CN107164282B

CN107164282B - 一种生产5‑羟色氨酸的方法

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Publication number: CN107164282B
Application number: CN201710542522.8A
Authority: CN
Inventors: 孙敬方; 赵云现
Original assignee: Nanjing Shoubai Biotechnology Co ltd; Blrh Biotech Co ltd
Current assignee: Nanjing Shoubai Biotechnology Co ltd; Blrh Biotech Co ltd
Priority date: 2017-07-05
Filing date: 2017-07-05
Publication date: 2018-03-23
Anticipated expiration: 2037-07-05
Also published as: CN107164282A

Abstract

本发明涉及一种生产5‑羟色氨酸的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)JSC‑69，其保藏编号为CGMCC NO：13533；以及应用该地衣芽孢杆菌生产5‑羟色氨酸的方法。本发明地衣芽孢杆菌JSC‑69以色氨酸为底物生产5‑羟色氨酸，转化效率达95％～100％。

Description

一种生产5-羟色氨酸的方法

技术领域

本发明涉及一种芽孢杆菌以及利用芽孢杆菌发酵生产5-羟色氨酸的方法，属于生物技术领域。

背景技术

5-羟色氨酸(5-HTP)是人体内激素serotonin的前驱物质，有镇静作用，可以帮助人体内这种激素的生产，使自己体内达到平衡。5-HTP是色氨酸、5-羟色胺(复合胺)的反应媒介，也就是说，5-羟色氨酸是重要的抑制神经传递素复合胺(5-HT)的前体。在脑部、血小板、肠胃、中枢神经***中均有复合胺。在情绪变化时，会相应分泌复合胺，它是脑部控制情绪、行为、胃口、睡眠、冲动的重要化学物质。5-羟色氨酸能有效帮助产生复合胺，因此可促进情绪、神经***的健康。研究表明，5-羟色氨酸可抑制食欲，减少脂肪摄取，减少焦虑，控制情绪，促进睡眠。目前国内可稳定生产的有优速达生物，产品质量已经得到欧美等国家的认可。

5-HTP作为食品成分是天然提取来自于Griffonia simplicifolia，一个西非药物植物的种子中得到的。5-羟色氨酸是一个自然氨基的酸性物质，在许多饮食所含的蛋白质中可以找到。5-羟色氨酸是处方药-百忧解(Prozac)的天然替代品。正如百忧解一样，5-羟色氨酸可增强5-羟色胺的活动力。

5-羟色胺是脑部分泌的一种激素，会影响我们的情绪、睡眠和食欲，造成脑中的血清素不平衡时需5-羟色氨酸来维持身体处于正常状态。因此含量太低则容易忧郁、焦虑及睡眠失调。百忧解这类的药物，可防脑细胞太快耗尽血清素，而导致5-羟色胺不足。而5-羟色氨酸的功效稍有不同：它可增加脑细胞的血清素制造量，进而提升5-羟色胺的含量。

5-羟色氨酸在人体中会制造出血清素，对于正常的神经的重要物质和脑的功能有帮助。血清素可以帮助睡眠，也可有效的控制疼痛。因此5-羟色氨酸也成功地被拿来治疗睡眠失调。由于血清素是褪黑激素(一种调节睡眠和清醒周期的天然荷尔蒙)的前身，因此当血清素的含量提高时，褪黑激素的含量也就增加。既然5-羟色氨酸和SSRI的作用类似，何不服用后者就好。原因之一是抗忧郁处方药贵；二是处方药常会引起一些不良的副作用，包括口干、焦虑及丧失***。

此外，使用5-HTP能帮助抑制食欲，它能使人体所摄取的碳水化合物更少且更快感到饱足，每天摄取750毫克的5-HTP可以减少碳水化合物的吸收，并且不使体重增加，进而达到减轻体重的效果。

5-羟色氨酸的临床应用：1、抗忧郁、镇定剂：5-HTP可增加脑细胞的血清素制造量，进而提升5-羟色胺的含量。5-羟色氨酸在人体中会制造出血清素，对于正常的神经的重要物质和脑的功能有帮助。血清素可以帮助睡眠，也可有效的控制疼痛，可以治疗忧郁症；2、减缓压力和改善睡眠方面：当血清素的含量提高时，褪黑激素的含量也就增加，使得睡眠更为香甜；3、减肥：可以有效控制食欲，提高饱食中枢的敏感性，在减肥过程的饮食控制中，降低饥饿感，使减肥过程更轻松容易达成，是当前流行的减肥食品辅助剂。对想减肥的人是一大福音；4、其他：除具有传统的医药功能和抗忧郁症外，还具有减肥、戒瘾、改善睡眠、缓和经前综合症，治疗偏头疼等功能；5-羟色氨酸现已被欧美各大保健品公司广泛应用。用于通过自然地提高血清素的水平，增加人体血液中复合胺的生成。目前，5-羟色氨酸的制备主要由植物来源，提取于非洲的植物加纳种子。但产量受资源限制，并且提取成本高。显然，微生物转化和发酵法生产是一条良好的途径。

发明内容

为解决现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种芽孢杆菌以及利用该芽孢杆菌发酵生产5-羟色氨酸的方法。

一种生产5-羟色氨酸的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)JSC-69，其已在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，编号为CGMCC NO：13533，保藏日期为2017年01月05日。

所述地衣芽孢杆菌JSC-69的鉴定：

1、菌体的形态特征：单个细菌0.6×2.0微米。无荚膜，不成链，能运动。革兰氏阳性菌，需氧菌。芽孢椭圆形至柱状，中间膨大，芽孢在中间或偏一端，0.9×1.5微米。当培养于肉汤琼脂平板上时，菌落近似圆形，乳白色，表面暗，不透明，边缘不整齐，菌落粗糙，粘着，扩展。菌落与培养基紧贴，不易挑取；液体培养有菌膜，无浑浊，无沉淀。

2、菌体的生理生化鉴定：将地衣芽孢杆菌JSC-69进行生理生化性状检测，结果：该菌株接触酶试验呈阳性。明胶液化，淀粉水解，V.P试验阳性，柠檬酸盐利用。甲基红试验呈阴性，卵磷脂酶试验阴性，可利用硝酸盐，可利用D-葡萄糖、L-***糖、D-木糖和D-甘露醇产酸。

本发明进一步提供应用所述的地衣芽孢杆菌JSC-69生产5-羟色氨酸的方法，该方法具体包括如下步骤：

步骤a，对地衣芽孢杆菌JSC-69进行扩大培养；

步骤b，用步骤a扩大培养获得到的地衣芽孢杆菌JSC-69转化色氨酸；和

步骤c，收集5-羟色氨酸。

进一步，步骤a所述扩大培养包括斜面培养、摇瓶培养、种子罐培养和发酵罐培养中的任意一种或几种的组合。

所述扩大培养过程所用培养基是含有可吸收的碳、氮和磷源的含水培养基。所述培养基还可包括适宜的盐、矿物质、金属和其他营养成分；所述碳源选自葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、糊精、甘油、淀粉、糖浆和糖蜜中的一种或多种；氮源选自氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、硝酸钾中的一种或多种。

其中，所述摇瓶培养和种子罐培养阶段所用培养基是含有可吸收的碳、氮和磷源的含水培养基；所述培养基还可包括适宜的盐、矿物质、金属和其他营养成分；所述碳源选自葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、糊精、甘油、淀粉、糖浆和糖蜜中的一种或多种；氮源选自氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、硝酸钾中的一种或多种。优选所述培养基组分包括胰蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉浸膏、酵母膏、葡萄糖、玉米浆、氯化钠。

所述发酵罐培养阶段所用发酵培养基是含有可吸收的碳、氮和磷源的含水培养基。所述培养基还可包括适宜的盐、矿物质、金属和其他营养成分；所述碳源选自葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、糊精、甘油、淀粉、糖浆和糖蜜中的一种或多种；氮源选自氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、硝酸钾中的一种或多种。优选所述发酵培养基组分包括：蔗糖、豆粕、(NH₄)₂SO₄、K₂HPO₄·3H₂O、KH₂PO₄；进一步优选所述发酵培养基组成为：蔗糖40g/L，豆粕40g/L，(NH₄)₂SO₄5g/L，K₂HPO₄·3H₂O8g/L，KH₂PO₄1.8g/L；初始pH6.5～7.0。

进一步，步骤a所述扩大培养条件为：温度25-45℃，pH6.5-7.0，时间20-50小时。

其中，所述摇瓶和种子罐培养阶段培养条件为：温度25-45℃，pH6.5-7.0，时间20-30小时。

所述发酵罐培养阶段培养条件为：发酵温度30-35℃，pH为6.5-7.0，发酵时间30-50小时。优选，发酵温度32℃，pH6.8，发酵时间45小时。

进一步，步骤b所述色氨酸浓度为0.2-10g/L；转化条件为：25-45℃下转化40-60小时，pH为6-8。

进一步，步骤c所述“收集5-羟色氨酸”包括如下方法：对步骤b得到的转化产物进行离心处理，取上清液部分即为产物5-羟色氨酸。

进一步，本发明方法还包括：步骤d，对产物5-羟色氨酸进行纯化。所述“纯化”过程依次包括固液分离、阳离子交换树脂吸附分离、浓缩、乙醇溶解、蒸馏的步骤。

本发明所述“扩大培养”以菌种扩增为目的，将处于休眠状态的菌种活化后，再经过逐级扩大培养，最终获得一定数量和质量的菌种的过程。所述扩大培养的一般过程为：斜面培养、摇瓶培养、种子罐逐级培养、发酵罐培养，在实际操作中，种子罐培养级数可按照发酵规模、菌体生长特性、接种量等因素而确定。

本发明所述“底物”是指待转化的反应物，所述“转化”是指利用微生物，在适宜的条件下，将待转化的反应物经过特定的代谢途径转化为人类所需要的产物的过程。本发明以“色氨酸”为底物，经过特定菌种地衣芽孢杆菌JSC-69的转化，得到终产物“5-羟色氨酸”。

本发明所述地衣芽孢杆菌JSC-69(Bacillus licheniformis JSC-69)，与一般的芽孢杆菌相比，具有更广泛的发酵温度(30℃～37℃)，可以利用复杂氮源，短时间内生长达到较高的生物量，可生物转化色氨酸生产5-羟色氨酸。通过对发酵条件的优化，地衣芽孢杆菌JSC-69以色氨酸为底物生产5-羟色氨酸，转化效率达95％～100％，可将转化液经进一步纯化及能得到高纯度的5-羟色氨酸。

具体实施方式

实施例1菌株筛选

平板筛选培养基：牛肉膏5g/L，大豆蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂15g/L。

筛选时所用液体培养基：蔗糖20g/L，豆粕20g/L，(NH₄)₂SO₄3g/L，K₂HPO₄·3H₂O5g/L，KH₂PO₄1g/L，牛肉膏2g/L，大豆蛋白胨4g/L，NaCl 5g/L，色氨酸8g/L；pH值7.0。

从南京及周边地区共采集100多份土样或水样，并制成适当浓度的稀释液，直接涂布于筛选培养基平板，37℃培养1天，分别挑取不同形态的单菌落接种于装有液体培养基的试管，30℃、200rpm震荡培养2天，离心取发酵上清液。测定上清中5-羟色氨酸含量。从500多个菌落中检测到4株可以产生5-羟色氨酸。

取初筛得到的菌株分别接种于装有5ml液体培养基的试管中，30℃震荡培养2天。然后转接到装有50ml液体培养基的三角瓶，30℃、200rpm发酵2天。用HPLC法精确测定发酵上清中5-羟色氨酸的含量。结果见表1。

表1部分筛菌株的产5-羟色氨酸情况

菌株编号	5-羟色氨酸的含量(g/L)
		JSC-24	1.2
JSC-69	7.7
		JSC-137	6.8
JSC-403	0.4

结果表明，菌株JSC-69和JSC-137发酵液中5-羟色氨酸含量明显高于另外两种菌株。

实施例2菌株JSC-69的鉴定

对JSC-69按《伯杰氏***细菌学手册》(第二版，2004)进行形态特征及生理生化特征的鉴定。在平板培养基上划线培养1天，菌落近似圆形，乳白色，表面暗，不透明，边缘不整齐，菌落粗糙，粘着，扩展。菌落与培养基紧贴，不易挑取；液体培养有菌膜，无浑浊，无沉淀。单个细菌0.6×2.0微米。无荚膜，不成链，能运动。革兰氏阳性菌，需氧菌。芽孢椭圆形至柱状，中间膨大，芽孢在中间或偏一端，0.9×1.5微米。将JSC-69进行生理生化性状检测，结果：该菌株接触酶试验呈阳性。明胶液化，淀粉水解，V.P试验阳性，柠檬酸盐利用。甲基红试验呈阴性，卵磷脂酶试验阴性，可利用硝酸盐，可利用D-葡萄糖、L-***糖、D-木糖和D-甘露醇产酸。

基于形态特征、生理生化特性分析，认为JSC-69属于Bacillus licheniformis新菌株，以命名为Bacillus licheniformis JSC-69。此菌株已于2017年01月05日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCC NO：13533。

实施例3菌株JSC-69的发酵培养与目标产物转化

1、扩大培养

(1)一级种子培养：取新鲜培养约18小时的平板种子培养基上单克隆菌株，接种于6ml的液体种子培养基中，37℃、225rpm培养约24小时。平板种子培养基成分(/L)：牛肉膏5g，大豆蛋白胨10g，NaCl 5g，水1L，15g琼脂。液体种子培养基成分(/L)：牛肉膏5g，大豆蛋白胨10g，NaCl 5g，水1L，pH值7.0。0.1MPa灭菌20min。

(2)二级种子培养：取6ml一级种子培养液，接种于含200ml的二级种子培养液的1000ml摇瓶中，30℃、225rpm培养约24小时。至OD₆₀₀值为6.0-10。二级种子培养液基成分：0.1％蛋白胨，0.2％玉米浆，0.5％葡萄糖，0.5％酵母膏，pH 8.0。

(3)发酵罐发酵培养

1)发酵培养基成分：见表2。初始pH6.5～7.0。

表2发酵培养基成分

名称	用量(g/L)
		蔗糖	40
豆粕	40
		(NH₄)₂SO₄	5
K₂HPO₄·3H₂O	8
		KH₂PO₄	1.8

2)主要技术参数及优化筛选

基本技术参数：接种量1％；发酵温度31℃；pH6.7；发酵时间40h。

在此基本技术参数基础上，进行摇瓶试验，对接种量、发酵温度、pH、发酵时间等因素分别进行了优化筛选。摇瓶试验方法：取菌株接种于装有5ml种子培养基的试管中，30℃震荡培养2天。然后转接到装有50ml发酵培养基的摇瓶中，发酵。发酵培养基中加入8g/L色氨酸底物。用HPLC法精确测定发酵上清中5-羟色氨酸的含量。

a)接种量的影响

考察了不同接种量对5-羟色氨酸催化合成的影响。其它技术参数条件：发酵温度31℃；pH6.7；发酵时间40h。结果见表3。

表3不同接种量对5-羟色氨酸催化合成的影响

接种量(％)	5-羟色氨酸的含量(g/L)
		0.5	7.3
1.0	7.8
		1.5	7.7
2.0	7.6

从表3可以看出，接种量过低(0.5％)，或过高(2.0％)对色氨酸催化合成5-羟色氨酸均不利，以1.0％接种量为佳。可能接种量过低，不利于菌体生长；接种量过高，菌体生长过快容易衰老进而催化效果。

b)发酵温度的影响

考察了不同发酵温度对5-羟色氨酸催化合成的影响。其它技术参数条件：接种量1.0％；pH6.7；发酵时间40h。结果见表4。

表4不同发酵温度对5-羟色氨酸催化合成的影响

发酵温度(℃)	5-羟色氨酸的含量(g/L)
		30	7.6
31	7.7
		32	7.8
33	7.6
		34	7.4
35	7.3

从表4可以看出，发酵温度对色氨酸催化合成5-羟色氨酸有一定的影响，32℃以下较32℃催化效果差，但32℃以上也较32℃催化效果差，而且随温度升高，效果越来越差。以32℃发酵最佳。

c)pH的影响

考察了不同pH对5-羟色氨酸催化合成的影响。其它技术参数条件：接种量1.0％；发酵温度32℃；发酵时间40h。结果见表5。

表5不同pH对5-羟色氨酸催化合成的影响

pH	5-羟色氨酸的含量(g/L)
		6.5	7.2
6.6	7.3
		6.7	7.7
6.8	7.9
		6.9	7.7
7.0	7.3

从表5可以看出，pH对色氨酸催化合成5-羟色氨酸有一定的影响，pH6.8以下或pH6.8以上均较pH6.8催化效果差，以pH6.8发酵时催化效果最佳。

d)发酵时间的影响

考察了不同发酵时间对5-羟色氨酸催化合成的影响。其它技术参数条件：接种量1.0％；发酵温度32℃；pH6.8。结果见表6。

表6不同pH对5-羟色氨酸催化合成的影响

发酵时间(h)	5-羟色氨酸的含量(g/L)
		30	6.7
35	7.0
		40	7.8
45	7.9
		50	7.8
55	7.8

从表6可以看出，不同发酵时间下色氨酸催化合成5-羟色氨酸有一定的差别，随发酵时间延长，催化效果逐渐增加。但45h以后，催化效果已达到顶峰，之后不再增加。因此发酵时间以45h为佳。

因此，经优化筛选，优化后技术参数：接种量1％；发酵温度32℃；pH6.8；发酵时间45h。

3)工艺操作

种子制备要求：菌种鉴定符合特性，无变异，无杂菌。

培养基配置：按配方准确称量。蔗糖加适量水充分溶解；(NH₄)₂SO₄，K₂HPO₄·3H₂O，KH₂PO₄，加适量水充分溶解。消泡剂适量。

发酵空罐灭菌：温度121～130℃，保持流通蒸汽，罐压0.09～0.15Mpa，维持时间30分钟。

进料加水：调整总体积。

发酵实罐灭菌：温度121℃，罐压0.08～0.15Mpa，通气量0.8～1.0vvm，维持时间30分钟，保持流通蒸汽；最后降温至30℃。

接种：接种量1％。

培养：温度32℃，时间45小时，罐压0.05～0.08Mpa，pH 6.8，DO25％以上。芽孢形成率98％，培养终止，得到JSC-69转化用菌液，液体菌数≥2.0×10⁹cfu/ml。降温保压。

2、目的产物转化与生产

(1)收集菌体细胞：取所述地衣芽孢杆菌JSC-69转化用菌液在离心机上以4000r/min的转速高心10min，收集菌体细胞沉淀。

(2)转化：将0.2M的磷酸盐缓冲液(pH7.4)加到所述菌体细胞沉淀中，形成菌体浓度为3.0×10⁷～8.0×10⁷个/ml的菌悬液；然后加入浓度为8.0g/L的色氨酸，在32℃温度下、通气量为1.0L/min、以225r/min的转速进行转化，45h后，得到转化液。

所述0.2M的磷酸盐缓冲液(pH7.4)的配制：将71.6g Na₂HPO₄·12H₂O溶于1000ml水，得到0.2M Na₂HPO₄；然后将31.2g NaH₂PO₄·2H₂O溶于1000ml水，得到0.2M NaH₂PO₄；最后，将19ml 0.2M的NaH₂PO₄和81ml 0.2M的Na₂HPO₄混合均匀后即得。

(3)固液分离：将所述转化液在离心机上以4000r/min的转速高心10min，得到含5-羟色氨酸上清液。

地衣芽孢杆菌JSC-69以色氨酸为底物转化生产5-羟色氨酸，24h转化率达95％～100％。

实施例4产物的纯化与提取

1、发酵液固液分离：采用离心或陶瓷膜分离法收集菌体。

2、001×7阳离子交换树脂(732)吸附分离，氨水洗脱。

经筛选，001×7阳离子交换树脂吸附分离效果最佳，适合于99％规格5-羟色氨酸的规模化生产。001×7树脂吸附分离的条件为：在常温下，上样液5-羟色氨酸质量浓度为10.8mg/ml，调pH为3.5，以4.0ml/min的上样速度上样，以3倍树脂体积的7.0％氨水以3.0ml/min的洗脱速度进行洗脱，洗脱液浓缩结晶后获得的产品中5-羟色氨酸质量分数大于99.0％，灰分小于1.0％。

3、浓缩成固体

将洗脱液剂型双效或多效蒸发浓缩成固体。烘干去除水分。

4、热水溶解，高选择性的树脂吸附分离

将浓缩固体用热水溶解，进一步用对5-羟色氨酸高度选择性的树脂吸附分离，去除杂质。氨水洗脱后，浓缩，结晶。得高纯度5-羟色氨酸。

实施例5产物分析方法

产物分析方法为HPLC检测方法。采用ShimadzuC18反相柱，0.05％的三氯乙酸(TCA)-甲醇(68.75∶31.25，v/v)为流动相，对色氨酸和5-羟色氨酸的标准溶液和样品进行色谱测定。进样量：10μL，流动相流速：1.5ml/min等梯度洗脱，紫外分光光度检测器的波长为275nm。所有溶液在使用前均用0.45μm滤膜过滤。用外标法进行计算。

Claims

1.一种生产5-羟色氨酸的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)JSC-69，其保藏编号为CGMCC NO：13533。

2.应用权利要求1所述的地衣芽孢杆菌JSC-69生产5-羟色氨酸的方法。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

步骤a，对地衣芽孢杆菌JSC-69进行扩大培养；

步骤c，收集5-羟色氨酸。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤a所述扩大培养依次经过斜面培养、摇瓶培养、种子罐培养、发酵罐培养。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵罐培养阶段培养条件为：发酵温度30-35℃，pH6.5-7.0，发酵时间30-50小时。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵罐培养阶段的培养基组分包括：蔗糖、豆粕、(NH₄)₂SO₄、K₂HPO₄·3H₂O、KH₂PO₄。

7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤b所述色氨酸浓度为0.2-10g/L。

8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤b所述转化条件为：25-45℃下转化40-60小时，pH为6-8。

9.如权利要求3所述的方法，其特征在于步骤c所述“收集5-羟色氨酸”包括如下方法：对步骤b得到的转化产物进行离心处理，取上清液，即为产物5-羟色氨酸。

10.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法包括：步骤d，对产物5-羟色氨酸进行纯化；所述纯化过程依次包括固液分离、阳离子交换树脂吸附分离、浓缩、乙醇溶解、蒸馏的步骤。