菌株及试剂如下:
(1)质粒:
平末端克隆载体pJET1.2/Blunt(Amp)购自Thermo Scientific公司,pKatAPH3(携带Km抗性基因)质粒由本实验保存,表达载体pET28a由本实验室保存,pJET-dwh(dwh基因片段与克隆载体pJET1.2/Blunt连接)、pET28a-dwh(dwh基因片段与克隆载体pET28a通过酶切连接)重组质粒由本研究构建。
(2)实验菌株:
耐辐射异常球菌Deinococcus radiodurans Rl野生型菌株(CGMCC 1.633)由中国普通微生物菌种保藏中心提供;突变株Δdwh(缺失dwh基因的D.radiodurans Rl菌株)由本研究构建,D.radiodurans Rl及其突变菌株均在TGY培养基中生长,最适培养温度为30℃;
大肠杆菌Escherichia coli trans 109及BL21菌株购自北京全式金生物技术公司;pET28a/BL21(空载体pET28a转化大肠杆菌BL21菌株获得的重组菌株)、pET28a-dwh/BL21(重组质粒pET28a-dwh转化大肠杆菌BL21菌株获得的重组菌株)由本研究构建,E.coli及其重组菌株均在LB培养基中生长,培养温度为37℃。
(3)生化试剂:限制性内切酶购自NEB公司;dNTPs、高保真Primestar HS DNApolymerase、T4DNA连接酶等购自大连宝生物公司(TaKaRa);琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、普通DNA产物纯化试剂盒、普通质粒小提试剂盒均购自天根生化科技公司(TIANGEN);30%H2O2、IPTG、抗生素等购自阿拉丁(aladdin);实验中所用引物合成及测序均由华大基因公司完成。
(4)培养基:
LB培养基:胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,NaCl 10g/L,pH调至7.0,固体培养基中加入agar 15g/L。高压蒸汽(121℃,1.034×105Pa)灭菌30min。
TGY培养基:胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,葡萄糖1g/L,固体培养基中加入agar 15g/L。高压蒸汽(112℃,1.034×105Pa)灭菌30min。
(5)抗生素及主要溶液配制:
氨苄青霉素(Amp)(50mg/mL):称取0.5g氨苄青霉素粉末,溶于10mL双蒸水中,滤膜过滤除杂后分装,保存于-20℃冰箱;
卡那霉素(Km)(50mg/mL):称取0.5g卡那霉素粉末,溶于10mL双蒸水中,滤膜过滤除杂后分装,保存于-20℃冰箱;
IPTG(100mmol/L):称取0.24g IPTG,溶于10mL双蒸水中,滤膜过滤除菌后分装,保存于-20℃冰箱;
CaCl2(0.3mol/L):称取4.5g CaCl2·2H2O粉末,溶解于80mL双蒸水中,定容至100mL,高压蒸汽(121℃)灭菌;
0.1mol/L H2O2:30%的H2O2溶液5.68mL稀释至1000mL;
130mmol/L甲硫氨酸Met溶液:称1.9399g Met用磷酸缓冲液定容至100mL;
750μmol/L氮蓝四唑NBT溶液:称0.06133g NBT用磷酸缓冲液定容至100mL,避光保存;
100μmol/L EDTA-Na2溶液:称0.03721g EDTA-Na2,用磷酸缓冲液定容至1000mL;
20μmol/L核黄素溶液:称0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000mL,避光保存;
0.05mol/L愈创木酚溶液:称取6.2065g(124.13g/mol×0.05mol),然后溶于1L 95%乙醇中,即为1L的0.05mol/L愈创木酚溶液;
2%H2O2:吸取20mL 30%H2O2溶于280mL蒸馏水中,即为300mL的2%H2O2。
所用PBS溶液按照分子克隆手册配备。
实施例1获得D.radiodurans R1dwh基因的缺失突变株Δdwh
从NCBI的GeneBank中获得D.radiodurans R1全基因组序列和质粒pKatAPH3序列,
根据dwh基因序列和卡那抗性基因序列设计引物(见表1)。
表1基因片段扩增所用的引物
采用融合PCR方法构建突变株Δdwh。以D.radiodurans R1基因组DNA为模板,分别用表1中合成的引物U-F/U-R扩增dwh基因上游片段,扩增产物dwh-U长度为749bp;用D-F/D-R引物扩增dwh基因下游片段,扩增产物dwh-D长度为595bp;以pKatAPH3质粒为模板,用K-F/K-R引物扩增卡那抗性基因片段,扩增产物K长度为1007bp。分别对各扩增产物进行纯化回收,条带单一(图3),在反应体系中加入等摩尔的三片段产物,引物U-F/D-R,采用一步融合法进行融合PCR反应,得到三片段的融合产物dwh-UKD(2268bp)。PCR反应条件为:94℃10min;94℃1min;60℃1min;72℃5min;17个循环;94℃1min;60℃1min;72℃3min;30个循环;72℃10min。
对融合产物dwh-UKD(2268bp)进行测序验证,完全与实验设计的序列一致。通过同源重组转化野生型D.radiodurans R1。在含有10μg/mL的Km平板上筛选缺失突变株Δdwh。通过PCR方法对Δdwh进行鉴定。以突变株Δdwh基因组DNA为模板,用YZdwh-F/YZdwh-R引物扩增dwh基因片段,未获得346bp条带,而在阴性对照D.radiodurans R1基因组DNA中能够扩增出346bp大小条带;用YZdwh-U-F/YZdwh-D-R引物扩增YZdwh-UKD片段仅获得2591bp条带,以D.radiodurans R1基因组DNA为模板扩增获得1985bp条带,同时以无菌水作空白对照。结果表明卡那抗性基因完全替代了dwh基因,完整的整合到dwh基因在D.radiodurans R1基因组DNA上所在的位置(图4)。
实施例2D.radiodurans R1dwh基因缺失突变株Δdwh的抗氧化实验
一、实验方法
(1)菌株的抗氧化表型实验
分别从划线培养的TGY平板上挑取野生型DR与突变株Δdwh单菌落接种到2mLTGY液体培养基中(突变株培养基中含有10μg/mL Km抗生素),30℃振荡培养至对数中期,1%分别转接到新鲜的50mL TGY液体培养基中(突变株培养基中含有10μg/mL Km抗生素),培养至对数初期(OD600约为0.6),各取1mL菌液,分别加入8μL 30%H2O2溶液,至菌液的H2O2终浓度为80mM(10mM H2O2≈1μL 30%H2O2),并设置对照组(未加入H2O2),30℃摇床分别温育30min后,立即用无菌去离子水等比稀释(10-1至10-5)。每个稀释度各取10μL点在TGY固体培养基表面,经30℃恒温培养2-3天,观察野生型和突变株在TGY培养基平板上的生长情况。分别进行三次独立重复实验。
(2)细胞内抗氧化酶活测定
分别从划线培养的TGY平板上挑取野生型DR与突变株Δdwh单菌落接种到20mLTGY液体培养基中(突变株培养基中含有10μg/mL Km抗生素),30℃振荡培养至对数中期,1%分别转接到200mL新鲜TGY液体培养基中(突变株培养基中含有10μg/mL Km抗生素),30℃220rpm培养至对数初期(OD600约为0.6),分别用50mM H2O2处理野生型DR与突变株Δdwh,并设置对照组(未加入H2O2的野生型DR与突变株Δdwh),摇床避光处理30min后,立即收菌(4℃8000rpm 10min),用无菌水洗涤菌体两次,最后重悬于5mL 50mM pH 7.0的PBS缓冲液中;于冰上进行超声破碎处理细胞(功率不超过200W,工作2s,间隔3s,处理时间45~60min,变幅杆Φ3),4℃12000rpm 20min离心,于冰上分装后测定各个样品总蛋白浓度(Bradford方法),并保存总蛋白于-20℃。
A细胞内过氧化氢酶(CAT)活性测定
①室温条件下(25℃),取1.5mL EP管,其中一个为样品测定管(每个样品1个),另一个为空白对照管(CK),按表2顺序加入试剂。
表2过氧化氢酶(CAT)活性测定各组分配方表
试剂 | 对照管CK | 样品管 |
0.2M pH7.8PBS(μL) | 100 | 90~95 |
0.1M H2O2(μL) | 100 | 100 |
粗酶液(μL) | 0 | 5~10 |
总体积(μL) | 200 | 200 |
用UV-3010分光光度计测定,关掉钨灯WI(340~1200nm),打开氘灯D2(190~340nm),先调零,内侧比色皿加入1mL 0.2M pH 7.8PBS,外侧比色皿先加入CK溶液(200μL),迅速调零;
②样品测定时,按表2顺序加入各成分,并迅速混合,立即开始计时,240nm下测定其吸光度,分别于15s、30s、45s、1min、1.5min、2min、3min读数。
③待所有样品全部测完后,按下列公式计算酶活性。以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位(Unit)。
CAT活性(Unit/μg·μL-1·min)=ΔA240·V1/(0.1·V2·t·C)
式中:ΔA240为样品管吸光值的绝对值;V1为反应液总体积(μL);V2为测定用粗酶提取液体积(μL);C为粗酶提取液总蛋白浓度(μg·μL-1);0.1为A240每下降0.1为1个酶活单位(U);t为过氧化氢到最后一次读数时间(min)。
B细胞内过氧化物酶(POD)活性测定
①酶活性测定显色反应体系如下:
表3过氧化物酶(POD)活性测定各组分配方表
试剂 | 对照管CK | 样品管 |
0.05M pH5.5PBS(μL) | 300 | 290~295 |
2%H2O2(μL) | 100 | 100 |
0.05mol/L愈创木酚 | 100 | 100 |
粗酶液(μL) | 0 | 5~10 |
总体积(μL) | 500 | 500 |
②首先调零:按照反应体系设置对照组CK,34℃保温3min后加入500μL 0.05M pH5.5PBS,分别于内侧石英比色皿加入1mL 0.05M pH 5.5PBS,外侧比色皿加入CK溶液(200μL),470nm波长下调零;
③同样,样品测定时首先按照表1-2的样品管加入各组分,待加入酶液后,立即于34℃保温3min。然后立即加入500μL 0.05M pH 5.5PBS,迅速稀释1倍,470nm波长下测定,每隔1min记录1次吸光度,分别测定1、2、3、4、5、6、7、8min的吸光值;
④待所有样品全部测完后,按下列公式计算酶活性。以每分钟内A470变化0.01为1个酶活性单位(Unit)。
⑤按下列公式计算出过氧化物酶活性Unit/(μg·μL-1·min)。
POD活性=ΔA470·V1/(0.01·V2·t·C)
ΔA470为反应时间内吸光度的变化,即所测得的A470读数;V1为反应液总体积(μL);V2为测定用粗酶提取液体积(μL);C为粗酶提取液总蛋白浓度(μg·μL-1);0.01为A470每变化0.01为1个酶活单位(U);t为反应时间(min)。
C细胞内过氧化物酶(POD)活性测定
①SOD酶活性测定反应体系,在具塞试管(10mL)中按表4依次加入以下溶液:
表4超氧化物歧化酶(SOD)活性测定各组分配方表
试剂 | 对照管CK | 样品管 |
0.05mol/L pH 7.8PBS(mL) | 1.5 | 1.45~1.47 |
130mmol/L甲硫氨酸Met溶液(mL) | 0.3 | 0.3 |
750μmol/L氮蓝四唑NBT溶液(mL) | 0.3 | 0.3 |
100μmol/L EDTA-Na2溶液(mL) | 0.3 | 0.3 |
20μmol/L核黄素溶液(mL) | 0.3 | 0.3 |
蒸馏水(mL) | 0.25 | 0.25 |
酶液(mL) | 0 | 0.05~0.03 |
总体积(mL) | 3 | 3 |
②混匀后将1支对照管置暗处不照光,其他各管于4000lx日光下反应20min。
③至反应结束后,以不照光的对照管设置空白,分别取样品200μL于酶标板中,测定各管在560nm处的吸光值。
④按下列公式计算出SOD活性U/(μg·μL-1)。SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示。
SOD活性=(ACK-AE)·V1/(0.5·ACK·C·V2)
ACK为照光对照管的吸光值,AE为样品管的吸光值,V1为反应液总体积(μL),V2为测定用粗酶提取液体积(μL),C为粗酶提取液总蛋白浓度(μg·μL-1)。
二、实验结果
(1)氧化胁迫对菌株具有强烈的杀伤作用,利用过氧化氢溶液进行氧化冲击处理,分析高浓度H2O2对野生型DR和突变株Δdwh生长的影响。图5和图6是H2O2冲击试验前后的D.radiodurans R1菌株的生长状况的菌落照片,其中:a是野生型DR菌株;b是缺失dwh基因的D.radiodurans R1突变株Δdwh;从图中可清楚看出:
H2O2处理前:
野生型DR菌株与缺失dwh基因的突变株Δdwh生长能力基本一致(见图5);
H2O2处理后:
经80mM H2O2处理后,野生型DR菌株与缺失dwh基因的突变株Δdwh的生存能力均有所下降,而突变株Δdwh对氧化胁迫更加敏感;突变株Δdwh较野生型DR菌株的菌落形成相差至少一个数量级,其生存能力远低于野生型DR菌株(见图6)。
(2)分别用50mM H2O2处理野生型DR菌株与缺失dwh基因的突变株Δdwh 30min,测定四个不同菌株样品(DR、DR-H2O2、Δdwh、Δdwh-H2O2)细胞内抗氧化酶(CAT、POD、SOD)活性(图7),结果显示,未处理的Δdwh细胞内的三种抗氧化酶活性均低于野生型DR菌株,表明dwh基因缺失导致D.radiodurans R1细胞内的抗氧化酶活性下降;经50mMH2O2处理的野生型(DR-H2O2)和突变株(Δdwh-H2O2)与未处理的对照相比,抗氧化酶活性均有所下降(SOD活性除外)(图7c),突变株Δdwh的抗氧化酶活性下降更加显著,尤其是H2O2处理的突变株Δdwh中CAT(图7a)和POD(图7b)的酶活性下降为野生型DR的6%-10%,表明氧化胁迫条件下,缺失dwh基因的突变株Δdwh清除氧自由基的能力下降。
三、实验结论
野生型DR菌株对氧化胁迫的抗性高于缺失dwh基因的突变株Δdwh,dwh基因的缺失减弱了D.radiodurans R1清除氧自由基(ROS)的能力。
实施例3D.radiodurans R1dwh基因在大肠杆菌中的表达
根据已公布的D.radiodurans R1基因组中的dwh基因序列设计1对PCR特异性引物,从D.radiodurans R1基因组DNA中扩增完整的核苷酸序列:
Up 5′CGGGATCCATGCTCACGAGTTTCAGTTT3′;
Down 5′CCCAAGCTTTCACGTCAGAGTTCCGTCCA3′。
通过PCR方法从D.radiodurans R1的基因组中扩增出目的基因片段,反应条件:95℃10min,[95℃30sec,62℃30sec,72℃30sec]35个循环,72℃10min,PCR产物经胶回收后,克隆于平末端载体pJET1.2/Blunt上,命名为pJET-dwh,并测序验证;然后通过BamH I/Hind III双酶切获得含有粘性末端的pET28a表达载体及dwh基因片段,将dwh片段连接于pET28a载体上,构建大肠杆菌重组表达质粒pET28a-dwh,将该表达质粒转化大肠杆菌BL21,经PCR、质粒酶切、测序验证***序列正确(见图8,9),将该重组菌株命名为pET28a-dwh/BL21。
将含有pET28a空质粒的E.coli BL21命名为pET28a/BL21。
实施例4含D.radiodurans R1dwh基因重组菌株的抗氧化实验
一、实验方法
1、将实施例3中获得的含有D.radiodurans R1dwh基因的pET28a-dwh/BL21菌株与含空质粒的pET28a/BL21菌株分别接种于20mL LB液体培养基(含Km抗生素)中,摇瓶过夜(37℃)培养后,再分别转接于100mL的LB液体培养基中,保持接种量的一致,培养30min后加入终浓度为0.1mM的IPTG,继续培养至OD600≈0.5即可。
2、取1mL的菌液,加入30%的H2O2溶液3μL使菌液终浓度为30mM,处理10min后,每个样品立即用无菌去离子水倍比稀释至10-5,取10μL点在LB固体培养基表面,经37℃培养16h,观察菌落形成情况并照相。
二、实验结果
图10和图11是H2O2冲击试验前后的大肠杆菌的生长状况的菌落照片,其中:a是含有空表达质粒的大肠杆菌BL21菌株;b是含有D.radiodurans R1dwh基因表达质粒的大肠杆菌重组菌株;从图中可清楚看出:
H2O2处理前:
含有D.radiodurans R1dwh基因的pET28a-dwh/BL21菌株与含空质粒的pET28a/BL21菌株生长能力基本一致(见图10);
H2O2处理后:
经30mM H2O2处理后,只含空质粒的pET28a/BL21菌株几乎不能正常生长;
含有D.radiodurans R1dwh基因的pET28a-dwh/BL21重组菌株生长状况良好,其生存能力远高于只含空质粒的pET28a/BL21菌株,对照菌株pET28a/BL21几乎不能正常生长(见图11)。
三、实验结论
含有D.radiodurans R1dwh基因的重组菌株对氧化胁迫的抗性远高于只含空质粒的菌株,该基因的表达提高了大肠杆菌的抗氧化能力。
Claims (8)
1.一种用于培育抗氧化微生物的基因,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述基因培育抗氧化微生物的用途。
3.含权利要求1所述基因的重组质粒。
4.权利要求3所述的重组质粒培育抗氧化微生物的用途。
5.用权利要求3所述的重组质粒转化的原核宿主细胞。
6.含权利要求3所述的重组质粒的重组工程菌株。
7.一种能够提高微生物抗氧化能力的蛋白,其氨基酸序列SEQ ID NO.2所示。
8.权利要求1所述蛋白培育抗氧化微生物的用途。
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